Asignatura:

MICROBIOLOGIA
AMBIENTAL

INGENIERA AMBIENTAL IV

TINCIN Y OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS

I. FUNDAMENTO
I.1.

Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben a una
superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio
en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin
algn tratamiento previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
a) Tincin simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa
celular.

b) Tincin diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre

clulas bacterianas o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan
mas de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin.
Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen, etc.
I.2.

Colorantes:
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los poli sacridos cidos (las

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envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas

negativamente).
I.3.

Tincin diferencial de Gram:

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien
la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativos (en
este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicamente distintos de
bacterias).
Las bacterias grampositivas y gramnegativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de
la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como
para prevenir la lisis osmtica.
El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula grampositiva es gruesa y consiste en varias
capas interconectadas de peptidoglicano a s como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80% - 90% de la pared de la clula grampositiva es
peptidoglicano.
La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms
delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% 20% de la pared de la clula gramnegativa es peptidoglicano.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso
del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas.
3. Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta - yodo.

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II. OBJETIVOS:
Brindar al estudiante herramientas bsicas en la confeccin y el manejo de
extendidos y la tincin de los mismos de acuerdo a la observacin que se desee
realizar.
III. MATERIAL:
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Microscopio
ptico
- Solucin de
cristal violeta al
1%
- Solucin de azul
de metileno al 1
%
- Solucin de
safranina al 1 %
- Solucin
decolorante

(alcohol etlico y
acetona 1:1)
Solucin de I2/ I
(yodo / yoduro al
0.1 %)
Muestra
bacteriolgica
de origen
natural: Sarro
dental, yogur,
etc.
Asa de siembra
o aguja
enmangada.

Palillos o
mondadientes
Aceite de
inmersin.
Soporte de
tincin.
Gotero.
Mecheros de
Bunsen o de
Alcohol.
Pinzas
Alcohol etlico.
Agua destilada.

IV. PROCEDIMIENTO:
IV.1. Preparacin del extendido previa a la coloracin
- Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el centro
del mismo una gota del cultivo lquido, mediante asa de platino.
- Si el cultivo es slido, se coloca primero una gota de solucin fisiolgica o
agua destilada estril sobre el portaobjeto. Luego, con asa de platino se
toma una colonia del medio slido y se emulsiona con la solucin fisiolgica.
Se extiende con el asa en forma de capa delgada y uniforme.
- Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa lentamente el
portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo el
extendido hacia arriba. La operacin se repite hasta sequedad total,
cuidando evitar la combustin del extendido.
IV.2. Tincin
IV.2.1.
Tincin simple
- Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno
y se deja actuar unos minutos.
- Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de forma
suave, con ayuda de piseta. Se seca el extendido de la forma
descripta anteriormente.
- Se observa al microscopio.
IV.2.2.
Tincin diferencial. Mtodo de Gram
Sobre el extendido realizado en el punto anterior se realiza el
siguiente tratamiento.
- REACCION Y COLORACION DE LAS
BACTERIAS
- GRAM
- GRAM
- PASO DEL
POSITIVAS
POSITIVAS
PROCESO
GRAM
GRAM
NEGATIVAS
NEGATIVAS
- Solucin de Cristal
- Clulas color
- Clulas color
violeta
violeta
- Violeta al 1%.
- Se deja actuar 1
minuto
- Solucin Yodo- Formacin del
- Formacin del
Iodurada.
complejo
complejo
- Se deja actuar 1 a
- Yodo Cristal
- Yodo Cristal
Violeta
Violeta
2
- en el interior de las
- en el interior de
- minutos
clulas
las clulas
- Las clulas
- Las clulas
permanecen
permanecen
- violetas
- violetas
-

Solucin de
alcohol
Acetona.
Se deja actuar 20
Segundos

El complejo Yodo
Cristal
Violeta no sale de
las
Clulas, las que
conservan el color
violeta.

Solucin de
Safranina.
Se deja actuar 1 a
2
Minutos
-

Las clulas
conservan el
Color Violeta.

El complejo Yodo
Cristal
Violeta se separa
de las
Clulas, las que
pierden el
Color y no pueden
observarse
Las clulas
decoloradas se
Tien de rojo

Lavar, secar y observar al microscopio

IV.3. Observacin al microscopio

IV.3.1.
Fundamentos
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen
de un objeto pequeo. Mediante un sistema de lentes y fuentes de
iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los
microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el
tamao original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el
electrnico. En el microscopio ptico el aumento del objeto se consigue
usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz
entre el objeto y los ojos.
El microscopio electrnico utiliza un rayo de electrones
controlado por un
campo magntico. Los microscopios pticos
generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamao original.
El lmite lo tienen en unas 2000 veces.
Las lentes de un microscopio ptico son el colector, el objetivo
y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la
preparacin y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el
condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una
posicin que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada
cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es
producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde
se realiza el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa
estn equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo
de inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una pieza que se
llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el
condensador.
La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por
el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto
del aumento su objetivo y de su ocular. En general, los aumentos del
objetivo son 10x, 40x y 100x (objetivo de inmersin) y los del ocular 5x,
10x y 15x. Por lo tanto, si se trabaja con un ocular de 10x y un objetivo
de 100x, el aumento total ser 10 x 100 = 1000 veces el tamao

original. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos

considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola
lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se usa principalmente
como lupas y cristales de aumento.
Adems del aumento, una propiedad importante de un
microscopio es su poder resolutivo; esto es, la distancia mnima a la
que se pueden ver dos objetos separados. Viene definido por una
frmula en la que las principales variables son la longitud de onda de
la luz y la apertura numrica del objetivo, pero en la prctica, y
asumiendo la mxima calidad de las lentes, es aproximadamente la
mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa. En
microscopa de campo claro es 0,2 micras, el microscopio ptico de
efecto tnel cuntico permite superar esta barrera y aumentar la
resolucin por debajo de 0,1 micras.
Apertura numrica. Es la capacidad de recoger luz de una
lente. Para lentes secas su valor mximo es de 1, pero por las
limitaciones fsicas de la calidad de las lentes, raras veces sobrepasan
el valor de 0,95. Cuanto mayor la apertura podremos conseguir mayor
resolucin y brillo en la imagen. Si queremos usar lentes con una
apertura mayor de 1 (mximo 1,6) estas deben ser de inmersin en
aceite con el mismo ndice de refraccin que la lente.
-

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. CALDAS A. L. Gua de Microbiologa y Parasitologa bsica. Disponible en: http://

www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedlnt/Tencion_de-gram.pdf.
2. PELCZAR J., CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R. Microbiologa: Conceptos y

Aplicaciones. 1ra. ed. Mxico: McGraw Hill. INC. 1993. 755 p. ISBN: 968-451-540-5