Gaceta Mdica de Mxico

Volumen
Volume

139

Nmero
Number

Mayo-Junio
May-June

2003

Artculo:

El papel de las tcnicas de biologa

molecular en el diagnstico y control
de tuberculosis

Derechos reservados, Copyright 2003:

Academia Nacional de Medicina de Mxico, A.C.

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BIOLOGA MOLECULAR Y MEDICINA

Coordinador:Dr. Fabio Salamanca Gmez

El papel de las tcnicas de biologa molecular en el

diagnstico y control de tuberculosis
Vernica Loera-Castaeda,* Jos Snchez-Corona,* Mara Cristina Morn-Moguel*

Contexto histrico

A la tuberculosis (TB) se le conoce como una de las

enfermedades ms antiguas que han afectado a la
humanidad. Se han encontrado datos de TB espinal en
momias de Egipto que datan desde 2,400 aos a.C.
Alrededor del ao 460 a.C, Hipcrates identifica a la
phtisis (trmino acuado por los griegos) como enfermedad contagiosa de consecuencia por lo general fatal.
Sylvius en 1702, identific las lesiones pulmonares o
tubrculos como cambios consistentes y caractersticos en pulmones y otros rganos de los pacientes con
TB. En 1720 el fsico Ingls Benjamin Marten fue el
primero en aseverar en su publicacin A New Theory of
Consumption, que la TB puede ser causada por diminutas criaturas vivientes, las cuales pueden introducirse en el cuerpo generando las lesiones y los sntomas
de la enfermedad. El botnico Hermann Brehmer, en
1854 concluye su tesis doctoral titulada Tuberculosis is
a Curable Disease, producto de estudios que realiz
despus de padecer la enfermedad y haber sanado. La
etiologa de la TB fue discutida hasta el descubrimiento
del bacilo tuberculoso por Robert Koch en 1852, que
aunado a la mejora en las condiciones socioeconmicas y el aislamiento del paciente tuberculoso en hospitales, represent un impacto importante en la epidemiologa mundial de la TB en la primera mitad del siglo XX.
En 1895 otro gran avance fue el descubrimiento de la
radiacin por Wilhelm-Konrad von Rntgen, herramienta importante para el seguimiento de los pacientes con
TB y posteriormente el descubrimiento de las bases
para la vacuna a partir del Bacilo de Calmette y Guerin
(BCG) por parte de Calmette y Guerin, la cual se
distribuye ampliamente en nuestros das.1

La secuencia genmica completa de Mycobacterium

tuberculosis fue descrita en Junio de 1998 por Cole y cols.
en la cepa H37Rv,2 suceso que proporcion una nueva
direccin a las diversas tcnicas de ADN recombinante
en la deteccin e identificacin de micobacterias y en la
identificacin molecular de resistencia. Estas tcnicas
aunque rpidas y exactas, son susceptibles a modificacin tratando de disminuir sus limitaciones y aumentar
sus ventajas. Las versiones simplificadas cada vez son
ms asequibles para los laboratorios clnicos. Sin embargo, las placas para anlisis en microscopio, y los procedimientos de cultivo, continan siendo los estndares de
oro para el diagnstico micobacteriano.

Deteccin molecular de Mycobacterium tuberculosis

Algunos de los mtodos moleculares para la deteccin
de Mycobacterium tuberculosis se basan en la amplificacin de secuencias repetidas de ADN mediante reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (de las siglas en
ingls Polymerase Chain Reaction) obteniendo un resultado en 24 a 48 horas. La PCR es capaz de demostrar
la presencia de fragmentos de ADN micobacterianos en
muestras biolgicas de pacientes con sospecha clnica
de tuberculosis, en muestras con resultado negativo a la
tincin de Ziehl-Neelsen o en el cultivo, lo cual resulta
particularmente til en infecciones no bacilferas de
pacientes con cuadros atpicos asociados a infeccin
por VIH.3 Sin embargo, se han reconocido dos grandes
obstculos al xito de la tcnica: las dificultades relacionadas con la ruptura de la pared celular micobacteriana
y la extraccin de ADN y la presencia de inhibidores de
la PCR. Otros factores que pueden influir en la sensibilidad y especificidad de la tcnica son la variabilidad
biolgica y la amplificacin inespecfica. La sensibilidad

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* Divisin de Medicina Molecular, Centro de Investigacin Biomdica de Occidente. Centro Mdico Nacional de Occidente. IMSS.
Guadalajara, Jalisco. Mxico.
Correspondencia y solicitud de sobretiros: M. en C. Mara Cristina Morn Moguel. Sierra Mojada #800 col. Independencia, Sector Libertad.
C.P. 44340. Guadalajara, Jal. Mxico. cmoran_moguel@hotmail.com

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Loera-Castaeda V, y cols.

de la PCR en muestras pulmonares se ha reportado

entre 74 y 100%.3 Una variedad de la PCR es la PCR
nested o anidada que consiste en dos reacciones de
PCR con el fin de hacer ms especfica la amplificacin
y aumentar el rendimiento.4
Las primeras sondas disponibles comercialmente
odarobale
FDP
fueron las sondas isotpicas para :rop
el complejo
M. tuberculosis y las especies M. avium, M. intracellulare y M.
VC con
ed AS,
gordonae, marcadas
I125 ycidemihparG
que hibridan con ARNr
que permitan la identificacin rpida (2 h aproximadaarap en ADN
mente) de las micobacterias ms comunes
extrado de cultivo o tejido. Esto permiti acortar el
arutaretiL
tiempoacidmoiB
de identificacin
de 4-6:cihpargideM
semanas a 2-4h, creando una ventaja tangible entre el uso de tcnicas moleculares y las tcnicas de identificacin tradicionales.

