INSTITUTO DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUMICOS

BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL - BIOQUMICA
DOCENTES: FABIO MERON E GIZELE CARDOSO FONTES
Prtica 1: PODER REDUTOR DOS GLICDIOS

1 - Teoria:
Os glicdios que possuem em sua estrutura um grupamento hemiacetal, identificado pela
presena da hidroxila heterosdica ligada ao carbono anomrico, apresentam poder redutor.
Metais como Cu2+, Ag+, Bi3+ e Hg2+ e ainda substncias orgnicas como o cido dinitrossaliclico
(DNS) so reduzidos em meio alcalino por glicdios. O poder redutor uma propriedade muito
utilizada para determinao qualitativa e quantitativa de glicdios.
2 - Objetivo:
Avaliar o poder redutor dos seguintes glicdios: glicose, frutose, sacarose, maltose e
lactose.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Reativos de Benedict, de Fehling, de Tollens e soluo de DNS.
-Solues aquosas: 1% de glicose (G), 1% de frutose (F), 2% de sacarose (S), 2% de
maltose (M) e 2% de lactose (L).
4 - Procedimento:
- Para cada reagente separar seis tubos de ensaio. Marcar cada um dos tubos com a inicial
de um dos glicdios a ser testado e mais um que ser o branco (B). Cada conjunto de seis tubos de
reagente corresponde a uma srie.
- Adicionar aos tubos da 1 srie 1mL de reativo de Benedict, ao da 2 srie 1mL do
reativo de Fehling, aos da 3 srie 1mL de reativo de Tollens e aos da 4 srie 1mL de DNS.
- Adicionar cada tubo 1 mL da respectiva soluo de glicdio. Aos tubos marcados com
B adicionar 1mL de gua destilada.
- Aos tubos contendo o reagente de Tollens, deve ser acrescida uma gota de soluo de
hidrxido de amnio.
- Aquecer a mistura em banho-maria por 10 min.
-Verificar a formao de precipitado, mudana de cor ou formao de espelho prata.
5 - Resultados:
Elaborar uma tabela indicando os glicdios que apresentam poder redutor frente aos
diferentes reagentes:
+ = reao positiva
- = reao negativa
Anotar todas as alteraes ocorridas.
6 - Relatrio:
-Apresentar as reaes ocorridas no experimento.
-Explicar porque nem todos os glicdios avaliados apresentaram poder redutor.

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Prtica 2: DOSAGEM DE GLICDIOS REDUTORES (GR) MTODO DE NELSON

1 - Teoria:
O mtodo de Nelson um mtodo espectrofotomtrico que tem como base a reduo do
cobre em meio alcalino (reativo de Fehling), seguido da formao de um complexo azul de Cu+
com molibdato de amnio (tcnica colorimtrica de Somogyi). um mtodo bastante sensvel,
sendo a intensidade da colorao azul diretamente proporcional quantidade de glicdio redutor.
2 - Objetivo:
- Elaborar uma curva padro para determinao da concentrao de glicdios redutores
presentes numa amostra.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Solues Nelson A, Nelson B e Nelson C.
-Soluo padro de glicose 18mg/100mL (1 mmol/L).
4 - Procedimento:
4.1- Preparo da curva padro
a-Adicionar a 6 tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose e completar cada um deles para 1mL com gua destilada.
OBS: Iniciar o item 4.2.
b-Adicionar em cada tubo 1mL da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24 mL de
Nelson A + 1,0 mL de Nelson B).
c-Aquecer em banho-maria em ebulio por 20 minutos.
d-Resfriar os tubos em gua corrente.
e-Adicionar 1,0 mL do reagente Nelson C e agitar at parar de espumar.
f-Completar o volume para 25 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
g-Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540nm, zerando o aparelho
com o branco (aquele que contm 0 mL da soluo padro de glicose).
4.2- Determinao da concentrao de glicose em amostra desconhecida
a-Adicionar a um tubo de Folin-Wu 1 mL de soluo da amostra desconhecida.
b-Repetir os procedimentos dos itens 4.1.b a 4.1.g.
5 Relatrio:
-Elaborar uma tabela com as concentraes de glicose (g/L) e as respectivas absorvncias.
-Construir a curva padro: absorvncia versus concentrao de glicose (g/L), incluindo a
equao da curva e o coeficiente de determinao (R2).
-Determinar a concentrao de glicose na amostra desconhecida.
-Apresentar a reao qumica que ocorreu, explicando a funo dos componentes dos
reagentes de Nelson.

