01/10/2015

PADMorfologia

PCR
A tcnica da PCR permite que um fragmento especfico da molcula de
DNAsejaamplificadomilharesdevezesemapenasalgumas
horas. Esta tcnica revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois
atentodemoravasemuitotempoparaaamplificaodo
DNA.ApartirdaPCRpossvelobtersecpiasdeumapartedomaterial
genticoemquantidadesuficientequepermitadetectare
analisarasequnciaquealvodoestudo.Areaopodesercomporadaa
umaprocuraporumanicapessoaemumagrandecidadee
clonlaaopontodepoderpovoartodaacidade.
A reao explora funo natural da enzima chamada de taq polimerases,
extradadabactriaThermusaquaticus,queumaenzima
termoestvel, fato de imensa importncia uma vez que a reao se
processaemciclosdediferentestemperaturas,comoserditomais
adiante.
Este processo de amplificao do DNA foi inventado por Kary Mullis em
1983eaprimeiraamplificaofeitafoiadabetaglobulina
humana. Desde ento, houve um aumento exponencial no nmero de
publicaescientficasquerelatavamutilizaratcnicadaPCRem
experimentos, passando de 3 publicaes em 1986 para 1700 em 1990.
EstadescobertacondecorouKaryMulliscomoprmioNobelde
Qumicadezanosapssuainveno.OfatocentralquefazaPCRtotil
quetodoorganismovivopossuisequnciasdenucleotdeos
noDNAquesonicaseespecficasparacadaespcie.
EstareaopermiteaamplificaodequalquerseqnciadeDNAcoletada
deamostrasdemateriaisbiolgicoscomosangue,urina,
outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de
microorganismos,clulasvegetaisouanimaismesmoquecom
milharesdeanos,tambmpodemserdetectadaspelaPCR.
ParaaexecuodatcnicadaPCRprecisoquesetenhaconhecimento
prviodaseqnciadocidonuclicoquesedesejaamplificar,
dita "seqncia alvo." A partir disto, desenhamse dois iniciadores
("primers")paradarpartidaaoprocessodesnteseemumlocal
especfico.Um"primer"serveparasintetizaraseqnciaalvonosentido3
5eoutroparaosentidoinversoisto,53.O"primer"
uma pequena seqncia de nucleotdeos que hibridiza no incio da
seqnciaalvoquesequeramplificaredaqualelecomplementar.
Aoreconhecero"primer,"apolimerasesintetizaumacpiacomplementar,
obedecendoinformaocontidanaseqnciadeDNAque
serreplicada(sintetizada).
Etapasdoprocesso:
ExtraodoDNAdaamostraquesepretendeestudar
PurificaodoDNA
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Preparao de uma mistura chamada Master Mix, que conter todas as

substnciasnecessriassintesedenovascpiasdeDNA
Incubao em um termociclador, que o aparelho responsvel pela
execuodetodososciclosdareaoaquecendoeresfriando
o/ostubo/s
EletroforeseemgeldepoliacrilamidadosprodutosdaPCR
Revelaoefixaodogel
ReagentesdaPCR:
SoluotampoparasegarantirpHeconcentraesinicasadequadas
reao
Deoxinucleosdeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam
comotijolosnaconstruodasmolculasdeDNA
Osprimers
ATaqpolimerase
H2O
Mg+2paraoptimizarareao(nemsempreusado)
ODNAextradodaamostra
Algunsadjuvantesquandonecessrio
Areaoemsiosciclos:
ExistemtrsfasesbsicasouciclosparacadareaodePCR.Cadaciclo
contmumoumaispassoseduasvariveisem
cadapasso:atemperaturaeadurao.
Etapadedesnaturaoinicial:consistedeumnicopassodedesnaturao
a94Cpor5minutos.Dificilmentealteraseesta
etapa.
ObojodaPCRtomalocalnesteciclo,quesubdivididoemtrs:
1)Etapa de anelamento este o passo que habilita os primers a anelar a
fitasimplesdesnaturada.Otemponecessrio
paraanelamentode3045segundos.
2) Etapa de extenso. neste passo que a Taq polimerase age para
estenderomolde.Regularmenteelarealizadaatemperaturade
72 (a atividade enzimtica tima de 76 79C), dificilmente alterase a
temperaturade72.Umaregraparaseestimara
extenso do tempo a de que para cada 1000 nucleotdeos atribumos 1
minuto.Outrafrmulapopularcalcular60bases
porsegundo.
3) Etapa de desnaturao: A desnaturao da molcula de DNA formado
servecomomoldeparaoprximociclo.Ela
realizadaatemperaturade9394C.Nestatemperaturaaenzimatemuma
meiavidadecercade1hora.
Estestrspassossorepetidos3040vezesemparticularparaanlisesde
digesto.Seosciclosexcederemesta
quantidadeelespoderointroduzirmutaescomaTaqpolimerase.
Etapadeextensofinal.Istofeitocomumnicocicloemdoispassos:um
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passodeanelamentooqualidnticoao
passodeanelamentonasegundaetapadePCR(mesmotempoemesma
temperatura).Osegundoadeextenso
longatemperaturaidnticaaopassodeextenso,pormcomduraode3
5minutos(72C)por5minutos.Isto
habilitatodaamplificaosemiiniciadaasecompletar.

DiferentesaplicaesdaPCR:
Estudodopadrodeexpressognica(transcritosraros)
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Seleodeclonesrecombinantes
Sequenciamentodiretodeprodutosamplificados
Detecodemutaesemgenesespecficos
Estudosdiagnsticosdedoenasinfecciosas,detecodebactrias,vruse
protozoriosparasitas
Diagnsticoprnatalemcasoderisco
Elucidaoderelaesevolutivasentreespcies,utilizandomaterial
arqueolgico
GrandevalianaMedicinaForense(impressodigitaldeDNA)

RevelaodaPCRemgeldepoliacrilamida

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