Seminario de Espectrometra

de masas para usuarios del

SUIC

La espectrometra de masas es una tcnica

analtica muy potente usada para:

Identificar compuestos desconocidos.
 Cuantificar materiales conocidos.
 Elucidar la estructura qumica de las
molculas.


Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Diagrama de un Espectrmetro de
Masas
Sistema en Vaco

Fuente
de Iones

Analizador

Detector
de Iones

Sistema
de Datos

Inyector
Introduccin de la
Muestra:
GC/MS - LC/MS - Directa
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Espectro de
Masas

Aplicabilidad Relativa de las Tcnicas

de Ionizacin en LC/MS
API-Electrospray (LC y CE):
La tcnica de ionizacin ms suave.
Ideal tambin para compuestos lbiles.
Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.
Vlida para compuestos de baja-media a muy

100,000

Peso Molecular

API-Electrospray
10,000

1000

alta polaridad que se puedan ionizar en solucin.

Mediante la formacin de iones con mltiples
cargas, permite el anlisis de compuestos de muy
elevado peso molecular.

APPI

APCI
GC/MS

no polar

Thermospray
Particle
Beam

Polaridad del analito/

Solubilidad en Agua

FAB

APCI (LC):
Vlida para compuestos de baja a alta polaridad;

no se requiere que estn ionizados en solucin.

Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
Buena sensibilidad para compuestos de polaridad
y peso molecular intermedios.
Tcnica que complementa a API - Electrospray
muy polar para el anlisis de analitos poco polares.

APPI (LC y CE):

Las interfases LC/MS tipo A.P.I.: Vlida para compuestos de muy baja a alta polaridad;
no requiere que estn ionizados en solucin.
Electrospray /APCI
Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
son hoy en da las ms utilizadas Posibilita el anlisis de compuestos apolares.
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Proceso de Ionizacin por Impacto

Electrnico (EI)
Ionizacin:
ABC + e -

+
ABC

Molcula
Neutra

In Molecular
Excitado

Fragmentacin:
.
+

ABC

In Molecular
Excitado

+ 2e

AB + C
.
+
A + + BC
AB . + C
AC + + B
etc.

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

ABC+

La curva
depende
del producto (ABC)

70

10

100 eV

Energa de los
electrones

Espectro de Masas +
+
AB

ABC+ .

+
A

.
m/z

A+
C

Detalle de la Ionizacin por Impacto

Electrnico
FILAMENT
O

"MAGNET" (imn)
FILAMENTO

e e e e e e ee
e e e e e eee e e
ee e e
e
e e
ee ee
e
e
e
ee

ENTRADA M M M
M
DE
M MM
MUESTRA

.
M+

M
M

.
M+

M M

M M

M
M

M
M

+.
M

M
M
M
M
M

.
M+

M
M

.
M+

"MAGNET"
(imn)

REPELLER

M+ .

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

"REPELLER"

ee e
e ee e
ee

.
F+
1
.
F
2

Detector de Iones: Electromultiplicador

Dnodo de alta
energa (HED)

Iones
positivos

 HED: Aumenta la vida del

Cuadrupolo

Iris

Focalizacin
de iones

Electrones

electromultiplicador en 2 3
veces puesto que a ste le
llegan electrones en vez de
iones y le permite ms bajos
voltajes de trabajo, adems
mejora la sensibilidad de todo
el sistema.

Multiplicador
de electrones
 Los electromultiplicadores (EM) son capaces de aumentar la corriente por un factor de
1,000,000 pero el rango de trabajo tpico es de 100,000.
 El tamao de la seal (y ruido) es funcin del voltaje del EM, cuanto mayor es el voltaje

mayor es la seal. La relacin NO es lineal en lo que respecta al voltaje o m/z.

 El EM tiene un tiempo de vida finito. Este tiempo de vida es funcin de la corriente de

salida, cuanto mayor es sta, menor es el tiempo de vida del EM.

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Tpico Espectro de Masas

: C12H26 (M=170)

Dodecano

Abundanc
e

dodecane

57

100
90

<--[C H ] + (pico base)

4 9

80
70

71
43

60

<--[C

50
85

40

<--[C H ] +
6 13

30
20
10
m/z->
20

H ]+
5 11

(In
M.+ molecular

55

29

98
40

60

80

100

113

128 141
120
140

170
159
160

In Molecular (M +): prdida de un electrn

Pico Base: in ms abundante del espectro
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

180

Sintonizado MS con PFTBA

Espectro Perfluorotributilamina (PFTBA: C12F27N PM:671)
Scan: 10.00 - 650.00

69

100

F3 C - F2C - F2C - F2
C

..
N
CF3

219

CF2 - CF2 - CF2 -

F3 C - F2C - F2C - F2
C

50
131

264

502

414

614

0
50

100

150

200

Mass Abund

300

350

400

450

500

Rel Abund Iso Mass Iso Abund Iso Ratio

69.00 1974784

100.00

70.00

20344

1.03

219.00 1161216

58.80

219.95

45968

3.96

502.00

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

250

56648

2.87

503.00

5690

10.04

550

600

650

Vial/Electrovlvula
para introduccin
vapores de solucin
de sintonizado:
PFBTA

Informe Sintonizado
Automtico

Aspectos a
controlar
Anchos de pico de masa consistentes
Perfiles simtricos de los picos de masa

El chequeo automtico que

se obtiene despus del
sintonizado revisa todos
estos aspectos a controlar

Apropiado voltaje del EM

Adecuada abundancia absoluta

Bajo background
Bajo contenido en agua y aire (<20 / <10%)
Asignacin correcta de masas
Tpica abundancia relativa
Adecuada relacin de istopos

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Iones tpicos procedentes de

contaminacin y background

15,

, 68, 69, 76, 77

94, 168, 170, 186, 262, 278, 354, 446

DIFFUSION PUMP OIL

Para reducir background (H2O,N2,O2,..) es til empezar los brridos desde masa 29 o 33

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Modalidades de Ionizacin: Impacto

Electrnico (EI)
Qu es un Espectro EI clsico?
+

Metil estearato (C19 H 38 O 2 ) M = 298

In (M+1)+ = 299
Contribucin isotpica del carbono:
C19 x 1.1% de C13
= 20.9%
Contribucin isotpica del deuterio:
= 0.6%
H38 x 0.015% de D

Contribucin isotpica total

(M+1)+ = 21.5%
de la abundancia de M

= 21.5%

Los espectros clsicos de EI deben

proporcionar picos isotpicos con
298 299
relaciones respecto al ion molecular muy
21,5%
cercanas a los valores tericos. n atomos C ~
1,1

