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Palabras clave, absorcin intestinal, sacos evertidos in vitro, tensoactivos, diseo experimental .
Key words : intestinal absorption, in vitro everted sacs, surfactans, experimental design .
ABSTRACT . In order to study the in vitro intestinal absorption of Gl (bacterial and fungi drug), in a solid dispersion (PEG 6000), in rat intestinal
segments, a spectrophotometric analytical technique through a 2 experimental design was evaluated . The experiments for the optimization of the
analytical technique were developed by a Wilson and Wiseman method . Two
factors were analyzed, shaking (Ta) and centrifugation times (Tc) . There
were remarkable differences in the absorbance of G1 between the two Ta
evaluated (2 and 5 min) . The statistical analysis showed that the best values were Ta = 5 and Tc = 2 min . The recuperation percentage result, with
the established Te and Ta values, was 95 % . Using in vitro everted intestinal sacs we evaluated the absorption of Gl-PEG 6000 in stomach, duodenum, jejunum and ileum, without remarkable differences among them . In
order to study the influence of surfactants in the absorption process Solutol,
Tween-60 and Tween-80 were studied in duodenal segments . The effectiveness orderwithregardstoapparentpermeabilitycoefficientsvaluesforGH
was Tween-60 > Solutol > Tween-80 . Finally, Tween-60 was evaluated in
the same intestinal tract and compared with the results obtained without
surfactant and there were not significative differences in the absorption .
The permeability coefficients with and without surfactants were high . The
transport mechanism of GI-PEG 6000 was by transcellular passive diffusion .
INTRODUCCION
El G1, 1-(5 bromofur-2-il)-2 bromo-2-nitroeteno, es un nitrovinilfurano con marcadas propiedades
bactericidas-fungicidas y sin potenciales riesgos genotxicos .' Su
escasa solubilidad acuosa y su velocidad de disolucin intrnseca estim
mada (14,34 mg/L), ha dado lugar a
la bsqueda
34 alternativas
/L)
lugar
gicas que mejoren su disolucin . En
este sentido, la obtencin de sistemas slidos dispersos en polietilenglicol 6000 (PEG 6000) ha brindado los mejores resultados .
Los modelos experimentales in
vitro, descriptivos de la absorcin in
vivo de frmacos, son valiosas herramientas en la estimacin del transporte biolgico de nuevas entidades
qumicas luego de su administracin
oral . ' Los sacos intestinales
evertidos de ratas es una de las tcnicas in vitro de particular utilidad
cuando la permeabilidad limita la
absorcin del frmaco o cuando la
absorcin limita la disponibilidad
sistmica del medicamento .'o, is.
Muchas veces la velocidad de disolucin de compuestos lipofilicos
pobremente solubles en agua, en los
fluidos del sitio de absorcin, es el
paso limitante en el proceso de absorcin . Los surfactantes pueden
influir en la absorcin de frmacos
liposolubles incrementando su
solubilidad aparente (como resultado de la solubilizacin micelar o por
reduccin del ngulo de contacto
entre el slido y el disolvente) y
con ello su velocidad de disolucin ." B
12
40
10- 2
14
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol . 32, No . 1, 2001 .
Con el presente estudio nosotros
pretendemos inicialmente optimizar
una tcnica analtica espectrofotomtrica para su aplicacin en ensayos de absorcin intestinal in vitro
de una dispersin slida de G1 en
PEG 6000 y posteriormente, evaluar
la absorcin de este producto en varios segmentos del tracto gastrointestinal de la rata, as como la influencia de tres tensoactivos en el
proceso de absorcin intestinal .
MATERIALES Y METODOS
La dispersin slida de G1 al 30 %
en PEG 6000 (Fluka, Suiza) se prepar segn el mtodo de fusin? Con
vistas a la determinacin cuantitativa del G1 en las muestras intestinales, se desarroll una tcnica
espectrofotomtrica UV-VIS . Para
ello se realiz una curva de calibracin (n = 4) de G1 en n-hexano (BDH)
en el intervalo de 0,05 a 0,9 mg/mL,
y se midi la absorbancia del G1 en
un espectrofotmetro UVVIS (Ultraespec III, Pharmacia, LKB, Suecia)
a 360 nm .
Animales
En todos los ensayos in vitro se
utilizaron ratas Sprague-Dawley macho con un peso entre 350 y 370 g .
Las ratas se adaptaron durante una
semana alas condiciones del laboratorio, con temperaturas de (22 2) C
y una humedad de (75 5) % . En la
alimentacin se utiliz pienso estndar para ratas (Centro Nacional de
Produccin de Animales para el Laboratorio) . Durante este perodo los
animales tuvieron acceso al agua y
comida ad libitum . La alimentacin
fue retirada 18 h antes de comenzar
los ensayos .
Optimizacin de la tcnica espectrofotomtrica
Para el establecimiento de la tcnica analtica se desarroll un diseo experimental 22 considerndose
dos factores fundamentales, tiempo
de agitacin (Ta) y de centrifugacin
(Ib) en el intervalo de 2 y 5 min . Todos los factores se estudiaron a dos
niveles (etiquetados con los signos
- y +) y se realizaron tres rplicas
para obtener la estimacin de los
efectos simples y de la interaccin
doble .
