Actividades generales de laboratorio

Diseo y montaje del sistema quimiostato

Preparacin de inculo para el quimiostato
Preparacin del medio de cultivo y reactivos necesarios, esterilizacin
de medios de activacin y de proliferacin celular.
Desarrollo del inculo para el quimiostato, cintica en matraces.
Puesta en marcha del quimiostato
Montaje y esterilizacin del sistema quimiostato.
Preparacin y esterilizacin del medio de cultivo

para

el

lote

quimiostato.
Inoculacin del medio liquido del quimiostato y controlar el lote hasta
2/3X log.
Inicio del cultivo continuo.
Obtencin de la curvas caractersticas del cultivo continuo con 5
estados estacionarios
Preparacin y esterilizacin del medio de fermentacin en volmenes
necesarios.
Muestrear durante la perturbacin de un estado estacionario por
aumento de la concentracin de sacarosa hasta alcanzar un nuevo
estado estacionario.
Muestrear para caracterizar un nuevo estado estacionario con cada uno
de los tres niveles de aireacin: 1; 1.5; 2.0 vvm.
Anlisis de X; S y P respectivos.
Determinacin del

m x

mediante operacin en condicin de

lavado.
Preparacin y esterilizacin del medio de fermentacin en volmenes
necesarios.
Muestrear y analizar X durante la condicin de lavado.
Desmontar el sistema continuo, lavarlo cuidadosamente y guardar los
equipos y materiales.

Referencia de composicin de medios de mantencin, adaptacin

y cultivo para K. marxianus para la produccin de inulinasa
Medio

Slido de mantencin

Activacin

Fermentacin

nutrientes
Extracto de levadura
Peptona
Glucosa
Agar
Sacarosa
Extracto de levadura
Peptona
MgSO4.7H2O
pH 6.0
Sacarosa
Extracto de levadura
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
pH 5.5 6.5

Concentracin (g/l)
10
20
20
20
20
3.0
5.0
0.65
5.0
3.0
1.0
5.0
0.5

Condiciones de cultivo: temperatura 30 oC, velocidad de agitacin 160

rpm en shaker y ajustar el pH con acido ortofosfrico o KOH al 1.0 M.
CRONOGRAMA DE TRABAJO BSICO
No
activid
ad
01
02

Actividad
Preparacin y esterilizacin de medios.

03

Preparacin y esterilizacin del medios y

equipo quimiostato.
Preparacin y esterilizacin de medios.

04

Preparacin y esterilizacin de medios.

05

Preparacin y esterilizacin del medio.

06
07
08

Preparacin y esterilizacin del medio con

alta concentracin de sacarosa.
Preparacin y esterilizacin del medio para
establecer estado estacionario con cada uno
de los tres niveles de aeracin.
Preparacin y esterilizacin del medio para
establecer
estado
estacionario
mas

Fecha

Gru
po

Marte
03.02.09
Mircoles
04.02.09
Jueves
05.02.09
Viernes
06.02.09
Lunes
09.02.09
Martes
10.02.09
Mircoles
11.02.09

Jueves
12.02.09

B
C

A
B
C

experiencia de lavado.

Datos adicionales, par el diseo de experiencia:

Volumen del medio liquido en quimiostato:
Cuadro No 01:

V L = 680 ml

nmero de experiencia con sus respectivos valores de D

en el cultivo aireado en quimiostato.

No

estado

estacionario
01
02
03
04
05
Total

D (h

)
0.0706
0.1060
0.1588
0.2206
0.2650

(h)
42.48
28.29
18.90
13.59
11.31
114.5
7

Gasto

(ml/min)
0.80
1.20
1.80
2.50
3.00
9.30

(ml)

medio

2039
2037
2041
2039
2036
10192

Determinar protenas: Mtodo de Bradfotd

Reactivos: disolver 0.1 g de azul de coomassie G 250 ml de etanol al 98 %,
mas 100ml de acido fosfrico al 85 % y con agua destilada aforar a un litro.
Procedimiento:
a. Agregar a un tubo de ensayo 500 ul de muestra convenientemente
diluida.
b. Aadir 5 ml de reactivo de Bradfotd (cada muestra) y dejar reaccionar
durante 5 minutos.
c. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm, contrastndolo
con un blanco de agua destilada de 50 ul.
d. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en
la curva de calibrado.