Ayudas en la interpretacin de espectros

M = impar indica la presencia de un n impar de tomos de N
M = par indica la ausencia o presencia de un n par de tomos de N
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

~ 19,5

Modalidades de Ionizacin en GC/MS

Impacto Electrnico (EI)
Es con diferencia la modalidad
ms utilizada. Es la empleada
para bsquedas en Bibliotecas
genricas de espectros

L-Amfetamina (PM 135)

EI (70 eV)

L-Amfetamina (PM 135)

Ionizacin Qumica Positiva

Ionizacin Qumica Negativa

NCI es la ms selectiva y sensible
EI: tcnica de ionizacin muy ENERGTICA.
FRAGMENTA LA MOLCULA y en ocasiones el in
molecular apenas se detecta
CI/NCI: tcnica de ionizacin muy SUAVE. Apenas
Fragmenta la molcula y el IN MOLECULAR
SUELE SER EL PICO BASE
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

135

M+1

PCI con Amoniaco

Diazepam (PM 284)

NCI con Metano

Ionizacin Qumica
Forma iones a partir del gas reactivo por bombardeo con electrones.
Los iones del gas reactivo sufren reacciones con molculas de la muestra
producindose iones de la misma
La ionizacin qumica (CI) es mucho ms suave que la ionizacin por
impacto electrnico (EI), por lo que se produce menos fragmentacin.
El gas reactivo ms comn es el metano, que produce iones con
prcticamente cualquier molcula de muestra.
Otros gases reactivos (isobutano, amoniaco) son ms selectivos y
producen incluso menos fragmentacin.
Es una tcnica que en modo negativo da muy alta sensibilidad.
Es el mtodo ms frecuentemente utilizado para determinar pesos
moleculares de compuestos.
Con metano se forma: M+1, M+29; M+43. Muy til para asegurar M.
Con amonaco se suele formar el M+1 y el M+18. Es muy selectivo
(aminas).
Con isobutano slo suele obtenerse el M+1.

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Amfetamina por EI y PCI (con Metano y Amoniaco)

44

91

n N impar => PM impar

NH2

44

91

135

M+1
91

MH+: m/z = 136

136+28=164

NH2

44

MH+:

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

119+28=147
119+40=159

m/z = 136

136+40=176

M+29 M+41

M+1

Voltaje de Ionizacin Variable (5-240 eV)

Beneficios:

Scan 619 (7.531 min.): 2.D (-)

Abundance

394

7000


71
6000
Los voltajes pequeos proporcionan una menor
fragmentacin general y por otro lado incrementan el 5000
4000
ion molecular en relacin a la ionizacin estndar a 3000
70eV
2000
1000
Los voltajes pequeos proporcionan ionizacin
0
m/z--> 60
selectiva [ej..: aromticos en alcanos]
Abundance57
Los voltajes altos con CI son tambin posibles y
11000
proporcionan una mayor sensibilidad
10000

12 eV
99
127

100

169

140

210
225

180

220

337
365

260

300

340

380

Scan 617 (7.515 min.):

GLUC.D (-)

C28H58

9000
8000

70 eV

85

7000

309
253

6000

La reduccin del eV facilita la

localizacin del in molecular

5000
4000
3000
113

2000

141

1000
0
m/z-->

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

60

100

140

168 183
180

211
220

238

268
260

295
300

337
340

394

365
380

Modos Adquisicin en GC/MS:

modo SCAN
Modo SCAN: consiste en hacer barridos entre dos masas para tener una
informacin total del contenido de la muestra a analizar. Es el modo a
emplear en anlisis cualitativo para la identificacin de compuestos por
bsqueda en biblioteca de espectros. Tambin puede utilizarse para
anlisis cuantitativos.
 En modo SCAN el MSD es un detector universal con una

Rango de
Brrido (SCAN)
Abundance

Scan 554 (5.086 min): 3PAT_1SC.D

64

1000000
900000
800000
700000
600000

48

500000
400000
300000
200000

32

100000
28

20

25

34

30

35

66

50
39 41

40

44

45

52

50

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

68

55

60

65

70

75

m/z

sensibilidad media cuando se trabaja con el TIC , y muy

selectivo y con buena sensibilidad cuando se trabaja con
iones extrados EIC (Extracted Ion Chromatogram).
 TIC (Total Ion Chromatogram): cromatograma correspondiente
a la suma de abundancias a todas las masas adquiridas.
 EIC (Extracted Ion Chromatogram): cromatograma
correspondiente a una determinada masa (extrada del
brrido).
 La sensibilidad se incrementa con la reduccin del rango de
masas seleccionado.

Modos Adquisicin en
GC/MS: modo SIM
Modo SIM: consiste en una monitorizacin selectiva de iones
caratersticos de los compuestos presentes en la muestra. En modo
SIM el MSD es un detector muy sensible y muy selectivo. Es el modo
a emplear para anlisis cuantitativo de trazas de compuestos conocidos.
Monitorizacin
Selectiva de
Iones (SIM)

Abundance

 La comparacin de las respuestas relativas de los distintos

iones (cualificadores), con respecto a las del patrn permite
confirmar la identificacin del compuesto cuantificado.
 La sensibilidad se incrementa con la reduccin del n de
masas seleccionado y la selectividad con el aumento de la masa
64 SO
monitorizada.
 La gran selectividad del MSD permite poder llegar a cuantificar
compuestos que se coeluyan.
48 SO
 La modalidad SIM con cuadrupolo proporciona, especialmente a
S
32
nivel de trazas, una mejor reproducibilidad cuantitativa que el
modo SCAN, no obstante ste (scan) admite mayores
Se efecta mediante una
concentraciones de analito.
programacin en el tiempo
 En modo SIM el TIC es el cromatograma correspondiente a la
de grupos de los iones a
suma de abundancias de todas las masas adquiridas.
adquirir
2

Scan 554 (5.086 min): 3PAT_1SC.D

1000000

900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000

m/z-->

28

20

25

30

34
35

39 41
40

44
45

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

50

50

66

68

52

55

60

65

70

75

Adquisicin SCAN versus SIM

25 pg de 3 sulfamidas (+250 pg de sulfaclorpiridazina) - CUADRUPOLO
Adquisicin SCAN:
3.925

MSD1 TIC, Scan

120000
100000
80000

250 pg de compuesto INESPERADO

Proporciona informacin sobre

componentes inesperados de la
muestra, pero NO proporciona el
mismo nivel de sensibilidad que
el modo SIM
La sensibilidad
mejorar en SCAN con la
reduccin del rango de
masas seleccionado y en
SIM con la reduccin del
n de iones monitorizado

60000
40000

Adquisicin SIM:

MSD2 TIC, SIM

3.156

30000
25000

15000

2.955

20000

Proporciona un nivel muy

elevado de sensibilidad, pero
NO da informacin sobre
componentes inesperados de
la muestra.