Los experimentos para la optimizacin de la tcnica analtica se realizaron en tres ratas utilizando el
mtodo descrito por Wilson y
Wiseman . 19 Los animales fueron
anestesiados con ter dietlico
(AnalaR, BDH) . Posteriormente, se
les realiz una incisin abdominal .
1 0
~dc
dt )
V
(Co A)
donde :
dC/dt cambio de concentracin por
unidad de tiempo (g/mL . s) .
V volumen del fluido serosal (mL) .
Co concentracin inicial de frmaco en el sitio mucosal (g/mL) .
A rea superficial de la membrana
intestinal (cm2 ) .
En los estudios para evaluar la
influencia de tensoactivos en la absorcin intestinal del G1 a partir de
su dispersin slida en PEG 6000 se
ensayaron el Solutol, Toreen 60 y
ltveen 80 . Para ello, se pesaron 4,3 mg
de Gl-PEG 6000, se humectaron con
300 mg de tensoactivo y se disolvi
en 100 mL del regulador salino . El
experimento se realiz en tres porciones de duodeno por rata (n = 3),
siguiendo el procedimiento citado
con anterioridad, y se calcul el
Papp . Luego se evalu la influencia
del lixeen 60 en la absorcin del Gi
disperso en PEG 6000 en las diferentes porciones del tracto gastrointestinal de cuatro ratas y se determin
el Papp .
Por ltimo, en un intento por esclarecer el mecanismo de transporte del Gl, se estudiaron las diferencias direccionales de la velocidad de
transferencia en segmentos duodenales del intestino de ratas (n = 3) . Una
vez extrado el duodeno se dividi en
tres fracciones, dos segmentos
evertidos y uno normal . Uno de los
sacos evertidos y el normal se colocaron en una disolucin salina con
la dispersin slida de GI (120 g/
mL) y se determin la concentracin
serosal y mucosal (interior del saco)
respectivamente . El otro saco evertido se coloc por 10 min en una disolucin de 10 mmol KCN, para envenenar los transportadores," y luego,
se continu con el mismo procedimiento de eversin y se calcul el
Papp para las diferentes condiciones experimentales, corrigiendo
los datos de concentracin de G1
sobre la base del factor de recuperacin .
El anlisis estadstico de los
datos se realiz por la prueba t de
Student a travs del programa
SPSS para Windows 95 y se consideraron diferencias significativas
cuando p < 0,05 .
RESULTADOS Y DISCUSION
Determinacin cuantitativa de G1
por Espectrofotornetra UV-VIS
La ecuacin de la curva de calibracin de la forma y = a + bx se
describe por a = 2,439 10 5 y b =
0,064 0 . El intercepto no difiere significativamente de cero . Los parametros de linealidad calculados para
.
Absorban
0 .8
Concentracin (p9/ml)
-1
0,034
0,033
0,036
0,034 ! 0,002
-1
0,030
0,021
0,031
0,027 0,005
0,039
0,044
0,057
0,047 x 0,009
Factor
de interaccin
Ta - Tc
Error
experimental
TOTAL
6,07510'
6,075 . 10a
1,355
0,277 9
1,841 10 4
1
1
1,841
1,841
4,108
4,106
0,077 3
1,841 10'
3,587 10 4
4,483 10"
0,001
11
10'
10 4
0,077 3
Absorbancia ( 10-')
48
40
36
32
28
24
1
tiempo de agitacin en
Determinacin de G1 en segmentos
intestinales
Se observ una gran variabilidad
en el coeficiente de permeabilidad
para el Gl, en ausencia de tensoactivo, para cada segmento intestinal
(Tabla 4), la cual pudiera estar dada
por los bajos valores de concentracin del G1 alcanzados luego de su
Ta
et
anlisis
de
los efectos
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol . 32, No . 1, 2001 .
Tabla 3 . Anlisis del efecto sobre la dispersin de la absorcin (Prueba ANOVA F) .
ELente
de variacin
Efectos
principales
Ta
Suma
Grados
de cuadrados de libertad
Te
Factor
de interaccin
Ta -Tc
Error
experimental
TOTAL
Cuadrado
medio
Relacin-F
1,126
0,861
2,940
2,250
0,110 3
0,172 0
2,253
0,861
1,391
1,391
3,631
0,093 2
2,383
2,383
6,221
6,221
0,037 3
2,383
2,383
3,064
7,70
0,383
11
0,037 3
Log r'
-3 .7
-4 .1
.4 .7
-5 .2
-5 .7
-6 .1
-6 .7
Ta
TI'.
Fig . 3. Internados LSD para la interaccin entre Los factores tiempo de agitacin y de
centrifngacti(5n, en el anlisis de los efectos sobre la dispersin, en la absorbancia
Tabla 4 . Valores del coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) en diferentes regiones intestinales de ratas
con y sin tensoactivo .
Regin
Papp
010 1 cm/s)
Sin
Con
tensoactivo tensoactivo
(Tween-60)
Estmago
1,87 = 1,12
2,01 = 0,77
Duodeno
2,38 = 1,79
1,69 0,48
Yeyuno
2,24 2,10
0,57 0,30
Ileon
1,96 z 1,31
0,98 0,25
Papp
( 10' cm/s)
2,66 2,18
No evertido-
3,09 x 2,01
Evertido (KCN) 6
1,19 = 0,08
12
Papp
10 4 cm/s)
0,86 0,23
TWeen-60
1,69 0,48
TWeen-80
0,63 0,03
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