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Prtica 3: DOSAGEM DE GLICDIOS REDUTORES (GR) E GLICDIOS REDUTORES

TOTAIS (GRT) EM AMOSTRA DE CALDO DE CANA-DE-ACAR

1 - Teoria:
O principal componente do caldo de cana-de-acar a sacarose, glicdio que no possui
redutor. Na determinao dos glicdios totais (GRT) presentes no caldo de cana, inicialmente a
sacarose presente deve ser hidrolisada, de acordo com a seguinte equao qumica:
sacarose + gua

glicose + frutose

Como glicose e frutose so glicdios redutores, a partir de sua quantificao no caldo

hidrolisado possvel determinar a concentrao de sacarose no caldo de cana.
2 - Objetivo:
Determinar a concentrao de GR, GRT, sacarose presentes no caldo de cana-de-acar e
a eficincia da hidrlise.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagente: Soluo de DNS.
-Soluo padro de sacarose (20 % m/v) e caldo de cana de acar.
-Soluo padro de glicose 0,9 g/L (5 mmol/L).
4 - Procedimento:
4.1- Hidrlise cida da soluo padro de sacarose e do caldo de cana-de-acar para
anlise de GRT
a-Colocar em erlenmeyer de 250 mL, 20 mL de amostra de caldo de cana-de-acar e 30
mL de gua destilada.
b-Colocar em um segundo erlenmeyer de 250 mL, 20 mL da soluo padro de sacarose
20% e 30 mL de gua destilada.
As etapas a seguir sero realizadas para ambas as solues obtidas nos itens a e b.
c-Levar a banho-maria na temperatura de 65C.
c-Atingida a temperatura acima adicionar 10 mL de HCl 6,2 mol/L e homogeneizar.
d-Retirar o erlenmeyer do banho e aguardar 30 minutos.
e-Transferir o hidrolisado para um balo de 500 mL e completar o volume.
f-Pipetar 10 mL da soluo do hidrolisado e colocar em balo de 500 mL, neutralizar com
2,0 mL de NaOH 0,62 mol/L e completar o volume a 500 mL.
g-Transferir 1,0 mL da soluo obtida no item f para um tubo de Folin-Wu.
4.2- Diluio do caldo de cana-de-acar para anlise de GR
a-Diluir o caldo de cana na proporo 1:100.
b-Adicionar 1 mL do caldo diludo na proporo 1:100 a um tubo de Folin-Wu.
3

4.3- Preparo de curva padro

a-Adicionar a 6 tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose e completar cada um deles para 1mL com gua destilada.
4.4- Determinao de GR nas amostras
Ser feita a anlise de GR pelo mtodo do DNS nos seguintes tubos de Folin-Wu: Os dois
tubos obtidos no item 4.1, o tubo obtido no item 4.2 e os seis tubos obtidos no item 4.3.
a-Adicione 1,0 mL do reagente do DNS a cada um dos tubos de Folin-Wu.
b- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
c- Resfriar os tubos em gua corrente.
d- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
e- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (1,0 mL de gua destilada).
5 - Relatrio:
-Elaborar uma tabela com as concentraes de glicose (mmol/L) e as respectivas
absorvncias.
- Construir a curva padro: absorvncia versus concentrao de glicose (mmol/L), incluir
a equao da curva e o coeficiente de determinao (R2).
- Calcular a concentrao de glicdios redutores totais (GRT), em g/L, no hidrolisado da
soluo padro de sacarose. A partir deste dado, calcular a eficincia da hidrlise.
- Calcular a concentrao de glicdios redutores (GR), em g/L, na amostra de caldo de
cana-de-acar.
- Com base na eficincia da hidrlise e na concentrao de GR no caldo de cana, calcular
as concentraes de glicdios redutores totais (GRT) e sacarose, em g/L, no caldo de canade-acar.
- Comparar as curvas padres obtidas pelos mtodos de Nelson (prtica 2) e do DNS
(prtica 3) no sentido de identificar a de maior sensibilidade na anlise de glicdios redutores na
faixa de concentraes em estudo.