6.914

20000

10000
5000

25 pg

25 pg25 pg
3

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

7 min

En Muestras Complejas 1 Pico (TIC) Suele Estar

Formado por Varios Compuestos No Resueltos
TIC (Total: suma de los 3)
Componente 1
Componente 2
Componente 3

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Deconvoluciona y Extrae los Compuestos

Individuales y sus Espectros
TIC & Espectro
Deconvolucin

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Picos y Espectros Deconvolucionados

Consideraciones Prcticas en LCMS

Introduccin Tcnicas de Ionizacin
a Presin Atmosfrica Utilizadas
en LC/MS
Electrospray
APCI
MALDI

Las distintas fuentes de ionizacin son intercambiables entre los

distintos equipos (si son de la misma marca, claro)
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Consideraciones en la Conexin LC/MS

HPLC

MS

Separacin en fase lquida a alta

presin
 Produce una alta carga de vapor
 Temperatura prxima a ambiente
 Sin lmites en rango de masas
 Puede utilizar tampones no voltiles


1 ml/min lquido

Se necesita alto vaco

 Tolera una carga de gas limitada
 Opera a Temperatura elevada
 Depende de m/z y del tipo de filtro de
masas
 Prefiere tampones voltiles


1 litro/min vapor

(orientativamente)
LC

Interfase
La clave del xito!

MS
Opera a elevado vaco

Interfases LC/MS: API-Electrospray / API-APCI/ APPI / FAB/ Termospray

Filtros MS: Cuadrupolo (Q) / Trampa Iones / QQQ / TOF /Q-TOF/Sector Magntico
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Diseo de la Fuente de Iones Electrospray

La presencia de sales no voltiles dificultara considerablemente la eficiciencia del proceso de desolvatacin
Gas de
Nebulizacin
(N2)

NEBULIZADOR
ORTOGONAL

Iones Desolvatados

HPLC

0 V (nebulizador conectado a tierra)

muy conveniente para CE/MS

Iones en solucin

La punta del nebulizador est

en un angulo de 90 con
respecto a la entrada del
capilar

(nitrgeno calentado)

Mesh Assembly: -3500 V

(atraer cargas + a la superficie
de la gota)
+

Disolvente
Nebulizado

Ejemplo con
Polaridad +

+ + +
+- - +
+
- - - +
+
+
+ +

Entrada Capilar
Dielctrico

Explosin
Lmite
Coulomb
Rayleig
Alcanzado

Evaporacin

+ + +
+ -+- - +
- +
+ - -+ ++

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Gas de secado

-4.500 V (End Plate)

++ +
+ -- - +
+- - - +
+++ +
+ +
+ +- - +
- +
+ -+ - - +
+ +

++
+
+ -- +
-- +

+ -+ +
-+ -+ +

+
+-+
++-+

+
- -- +
+ + +
- +

+ +
- -+ +
-+
- +

+++
+-++

+
+ + +
+ +
+

p.e. Vcap: -5,000 V

(tpico -1500 -6000)

Ines Analito
Desolvatado

Evaporacin
+ + +
+ - - +
+
- - +
+ + + +

+++
+ -- - +
+- -+
+ -+
++

+
+ +
+-- +
-+

N2

+++
+- - +
++ -- - +
+++

SECADO
---

+
+

+
+

+
+

+
+

 JOHN B. FENN CONSIGUI EL NOBEL EN 2002 POR

SU DESCUBRIMIENTO DEL ELECTROSPRAY

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Proceso APCI (Ionizacin Qumica)

Entrada
HPLC

Aerosol con
el analito

Nebulizador

+ ++ + +
+ ++
+
+
+ +
+ + + + +
+ + + + ++

APCI
Gas de
Secado

Vaporizador
(calentador)

+ +
+

Evaporacin

El disolvente vaporizado se
ioniza mediante descargas
elctricas producidas por el
electrodo/aguja de descarga

Capilar

Vapor

Entre otros mecanismos:

N2 + e-

fase
gas

N2+ + 2 e-

MeOH + e-

fase
gas
fase
gas

[AcN]+

e-

fase
gas

[H2O]+ +- 2 e-

AcN

H2O

e-

Proceso APCI +
El analito CAPTA protones
del disolvente

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

segn su afinidad
protnica para captar
ceder un protn al gas
reactivo (o su afinidad
electrnica)

Formacin del gas

reactivo cargado

Aguja
Corona

e-

Transferencia de
carga al analito

[MeOH]+ +- 2 e+-

N2+ + Solv

fase
gas

+
+

Iones de
Analito

[Solv.+H ]+ + N2
fase

[MeOH2]+ + MeO-

[AcN]+ + H2O

fase
gas

[AcN-H]+ +

[H2O]+ + H2O

fase
gas

[MeOH]+ + MeOH gas

[Solv+H]+ + A --> Solv + [A+H]+

Empleados
en APCI +
[Solv+H]+

OH-

[H3O]+ + OHEmpleados
en APCI -

Criterios Seleccin Tcnica Ionizacin

ELECTROSPRAY:

Compuestos inicos, o polmeros/biopolmeros que en disolucin adquieren

mltiples cargas (pptidos protenas - ...).
Compuestos termolbiles con grupos funcionales ionizables en disolucin, o
de los que se pueden obtener sus sales sdicas (ESI-) o sus clorhidratos
(ESI+)
Tcnicas que requieran trabajar a nano o microflujos

APCI / APPI:

Compuestos NO termolbiles de media-baja polaridad y que contengan algn

heterotomo. Molculas sin grupos funcionales ionizables.
Preferencia por trabajar con fases mviles NO tamponadas
Necesidad de trabajar con fases fuertemente tamponadas por necesidades
cromatogrficas. (APCI/APPI toleran mayores concentraciones de tampn)

En buena parte de los casos se podrn utilizar las 2

tcnicas
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Consideraciones Electrospray versus APCI

Electrospray:

APCI (/APPI):

1.- La sensibilidad depende de la

1.- La sensibilidad depende de la
concentracin de analito; por ello admite flujos CANTIDAD de analito; por ello no
muy bajos (microbore /CE).

