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EXAMEN PARASITOLOGIQUE DES SELLES

INDICATIONS ET LIMITES DE LANALYSE COPROLOGIQUE


Les indications de la coprologie portent sur la mise en vidence de parasites de lappareil
digestif et de ses annexes ainsi que de parasites dont les adultes ont une localisation
vasculaire (Schistosomes) ou pulmonaire (Douve du poumon).
Les possibilits de lanalyse des selles sont limites par la biologie de certains parasites :
- Lanalyse coprologique est ngative pendant la phase dinvasion des vers
(migration larvaire) qui varie de quinze jours trois mois selon les vers.
Pendant cette priode, lorientation biologique (Eosinophilie) est un lment
prendre en considration, et on doit sorienter vers des mthodes
immunologiques permettant un diagnostic plus prcoce.
- Llimination des formes parasitaires de dissmination est variable dans le
temps, do la ncessit de rpter les analyses.
- Cas particulier du dpistage des Oxyures grce au Scotch test ; les ufs de
Taenia peuvent occasionnellement tre mis en vidence par ce prlvement.

REPETITION DES EXAMENS


Trois analyses effectues sur des selles recueillies sparment quelques jours
dintervalle, peuvent garantir une scurit satisfaisante au diagnostic . La troisime peut tre
pratique aprs ractivation par un purgatif salin (sulfate de magnsium raison de 5g par
jour, 2 3 jours de suite). Cette preuve prsente un intrt plus particulier dans les
Protozooses et dans la Strongylodose.

RENSEIGNEMENTS QUI ORIENTENT LA CONDUITE DE LEXAMEN


Il faut fournir au biologiste certains lments dorientation qui le guideront dans le
choix des techniques mettre en uvre. Ces lments sont :
- Le statut immunitaire du patient.
- Lorigine gographique du malade : A- t- il quitt la France continentale? A- t- il
sjourn en zone intertropicale?
- Signes cliniques principaux : diarrhe, prurit, douleurs abdominales, fivre.
- Eosinophilie sanguine.

RECUEIL DES SELLES


- Sabstenir de prendre des mdicaments base de charbon, de sels de baryum, de
magnsie, dhuiles purgatives, suppositoires, plusieurs jours avant denvisager lexamen.
- Eviter les aliments qui laissent beaucoup de rsidus (crudits notamment peau de
tomates, pommes de terre, petits pois, peau de pche, poires, figues), ou des graisses ( noix,
olives, cacahutes, avocats).
Trois jours avant lexamen, liminer de lalimentation les fculents, crudits, fruits et
remplacer par ptes, riz, poisson, laitages.
- Recueillir la totalit de lmission fcale dans un rcipient en plastique transparent
hermtiquement ferm, et sparment des urines. Maintenir temprature ambiante (sans
refroidissement) et faire parvenir le plus rapidement possible au laboratoire.
Proscrire une rfrigration qui dtruirait les formes vgtatives de Protozoaires et les
larves de Strongles, diminuerait la viabilit des ufs pour lesquels on envisage une
coproculture.
- En cas de diarrhe, prfrer lmission des selles au laboratoire pour un examen
dans lheure qui suit.
- Si lexamen doit tre diffr, un prlvement de glaires ou de selles liquides est
mlang un fixateur, aussitt la dfcation, afin de prserver les formes vgtatives de
Protozoaires. Deux fixateurs sont classiquement utiliss :
MIF : Merthiolate-Iode-Formol : 2,35 ml de solution M.F. seront ajouts 0,15ml
de la solution iode (et non linverse), dans les quelques secondes qui prcdent laddition
de lchantillon fcal (volume quivalent la valeur de deux pois). Bien agiter le tube
hmolyse. Le prlvement se fera ultrieurement au niveau suprieur de la couche
sdimente. La chromatine nest pas colore, la membrane nuclaire prend une teinte rouge
fonc, le cytoplasme rouge.
Solution mre stable de MF :
- Eau distille
- Teinture de merthiolate n99 0,1% Lilly
- Formol
- Glycrine
Solution iode de Lugol frachement prpare
- Iode
5g
- Iodure de potassium
10 g
- Eau distille
100 ml

250 ml
200 ml
25 ml
5 ml

APV : Alcool polyvinylique : mlanger dans un tube hmolyse 1volume de glaires


ou de selles avec 3 volumes dAPV. On peut confectionner un frottis mince qui sera
sch une nuit 37 C; ce procd permet lexpdition dune lame. Le frottis sera
soumis ultrieurement une coloration lective (Noir chlorazol, Hmatoxyline).
(Voir formule APV avec technique de coloration)

CONSEQUENCES DUN RETARD A EFFECTUER LEXAMEN


-

Destruction des formes trophozotes des Protozoaires.


