INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

METODOS DE ANALISIS CLINICOS

Prctica No3 y 4
Determinacin e protenas por el mtodo de Lowry y Bradford.

5QM2
Seccin: 2

Equipo:
Daz Lpez Mnica
Trejo Solrzano Alejandra

Fecha de entrega: 2 de Septiembre del 2016

Objetivos
Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando un
mtodo fotomtrico.
Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa en la precisin y la
exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry.
Conocer el efecto de sustancias no protenicas, en el desarrollo de color.
Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry, con respecto a otros
mtodos para la cuantificacin de protenas.

Fundamentos
Mtodo de Lowry.
Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se
aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad
de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer.
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un
color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido
fosfomolibico-fofotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da
lugar a un complejo de color azul intenso.
Mtodo de Bradford.
Est basado en el cambio de color del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las
protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm.
Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de
presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en

azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia de

Absorbancias entre 595 y 465 nm.

Resultados (METODO DE LOWRY).

A) ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION
Tabla 1. Curva de calibracin e albumina mtodo de Lowry.

Tubo No.
1
2
3
4
5

Cantidad
de Protena
(g)
25
50
75
100
125

A590
Serie A

Serie B

0.061
0.135
0.196
0.247
0.287

0.080
0.155
0.169
0.237
0.287

CURVA DE CALIBRACION
0.35
0.3
f(x) = 0x + 0.03
R = 0.98

0.25
0.2

Albmina

Absorbancia 0.15

Linear (Albmina)

0.1
0.05
0
0

50

100

150

Cantidad de Proteina (g)

Fig. 1. Grafica Curva de calibracin de concentracin de Albumina por el mtodo de Lowry.

Ecuacin de la recta.

y=m x+ b

Pendiente m=0.0021
Ordenada al origen b=0.0264
Coeficiente de relacin r2= 0.9765
De la ecuacin de la recta donde la variable y nos representa la absorbancia y x la
concentracin de protena, podemos interpretar el coeficiente de relacin como la relacin

lineal que se mantiene entre la cantidad de protena y la absorbancia, entre ms se acerque

este nmero a 1; mayor ser la relacin de estas variables.
Por lo tanto podemos decir que la Ley de Bouger-Beer se cumple ya que como se observa
en la Fig.1 La absorbancia es directamente proporcional con respecto a la concentracin.
Para calcular la concentracin de Protena:

De acuerdo a lo anterior mencionado, despejamos de la ecuacin de la recta x que

representa concentracin e protena.
X=

y 0.0264
0.0021

Con esta expresin se calcul la

concentracin de protena e la
Tabla 2

B) REPLICAS PARA EL ANALISIS ESTADISTICO.

Tabla 2. Replicas para el anlisis estadstico.

Tubo N

A 590nm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.179
0.177
0.180
0.198
0.175
0.185
0.181
0.187
0.160
0.180

Cantidad de protena
(g)
73.19
72.26
73.26
82.02
71.33
75.98
74.12
74.12
67.14
73.65

Tabla 1. Resultados del anlisis estadstico

73.74

S
3.73

S2
13.91

%C.V.
5.05%

Clculos para la tabla 3.

x=

Xi 737.4
=
=73.74
n
10

%C.V.=

S
3.73
( 100 )=
( 100 ) =5.05
X
73.74

S=

(X 1x)2
=3.73
n1

76.40-71.07

=73.74

(2.262)(3.73)
=(76.4071.07)
10

Tabla 2. Efecto de algunas sustancias no protenicas en el mtodo de Lowry

Tubo N

Sustancia

Absorbancia a
590 nm

Cantidad de
protena (g)

Tipo de interferencia
generada

1
2
3
4
5

Tris 1M pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial al 1%
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0%
cido tricloroactico (TCA) al 5%

0.182
0.185
0.176
0.155
0.156

74.60
75.98
71.80
62.02
62.50

Negativa
Negativa
Negativa
Positiva
Positiva

Resultados (METODO DE BRADFORD).

C) ELABORACION DE LA CURVA DE CALIBRACION
Tabla 5. Curva de calibracin e albumina mtodo de Bradford.