2.- El pH de la fase mvil es crtico. Con

gradientes habr que controlar pH en todos los
canales (acidular/basificar tambin fases
orgnicas).

3.- El solvente orgnico de la fase mvil

apenas afecta a la ionizacin.
4.- [Tampn voltil] < 25mM*
*Concentraciones elevadas pueden dificultar la
evaporacin/ionizacin por formacin de par inico

convienen flujos muy bajos

2.- El pH de la fase mvil NO es crtico. No
requiere del empleo de tampones
3.- El solvente orgnico de la fase mvil
afecta mucho a la ionizacin.
Metanol o Acetona (y an ms el agua) mejor que Acetonitrilo

4.- [Tampn voltil] < 100mM

5.- [Tampn no voltil]* <5-10mM

*tampn no voltil dificulta la desolvatacin/ionizacin
(el fosfato la dificulta menos con polaridad negativa,
pero ensucia ms el detector).

6.- Fcilmente forma aductos con Na y K

5.- [Tampn no voltil] <5-10mM

6.- No forma aductos con Na y K. Si los
puede formar con NH4

- Basta una concentracin 25-100M para una buena

.
formacin de aductos.
- Los aductos con NH4 son menos estables.
- La formacin de aductos dificulta la Fragmentacin

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Consideraciones Prcticas en LCMS

Consideraciones en la Seleccin de
Eluyentes y Tampones para LC/MS
Influencia de:
pH
Concentracin y Volatilidad del tampn
Tampones
y Disolventes
Consideraciones
Varias: Tpicos en LC/MS
Supresin de la Ionizacin por formacin par
inico fuerte
Iones tpicos de Background
Adaptacin de un mtodo de HPLC a LC/MS

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Influencia del pH en LC/MS con Electrospray

Modo In Positivo
R1
:N

pH cido

R2 + HA

R3

Base

cido

(Analito NO
Ionizado)

x100

pH Bsico

R1
+
H - N R 2 + AR3

Analito
Ionizado

Modo in Negativo
O
R

pH Bsico

OH + :B

cido

Base

pH cido

(Analito NO
Ionizado)

pH

Comp. Bsicos

Comp. cidos

pH=pK+2 (pH bsico)

pH=pK+1
pH=pK
pH=pK-1
pH=pK-2 (pH cido)

1% ionizacin

99% ionizacin
90% ionizacin
50% ionizacin
10% ionizacin
1% ionizacin

10% ionizacin
50% ionizacin
90% ionizacin
99% ionizacin

O
R

Analito
Ionizado

x100

Para ptima Sensibilidad con Electrospray trabajar:

pH (bsico) > pK + 1 para cidos en modo negativo
pH (cido) < pK - 1 para Bases en modo positivo
Para una buena repetibilidad de la respuesta obtenida en Electrospray y de los tiempos de retencin ser
especialmente importante un buen control del pH de la fase mvil, cuando ste sea prximo al pKa (+/-1) de
alguno de los analitos, dada la gran variabilidad en su grado de ionizacin en esta zona

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

C O + H:B

Influencia del pH en la Deteccin de Iones

Negativos mediante Electrospray (ESI)
100

Modo in Negativo

pH 3

pH 7

Relative Response

pH 10

OH + :B

pH Bsico

Base

cido

R
pH cido

(Analito NO
Ionizado)

50

Para iones Negativos trabajar

a pH bsico : pH> pk+1 2
(anlisis de cidos)

C O + H:B

Analito
Ionizado

pH

pH
3 7 10

3 7 10

pH
3
0

7 10

.5
b-Lactams

pKa aprox. 5

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Aminoglycosides

1.2
Ivermeitin
Compound Class

1.1
Tetracyclines
pKa aprox. 7

.9
Sulfamides
pKa aprox.7.5

Tampones Tpicos para API-ES y APCI

Modo in positivo (uso pH < 7.0; <5 preferido)
cido actico
(rango pH 3.8-5.8)
cido frmico
(rango pH 2.8-4.8)
(cido trifluoroactico (TFA)

(rango pH 1.5-2.5))

(no recomendable usar mnima concentracin posible de TFA)

Modo in negativo (pH > 7.0; 9 preferido)

Hidrxido amnico
(rango pH 8.2-10.2)
Trietilamina (TEA)
(rango pH 10.0-12.0)
Dietilamina (DEA)
Piperidina

(o formiato/ acetato amnico)

Bomba
Auxiliar

(rango pH 9.5-11.5)
(rango pH 10.1-12.1)

Consideraciones Varias:
Bomba
La adicin post-columna de cido o base
permite ajustar el pH si el proceso cromatogrfico
Eluyente
necesita otro de diferente.

Adicin
Post-columna

Mta

Columna

Inyector

Conexin
T

MSD

Los tensoactivos pueden interferir en la evaporacin. Los reactivos de par

inico suelen producir un elevado background, si se requieren utilizarlos
voltiles como tributilamina (TBA) o cido heptaflurobutrico (HFBA). La formacin
de un par inico fuerte puede suprimir la ionizacin del analito.
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Iones ms Tpicos como Background"

Iones

Modo

Procedencia

64

ES +

Acetonitrilo + Na

102

ES +

Trietilamina (se absorbe en tefln y plstico del HPLC)

113

ES -

TFA

116

ES + -

Contenedor de calibrante

145,147

ES +

Acetonitrilo + Cu (proviene del acero del sistema)

149, 391, 419, 413

ES + -

Ftalatos (contenedores de dtes., N2, filtro de gases...)

