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Chromatographie dadsorption

1. Facteurs intervenant dans la chromatographie dadsorption


1.1. Adsorbants. Les adsorbants sont des solides trs diviss (l'adsorption tant un phnomne de
surface, il faut que l'adsorbant prsente la plus grande surface utile possible) :1 g d'alumine pour
chromatographie reprsente une surface de l'ordre de 100 m2. La qualit d'un adsorbant dpend de
sa puret, de sa surface, de son homognit, de sa teneur en eau. Il est caractris par les critres
suivants :
la capacit d'adsorption ; on distingue les adsorbants faibles ( faible capacit d'adsorption),
comme le talc ou le carbonate de sodium et les adsorbants forts ( forte capacit d'adsorption)
comme le gel de silice ou l'alumine.
la polarit ; certains adsorbants prsentent une forte polarit, comme le gel de silice ou
l'alumine, tandis que d'autres, au contraire, ont une faible polarit comme le charbon actif.
la granulomtrie ; un adsorbant prsentant une granulomtrie faible assure une meilleure
sparation mais par contre, celle-ci se fait beaucoup plus lentement.
Principaux adsorbants employs en chromatographie
Papier, cellulose
Kieselguhr,terre de diatomes
Amidon
Sucres
Talc
Carbonate de sodium
Oxyde de magnsium
Gel de silice
Alumine
Charbon activ

forces d'interactions croissantes avec les composs


polaires

Le gel de silice est ladsorbant le plus utilis et le plus rentable essayer en premier lieu pour
sparer des composs neutres contenant un ou deux groupes fonctionnels. Par contre, pour sparer
des bases, il est prfrable dutiliser de lalumine plus basique que la silice. Ces deux adsorbants se
trouvent dans le commerce additionns dune substance qui permet une visualisation des dpts
sous U.V.
1.2. Solvants ou luants. Le pouvoir luant d'un solvant dpend de sa polarit. Plus un luant est
polaire, plus il entranera facilement une substance polaire. En revanche, un solvant apolaire
possdera un mauvais pouvoir luant vis vis des substances polaires mais entranera facilement
un constituant apolaire. On utilise soit un solvant pur soit un mlange de plusieurs solvants de
faon ajuster son pouvoir luant au systme chromatographique tudi.
Srie luotropique des solvants
Ether de ptrole
Cyclohexane
Tolune
Dichloromthane
Ethoxythane
Ethanoate d'thyle
Propanone
Propan-1-ol
Ethanol
Mthanol
Eau
Acide actique

pouvoir luant croissant ;


polarit croissante

1.3. Interactions substance-adsorbant et substance-luant


Les interactions substance-adsorbant correspondent essentiellement l'tablissement de
liaisons du type diple-diple, diple-ion ou de liaisons de Van der Waals. En gnral, plus un
adsorbant est polaire, plus il fixe les substances polaires. Les interactions substance-luant sont
de deux types :
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dissolution de la substance par l'luant : les substances ont tendance se dissoudre dans
l'luant et migrer avec lui. C'est ce phnomne qui est prpondrant dans le cas de solvants
peu polaires (hydrocarbures, ther, composs carbonyls).
dplacement des molcules adsorbes par l'luant : les molcules d'luant recherchent les
mmes sites d'adsorption que les molcules de la substance adsorbe et dplacent ces
dernires. C'est ce phnomne qui est prpondrant dans le cas de solvants polaires et
protognes (alcools, eau, acides).
2. Etude de quelques techniques de chromatographie
2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
Cette mthode de chromatographie, trs rpandue au laboratoire et trs facile mettre en
oeuvre, repose sur des phnomnes d'adsorption.
a. Matriels
- Phase mobile : on emploie un solvant ou un mlange de plusieurs solvants
- Phase stationnaire : on emploie un adsorbant (gel de silice, d'alumine de cellulose...) mlang un
liant et uniformment tal sur une plaque de verre, d'aluminium ou un support plastique.
b. Principe de la technique
La cuve contenant l'luant est sature en vapeurs d'luant. Cette saturation a pour but de
limiter l'vaporation de la phase mobile depuis la plaque lors de la migration de l'luant et des
constituants du mlange. Les dpts sont effectus sous forme de petites taches l'aide d'un
capillaire. Pour augmenter la quantit de mlange dpose, on effectue plusieurs dpts au mme
point, en schant (de faon vaporer le solvant) entre deux dpts successifs. Lorsque la plaque
est place dans la cuve, l'luant monte le long de la plaque essentiellement par capillarit. Chaque
constituant du mlange migre sa propre vitesse (un constituant de faible polarit migre en gnral
plus rapidement qu'un constituant de forte polarit). Cette phase de la CCM se nomme
dveloppement du chromatogramme. En fin de dveloppement, les spots (traces des constituants
du mlange) sont rvls.
c. Applications de la CCM.
Cette technique ne requiert que quelques microgrammes d'chantillon et est utilise
principalement dans les cas suivants :
- contrle de la puret d'un compos organique
- suivi de la progression d'une raction chimique
- recherche du meilleur luant avant de faire une sparation par chromatographie sur colonne
- identification des constituants d'un mlange.
d. Choix de l'luant
Le choix d'un luant est fait selon les critres suivants :
- un luant qui entrane tous les constituants du mlange est trop polaire
- un luant qui empche leur migration n'est pas assez polaire
Le meilleur luant, pour un constituant donn, est celui qui, lorsqu'il a termin sa migration, a
entran ce constituant une distance d'environ la moiti de celle qu'il a parcourue.
e. Technique de la CCM
Voir TP prcdents.