Tubo No.
1
2
3
4
5

Cantidad
de Protena
(g)
25
50
75
100
125

A590
Serie A

Serie B

0.235
0.390
0.494
0.603
0.675

0.246
0.353
0.487
0.585
0.676

CURVA DE CALIBRACION
0.8
0.7

f(x) = 0x + 0.15
R = 0.99

0.6
0.5

Absorbancia

0.4

Albmina

0.3

Linear (Albmina)

0.2
0.1
0
0

50

100

150

Cantidad de Proteina (g)

Fig. 2. Grafica Curva de calibracin de concentracin de Albumina por el mtodo de Bradford.

Ecuacin de la recta.

y=m x+ b

Pendiente m=0.0021
Ordenada al origen b=0.0264
Coeficiente de relacin r2= 0.9765
De la ecuacin de la recta donde la variable y nos representa la absorbancia y x la
concentracin de protena, podemos interpretar el coeficiente de relacin como la relacin
lineal que se mantiene entre la cantidad de protena y la absorbancia, entre ms se acerque
este nmero a 1; mayor ser la relacin de estas variables, a diferencia de Lowry, Bradford
es ms preciso ya que su r2 es mayor.
Por lo tanto podemos decir que la Ley de Bouger-Beer se cumple ya que como se observa
en la Fig.2 La absorbancia es directamente proporcional con respecto a la concentracin y
comparando con la curva tipo de Lowry las absorbancias registradas en Bradford son ms
altas, esto puede ser debido a que el mtodo es ms sensible.
Para calcular la concentracin de Protena:

De acuerdo a lo anterior mencionado, despejamos de la ecuacin de la recta x que

representa concentracin e protena
Con esta expresin se calcul la
y 0.1467
X=
concentracin de protena e la
0. 0044
Tabla 6

B) REPLICAS PARA EL ANALISIS ESTADISTICO.

Tabla 6. Replicas para el anlisis estadstico.

Tubo N

A 590nm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.441
0.481
0.517
0.465
0.449
0.482
0.464
0.489
0.473
0.479

Cantidad de protena
(g)
73.58
83.57
92.57
79.57
75.57
83.82
79.32
85.57
81.57
83.07

Tabla 7. Resultados del anlisis estadstico

81.8

S
5.34

S2
28.52

%C.V.
6.53%

Clculos para la Tabla 3.

x=

Xi 818
=
=81.8
n
10

( X 1x)2
S=
=5.34
n1

77.98-85.62

%C.V.=

S
5.34
( 100 )=
( 100 ) =6.5 3
X
81.8

=81.8

(2.262)(5.34)
=(77.9885.62)
10

Tabla 8. Efecto de algunas sustancias no protenicas en el mtodo de Bradford

Tubo N

Sustancia

Absorbancia a
590 nm

Cantidad de
protena (g)

Tipo de interferencia
generada

1
2
3
4
5

Tris 1M pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial al 1%
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1.0%
cido tricloroactico (TCA) al 5%

0.514
0.537
0.530
0.131
0.494

83.48
88.70
87.11
3.57
78.93

Negativa
Positiva
Positiva
Positiva
Negativa

Compare los dos mtodos con los mtodos ms usuales para la determinacin de protenas
(Biuret, Lowry, absorbancia a 280 nm, etc.) seale ventajas y desventajas de ellos.
Mtodo de Kjeldahl se caracteriza por el uso de cido sulfrico concentrado que efecta la
destruccin oxidativa de la materia orgnica de la muestra y la reduccin de nitrgeno
orgnico a amonaco el amonio es retenido como bisulfato y puede ser determinado in situ.
Desventajas: demora demasiado en la digestin de la materia orgnica; genera una
espumosidad excesiva; es necesario conocer la proporcin de nitrgeno en las protenas
para emplearlo como mtodo de identificacin; consideraciones ambientales respecto a
descarga de humos y contaminacin de aguas con los catalizadores empleados. Ventajas:
suele ser un mtodo con una alta exactitud, es capaz de discernir entre muestras con una
variacin del 1%.
Mtodo de Biuret se caracteriza por la formacin de un complejo de color azul cuando iones
cpricos son complejados por enlaces peptdicos a pH alcalino. Ventajas: es poco
susceptible de errores, cumple la ley de Lambert-Beer hasta en concentraciones de 2 g/L.
Desventajas: la presencia de azcares reductores producen resultados insatisfactorios, la
lectura a 330 nm, a pesar de proporcionar mayor sensibilidad, tambin es susceptible de
interferencias debidas a presencia de otros compuestos.
Tabla 9. Clculos estadsticos para comparar precisin.