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Prtica 4: DETERMINAO DOS NDICES DE SAPONIFICAO E ACIDEZ

I-ndice de Saponificao (I.S.):

1 - Teoria:
Corresponde a massa, em miligramas, de hidrxido de potssio necessria para neutralizar
os cidos graxos resultantes da hidrlise de 1 grama de gordura ou leo. Desprezando-se a
matria insaponificvel, este ndice inversamente proporcional massa molar mdia dos
grupamentos acila (resduos de cidos graxos) presentes na molcula de triacilglicerol.
2 - Objetivo:
-Determinar o ndice de saponificao de amostras de leos ou gorduras comerciais.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4% m/v, soluo alcolica de
fenolftalena a 1% e cido clordrico 0,5 mol/L.
4 - Procedimento:
a-Pesar 2g de amostra em um frasco erlenmeyer de 250 mL.
b-Adicionar 20 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4%.
c-Adaptar o erlenmeyer a um condensador de refluxo.
d-Aquecer at ebulio branda por 30 minutos.
e-Resfriar, adicionar 2 gotas de fenolftalena e titular com HCl 0,5 mol/L at que a
colorao rsea desaparea.
f-Realizar um ensaio em branco em outro frasco erlenmeyer sem amostra (item b ao e).
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com os resultados da titulao.
- Calcular o ndice de saponificao para as amostras.
I.S. = (Vb - Va) MHCl x MMKOH
m
onde: Vb = volume da soluo de HCl gasto na titulao do branco (L)
Va = volume da soluo de HCl gasto na titulao da amostra (L)
MHCl = concentrao em quantidade de matria da soluo de do HCl (mol/L)
MMKOH = massa molar do KOH (56000 mg/mol)
m = massa da amostra (g)

II-ndice de Acidez (I.A.):

1 - Teoria:
Corresponde massa, em miligramas, de hidrxido de potssio necessria para neutralizar
os cidos graxos livres presentes em 1 grama de leo ou gordura.
2 - Objetivo:
-Determinar o ndice de acidez em amostras de leos comerciais.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo de ter etlico-lcool etlico (2:1) neutra, soluo alcolica de
fenolftalena a 1% e hidrxido de sdio 0,01 mol/L.
4 - Procedimento:
a-Pesar 2g de amostra em um frasco erlenmeyer de 250 mL.
b-Adicionar 25 mL de soluo de ter etlico-lcool etlico neutra e homogeneizar.
c-Adicionar 2 gotas de fenolftalena e titular com NaOH 0,05 mol/L at colorao rsea.
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com os resultados da titulao.
- Calcular o ndice de acidez para as amostras.
I.A. = Va x MNaOH x MMKOH
m
onde: Va = volume de soluo de NaOH gasto na titulao da amostra (L)
MNaOH = concentrao em quantidade de matria da soluo de NaOH (mol/L)
MMKOH = massa molar do KOH (56000 mg/mol)
m = massa da amostra (g)
- Comparar e interpretar os resultados obtidos para as amostras analisadas.
- A partir da estequiometria da reao, deduzir as equaes para os clculos dos ndices.
- Explique a viabilidade de se expressar um ndice em termos de KOH, quando se
empregou NaOH nos ensaios.

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Prtica 5: CURVA DE TITULAO DE AMINOCIDOS