Cultivo celular continuo aireado

I.

Objetivos
I.1.

Objetivos generales:
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en
quimiostato empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus
ATCC 16045.

I.2.

Objetivos especficos:

Disear medio de cultivo.

Activar clulas y desarrollar el inculo.

Obtener la curva caracterstica del cultivo continuo considerando al

menos cinco estados estacionarios.

Obtener y caracterizar un estado estacionario bajo limitacin por

nitrgeno.

Perturbar

un

estado

estacionario

mediante

aumento

de

la

concentracin del nutriente limitante en la alimentacin y su

seguimiento hasta el nuevo estado estacionario.

Determinar

la

velocidad

especfica

mxima

de

crecimiento

mediante operacin de lavado.

II. Metodologa experimental:
2.1. Diseo de medios:
2.1.1. Medio solido de mantencin
Materiales y equipos

Balanza

analtica

Olla a presin

Mechero
Bunsen

de

ensayo con tapas

Varilla
vidrio

Pipetas de 10
ml.

Tubos

Matraz
erlenmeyer

Guantes.

Esptula

de

Probeta
graduada.

Capachos de papel.

Reactivos

Muestra: Kluyveromyces marxianus ATCC

16045.

Extracto de levadura.

Peptona.

Agar.

Glucosa.
Tabla No 01: Composicin del medio solido de
mantencin de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045
para un crecimiento de biomasa de 3 g/L
N
u
t
r
i
e
n
t
e
s
E
x
t
r
a
c
t
o
d
e
L
e
v
a

0.50

d
u
r
a
E
x
t
r
a
c
t
o

1.00

1.00

1.00

d
e
m
a
l
t
a
P
e
p
t
o
n
a
A
g
a
r

Procedimiento:

Se pesa cuidadosamente en la balanza analtica los

nutrientes que la clula necesitara para su crecimiento (Tabla No

01) en base a los clculos del medio de fermentacin que

deseamos alcanzar

Medir 10 ml de agua destilada en una probeta graduada.

Posteriormente mezclar y disolver todos los componentes con
el

agua

destilada

Erlenmeyer.

medida

anteriormente

en

un

matraz

 Calentar la mezcla del matraz durante 1 a 2 minutos;

contabilizar este tiempo a

partir de la aparicin de las

primeras burbujas; con ayuda de un mechero Bunsen.

Preparar 1 tubo de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 8
ml de la mezcla en el tubo, e inmediatamente taparlo.
Colocar los tubo en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla
a presin, previamente aflojar las tapas, para permitir el
intercambio de gases
Esterilizar a 121 C por 15 20 minutos.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la
olla, luego colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a
temperatura ambiente.
2.1.2.Medio de activacin:

Materiales y equipos:

Balanza analtica

Varilla de vidrio

Esptula

Agua destilada

2 tubos de ensayo con

Pinzas, Guantes

tapa

Olla a presin, pipetas,

Mechero

Bunsen,

pH metro

trpode y rejilla.

Reactivos:

Sustrato

K2HPO4.

limitante: sacarosa

MgSO47H2O.

Extracto de

KCl.

(NH4)2SO4.

levadura.

Procedimiento:

Pesar los componentes calculados para este medio

ver (Tabla No 02).

Mezclar el extracto de levadura en tuvo de ensayo

con 5 ml de agua destilada; mezclar la sacarosa con 10 ml de

agua destilada en un matraz de 125 ml; mezclar el extracto de
malta con 8 ml de agua destilada en un matraz de 125 ml y
mezclar las sales en un tubo de ensayo con 5 ml de agua
destilada.
Esterilizan por separado cada mezcla para evitar la

formacin de otros componentes no deseados.

Luego de esterilizar mezclar todos los componentes

en el matraz;

posteriormente ajustar el pH a 6.0 con cido

fosfrico (H3PO4)
Este procedimiento se har por duplicado

Tabla No 2: Composicin de
medio de Activacin de Kluyveromyces marxianus ATCC16045 para un crecimiento de biomasa de 3 g/L

Elemento

Nota: se trabajara con u pH =

6.

desarrollo del inculo

Activacin

celular

Materiales y equipos:

Matraz de 112 ml con mezcla de nutrientes ya

preparada anteriormente.

Algodn, Gasa

Shaker

Mechero Bunsen, trpode y rejilla.