Cantidad de Protena
(g)
Mtodo de
Mtodo de
Bradford
Lowry
(Prueba)
(Referencia)
73.58
73.19

Di

(Di-)2

0.39

59.12

83.57
92.57
79.57
75.57
83.82
79.32
85.57
81.57
83.07

72.26
73.26
82.02
71.33
75.98
74.12
74.12
67.14
73.65

Di 80.79
= n = 10

11.31
18.92
-2.44
4.24
7.84
5.20
11.45
14.43
9.42

10.47
117.63
110.75
14.69
0.054
8.25
11.39
40.39
1.811

=8.079

Clculos de precisin y exactitud.

Sd =

(DiD)2
374.55
=
=6.45
n1
9

t calculada=8.079 x

f calculada=

9 =3.9601

41.47

28.52
=2.050
13.91

t tablas=2.262

f tablas=2.262

SI HAY Diferencia Significativa

NO HAY Diferencia Significativa

Discusin
El mtodo de Bradford es un mtodo propuesto ms recientemente que el de Lowry, por eso
tambin se dice que Bradford es el mtodo de prueba y Lowry el mtodo de referencia.
De acuerdo al desarrollo experimental de ambos mtodos podemos decir que el mtodo de
Bradford es ms rpido, es de menor costo ya que emplea menos reactivos y tiene una
mayor sensibilidad, siendo ms fcilmente afectado por errores del analista o bien del no
correcto funcionamiento del equipo utilizado.
Esto ltimo lo podemos comprobar con los coeficientes de relacin obtenidos en la Figura 1
y Figura 2 ya que el coeficiente de relacin de Bradford es mayor al de Lowry lo que nos
indica
una
mayor
proporcionalidad
y
relacin
lineal.
No se afirma que debido a estas ventajas antes presentadas el mtodo de Bradford sea
mejor que el de Lowry ya que al realizar el anlisis estadstico por medio de la t de Student
existe una diferencia significativa entre ambos mtodos lo que nos indica que los datos de
cantidad de protena obtenidos van a ser variantes dependiendo del mtodo utilizado.

Aunque al efectuar el anlisis estadstico de F de Fisher; que es una prueba utilizada para
comparar la precisin entre dos mtodos; Donde F calculada=2.050 fue menor a la F de
tablas =4.03, nos indica que NO HAY diferencia significativa entre ambos mtodos; por lo
cual la precisin de los datos de concentracin obtenidos en ambos mtodos no ser una
variable que afecte nuestros resultados.
Para poner a prueba la sensibilidad del mtodo se llev a cabo una serie de anlisis de
muestras con sustancias interferentes, se observa que al contrario del mtodo de Bradford,
el mtodo de Lowry no se vio demasiado afectado por la presencia de ciertas sustancias, las
nicas sustancias que afectaron fue el SDS, el TCA ya que este tipo de sustancias altera a la
estructura de las protenas generando una menor afinidad por el reactivo de Folin-Ciocalteu
impidiendo formar el compuesto de color azul, y obtener una absorbancia menor que no es
proporcional a la concentracin.

Conclusin.
Se determin que el mtodo de Lowry no se ve fcilmente alterado por la presencia de
sustancias interferentes.
De acuerdo a las curvas de calibracin el mtodo de Bradford es ms sensible que el de
Lowry y por lo tanto se puede afectar por errores generados por el analista.
El mtodo de Bradford es ms barato, ms en comparacin con el mtodo de Lowry
Ambos mtodos son precisos en sus resultados.
Hay una diferencia significativa entre ambos mtodos.

Bibliografa
http://www.uhu.es/tamara.garcia/quimI/apuntes/TEMA%203.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22427.pdf

Roca P. Oliver J. Rodrguez A. M. 2003. Bioqumica: tcnicas y mtodos. Editorial

Hlice. Madrid, Espaa. pp. 154-158.