Mtamorphose des larves rhabditodes de Strongles en larves
strongylodes en moins de 24 heures. Au contraire, lors dun transit
acclr, les larves de Strongles peuvent encore se trouver dans
lenveloppe de luf pas tout fait clos.
Embryonnement des ufs dAncylostoma et de Necator pouvant aller
jusqu la libration de larves quil faudra diffrencier avec celles des
Strongles. Pas dinfluence sur les autres ufs de vers ni sur les kystes de
Protozoaires.

EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LA SELLE


La consistance de la selle est un lment important qui conditionnera la prsence ou
labsence de formes parasitaires.
On doit noter la prsence dlments non parasitaires : mucus, sang, rsidus
alimentaires, lambeaux de desquamation de la muqueuse intestinale.
Il faut observer la prsence ventuelle de certains parasites :
- Nmatodes : Oxyures et Ascaris adultes.
- Cestodes : anneaux de Taenia (parfois anims de mouvements), scolex recherchs
aprs thrapeutique.
- Trmatodes : ce nest qu la suite dune thrapeutique que les Douves adultes
peuvent tre expulses.

Les Nmatodes seront lavs en eau physiologique, puis fixs au Demke :


Fixateur de Demke :
Formol commercial :
15 ml
Acide actique crist. :
5 ml
Glycrol :
10 ml
Alcool thylique 95 :
24ml
Eau distille :
46 ml
Le fixateur doit tre vers bouillant sur les vers, dans un rcipient que lon ferme ; il
doit agir au moins 2 heures.

Les Cestodes doivent tre lavs en eau physiologique puis claircis au


Chloral-lactophnol :
Chloral-lactophnol :
Hydrate de chloral cristallis
50g
Phnol
25g
Acide lactique
25g
Lclaircissement seffectue entre lame et lamelle au dessus de la veilleuse du bec
de gaz en renouvelant le ractif au fur et mesure de son vaporation.

Les Trmatodes, dabord lavs en eau physiologique devront subir ensuite un


relchement une nuit 4C dans de leau ordinaire, et seront enfin fixs par
le ractif de Demke.

Remarque : de mauvaises conditions de recueil des selles ou lingestion de certains


aliments (fromages) peuvent expliquer la prsence exceptionnelle de larves de
Brachycres.

ETALONNAGE DU MICROSCOPE
La mensuration des lments parasitaires est souvent primordiale pour leur
identification.
Matriel :
- un micromtre objet qui est une lame de verre portant en son milieu
un trait de 1 mm divis en 100 parties. La distance sparant deux traits
contigus est donc de 10 m.
- un oculaire micromtrique qui est un oculaire comportant une chelle
gradue.
Ralisation :
- Remplacer loculaire normal par loculaire micromtrique.
- Disposer sur la platine du microscope le micromtre-objet.
- Etablir la mise au point des 2 chelles et faire concider les O des
deux chelles.
- On repre une division du micromtre oculaire qui se superpose
exactement une division du micromtre-objet (ces deux divisions
doivent tre recherches le plus loin possible du O , de faon obtenir
une meilleure prcision). On peut ainsi en dduire la longueur de chaque
division du micromtre oculaire.

Micromtre objet

Micromtre oculaire

Exemple : 18 divisions du micromtre oculaire couvrent 300 m


1 division couvre donc 16,66 m
-

Lopration doit tre effectue pour les deux objectifs x10 et x 40.

Mesure :
Llment mesurer tant au point, il suffit de dterminer le nombre de
divisions du micromtre oculaire quil couvre pour obtenir sa taille.