Procedimiento:

Para la activacin partimos con la cepa incubada en

medio slido (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045).

Se toma una o dos azadas (siguiendo los pasos del

medio de inoculacin)y se introduce en el matraz con los 20 ml
del medio de activacin

Tapamos el tubo con un tapn de gasa y algodn

preparado anteriormente.

Luego se lleva al Shaker a 160 rpm, T = 30 o C y un t

= 4-6 horas hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente,
evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

Este procedimiento se har por duplicado.

Se

realizaran

activacin

las

3 medios
cuales

de
se

dispondrn

de

la

siguiente

manera:
1. La primera para la cintica de crecimiento de biomasa.
2. La segunda inoculo para el quimiostato.
3. La tercera para la curva de calibracin de biomasa por el mtodo rpido.

2.2.3.Medio de fermentacin:

Materiales y equipos:
Balanza

analtica

vidrio
Mechero

erlenmeyer de 1 L
Pipetas de

10 ml.

Matraz

Bunsen

Varilla de

Tubos de
ensayo con tapas

Guantes.

Esptula

Probeta
graduada


Procedimiento:

Pesar los componente componentes descritos en la

tabla 3

Se mezcla sacarosa y el KHPO 4 en un matraz de 1 L

con 88 ml de agua destilada

Se mezcla Extracto de levadura en un matraz con 40

ml. de agua destilada

Esterilizar las diluciones por separado a 121 C por 15

minutos.

Dejar enfriar y guardar en refrigeracin hasta su

posterior uso.

Tabla NO 3: Medio de fermentacin e inculo

para el cultivo contino de Kluyveromyces marxianus ATCC
16045, para un crecimiento de biomasa de 3 g/L

Element

Com

Saca

4.039

E
xt
r
a
ct
o
d
e
L
e
v
a

d
u
r
a

(NH

1.298

0.3434

MgS

0.124

KCl

0.029

Tabla NO 04: Medio de fermentacin:

Matraz
A
B

Compuestos
Maltosa
Extracto de
levadura
Sulfato de
amonio
Fosfato
dicido de
potasio
Sulfato de
magnesio 7
hidrato
Cloruro de
Potasio

Nota: Los medios se esterilizan a 121 O C por 15

minutos

Tabla No 4: composicin del medio de

fermentacin y proliferacin (para 68 ml de
solucin)

Elemento
u
%Nutrie

So(g/68

t
r
i
e
n
t
e
S
a
c
a
r
o
s
a
C

1
2

H
2
2

O
1
1

E
x
t
r
a
c
t
o
d
e

L
e
v
a
d
u
r
a
S
u
l
f
a
t
o
d

e
m
a
g
n
e
s
i
o
h
e
p
t
a
h
i
d
r
a
t
a
d
o
M
g
S
O
4

.
7
H
2

O
S
u
l
f
a
t
o
d
e
a
m
o
n
i
o
(
N

H
4

)
2

S
O
4

F
o
s
f
a
t
o

d
i
a
c
i
d
o
d
e
p
o
t
a
s
i
o
K
H
2

P
O
4

F
o
s
f
a
t
o
d
i
a
c
i
d
o

d
e
p
o
t
a
s
i
o
K
H
2

P
O
4

Elemento

Tabla N 5: composicin del medio de

fermentacin en el Quimiostato (para 680 ml de
solucin)

N
%Nutrie

So(g/68

III.

Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa:

Materiales y equipos:

Matraz de 1 L conteniendo el medio de

fermentacin
Espectrofotmetro
pH metro
Gasa y algodn
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel aluminio

Procedimiento:

Fermentacin del microorganismo

El medio anterior agregar a un matraz de 1 litro

contenido de 180 ml de medio con la siguiente composicin:

Fuente de carbono : Sacarosa

Concentracin celular final de 3 g/l

Volumen del medio

1 Lt. Pero considerando el

volumen de 680 ml con que se va a trabajar en el quimiostato, de

ello el 10 % es 68 ml, y sera esta la cantidad requerida, pero
trabajaremos con 88 ml.; es decir un excedente de 20 ml. para
emplearla en la elaboracin de la curva de calibracin para la
biomasa.

Ajustar el pH a 5 6 con HCl o NaOH 2 M y llevar el

autoclave a 121C por 15 minutos.

IV.