331

ES +

Polietiln propileno

Para evitar contaminaciones persistentes de aditivos utilizados anteriormente, se

recomienda reservar un canal (y material de vidrio: botellas matraces-) para utilizar con
aditivos problemticos (TEA / aminas / TFA / ) que queden adsorbidos

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Adaptacin de un Mtodo HPLC a LC/MS

ELECTROSPRAY
Sustitucin de tampones no voltiles por tampones voltiles
La concentracin de tampn voltil deber ser < 10 mM
Si ha de emplearse tampn no voltil, usar uno donde la parte
aninica o catinica sea voltil (y a la menor concentracin posible)
Fosfato amnico en lugar de fosfato sdico potsico
Mejor si la porcin no voltil del tampn es ionizable en el modo
usado
Fosfato (H2PO4- ) en modo negativo

APCI
Debe emplearse tampn voltil
La concentracin de tampn voltil deber ser < 100 mM
Al no requerir APCI el uso de tampones para controlar la ionizacin
del analito bastantes mtodos pueden transferirse directamente

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Caractersticas Tpicas del Espectro en LC/MS

O

R3

Base

Muestra

cido

Polaridad Positiva : M+1

cido

OH + :B

Base

156.1
100

150

200

ESI-

m/z

Max: 73.200

M-H

30

+
C O - + H:B

Muestra

Polaridad Negativa : M-1

20
10
0
100

150

200

Utilizar en los clculos Pesos mono-Isotpicos (no los moleculares)

Ejemplo Cl = 35 ( 37 para clculos isotpicos - no 35.45)
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

250

60 API-ES, Neg, Scan, Frag: 100, "Neg scan"

40

O
C

50

Modo iones Negativos

O

20

M+Na

270.0

R3

Distinta
Fragmentacin
entre + /

196.1

R2 + HA

40

197.1

:N

+H N R + A 2

ESI+
293.0

R1

R1

Max: 120.223

272.0

60

M+H

269

Modo iones Positivos

80

CH 3

API-ES, Pos, Scan, Frag: 75, "Pos scan"

100

NH

157.1

El espectro y proporcin entre iones es

instrumento-dependiente >> Las bibliotecas
se las debe crear el propio usuario

H2N

El pico base suele ser el in quasi molecular

271

Suele presentar poca fragmentacin

250

m/z

Espectros LC/MS, CE/MS -APCI versus GC/MS - EI)

Intensidad
5.4e5
5.0e5
4.5e5
4.0e5
3.5e5
3.0e5
2.5e5
2.0e5
1.5e5
1.0e5

Clenbuterol

277.087

Espectro LC/MS
(API-ESI)

[M+H]+=277.0874

279.084

Contribucin del Cl(37) de aprox. 2/3
2 tomos Cl

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

m/z (masa/carga)
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000

m/z-->

OH

86

Abundance

#103730: Clenbuterol

Cl

Espectro GC/MS
(EI)

HN
H2N

Cl
57

127

41
71
0

40

60

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

80

99

140 154166

190

243 259

CH3

276

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

H3C

Clenbuterol
PM = 276 Da

CH3

Presentacin de un anlisis

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Ejemplos Espectros LC/MS (AP-ESI / APCI)

Los espectros en LC/MS suelen presentar
poca fragmentacin

VENTAJAS MNIMA FRAGMENTACIN

DEL ESPECTRO LC/MS:
Mayor Selectividad
Mayor Sensibilidad

In con
doble
carga

Representaciones en forma diagrama barras

Representacin espectro completo

Siduron

INCONVENIENTES:
Menor informacin estructural*

* En LC/MS aumentando suficientemente el

Voltaje del Fragmentador (voltaje a la salida del
capilar) se puede aumentar la fragmentacin en
los espectros para obtener mayor informacin
estructural, aunque la mejor alternativa es la
utilizacin de sistemas de LC/MSn

M+3 = 1/3 (M+1) >> Existencia de 1 Cl

Las proporciones de los iones a A, A+2, A+4,... Permite reconocer la presencia de ciertos elementos
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Prfiles y Proporciones Istopos (A+2 )

98%

Br

Cl

Si

77%

BrCl

33%
24%
5%
3%

Br2
51%

65%

4.4%
1%

Cl2

Si2

S2

85%

49%

Br3 Cl

M = impar

49%
26%
11%

98%

Cl3

32%

Br4

Si3

77%

Cl4

Si4

A+X: +0 +2 +4 +6 +8

11%
1%
A+X: +0 +2 +4 +6 +8

M = par

32%
4%

S4

no existe N o
existe un n par de N

BrCl3

65%

16%

Br2 Cl2

13%
2%

65%

49%

17%

89%

S3
38%

15%
11%
1%

n impar de N

8%

32%
3%

68%

9%
2%

98%

Br3
34%

10%
7%
0.4

51%
20%
15%
2%1%
A+X:+0 +2 +4
+1

+3

22%
3% 2%
A+X: +0 +2 +4
+1

+3

n C ~ %(A+1)* / 1.11
18%
2%

A+X: +0 +2 +4 +6 +8

Contribucin C13
* %(A+1) = % de abundancia de la
seal correspondiente al C13 (A+1)
con respecto a la del C12 (A).
10x C -> A+1= 11.1% de A

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Formacin de Aductos en LC/MS

Na+, K+, NH4+, pueden competir con los H+ en la ionizacin del analito.
En Electrospray +: en presencia pequeas concentraciones*a de sales Na+ (K+ /
NH4+) se observan muy habitualmente los aductos M+23 (M+39 / M+18). Estos
NO se observan en polaridad negativa. En caso de duda (p.e. anlisis de trazas) la
adicin de Na+ y K+ puede ayudar a confirmar el M. Incluso en algunas ocasiones pueden
facilitar su ionizacin: algunas molculas neutras con tendencia a formar puentes de
hidrgeno (p.e. Mentol y carbohidratos) se pueden conseguir ionizar mediante la formacin
de aductos con NH4+ y metales alcalinos (probar AcNH4 o AcNa como tampn).

En APCI+: Se forman aductos con NH4+, pero NO con Na+ o K+.

En APCI-: se pueden formar en ocasiones aductos con compuestos halogenados
si el eluyente contiene algn disolvente halogenado (basta un pequeo porcentaje).
En modo Negativo (ESI y APCI) puede adicionarse un anin procedente del
M + A- => [M+A]eluyente:
Abundancia
903
Trioleina (C18:1,[cis]-9)
A-: Carboxilato (AcO-, HCOO-, TFA-), Haluro (Cl-,I-,,...)

En instrumentos que no desolvaten perfectamente

al analito se puede observar la formacin
de aductos con disolvente. (p.e. acetonitrilo - por
formacin puentes hidrgeno)

M 884.781 C57H104O6

110000
100000

<- [M+NH4+ ]

90000
80000
70000

Aducto con NH4+

60000

APCI+

50000
40000

NH4 presente en eluyente

30000
20000

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

m/z-->300

987

603639

10000

*a Bastan niveles M de Na, K o NH4 para poder obtener aductos.