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f. Influence de divers facteurs sur la qualit de la sparation


Polarit de lluant. Pour chacune des plaques reprsentes ci-dessous, A est lacide benzoque
PhCOOH, compos polaire et B est le biphnyle PhPh qui est un compos apolaire. Lacide
benzoque polaire aura des interactions fortes avec le gel de silice qui est un adsorbant polaire alors
que le biphnyle sera peu retenu par le gel de silice.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

plaque (1) : lluant est un mlange actone / cyclohexane 1/1 en volumes

plaque (2) : lluant est un mlange actone / cyclohexane 1/1 + 2 gouttes dacide actique ;
lluant est plus polaire que le prcdent et entrane plus lacide benzoque
plaque (3) : lluant est un mlange actone / cyclohexane 1/1 + 10 gouttes dacide
actique ; la polarit de lluant a augment, lacide benzoque migre plus mais la sparation
devient moins bonne
plaque (4) : lluant est un mlange actate dthyle / cyclohexane 1/1 en volumes ; ce
mlange est moins polaire que celui utilis pour la plaque (1), le biphnyle est mieux
entran
plaque (5) : lluant est un mlange propan-2-ol / cyclohexane 1/1 en volumes ; lluant
utilis est trop polaire et les deux composs ne sont pas suffisamment spars
plaque (6) : lluant est un mlange dichloromthane / cyclohexane 1/1 en volumes ;
lluant, trop peu polaire nentrane quasiment pas lacide benzoque

Polarit du solut. Pour la plaque reprsente


dichloromthane / cyclohexane 1/1 en volumes

ci-dessous,

lluant

est

un

mlange

A : alcool benzylique PhCH2OH


B : benzaldhyde PhCOH
C : benzophnone PhCOPh
D : actophnone PhCOCH3
E : benzoate dthyle PhCOOC2H5
F : acide benzoque PhCOOH
Plus un compos est polaire, plus il est retenu par le gel de silice
polaire lui aussi.
Polarit du solvant. Pour la plaque reprsente ci-dessous, lluant est un mlange tolune /
mthanol 1/1 en volumes +6 gouttes dacide actique
A et B : le solvant est lacide actique
A : benzaldhyde PhCOH
B : acide cinnamique PhCHCHCOOH
C et D : le solvant est le tolune
C : benzaldhyde PhCOH
D : acide cinnamique PhCHCHCOOH

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2.2. Chromatographie sur colonne. Contrairement la CCM, la chromatographie sur colonne est
une mthode prparative qui permet de sparer et d'isoler les constituants d'un mlange. Cette
mthode prsente plusieurs inconvnients :
elle ncessite une grande quantit d'luant
la dure de l'lution est en gnral trs grande (au minimum, plusieurs heures)
il est indispensable de coupler cette chromatographie avec d'autres mthodes de faon pouvoir
dtecter les constituants du mlange.
a. Description succincte
La chromatographie sur colonne est une technique fonde
principalement sur des phnomnes d'adsorption :
phase stationnaire : alumine ou silice remplissant une colonne de
longueur et de section variables
le mlange, en solution trs concentre, est dpos au sommet de
la colonne
la sparation des constituants du mlange rsulte de l'coulement
continu d'un luant travers la colonne par gravit.
Dans la technique classique, l'luant est un solvant unique mais on
peut accrotre progressivement la polarit de l'luant de faon
acclrer le dplacement des constituants du mlange.
b. Principe de la technique
Le principe de la chromatographie sur colonne est le mme que celui
de CCM
D'une part, les substances les plus polaires sont fortement retenues
par l'adsorbant, d'autre part, les solvants polaires entranent
facilement les constituants les plus polaires.