1 - Teoria:
Os aminocidos apresentam-se na forma dipolar inica, com propriedades anfotricas em
funo dos seus grupamentos amino NH2 (NH3+) e carboxila COOH (COO-).
A adio de quantidade equivalente de um cido forte (HCl) ao aminocido far com que
ele se apresente na forma protonada. A titulao potenciomtrica utilizando uma base forte
(NaOH) permite determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2 e o ponto isoeltrico (P.I.).
2 - Objetivo:
-Construir a curva de titulao do aminocido alanina.
-Determinar os pKs dos grupamentos COOH e NH2, e o ponto isoeltrico (P.I.) da
alanina.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Alanina, NaOH 0,1 mol/L e HCl 0,1 mol/L.
4 - Procedimento:
-Pesar 2 mmol de alanina em um becher de forma alta de 100 mL.
-Adicionar quantidade equivalente de HCl 0,1 mol/L.
-Proceder titulao potenciomtrica da alanina utilizando 40 mL NaOH 0,1 mol/L.
-Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 mol/L de cada vez e anotar o pH aps estabilizar a leitura.
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com os resultados da titulao (volume de base adicionado, nmero
de mmols equivalente e valor do pH).
- Construir a curva de titulao da alanina (mmol de base x pH).
- Determinar graficamente os valores de pk1 e do pk2 e calcular o ponto isoeltrico (P.I.).
- Calcular os valores de pk1, pk2 e P.I. a partir da estequiometria da reao;
- Comparar os valores dos pKs e P.I. obtidos nos itens anteriores com os valores indicados
na literatura: pK1 = 2,35 e pK2 = 9,87.

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Prtica 6: CURVA DE SOLUBILIDADE DA CASENA EM FUNO DO pH

1 - Teoria:
As protenas tm sua solubilidade altamente influenciada pelo pH. Isto se deve ao carter
anfotrico desses compostos, apresentando em sua estrutura resduos de aminocidos com cargas
eltrica distintas. O pH de menor solubilidade de uma protena localiza-se no seu ponto
isoeltrico (P.I.), uma vez que a fora de repulso entre as molculas menor. A solubilidade
aumenta quando o pH desloca-se para valores inferiores ou superiores ao P.I. da protena.
2 - Objetivo:
-Verificar a influncia do pH na solubilidade de uma protena.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes: Soluo de casena 0,3g/100 mL em acetato de sdio 0,1 mol/L
cido actico 0,1 mol/L
cido actico mol/L
4 - Procedimento:
- Numerar 8 tubos de ensaio e proceder seu preenchimento de acordo com o quadro:
Tubo

gua (mL)

5,0

4,4

4,3

4,0

3,5

2,5

0,5

3,9

Ac. Actico 0,1 mol/L (mL)

0,1

0,2

0,5

1,0

2,0

4,0

Ac. Actico 1,0 mol/L (mL)

0,6

Sol. Casena (mL)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

- Determinar a absorvncia em cada tubo a 570 nm.

5 - Relatrio:
- Calcular o pH terico de cada tubo usando a equao de Henderson-Hasselbach.
- Construir um grfico do inverso da absorvncia (1/Abs) X pH.
- Analisar o grfico obtido indicando a faixa onde se situa o P.I. da casena. Justificar a
resposta.

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Prtica 7: ANLISE DE PROTENAS PELO MTODO DO BIURETO

1 - Teoria:
O biureto o composto formado pelo aquecimento da uria 180C. Quando o biureto
colocado em presena de CuSO4, em meio alcalino, obtm-se um complexo de colorao azul.
Este mesmo tipo de reao colorida ocorre entre substncias com duas carbonilas ligadas
diretamente, atravs de um tomo de nitrognio ou carbono, peptdios (mnimo 2 ligaes
peptdicas) e protenas com o CuSO4, conservando o nome de reao do biureto. Esta reao
muito utilizada na dosagem de protenas em materiais biolgicos, uma vez que a intensidade da
cor depende exclusivamente da concentrao da protena, j que as ligaes peptdicas aparecem
com a mesma freqncia por grama do material a ser analisado.
2 - Objetivo:
- Determinar a concentrao de protena em amostra de produto comercial.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Reagente do biureto: CuSO4 em soluo alcalina
Soluo padro de casena 10 mg/mL, em NaOH 0,1 mol/L.
Solues de produtos comerciais na concentrao de 10 mg/mL em NaOH 0,1
mol/L: extrato de leveduras, protena de soja e gelatina.
4 - Procedimento:
-Seguir o protocolo abaixo utilizando a soluo padro de casena:
Tubo
Soluo de casena (mL)
H2O (mL)
Reagente biureto (mL)
Branco
0
1,0
5,0
1
0,2
0,8
5,0
2
0,4
0,6
5,0
3
0,6
0,4
5,0
4
0,8
0,2
5,0
5
1,0
0
5,0
- Para cada amostra de produto comercial, colocar em um tubo de ensaio, 1,0 mL da
soluo e 5,0 mL do reagente biureto.
- Aps a adio dos reagentes, agitar e aguardar 30 minutos temperatura ambiente em
ausncia de luz.
- Determinar as absorvncias a 550 nm.
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com as concentraes de protena (g/L) e as respectivas
absorvncias.
- Construir a curva padro: absorvncia versus concentrao de protena (g/L), incluir a
equao da curva e o coeficiente de determinao (R2).
- Determinar a concentrao de protena nas amostras analisadas.
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Prtica 8: ATIVIDADE ENZIMTICA