Resistencia a antifmicos y mecanismos moleculares

de resistencia
Desde 1946 cuando se administraba estreptomicina
como monoterapia, se reportan pacientes con resistencia clnica al frmaco y desde 1973 se tiene antecedente
de pacientes infectados con cepas resistentes a mltiples antifmicos.4 Los mecanismos moleculares de resistencia a frmacos son: inactivacin del frmaco,
dificultad para acceder al blanco y alteracin del blanco
por mutacin. De estos tres solamente el tercero se ha
descrito como mecanismo de resistencia en Mycobacterium tuberculosis. Esta resistencia es el resultado de
mutaciones gnicas espontneas que ocurren con una
frecuencia aproximada de 10-5 a 10-8.4 Actualmente se
conocen diez genes y sus productos proteicos involucrados en dicha resistencia: Cuatro genes cuyas mutaciones condicionan resistencia a isoniazida (KatG, inhA,
kasA y oxyR-ahpc); se ha identificado un gen en la
resistencia a etambutol (embB); uno en la resistencia a
fluoroquinolonas (gyrA); uno en la resistencia a pirazinamida (pncA); dos genes (rpsL, rrs) en la resistencia a
estreptomicina y un gen (rpoB) en la resistencia a
rifampicina; en este ltimo, se ha descrito una regin
que contiene los puntos calientes para mutacin denominada regin Rif. Todas la mutaciones que en ella se
han identificado confieren resistencia a rifampicina, la
mayora son mutaciones de sentido equivocado, es
decir, cambia un aminocido por otro; adems se ha
descrito que aproximadamente el 66.8% de estas cepas
desarrollan resistencia a otras drogas.4

Estrategias moleculares para identificar mutaciones

que confieren resistencia

(en la muestra remitida al laboratorio) o en cultivo. De

acuerdo con el grado (de menor a mayor) de especificidad y costo o requerimiento de equipo especial, las ms
utilizadas son: PCR heterodplex, tcnica que permite
analizar cambios hasta de una sola base dentro de la
secuencia especfica de un fragmento de ADN de doble
sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
cadena,
evidente como un cambio en el patrn electrofortico, debido al mal apareamiento en la doble cadena
de ADN. PCCS (Polimorfismo conformacional de cadena sencilla) tcnica para detectar diferentes conformaciones de una sola cadena de ADN dadas por la presencia de mutaciones. Estas dos tcnicas proporcionan
una manera fcil y rpida de detectar presencia pero no
el tipo y sitio especfico de la mutacin, lo que es una
limitante para su aplicacin en estudios epidemiolgicos de prevalenca y caracterizacin de las cepas
resistentes a antifmicos, sin embargo, son una opcin
rpida y de menor costo. La hibridacin con sondas
actualmente utiliza membranas de diferente material y
es posible cargarlas con sondas de inters, como aquellas que contienen mutaciones conocidas responsables
de resistencia a diversos frmacos, lo cual favorece el
diagnstico temprano y especfico de resistencia en
pacientes en control con antifmicos de primera lnea.
PLH (del ingls; PCR-reverse Line Blot Hybridization),
tcnica que consiste en hibridacin reversa de una
regin de inters, que es amplificada por PCR con un
iniciador biotinilado. El producto de PCR es hibridado en
una membrana cargada con sondas de secuencias
silvestres y mutantes, las cuales se unen a la membrana
covalentemente. El resultado positivo indica una hibridacin exitosa y se detecta mediante una seal que
emite el conjugado de estreptavidina-peroxidasa.5 INNOLiPA-Rif TB (del ingls; INNOGenetics Line Probe Assay), prueba de hibridacin reversa que permite la
identificacin rpida de la mutacin causante de resistencia en cepas de Mycobacterium tuberculosis. Otorga
una correlacin del 100% con el anlisis convencional
de susceptibilidad a drogas y se ha validado con una
sensibilidad y especificidad del 100%. La hibridacin
reversa se realiza entre un fragmento de ADN de inters
(producto de un sistema de PCR nested) y una sonda de
ADN con una mutacin conocida biotinilada en su extremo 5'. Estas dos tcnicas ofrecen una deteccin rpida,
fcil y especfica de mutaciones conocidas, pero sus
limitaciones incluyen costos elevados, la incapacidad
para detectar mutaciones desconocidas, el nmero
limitado de sondas y en ocasiones la necesidad de un
gran inculo.5 Secuenciacin. Tcnica mediante la cual
se puede determinar el orden de nucletidos en regiones especficas del genoma. Ha permitido la asignacin
e identificacin clara de nuevas especies de micobacterias, as como de mutaciones asociadas con la resistencia a mltiples antifmicos. El costo y el requerimiento de

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Para la identificacin de mutaciones pueden utilizarse

diversas tcnicas moleculares, ya sea en forma directa
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Diagnstico y control de tuberculosis

equipo especializado para secuenciacin limitan su uso

en la mayora de los laboratorios.5
La especificidad y la rapidez de las tcnicas moleculares actuales, representan una ventaja plausible frente
a las tcnicas tradicionales, esto motiva a la bsqueda
de versiones con mayor sensibilidad, especificidad y
con menores costos, que sean asequibles para su
aplicacin en el diagnstico de infeccin y la identificacin de mutaciones que confieren resistencia, lo que
representara un impacto importante en el control epidemiolgico de la tuberculosis en el mundo.

3.

4.

Referencias
5.
1.
2.

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