Pour tout constituant du mlange, il s'tablit un quilibre de distribution entre l'adsorbant et


l'luant, la proportion des molcules adsorbes dpendant de leur nature et du pouvoir de
dissolution de l'luant. Lorsque le mlange (souvent nomm chantillon) est dpos au sommet de
la colonne, il est aussitt adsorb en une zone cylindrique de faible paisseur. L'coulement continu
de l'luant dans la colonne provoque alternativement la dsorption et l'adsorption des molcules
des diffrents constituants du mlange. Les diffrents constituants du mlange sont entrans vers
le bas des vitesses variables selon leurs interactions attractives pour l'adsorbant et leur solubilit
dans l'luant. Le chromatogramme se dveloppe en formant une succession de zones cylindriques
qui se sparent en migrant vers le bas. Au fur et mesure que chaque zone s'coule de la colonne,
on la recueille.

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c. Facteurs dont dpend la sparation


Une bonne sparation est souvent plus difficile obtenir qu'avec une CCM Outre du choix de
l'adsorbant et de l'adsorbant, la sparation dpend de la dimension de la colonne et de la vitesse de
l'lution.
Adsorbants : le plus usuel est l'alumine (Al2O3) sous forme acide, basique ou neutre. Cet
adsorbant ne peut tre employ qu'avec des composs organiques stables (l'alumine acide
entrane la dshydratation des alcools tertiaires, l'alumine basique entrane l'hydrolyse des
esters ou la condensation aldolique des aldhydes). L'alumine est un adsorbant polaire ; le
constituant le plus polaire sera le plus fortement fix et c'est le constituant le moins polaire qui
sera lu le premier. On peut aussi utiliser un gel de silice (SiO 2), en particulier pour sparer
des composs organiques qui n'ont pas une stabilit suffisante pour tre spars sur alumine.
La granulomtrie d'un adsorbant employ en chromatographie sur colonne est plus importante
que celle d'un adsorbant employ en CCM (80 200 m au lieu de 70 m).
La quantit d'adsorbant dpend de la difficult de la sparation et de la masse de l'chantillon.
Approximativement, il faut 30 50 g d'adsorbant par gramme d'chantillon. La quantit
d'adsorbant ncessaire est nettement plus faible si les constituants du mlange ont des
polarits trs diffrentes.
Eluants : on emploie gnralement un mlange de deux solvants. Le plus souvent, au dbut de
l'lution, on commence par le solvant le moins polaire qui entrane les constituants les moins
polaires (les moins retenus par l'adsorbant) ; on augmente ensuite la polarit de l'luant par
addition graduelle du solvant le plus polaire ; on lue ainsi les constituants les plus polaires. En
gnral, si le volume de l'adsorbant est V, on change la composition de l'luant aprs
coulement d'un volume 3V d'luant.
Dimension de la colonne : de faon gnrale, la hauteur h de la colonne est gale sept dix
fois le diamtre intrieur de la colonne. Il faut laisser un espace libre d'environ 10 cm au-dessus
de l'adsorbant.
Vitesse d'lution : elle doit tre la plus constante possible. Elle doit tre suffisamment faible
pour qu'il y ait quilibre de chaque constituant entre l'adsorbant et l'luant. Si la vitesse
d'lution est trop faible, les constituants diffusent dans l'luant. Le chromatogramme prsente
alors des bandes larges et la sparation est mdiocre. Si la vitesse d'lution est trop grande, la
sparation des diffrents constituants de polarits voisines ne se fait pas.
d. Remplissage de la colonne
C'est l'opration la plus dlicate. Le remplissage de la colonne doit tre le plus homogne
possible et totalement exempt de toute bulle d'air. Les surfaces infrieure et suprieure de
l'adsorbant doivent tre parfaitement horizontales. Si ces conditions ne sont pas remplies, les zones
se dforment pendant le dveloppement du chromatogramme.
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Les effets dun mauvais remplissage de la colonne

Il existe deux modes de remplissage de la colonne.