1 - Teoria:
A influncia do tempo sobre a velocidade de uma reao enzimtica ser verificada com a
utilizao da enzima invertase, que catalisa a converso (hidrlise) da sacarose (glicdio no
redutor) em quantidades idnticas de glicose e frutose (glicdios com poder redutor). Atravs do
emprego do mtodo de dosagem de glicdios redutores pelo DNS (cido 3,5 dinitro saliclico)
possvel quantificar os acares formados no hidrolisado.
2 - Objetivo:
-Determinar a velocidade de reao e calcular a atividade da preparao enzimtica.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose 0,5 mol/L em soluo tampo de acetato 0,05 mol/L, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).
Soluo padro de glicose 5,0 mol/mL em soluo tampo de acetato 0,05 mol/L.
4 - Procedimento:
4.1- Obteno da enzima invertase:
a- Pesar 15 g de fermento biolgico e 15 g de NaCl.
b- Misturar os dois slidos por 10 min.
c- Centrifugar a mistura por 20 min ( 2500 rpm).
d- Recolher o sobrenadante e diluir na proporo de 1:250 com gua destilada.
4.2- Curva padro de glicose
a- Adicionar aos tubos de Folin-Wu 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mL da soluo padro de
glicose 5,0 mol/mL e completar para 1,0 mL com gua destilada.
b- Adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS.
c- Aquecer em banho-maria por 5 min.
d- Resfriar os tubos em gua corrente.
e- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada (usar a marcao do tubo) e
homogeneizar.
f- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (0 mL da soluo padro de glicose 5,0 mol/mL).
4.3-Influncia do tempo de reao (T=ambiente).
a- Marcar 6 tubos de Folin-Wu com os tempos de reao a serem avaliados: 1, 2, 3, 5, 10
e 15 min.
10

b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL da soluo de sacarose 0,5 mol/L.

c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima obtida no item 4.1 e
imediatamente disparar o cronmetro para cada tempo de reao a ser avaliado.
d- Imediatamente aps finalizado o tempo de reao, adicionar 1,0 mL do reagente do
DNS e levar a banho-maria em ebulio por 5 minutos.
e- Utilizar os procedimentos de d at f descritos no item 4.2.
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com as concentraes de glicose (mol/mL) e as respectivas
absorvncias.
- Construir a curva padro; absorvncia versus concentrao de glicose (mol/mL), incluir
a equao da curva e o coeficiente de determinao (R2).
- Elaborar uma tabela com os dados de produto formado (mol/mL) e os respectivos
tempos de reao.
- Construir um grfico de produto formado (mol/mL) X tempo (min).
- Calcular a velocidade inicial da reao, isto quando P/t constante. Explicar a
importncia da determinao da velocidade inicial da reao.
- Calcular a atividade da preparao enzimtica, apresentando o resultado em unidade
padro (U)/mL. Unidade padro (U) de uma enzima a quantidade de enzima que catalisa a
formao de 1 mol de produto por minuto sob condio definida. Neste caso considerar
U=1mol de glicose/min a T=ambiente em pH= 4,7.
- Explique os fatores que leva a interrupo da reao enzimtica.
- Justifique os pontos do grfico escolhidos para o clculo da velocidade inicial

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Prtica 9: INFLUNCIA DA TEMPERATURA SOBRE A ATIVIDADE ENZIMTICA