400

500

600

700

800

900

1000

Ejemplos Formacin Aductos LC/MS: Espectros

Aflatoxinas (ESI+) y Saponina (ESI-)
ADUCTOS ESI+ con Na+

ADUCTO ESI- con TFA-

331
90

[M+H]+

Aflatoxina G2

90

Aflatoxina B2

315
[M+H]+

Saponina ESI(-)
M=1250

-18

313
[M-OH]+

O O
50

O
O O

+22

O O

50
353
[M+Na]+

OCH3

(M + TFA)
100

MS

O O

OCH3

287

337
60
[M+Na]+

1363

COO-Glc

Rha Glc Glc O

Glc

20

120 160 200 240 280 320 360

Prdidas agua (-18)

120 160 200 240 280

Aflatoxina G1

50

120 160

OCH3

Aflatoxina B1

[M+Na]+

200 240 280 320 360

(M-H)1249

MS/MS con Trampa Iones

-TFAH (-114)

MS2 (1363)

(M + TFA)

1363

-Glc 1087
20

351

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

100

O O

50

283

313
[M+H]+

M (CF3-COOH) = 114

60

O
243

O O

90
311
[M-OH]+

O O

(M -1)

Aductos por la presencia de Na+ en eluyente

329
[M+H]+

90

320

O O
120 160

285
OCH3
200 240 280

m/z

335
[M+Na]+

320

250

500

750

1000

1250

Muestra analizada por ESI(-)

mediante infusin de una disolucin
que contiene TFA (cido trifluoroactico)

Diseo del Sistema con Trampa de Iones

Excelente Sensibilidad y Calidad Espectral

Hasta MS11 en modo manual

Adquisicin Automtica e Inteligente hasta MS5 (l solo decide los precursores)

Adquisicin Simultanea (MRM) de hasta MS3 de 10 iones precursores

Adquisicin Simultnea polaridad +/- (alternante incluso con MSn)

Parmetros totalmente programables en el tiempo

Trampa
+

Anillo

N2

2 Octopolos

+
+
+

+ + +

N2
End Caps
Zona
VAPORIZACION
DE IONIZACION

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Zona FOCALIZACION

Zona
SEPARACION
IONES

Zona DETECCION

Trampas de Iones: Obtencin Espectro MSn

3-Excitacin

2-Aislamiento
In
1-Acumulacin Precursor

La energa de Fragmentacin
se aplica selectivamente. Slo
la recibe el In Precursor o
rango de iones que interese
fragmentar

4-Fragmentacin
He

(C.I.D.: Disociacin Inducida por

Colisin (con helio) del in precursor)

He

En una Trampa el proceso de

transmisin de Iones de
Fuente a Detector es un
proceso discontinuo

5
6

5-Acumulacin
de Fragmentos
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Espectro
n
MS
MS/MSMS/

Acumulacin

Deteccin: MS1

6-Deteccin

Espectro
de Masasn
(n=1-11)

Ejemplo Obtencin Espectro MSn

Intens.
x104
6

065-0601.D: EIC 461.4 All MS, Smoothed (0.3,1, GA)

Datos obtenidos en colaboracin con:

Lab. Qumico Microbiolgico - Murcia

Intens.
x104
1.00

MS1

2
0
x104

065-0301.D: EIC 426.2 MS2(461.4), Smoothed (1.5,1, GA)

200ppb Oxatetraciclina
4

0
x104

250

300

350

400

MS2 *

0.6

450

m/z

426.1

(461.4)

0.4

1 ciclo

0.0
200

250

408.2

300

350

400

450

m/z

065-0401.D: EIC 337.2; 365.2; 381.1 MS3(461.4->426.1), Smoothed (1.8,1,

MS3

0.4

1 1000

461.4

+MS2(461.4), 3.5-3.9min, 100%=6091, Background Subtracted

0.2

n 0.6ciclos
0.0

200

x10 4
0.8

S/N= 735

0.8

0.2

Intens.

MS2

Electrospray + con 0.5%HCOOH

en 80/20 CH3-CN/H2O

MS1

0.75
0.50
0.25
0.00

S/N= 23

+MS, 3.6-3.8min, 100%=8686, Background Subtracted

2-Aislamiento
In
Precursor

Intens.
1000
750

S/N= 605

4-Fragmentacin

MS4

He

750
He

1-Acumulacin
500

0
200

250

0
0.5

5-Acumulacin
de
1.0Fragmentos
1.5

250

Intens.

S/N= 90

6-Deteccin

337.2

2 ciclos

250

065-0501.D: EIC 283.2 MS4(461.4->426.1->337.2), Smoothed (2.2,1, GA)

+MS3(461.4->426.1), 3.4-4.0min, 100%=697

(461.4 / 426.1)

500

3-Excitacin

MS3

300

381.1
365.2

350

426.1
400

m/z

+MS4(461.4->426.1->337.2), 3.5-3.8min, 100%=466

337.1

600

MS4

400

(461.4 / 426.1/ 337.2)

3 ciclos

283.2

200
0

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5Time [min]

200

250

300

350

400

La gran selectividad proporcionada por MS2 y MS3 suele proporcionar una mejor sensibilidad en la
deteccin de picos minoritarios

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

450

450

m/z

Scan Completo MS de la
339.5
100 inyeccin sin columna
397.5
(F.I.A.) de 10 L en un
sistema APCI de
80
423.5
Vitamina D3 en extracto de
pienso de aves
60
385.4
383.4
40

Patrn Vitamina D3

80

313.4

MS3 (385/367)

271.1
60

213.0 241.3
227.2
185.0

40

285.3
325.5

20 158.6

493.4
20

255.3

0
150

200

250

300

m/z

350

400

450

[M+H]+ - H2O

Las prdidas de agua (18) y

amonaco (17) son muy poco
selectivas

40
20

199.3 219.0 255.2

0

150

200

200

250

287.3
300

325.4

m/z

350

400

450

500

Tambin se habra poder aislado el 385 y fragmentado 367-385

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

250

300

255.1

350

400

500

MS3 (385/367)

500

Extracto de
pienso de ave

80

MS2 (385)

367.4

80
60

349.2
367.6

100

APCI MS/MS de 385.4

100

0
150

467.5

163.1 203.3231.4

% Abundancia Relativa

255.2

100

% Abundancia Relativa

Vitamina D3 ?
[M+H]+ 385

MS

% Abuncia Relativa

% Abundancia Relativa

Anlisis Vitamina D3 por MSn por Inyeccin Directa

(FIA) mediante Supresin Fondo de la Muestra

60
241.2
40

227.2
213.1
185.0

20
158.5
0
150

200

285.4
271.1 311.2
325.5 353.2

250

300

350

400

500

Espectros de Iones con Mltiples Cargas

Espectro MS (ESI+) de LISOZIMA
protena M=14.306

Abundance

Molculas de gran tamao, p.e.

pptidos y protenas, suelen
proporcionar en ESI iones con
Mltiples Cargas respuesta a
mltiples relaciones m/z (masa/carga)
Con molculas amfotricas (molculas
con grupos cidos y bsicos - p.e. Pptidos y
Protenas) si pH = pI (pto. Isoelctrico) =>

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

1000

1200

1600

1800

2000

pH 6

+10
+13

8000

+9

6000
4000

+14
+15

2000

pH > pI
negativa

1400

+9

+11
+12

800

El perfil del espectro de iones con

mltiples cargas variar en funcin
del pH de la fase mvil.