Obtencin de la curva caracterstica de crecimiento de una

levadura:

Para la obtencin de esta curva, es necesario

considerar 5 estados estacionaros.


Estados estacionarios:

dx ds d p
; ; =0
dt d t d t

Con liderando D < max porque de lo contrario ocurrir

el lavado del cultivo, es decir existir un D C = max = 0.452 h-1. Para

evitar el lavado tomaremos velocidades de dilucin (D) menores a 0.452
h-1

determinaremos

el

valor

de

los

flujos

para

los

estados

estacionarios. Sabiendo que VL = 680 ml.

Consideramos arbitrariamente las velocidades de

dilucin para los siguientes estados estacionarios:

( 1/h

0.07

0.10

0.15

0.22

0.26

Utilizando la siguiente formula: donde V L = 680 ml.

D=

F
; =D
VL

Luego determinamos los flujos de alimentacin (F)

para los 5 estados estacionarios, considerando un V L = 680 ml. Como
por ejemplo para el 1er estado estacionario tenemos:

F=D .V = . V

F=680 mlx 0.0706

F=0.8 ml /min

1
1h
x
=0.8 ml/min
h 60 min

Luego tenemos para cada estado estacionario

siguientes flujos de alimentacin (F).

los

( ml/

( ml/

0.80

1.20

1.80

2.50

3.00

48.00

72.00

108.00

150.00

180.00

Luego hallamos
considerando la siguiente formula:

1
; =D
D

Donde:

1
0.0706 h1

=14.16 horas

los

tiempos

de

residencias


Luego tenemos para cada estado estacionario
siguientes tiempos de residencia (T)

d
e
E
s
t
a
d
o
e
s
t
a
c
i
o
n
a
r
i
o
1

9.

6.

4.

3.

los


Seguidamente
alcanzamos
los
fermentacin ( ) aplicando el siguiente producto: 3

tiempos

de

Donde:

T =3 =3 x 14.16 h

T =42.48 horas

Luego tenemos para cada estado estacionario

siguientes tiempos de fermentacin

d
e
E
s
t
a
d
o
e
s
t
a
c
i
o
n
a
r
i
o
1

los

T
i
e
m
p
o

t
o
t
a
l
d
e
f
e
r
m
e
n
t
a
c
i

Para hallar el gasto de alimentacin hacia el

quimiostato se considera la siguiente formula, para los 5 estados
estacionarios:

Gi=F i x T i

Donde:

Gi : gasto

Fi :flujo

T i :tiempo de fermentacin

Gi=F i xT

Gi= 48

Gi=2.039 litros

ml
( 42.48 h )
h

Luego tenemos para cada estado estacionario los

siguientes gastos

d
e

E
s
t
a
d
o
e
s
t
a
c
i
o
n
a
r
i
o
1

2.

2.

2.

2.

2.

G
a

s
t
o

t
o
t
a
l
d
e
a
l
i
m
e
n
t
a
c
i

IV.1.

Calculo del flujo de aire necesario para el cultivo

IV.1.1.

Demanda de Oxigeno:

Estando el cultivo ya en el quimiostato, se tienen que

tomar en cuenta la velocidad del flujo de aire que ingresa.

Y o =rendimiento de oxigenoen clula

2

cel. / g O2)
Consideramos:

Y o =0.5 g /g
2

=0.10(efieceincia de absorsin)

=0.452 h1

X =3 g /l
Entonces reemplazamos datos:

N A=

. X
Yo
2

(0.5 2.0 g


IV.1.2.

N A =2.712 g /l . h

Velocidad de aeracin especifica:

VVM=2.035 x 104

VVM=1.67 min1

N A xT
; T =30 o C=303 K

Este ltimo valor es la velocidad de aireacin

especfica para alcanzar la concentracin deseada.
IV.1.3.

Flujo de aire necesario para el cultivo:

Q=VVMx V L

Q=1.136 L/min
Procedimiento :

Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluar el

crecimiento de biomasa, tomar una muestra inicial, al que se
le mide la absorbancia y se centrfuga, guardando el
sobrenadante en viales y la masa sedimentada en capachos
que sern expuestos a la estufa.

Una vez iniciado el crecimiento de biomasa en el

quimiostato,
se manipula el flujo de alimentacin de tal
manera que en tiempos determinados, se provoque en el
comportamiento del crecimiento, 5 estados estacionarios.