TECHNIQUES DE ROUTINE

EXAMEN MICROSCOPIQUE A LETAT FRAIS : EXAMEN DIRECT

Ses conditions diffrent selon la nature et la consistance du prlvement, par suite de


la prsence ventuelle dans les glaires et les selles liquides, de formes vgtatives de
Protozoaires dont la fragilit impose des prcautions particulires.

1 Glaires muqueuses ou muco-sanguinolentes


Recherche de formes vgtatives damibes, doeufs de Schistosomes.
Lanalyse doit tre faite immdiatement aprs lmission, ou ventuellement
recueillir les glaires dans un petit rcipient ferm hermtiquement et maintenu la
temprature du laboratoire.
Utiliser de prfrence, une platine chauffante 37 C.
A laide dun ensemenceur, prlever un fragment de glaire que lon examinera entre
lame et lamelle. Reprer les formes vgtatives grce leur mouvement, noter
lhmatophagie.
Lidentification des formes vgtatives peut tre facilite par une coloration au VF
ou au Lugol.
Coloration au VF : Violet cristal Fuchsine basique
- Violet Cristal
50 mg
- Fuchsine basique
10 mg
- Ethanol 95
20 ml
- Phnol cristallis fondu
4 ml
Aprs dissolution, ajouter qsp 100 ml deau distille .
Une petite goutte de colorant est mlange au prlvement avec le coin
dune lamelle ; les structures nuclaires apparaissent fonces, le
cytoplasme rose.
Coloration au Lugol 1%
- Iode
1g
- Iodure de potassium
2g
- Eau distille
100 ml
Dissoudre liodure de potassium dans le plus petit volume deau. Ajouter
lentement les cristaux diode jusqu dissolution. Ajouter le reste deau. Filtrer.
La chromatine ressort par contraste sur le cytoplasme beige clair.

2 Selles liquides ou en bouse


Recherche de formes vgtatives et de kystes de Protozoaires, Coccidies,
Microsporidies, oeufs et larves dHelminthes.
Mmes prcautions que prcdemment concernant les formes vgtatives.
Cest le moyen le plus efficace pour diagnostiquer les trophozotes de flagells.
La consistance des selles ncessite de dlayer la parcelle de matire fcale, prleve
laide dune anse mtallique, avec une goutte deau physiologique.

3 Selles moules
Recherche de kystes de Protozoaires, doeufs et larves dHelminthes.
Lexamen direct sera effectu paralllement la dilution avec le ractif de
concentration Acto-Actique.
Cas particulier dune suspicion de Bilharziose : effectuer un examen direct dune
dilution du produit de raclage de la surface des selles.

EXAMEN MICROSCOPIQUE
dune ou deux techniques de CONCENTRATION STANDARD

La mthode de BAILENGER est une technique simple, rapide et efficace pour la


mise en vidence du plus grand nombre de parasites. Les techniques de flottation
constituent, par leurs indications, un complment de trs grande valeur.
1 Mthodes Diphasiques
Technique de BAILENGER : Ractif Acto Actique pH 5 / Ether
Principe : la mise en prsence de 2 phases non miscibles, lune aqueuse, lautre
lipophile, permet la ralisation dun coefficient de partage dont la valeur est conditionne
pour chaque particule fcale par sa balance hydrophile / lipophile. Les parasites se
concentrent dans le sdiment. On couple lexamen direct cette technique de concentration
dans le cas dune selle moule.
Ractif Acto-Actique :
- Actate de Na
15g
- Acide actique
3,6 ml
- Eau distille
1 litre
Ajuster, si ncessaire, pH 5 avec Acide actique.
Technique : (illustration pages suivantes)
- Triturer dans un verre pied, avec un agitateur, une partie de matires fcales ( 2
5 g), prleves en diffrentes zones, dans 5 10 parties (selon la consistance fcale) de
ractif Acto Actique. Effectuer une dilution homogne en ajoutant le ractif dautant
plus lentement que la selle est dure.
- Effectuer un premier prlvement (1 goutte entre lame et lamelle) en dbut de
dilution pour procder un examen direct. Maintenir en chambre humide jusqu la
lecture. Cette tape est surtout utile pour dceler les oeufs dAscaris qui se concentrent
mal.
- Poursuivre la dilution.
- Laisser sdimenter pendant 10 30 secondes pour liminer les gros dbris.
- Dcanter dans un tube centrifuger (environ moiti du tube), et ajouter
sensiblement le mme volume dEther (ou lgrement moins) en laissant une collerette
denviron 1 cm.
- Emulsionner parfaitement en oblitrant lorifice du tube avec le pouce et en
agitant vivement. Dgazer.