+10

+15

10000

+
pH = pI
neutra

Ejemplo de Iones + con

Mltiples cargas

+11

12000

1000

+8
1200

1400

1600

1800

2000

m/z: (14.306+11)/11= 1302

800
Abundance

pH < pI
Carga: positiva

+14

800

pH 2.5

+12

2000

Abundance

molcula globalmente ser neutra:

+13

18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000

pH 12

600
400
200

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Reconocimiento de Iones con Mltiples Cargas

% Abundancia Relativa

TRAP: Angiotensina I Humana:

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu

PM 1296

Iones con 1 carga: m/z = 1.0

En Iones con 1 sola carga la diferencia entre las

seales correspondientes a C12 y C13 es de m/z = 1.
En iones con mltiples cargas la diferencias sern:
m/z = 1 /z (n cargas)

1297.29

100

=0.99
80
60

[M+H]+
Con Trampa
Iones

1298.28
=0.98

40

Por consiguiente:
m/z = 1.0
1 carga
m/z = 0.33 3 cargas

1299.26

m/z = 0.5
m/z = 0.25

2 cargas
4 cargas

Para reconocimiento del n de cargas se recomienda

guardar el espectro de masas en modo completo

20

1294 1296 1298 1300 1302 1304 m/z

Iones con 2 cargas: m/z = 0.5

648.92

100
80

+
[M+2H]2

=0.48

Intens.

Iones con 2 cargas: m/z =0.5

x106

807.00

1.0

649.40

Con Trampa 0.8

=0.48 Iones

60

0.6

40

649.89

20
646

648

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

650

652

654 m/z

=0.50
807.50
=0.42

0.4

807.92

0.2

808.60

0.0
644

Con
Cuadrupolo

[M+2H]2

790

795

800

805

810

815

820

m/z

Comparacin Resolucin Espectral: Q vs TRAP

% Abundancia Relativa

TRAP: Angiotensina I Humana:

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu

PM 1296

Iones con 1 carga: m/z = 1.0

En Iones con 1 sola carga la diferencia entre las

seales correspondientes a C12 y C13 es de m/z = 1.
En iones con mltiples cargas la diferencias sern:
m/z = 1 /z (n cargas)

1297.29

100

=0.99
80 [M+H]+
60

Con Trampa
Iones

1298.28
=0.98

40

Por consiguiente:
m/z = 1.0
1 carga
m/z = 0.33 3 cargas

1299.26

m/z = 0.5
m/z = 0.25

2 cargas
4 cargas

Para reconocimiento del n de cargas se recomienda

guardar el espectro de masas en modo completo

20

1294 1296 1298 1300 1302 1304 m/z

Iones con 2 cargas: m/z = 0.5

648.92

100
80

[M+2H]2+

=0.48

Intens.

Iones con 2 cargas: m/z =0.5

x106

807.00

1.0

649.40

Con Trampa 0.8

=0.48 Iones

60

Con
Cuadrupolo

0.6

40

649.89

20
644

646

648

650

652

=0.50
807.50

(Q-QQQ)

=0.42

0.4

807.92

0.2

808.60

0.0
654 m/z

[M+2H]2+

790

795

800

805

810

815

820

La Trampa de Iones proporciona mas resolucin y selectividad espectral que los cuadrupolos
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

m/z

Comparacin Resolucin Espectral: TOF vs Trap & Quads

% Abundancia Relativa

Tiempo de Vuelo (TOF)

879.403

879.649

Cuadrupolo (Q & QQQ)

807.00

x106
1.0

=0.25

[M+4H]4+

Intens.

879.902

[M+2H]2

0.8

=0.5

0.6
Resolucin Espectral:

879.149
880.158

807.50
=0.4
807.92

TOF > Trap > Q &0.4QQQ

880.398

808.60

0.2

880.651
0.0

805

1 amu

Iones con 4 cargas: m/z = 0.25

324.85

100
80

[M+4H]4

325.10

60

=0.26

40

325.36

Iones con 2 cargas: m/z =0.5

648.92

100

=0.25

=0.5

649.40

80

Trampa Iones (Trap)

[M+2H]2+

(modo mxima resolucin)

60

=0.5

40

20

m/z

810

1 amu

649.89

20
323

324

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

325
326
1 amu

327

328
m/z

644

646

648

650
1 amu

652

10mi
n

m/z

LC/MSD TOF
Excelente Resolucin Espectral
956.5993

3.0e4

956.4333

2.8e4

5 fmol Insulina

2.6e4
2.4e4

956.2672

con +6 cargas

956.7661

2.2e4
2.0e4
Intensity, counts

1.8e4

956.9319

1.6e4
956.0967

1.4e4
1.2e4

Permite llegar a resolver

incluso istopos con +8 cargas

957.0981

1.0e4
8000.0
957.2634

6000.0
4000.0

957.4285

2000.0
0.0

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

955.5

956.0

956.5

957.0
m/z, amu

957.5

958.0

958.5

Fundamentos del TOF Tiempo de Vuelo (Time-of-Flight)

Fuente
Iones

Zona libre de campo elctrico.

Opcional: Reflectron (espejo de iones)
Detector

30 kV

2
1
E=-mv
2

0V

v=

2E
m

t=

Long.