1 - Teoria:
A temperatura altera a velocidade de uma reao enzimtica exercendo influncia na
constante de velocidade. Entretanto, como a enzima uma protena, a elevao da temperatura
tende a provocar a desnaturao da mesma, com perda de atividade.
2 - Objetivo:
-Verificar a influncia da temperatura sobre a atividade da enzima.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose 0,45 mol/L em tampo de acetato 0,05 mol/L, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).
4 - Procedimento:
a- Marcar 5 tubos de Folin-Wu com as temperaturas a serem avaliados (0oC, ambiente,
50oC e 100oC) e o branco (B).
b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL da soluo de sacarose 0,5 mol/L e no branco 1,0 mL
de gua destilada.
c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima (exceto no branco) e,
imediatamente, colocar os tubos nos respectivos banhos: 0oC banho de gelo, temperatura
ambiente medir a temperatura, 50oC banho trmico a 50oC e 100oC gua fervente.
d- Aps exatamente 10 min retirar os tubos dos respectivos banhos e adicionar em cada
tubo 1,0 mL do reagente do DNS, inclusive no branco.
e- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
f- Resfriar os tubos em gua corrente.
g- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada e homogeneizar.
h- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (1,0 mL de gua destilada).
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com os dados de temperatura (oC), absorvncia a 540 nm,
concentrao d eproduto formado (mol/mL) e velocidade da reao (mol/mL.min.).
- Construir um grfico de velocidade de reao (mol/mL.min) X temperatura (oC).
Obs.: O clculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando a curva padro
obtida na prtica no 8.
- Determinar a temperatura na qual a enzima apresenta maior atividade. Justifique.
- Explicar os fatores que levam a interrupo da reao enzimtica realizada.
- Explicar como a temperatura afeta a velocidade de uma reao enzimtica.
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Prtica 10: MODELO CINTICO DE MICHAELIS-MENTEN

1 - Teoria:
Se aumentarmos a concentrao do substrato ([S]) tal que [S]>[Sn-1]...>[S3]>[S2]>[S1],
verificamos que as velocidades iniciais aumentam. Quanto maior [S], mais lentamente este
aumento ocorre, at que mais nenhum aumento observado. Isto quer dizer que atingimos [ES]
mxima, e a enzima est totalmente saturada pelo seu substrato.
2 - Objetivo:
-Verificar a influncia do fator concentrao de substrato sobre a velocidade inicial de
uma reao enzimtica.
3 - Material:
-Anotar toda vidraria e equipamentos utilizados.
-Reagentes/solues:
Soluo de sacarose nas concentraes de 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,02 e 0,01 mol/L em
tampo de acetato 0,05 mol/L, pH 4,7.
Soluo de enzima obtida por extrao com NaCl de fermento biolgico.
Reagente do DNS (cido 3,5 dinitro saliclico em meio alcalino).
4 - Procedimento:
a- Marcar 8 tubos de Folin-Wu com as concentraes de sacarose a serem avaliadas (1,0;
0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,02 e 0,01 mol/L) e o branco (B).
b- Adicionar em cada tubo 0,5 mL das respectivas solues de sacarose e no branco 0,5
mL de gua destilada.
c- Em seguida, adicionar 0,5 mL da soluo da enzima e imediatamente disparar o
cronmetro.
d- Aps exatamente 10 minutos adicionar em cada tubo 1,0 mL do reagente do DNS,
inclusive no branco.
e- Aquecer em banho-maria em ebulio por 5 minutos.
f- Resfriar os tubos em gua corrente.
g- Completar o volume para 12,5 mL com gua destilada e homogeneizar.
h- Ler as absorvncias das solues em espectrofotmetro a 540 nm, zerando o aparelho
com o branco (0,5 mL de gua destilada).
5 - Relatrio:
- Elaborar uma tabela com os dados de concentrao de substrato - [S], absorvncia a 540
nm, produto formado (mol/mL), velocidade da reao -V (mol/mL.min.), 1/[S] e 1/V.
- Construir um grfico de velocidade de reao -V (mol/mL.min) X concentrao de
substrato - [S] e analisar o grfico.
- Construir um grfico de 1/V X 1/[S] e determinar os parmetros Km e Vmx.
Obs.: O clculo do produto formado em mol/mL deve ser feito utilizando a curva padro
obtida na prtica no 8.
- Explique como a concentrao de substrato afeta a velocidade de uma reao
enzimtica.
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