- Centrifuger 3 mn 2500 trs/min. 4 couches se superposent.


Phase thre
Dbris
Phase aqueuse
Culot denrichissement : PARASITES
- Eliminer dun geste sec les 2 phases liquides et lanneau de dbris aprs avoir
dcoll ce dernier des parois du tube avec les mors dune pince. Remettre rapidement le
tube en position horizontale, passer un tampon de coton sur les parois internes du tube pour
se dbarrasser de toute trace de dbris.
- Prlever 1 goutte de culot avec une pipette Pasteur aprs avoir remis en
suspension les parasites en agitant le tube. Examiner entre lame et lamelle.
La mise en vidence des structures nuclaires des kystes damibes peut tre facilite par une
coloration au VF ou au Lugol.
Indications :

ufs dhelminthes
Kystes de Protozoaires
Cryptosporidies

2 - Mthodes par Flottation

Technique de JANECKSO modifie :Ractif Iodomercurique (densit 1,440)

Ractif Iodomercurique :
- Iodure de potassium
53 g
- Iodure mercurique (Biiodure de mercure)
10 g
- Eau distille
100 ml
Faire dissoudre liodure de potassium dans le plus faible volume deau ; ajouter le
biiodure de mercure peu peu tout en agitant ; complter 100 ml.
Linconvnient est laction caustique, allergique et polluante du ractif mercuriel.

Technique de FAUST : Solution aqueuse de Sulfate de Zinc (densit 1,180)

Solution aqueuse de Sulfate de Zinc : solution sature 33 % environ.

Technique au NaCl (densit 1,2 pH 2)


Ractif : solution sature de chlorure de sodium pH 2
- Acide chlohrydrique N
47,7 ml
- Eau distille
952,3 ml
- Glycocolle
7,0 g
- Chlorure de sodium
saturation

Principe : effectuer une dilution fcale avec un liquide plus dense que les lments
parasitaires qui surnagent et se concentrent dans le film superficiel. Une prdilution en eau
distille est prconise pour le JANECKSO et le FAUST. Pour la technique au NaCl, cette
tape est inutile.
Technique : (illustration pages suivantes)
- Triturer dans un verre pied, avec un agitateur, 5g de selles prleves en
diffrentes zones. Diluer progressivement avec de leau distille selon la consistance
de la selle (au 1/10 en moyenne).
- Tamiser sur un tamis mtallique, et remplir un tube centrifuger.
- Centrifuger 2 3 mn 3000 trs/min. Eliminer la phase aqueuse.
- La technique de FAUST impose des centrifugations multiples (3 4jusqu
ce que le liquide surnageant soit clair.
- Diluer trs soigneusement le culot avec le Ractif Iodomercurique ou la
Solution de Sulfate de Zinc ajout progressivement au dbut, puis en quantit
suffisante pour remplir le tube jusqu cm du bord.
- Centrifuger 2 min 2000 trs/min.
- Prlever, aussitt aprs centrifugation, avec une anse mtallique plusieurs
gouttes du film superficiel et les dposer sur une lame.

Mthodes par flottation (suite)


Indications : oeufs dAnkylostomes (d : 1,055), Ascaris fertiles (d : 1,110), Taenia,
Schistosomes et Douves sont souvent altrs.
Contre-indications : selles riches en lipides
Oeufs dAscaris infertiles (d : 1,200)
Larves dHelminthes
Kystes de Protozoaires

EXAMEN DUNE PREPARATION MICROSCOPIQUE


Recherche et identification doeufs dHelminthes et de kystes de Protozoaires
Une goutte de la prparation examiner est porte sur une lame porte-objet et
recouverte dune lamelle 20 x 20 ou 18 x 18. Elle doit tre suffisamment mince et
uniformment claire pour tre facilement et entirement lisible.
On effectue un examen systmatique de la prparation selon le schma suivant :