2E
m

1.0

Tiempo

= 91 sec
2(30000)
50200

Acelerar con la misma energa a los iones procedentes de la fuente

Los iones de distinta masa adquieran distintas velocidades y
lleguen al detector con distintos tiempos de vuelo
(menor masa
mayor velocidad)
Tcnica pulsante con un intervalo tpico de generacin de pulsos de 100 seg. (10.000 pulsos/s)
Tiempos Vuelo tpicos (vuelo 2m): m/z - seg.: 118 = 20s. 622 = 46s. 3000 =100s.
 Resoluciones en el rango de ppms requerirn la medicin del tiempo de vuelo con una precisin mejor de 1 nanosegundo

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Masa Exacta Requiere una Elevada

Resolucin Espectral
m/z = 118
922.0092

1.30e4
1.20e4
1.10e4

Resolucin Espectral:
> 4.000 a masas bajas
>10.000 a partir de masas medias

R=4.700

1.00e4

Resolucin = M/M

9000.00
Intensity, counts

8000.00

922/0.087 = 10.600

7000.00

m/z = 922

0.087

6000.00

m/z118

119

120

5000.00
4000.00

m/z = 2.722

3000.00

923.0121

R=13.500

2000.00
1000.00
0.00

921.5

922.0

922.5

923.0
m/z, amu

923.5

924.0

924.5

La elevada resolucin espectral proporcionada por los TOFs (superior a

Trampas y Cuadrupolos) permitir obtener masa exacta mediante la adicin
en continuo de algunos compuestos como referencia interna para m/z.

m/z 2722
Jos Rodrguez
SUIC. UMU

2724

La Importancia de disponer de Masa Exacta

para centrar la bsqueda:

Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el n de posibles

composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestin.

P.M.

N Posibles Frmulas
Empricas

1000
5.687
1672

100

386

1347

882

882

1347

386

10

1672

176

5687
1
0,1
QUAD
s

176

0,05

0,01

Exactitud Masa
0,001 0,0005 0,0001 (u.m.a)

0,005
1.000

1.000uma

500

500

TOFs

250

250uma

100uma

100uma

P.M.(uma) para 3ppm

P.M.(uma) para 10ppm

En molculas pequeas el poder determinar el peso molecular con la tercera cifra

decimal permite tpicamente definir una frmula emprica inequvoca.

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Esquema LC/MS-TOF
Opciones nebulizadores:
Analtico
Micro-analtico
Electroforesis Capilar

FUNCIONES
ESPEJO DE IONES:

1.- Doblar el
recorrido de
vuelo
2.- Refocalizar
cualquier
dispersin
producida por
iones con
distinta energa

Fuente
Electrospray

Ampliacin Zona
DETECCION

Iones

C.I.D.
Zona
VAPORIZACIN
DE IONIZACIN

Zona FOCALIZACIN

Opciones Fuentes Ortogonales HPLC / Infusin:

Electrospray (dual)
nano-Electrospray
APCI
APPI
AP-MALDI (acoplable offline con HPLC)

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Zona
SEPARACIN
Y
DETECCIN
IONES

Electrones

Fotones

Microchannel
Plate (MCP)

Centelleador

Ganancia
aprox.
2x10E6

Fotomultiplicador

Detector pticamente Acoplado

LC/MSD TOF: Fuente Electrospray

Para obtener masa exacta -adems de elevada resolucin espectral- se requiere
la adicin en continuo de unas masas/compuestos de referencia interna

Incorpora sistema de
suministro en continuo
de una Solucin de
Referencia
Fuente Agilent TOF
Series 1100: MASA
EXACTA EN RUTINA
gracias al Diseo con
Doble Nebulizador
ortogonal para Ionizacin
Independiente de
Muestra y Masas de
Referencia

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Nebulizador Analtico
Nebulizador de
Referencia
Fuente compatible con el resto de
LC/MS Agilent Series 1100 (Quads y
TRAPs)

Seleccin
Compuestos de
Referencia utilizados

El usuario puede
utilizar las soluciones
de referencia de
Agilent o las suyas
propias

Agilent 1100 LC/MSD TOF: Amplio Rango Dinmico para

Correccin Automtica con Masas de Referencia para
Masa Exacta en Operacin de Rutina (p.e. m/z 118 y 922)
Unknown
Ref. Mass

m/z 582.319

m/z 922.010
Masa Exacta en
Rutina requiere:
250 Arb.Units

100,000 Arb.Units

1.6 ppm
error

Muy amplio rango

dinmico (+3
ordenes) gracias a la
tecnologa A.D.C. de
digitalizacin del
tiempo de vuelo

400x
 El amplio rango dinmico espectral permite utilizar como
referencia masas a concentraciones mucho ms diluidas que el
analito (y as pasen desapercibidas en el espectro del analito) .
 Evita tener que efectuar diluciones (el analito puede estar 1000
veces ms -concentrado o diluido- que la solucin de referencia) .

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Theoretical
Mass
487.73253
450.2364
722.81666
417.21191
512.25457
464.25036
519.21717
653.3617
435.91023
501.79513
820.47251
526.58871
674.32258
480.60877
582.31897
710.84248
627.97323
474.23075
507.81333
740.40136
784.37501

Abundance
Arb. Units
1316
5304
6611
6910
8978
12534
575
21881
555
10141
842
3100
1881
23885
49027
3863
13881
24508
11016
9671
643

Error
(ppm)
0.61
1.59
0.64
2.66
1.66
0.73
0.06
1.38
-0.28
-0.04
0.25
0.35
-1.4
-2.52
1.57
-1.16
0.55
1.13
0.68
-0.12
-3.49

Promedio error absoluto masa:

1.0ppm

Selectividad con Extraccin 1amu (tpica con Qs) Orina aadida con
2ng/ml Clenbuterol (2ppb) Zorbax XDB-C18 2.1x50mm x3,5m

TIC

1.6 x 107

A 5mM NH4OAC/0.1% Actico

B Acetonitrilo
300 l/min Iny.: 20 l
0 min
5%B
7 min
80 % B
9 min
80 % B
Clenbuterol

x350

1.0 x

105

Clenbuterol

IC(276.38744 277.38744)
-0.7 - +0.3 amu

S/N = 14
rango extraccin tpico con cuadrupolo

Jos Rodrguez
SUIC. UMU

Selectividad con Extraccin +/- 30ppm m/z

Orina aadida con 2ng/ml Clenbuterol (2ppb)
1.9 x

104

(TIC: x850 x320 5.9 min )

277.0866 Da
error: 0.7ppm

5
inyecciones
por nivel

Ventana Extraccin:
IC(277.07913 277.09575
m/z)

+/-30 ppm

OH

+/- 8 mDa

S/N = 102

Cl

HN

CH3

H2N
Cl

H3C

CH3

El TOF adems
proporcionar
espectros
completos

Jos Rodrguez
SUIC. UMU