IV.2.
Perturbacin de un estado estacionario mediante
aumento de la concentracin del nutriente limitante en la
alimentacin:

Habindose obtenido los estados estacionarios en el

crecimiento de la levadura, se perturbara este estado aumentando la
concentracin de sacarosa (Nutriente limitante) en la alimentacin,
con el cual el estado estacionario en el que se encontraba terminar,
dando lugar a un comportamiento logartmico.

Este nuevo flujo tendr una concentracin de

Sacarosa = 5 g/l. Para este estado estacionario consideraremos los
siguientes datos:

= 0.080 h-1

F = 54 ml/h

t = 38 h

V = 2.052 L o gasto a utilizar

por 15 min.

Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121 o C

Determinacin de la
mxima de crecimiento mediante lavado:

velocidad

especfica

Para poner en marcha esta actividad, comenzamos

realizando los siguientes pasos:

Cortar el flujo de alimentacin, despus de haber

transcurrido el tiempo de fermentacin; en donde se alcanza una
reduccin de X y =mx .

Utilizando la ecuacin de balance general de clulas:

X vs t.

dx
=D X o+ . X
dt
Consideramos

X o =0.3 g /l , obtenemos la grfica Ln

Luego trazamos una recta tangente a la curva,

considerando un D = 0.452, y obtenemos el MAX. a travs de la
funcin tangente.

Utilizando la siguiente frmula:

hallamos el tiempo para el lavado:

t = 5.10 h

ln

x
=t ,
xo

( )

Anexo:
1. Calculando la fuente de carbono y energa:

Sacarosa (C12 H22 O11), M = 342 g

Y x / s=

de C en el nutriente
de C en clula
12(12)
x 100
342

de C en el nutriente=

de C en el nutriente=42.105

2. Clculos para el diseo de medio del fermentador:

IV.3.

Calculo de % Nutriente:
Sacarosa:

C12 H22 O11 , PM

sacarosa

= 342

342

100%

12x12

X
X = 42.105

Sulfato de amonio: (NH4)2SO4, PM = 132

132

100%

28

X = 21.212

Sulfato de magnsio heptahidratado: MgSO4.7H2O, PM = 246.3

246.3

100%

24.3

X = 9.866
K2HPO4, PM = 174
174

100%

31

X = 17.82

Clorhuro de potasio: KCl, PM = 74.5

74.45

39

X = 52.349
IV.4.

Calculo de

Y x /s

Y x / s=

de C en el nutriente
x 0.6
de C en clula

Y x / s=

42.105
x 0.6
50

Sacarosa:

Y x / s=0.505 g/ g

(NH4)2SO4:

Y x / s=

21.212
9
Y x / s=2.357 g/ g

100%
X

 K2HPO4:

Y x / s=

17.816
2
Y x / s=8.908 g/ g

MgSO47H2O

Y x / s=

9.863
0.4
Y x / s=24.658 g / g

KCl

Y x / s=

52.448
0.5
Y x / s=104.896 g / g

3. Calculando el sustrato inicial: S0

Y x / s=

x x o
so s

Sacarosa:

0.505=

S o=5.941 g/l

(NH4)2SO4:

S o=

3
x 1.5
2.357

S o=1.91 g/l

K2HPO4:

S o=

3
x 1.5
8.908

MgSO47H2O:

S o=0.505 g /l

3
so 0

S o=

3
x 1.5
24.658

S o=0.1828 g /l

KCl:

S o=

3
x 1.5
104.896

S o=0.043 g /l

Descripcin del muestreo:

1. Extraemos con una pipeta 5 ml del medio del fermentador enrasamos
la medida del tuvo de espectrofotmetro y medimos la absorbancia a
640 nm la muestra (antes el espectrofotmetro debe estar encendido
con 30 minutos anterioridad y tambin previa calibracin con el blanco
en cada medida)
2. Una ves determinada la absorbancia procedemos a llevar la muestra en
un tubo de ensayo

a la centrifuga

a 1200 rpm por 20 minutos.

Previamente en el equipo ha sido colocado un tubo con agua destilada

para hacer contrapeso y obtener una mejor centrifugacin.
3. Concluido los 20 minutos se saca el tubo con el contenido de muestra y
el sobrenadante se hecha a los viales y el pellets es desechado.
4. Luego el vial es colocado a congelacin.