1 - On parcourt la lamelle lobjectif x 10, ce qui permet de reprer les lments


parasitaires; chaque lment intressant est plac au centre du champ puis observ et
mesur lobjectif x 40.
Ceci permet : - lidentification des oeufs dHelminthes.
- de noter la forme et la taille des kystes de Protozoaires.
La lecture de toute la prparation se poursuit ainsi lobjectif x 10.
2 - Lidentification des kystes de Protozoaires seffectue ensuite lobjectif x
100 immersion. Pour cela on repre dabord lobjectif x 10 un des kystes prcdemment
observ, puis aprs lavoir parfaitement centr et avoir dpos une goutte dhuile
immersion sur la lamelle, on lidentifie au grossissement x 1000 ( le passage lobjectif x
40 nest alors plus possible).
3 - En cas de difficult quant lobservation des structures nuclaires des kystes
de Protozoaires, il est possible de faciliter lidentification par coloration. Nous conseillons
la technique Violet cristal-Fuchsine basique : dposer une goutte du culot denrichissement
Acto Actique sur une lame ainsi quune petite goutte de ractif VF et mlanger avec le
coin dune lamelle; recouvrir de la lamelle et examiner lobjectif immersion.
Le Lugol 2% peut galement tre utilis.

TECHNIQUES SPECIALES
NUMERATION DES UFS
Cette technique permet dapprcier lintensit dune infestation (Ankylostomes), de
juger de lefficacit dune thrapeutique.
1 Frottis pais de KATO et MIURA
Principe : Cest une technique de dcoloration des selles qui permet de distinguer
les ufs de parasites dans une prparation des selles rendue translucide.
Ractif et matriel : Solution de glycrine-vert malachite
- Glycrine
100 ml
- Eau distille
100 ml
- Solution de vert malachite 3 %
1 ml
Bandes de cellophane adhsive de 20 x 30 mm immerges dans la solution
de glycrine pendant 24 heures.
Technique: Sur une lame porte-objet, dposer 50 mg de selles, recouvrir par une des
bandes de cellophane imprgne, presser laide dun bouchon de caoutchouc pour rpartir
rgulirement la selle; laisser claircir une heure temprature ambiante. Examiner
rapidement car un sur-claircissement risquerait de faire passer inaperu certains ufs
(Ankylostomes, Schistosomes).
Les rsultats sont rendus en nombre dufs par gramme de selles.
2 Mthode de GORDON et WHITLOCK
Principe : Diluer les selles avec une solution dense que lon met flotter dans une
cellule numration de Mac Master.
Ractifs et matriel :
- Solution de sulfate de zinc 33 % (ractif de Faust )
- Solution diodomercurate de potassium (ractif de Janeckso et Urbanyi)
La cellule de Mac Master est constitue de 2 lames de verre distantes de 1,5 mm; sur la
lame suprieure est dlimite une surface de 1 cm correspondant un volume de 0,15 ml
et divise en six bandes.
Technique: Dans un verre pied et laide dun agitateur, dlayer 2 g de selles avec
30 ml de ractif. Eliminer les dbris volumineux par passage sur un tamis mtallique. Aprs
agitation, introduire la dilution dans la cellule : attendre 5 mn pour permettre aux ufs de
monter et de sappliquer contre la lame suprieure gradue, au niveau de laquelle on
effectue la mise au point avec lobjectif x 10.
Pour exprimer les rsultats en nombre dlments par gramme de selles, multiplier par 100
le nombre dufs trouvs (volume 0,15 ; dilution au 1/15).

Mthode de BAERMANN et LEE


Mthode biologique de concentration des larves de Strongles
Quand la mettre en uvre ?
Mme si elle na pas t prescrite par le clinicien, cette technique doit tre mise en
route lorsque les renseignements cliniques, pidmiologiques ou biologiques (examen de
selle ngatif ou cristaux de Charcot-Leyden, sjour en zone dendmie, hyperosinophilie
sanguine, prurit) font suspecter une anguillulose.
Principe : On met profit lhygrotropisme et le thermotropisme des larves.
Matriel :

Selle
Tamis
ssssss + gaze
Entonnoir
Eau
Raccord caoutchouc
Pince

Pipette
Technique :
- Disposer une gaze sur le fond dun tamis mtallique plac dans un entonnoir.
La tubulure de lentonnoir porte un tube de caoutchouc susceptible dtre ferm par une
pince et ajust, par son extrmit libre, une pipette Pasteur.
- La pince tant ouverte, verser de leau tide jusqu la partie infrieure
du tamis. Les larves se collectent dans la pipette en deux trois heures.
- Par manipulation de la pince, on soutire 5 10 ml de liquide que lon centrifuge
lentement mais longtemps pour conserver aux larves leur mobilit. Le culot est examin
entre lame et lamelle.