Remplissage par voie humide : on prpare d'abord, dans un bcher, un mlange parfaitement
homogne de l'adsorbant et du moins polaire des deux solvants de faon obtenir une bouillie
suffisamment fluide pour couler facilement (on verse l'adsorbant dans le solvant par petites
quantits et en agitant). On verse suffisamment de bouillie dans la colonne pour que l'adsorbant
qui se dpose progressivement forme une couche d'environ 2 cm. On frappe les parois de la
colonne pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre le robinet et on laisse couler le
solvant puis on recommence (attention ne jamais laisser la surface suprieure sec) jusqu'
ce que tout l'adsorbant ait t introduit dans la colonne.
Remplissage par voie sche : on remplit la colonne au deux tiers avec le moins polaire des deux
solvants puis on ajoute l'adsorbant en poudre par petites portions successives. Pendant
l'addition, on frappe continuellement sur les parois de la colonne pour avoir un tassement
rgulier de l'adsorbant.
e. Dpt de l'chantillon
Il s'agit d'une opration dlicate car l'chantillon doit former une zone cylindrique de faible
paisseur en haut de la colonne. Si l'chantillon est liquide, il est dpos tel quel. Si l'chantillon
est solide, on le dissout dans un minimum du moins polaire des deux solvants. Il faut que la
solution obtenue soit la plus concentre possible. On ajuste d'abord le niveau du solvant pour qu'il
soit juste au-dessus de la surface suprieure de l'adsorbant. Ensuite, on coule l'chantillon (pur ou
en solution trs concentre) au sommet de la colonne le long d'un agitateur en essayant de le
distribuer de la faon la plus uniforme possible. On ouvre le robinet un court instant de faon que
l'chantillon pntre dans la colonne et soit adsorb uniformment au sommet de la colonne. On
insre une rondelle de papier filtre ou un peu de laine de verre de faon bloquer l'adsorbant.
f. Alimentation en solvant et dveloppement du chromatogramme
L'alimentation en solvant s'effectue l'aide d'une ampoule de coule. On doit s'assurer, durant
l'lution, que la surface de l'adsorbant est toujours recouverte de solvant et n'est jamais au contact
de l'air. Lorsque dbute l'alimentation en solvant, on rgle le dbit de l'alimentation de faon qu'il
soit le mme que celui de l'coulement au bas de la colonne (vitesse de 5 50 gouttes par minute).
Le volume de chaque fraction recueillie varie de 1 50 mL selon les cas (il existe des collecteurs de
fractions automatiques). On collecte les fractions et on les analyse.
g. Analyse des fractions
Lorsque les composs qui se sparent forment des zones colores dans la colonne ou sont
fortement fluorescents aux U.V., il est facile de les reprer soit directement sur la colonne soit dans
les fractions recueillies. La rcupration s'effectue alors simplement en runissant les fractions
appropries et en vaporant le solvant. Si les produits sont incolores, l'analyse des fractions
recueillies s'effectue le plus souvent selon l'une des deux mthodes suivantes :
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on dtermine la concentration des diffrents


constituants dans chacune des fractions et on
trace une courbe d'lution (ce type d'opration
peut tre effectu par des appareils automatiss).
Dans la courbe ci-contre, les constituants C et D
apparaissent sous forme d'un pic prsentant un
paulement, ce qui tmoigne d'une sparation
incomplte. Par contre, les constituants A et B
sont bien spars. Chaque fraction est caractrise
par son volume de rtention, caractristique d'un
compos
donn
dans
un
systme
chromatographique donn (quivalent du Rf en
CCM).

chaque fraction peut tre analyse qualitativement et quantitativement (sauf dans le cas d'une

analyse par CCM), selon la nature des constituants de l'chantillon, par CPG, HPLC, par
spectroscopie IR, UV ou RMN ou par CCM Dans les deux cas, lorsque l'analyse des fractions est
termine, on runit celles qui correspondent des constituants identiques, en prenant soin
d'liminer celles o apparaissent plusieurs constituants. On chasse le solvant et on obtient ainsi
des substances organiques d'une grande puret.

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