Variante : Mthode de BAERMANN et BRUG


Le tamis garni de gaze et contenant la selle est dpos sur un verre pied contenant
de leau tide, de telle sorte que le niveau de leau atteigne celui des selles. Au bout de 2
heures, le liquide est prlev doucement par aspiration laide dune pipette Pasteur relie
une trompe vide. La dcantation est interrompue lorsquil ne reste que quelques millilitres
deau dans lesquels lexamen la loupe binoculaire permet lobservation des larves.

CULTURE DES VERS


Quand la mettre en uvre ?
Dans le cadre dune suspicion dAnkylostomose ou de Strongylodose, si les
techniques de concentration nont pas donn de rsultats, une mise en culture partir dune
quantit plus importante de selles peut apporter un rsultat positif.
Principe :
Ces vers sont capables de subir une volution dans le milieu extrieur
Pour les Ankylostomes, lvolution sous forme de larve permet de
diffrencier les genres Ancylostoma et Necator.
Pour les Strongles, la culture permet de multiplier le nombre dlments
parasitaires pour en favoriser lidentification.
Technique :
Les selles analyses doivent tre maintenues temprature du laboratoire
entre le moment de la dfcation et celui de la mise en culture : une temprature de 37 C
ainsi que le froid altre la viabilit des larves. Dans tous les cas les selles doivent tre
manipules dans les plus brefs dlais.
Nous prconisons la technique en bote de Ptri sur bande de papier filtre;
son avantage est de pouvoir effectuer un prlvement quotidien pour surveiller lvolution.
- Appliquer ensemble deux ou trois lames et les entourer, sur plusieurs
paisseurs, dune bande de papier filtre plus troite que la longueur des lames.
- Etaler la selle en film mince sur un ct en laissant une petite marge.
- Humidifier avec de leau distille de faon former une petite rigole
autour de la lame.
- Porter 25 - 28 C. Humidifier avec de leau distille tide tous les
jours si ncessaire.
- Prlvement : il seffectue sous la loupe la pipette Pasteur aprs avoir
ajout quelques gouttes deau distille avant la lecture car les larves ont tendance se
dissimuler sous les lames. Chaque goutte prleve sera dpose sur une lame et additionne
dune goutte de Formol 5 % pour tuer les larves.

Selles

Eau

Lames + Papier

CULTURE DAMIBES

Quand la mettre en uvre ?


En pratique on ne la met en uvre que lorsque les examens microscopiques ont t
ngatifs et lorsque cliniquement lamibiase est le diagnostic le plus vraisemblable.
Elle peut rendre service lorsque lidentification imprcise est gne par un nombre
rduit de trophozotes. La culture en accrot le nombre.

Mise en culture sur milieu diphasique :


Support de srum de cheval coagul sur lequel on tale le prlvement fcal avec
un agitateur; ajouter une ampoule de srum de Ringer pour Protozoaires. Bien visser les
tubes. Multiplication en 24 48 heures 37C. Prlever au niveau de lamidon de riz sans
remettre en suspension.

Etalement
de selles
Srum de
cheval

Srum de
Ringer
Prlvement

COLORATIONS ELECTIVES DES FORMES VEGETATIVES DE


PROTOZOAIRES
Quand les mettre en uvre ?
Soit lors de la recherche extemporane sur selles non moules ou glaires
muco-sanguinolentes.
Soit aprs cultures damibes.
1 Le MIF qui associe fixation et coloration en tube hmolyse est la coloration la
plus simple et la plus rapide. Elle donne dexcellents rsultats pour les amibes, mais le MIF
est un moins bon colorant des flagells.
2 Le Noir Chlorazol (mthode de Kohn) assure, sur frottis humide de la selle, la
fixation et la coloration en 4 heures temprature ambiante.
Ractifs : Alginate de Na
- Alginate de Na basse viscosit
2g
- NaCl
0,6g
- Eau distille
100 ml
Noir Chlorazol 0,5g dissoudre dans
- Alcool thylique 90
17 ml
- Alcool mthylique
16 ml
- Acide actique
2 ml
- Phnol cristallis fondu
2 ml
- Acide Phosphotungstique 1%
1,2 ml
- Eau distille
qsp
100 ml
Laisser mrir la lumire plusieurs semaines.
Technique :
- Sur une lame, mlanger 1goutte de prlvement fcal + 1goutte Alginate de Na
(amliore ladhrence). Etaler.
- Dans une bote de Ptri contenant du Noir Chlorazol et munie dun chevalet,
retourner la lame (le colorant doit affleurer la lame retourne). Incuber 4 heures
temprature ambiante.

Rincer dlicatement leau du robinet.


Dshydrater 1 minute par alcool (70, 80, 90, 95).
puis alcool absolu et xylne ( 1 min).
Montage lEukitt ou au Depex.

3 La coloration lHmatoxyline ferrique ( mthode de Goldman) seffectue sur


frottis sec, ou sur frottis humide.
Fixation
Frottis sec:1 gtte prlvement fcal + 3 gttes solution APV (ractif 4); taler;1 nuit 37 C.
Frottis humide :1gtte prlvement fcal +1 gtte Alginate de Na ; taler ; retourner
immdiatement la lame dans une boite de Ptri contenant le Schaudinn actique (ractif
2) prchauff 56 C, il doit affleurer la lame retourne. Mettre 56C pendant 10min.
Ractif 1 : Sublim : solution aqueuse de HgCl2 saturation (dissoudre chaud
10% du sel puis refroidir)
Ractif 2 : Fixateur de Schaudinn actique
2 volumes de Sublim
1 volume Ethanol 95
Au moment de lemploi, ajouter 5% dacide actique cristallisable.
Ractif 3 : Schaudinn actique - Glycrol
98,5 ml Schaudinn actique
1,5 ml Glycrol
Ractif 4 : Solution dAPV :
100 ml de Schaudinn actique-Glycrol
5g dAPV (90-50 basse viscosit liquide).
Porter 75 C au Bain Marie sous agitation.
Aprs fixation (frottis sec ou humide), passer successivement dans les bains suivants :
Alcool iod 70 5 min
Alcool 50 2 fois 5 min
Rincer 15 min sous un filet deau du robinet.
Coloration lHmatoxyline ferrique
Ractif de Goldman :
Solution 1 : Hmatoxyline 1% dans Ethanol 95
Solution 2 : Sulfate dammonium ferrique 20g
Acide actique
5 ml
Acide sulfurique
0,6 ml
Eau distille
500 ml
Mlanger au moment et volumes gaux les solutions 1 et 2; filtrer.
Diluer ce mlange dans un volume gal dAcide phosphotungstique 0,5 %.
Technique :
- Immerger dans le ractif de Goldman 10 min les frottis secs
5 min les frottis humides fixs
- Passer les lames dans 2 borrels avec Acide phosphotungstique 2% :
Borrel 1 : 2 3 immersions
Borrel 2 : 15 min pour frottis sec
10 min pour frottis humide
- Rincer 15 min sous un filet deau du robinet .
- Dshydrater 1 minute par alcool (70,80,90, 95).
puis alcool absolu et xylne ( 1 min).
- Montage lEukitt ou Depex.

COLORATION DES CRYPTOSPORIDIES


Techniques de coloration temporaire des Cryptosporidies
(nayant quune valeur dorientation)
1 Lugol 2 %
Mlanger 1 goutte de selle liquide + 1 grosse goutte de Lugol 2 %
Lecture dans les 5 min lobjectif X 40 : Cryptosporidies rfringentes
Levures jaune brun
2 Vert Malachite 5 %
Mlanger 1 goutte de selle liquide + 1 petite goutte de Vert malachite
Lecture dans les 5 min lobjectif X 40 : Cryptosporidies rfringentes
Levures vertes
Technique de coloration permanente dHenriksen et Pohlenz
La recherche de Cryptosporidies doit seffectuer devant toute diarrhe persistante
chez un immunodprim.
Ce protozoaire a pu galement tre incrimin comme cause dpidmies rgressant
en quelques jours dans les crches et coles maternelles chez des enfants
immunocomptents.
Ractif : Fuchsine phnique : 10ml solution A + 90ml solution B
Solution A : Fuchsine de Ziehl
- Fuchsine basique
15 g
- Ethanol 95
100 ml
Solution B : Eau phnique
- Cristaux de Phnol
- Eau distille

5g
100 ml

Technique :
- Faire scher sur une lame 1 goutte de selle liquide ou de culot de concentration.
- Fixer au Mthanol
5 min
- Scher
- Colorer par la Fuchsine phnique
1 heure
- Rincer leau du robinet
- Diffrencier par H2SO4 2%
10 20 secondes
- Rincer leau du robinet
- Contre-colorer par une solution de Vert Malachite 5 % :
Sur un cristallisoir, laisser un peu deau du robinet sur la lame et ajouter
quelques gouttes de Vert Malachite ; homogniser.
- Rincer leau du robinet. Scher.
Lecture lobjectif X 100 immersion : la contre-coloration permettra de
diffrencier les levures qui se colorent en vert alors que les Cryptosporidies (3 5 m)
prennent une teinte qui varie du rose ple au rouge vermillon, faisant apparatre quatre
sporozotes en forme de croissant autour dune zone claire plutt centrale.

COLORATION DES MICROSPORIDIES


par la technique de Weber modifie
Les microsporidies sont trouves chez 10 15 % des patients VIH positifs et atteints
de diarrhe; dans 80 % des cas Enterocytozoon bieneusi est en cause.
Ractif de Weber : Mlanger les colorants et lacide :
- Chromotrope 2R
6g
- Vert rapide
0,15 g
- Acide phosphotungstique
3 ml
Attendre 30 mn et ajouter 100 ml deau distille.
Technique :
- Raliser un frottis trs mince sur 1 cm avec 10 l de selle liquide.
- Scher.
- Fixer au Mthanol.
5 min
- Scher.
- Colorer au Weber.
90 min
- Dcolorer dans un bain comprenant :
10 secondes
Alcool 90 995,5 ml
Acide actique 4,5 ml
- Rincer rapidement dans de lAlcool 90.
- Dshydrater successivement 1 min : Alcool 95, Alcool absolu, Xylne.
- Montage au Depex.
Lecture lobjectif X 100 immersion : la coloration des Microsporidies (2 m)
semble souvent renforce lquateur avec un aspect asymtrique de la spore d la
vacuole polaire.

SCOTCH TEST
Mthode de Graham ou des lames adhsives
Les ufs dOxyures sont rarement retrouvs lors de lexamen parasitologique des
selles sauf en cas dhyperinfestation. Ils se situent sur la marge anale o ils sont librs par
le ver femelle en gnral le soir (prurit vespral). Un interrogatoire mdical soigneux
permet souvent de faire le diagnostic doxyurose mais en cas de doute cette recherche est
demande.
Prlvement : le matin, avant la dfcation et la toilette, appliquer le ct adhsif de
la lame sur les bords de la marge anale. Rabattre la bandelette protectrice sa place initiale
cest--dire sur lenduit adhsif qui a permis le prlvement.
Examen microscopique : les ufs sont reprs par leur rfringence lobjectif
X 10 et confirms lobjectif X 40.
Cette technique permet aussi de retrouver parfois des embryophores de Taenia sp.

TECHNIQUE DIDENTIFICATION DES UFS DE SCHISTOSOMES


sur produit de raclage rectal ou biopsie rectale
effectus sous rectoscopie

Coloration la Fuchsine phnique :


La coque des ufs se colore en rouge.
Dcoloration lAlcool chlorhydrique :
Seuls les ufs de Schistosoma haematobium se dcolorent.
La coque des autres espces portent une substance alcoolo-acido rsistante.
Contre coloration au Bleu de Mthyle :
La coque des ufs de Schistosoma haematobium se teinte en bleu outremer .