PRCTICA N1

DEMOSTRACION DE LA
ESPECIFICIDAD ENZIMTICA

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1. OBJETIVOS
1.1 Demostrar la especificidad enzimtica de la enzima de glucosa
oxidasa sobre la glucosa.

2. INTRODUCCION
La glucosa oxidasa es producida por Penicillium notatum. Esta enzima tiene
una afinidad extremadamente marcada por la glucosa. En la presente prctica
vamos a demostrar la especificidad de la enzima sobre un sustrato. Para ello,
emplearemos glucosa y fructosa; dos ismeros que tiene la formula general
C6H12O6.
La Glucosa oxidasa (GOD) cataliza la reaccin siguiente:
Glucosa + O2 + H2O2 -----GOD----- cido Glucnico + H2O2.
El H2O2 uno de los productos de la reaccin pude ser determinado utilizando la
enzima Peroxidasa, la misma que al actuar sobre el H 2O2 libera Oxigeno, el
cual reacciona con la 4-aminofenazona (4-AF) y el fenol, en forma proporcional
a la concentracin de H2O2.
La reaccin es la siguiente:
2 H2O2 + 4 AF + fenol -----POD---- Quinona coloreada + 4 H 2O.

3. MATERIAL METODOS
3.1 Materiales:
Pipetas
Tubos de ensayos
Bao mara
Cocina elctrica

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3.2. Reactivos.
Solucin fructosa.
Solucin glucosa.
Solucin GOD/POD.
4. PROCEDIMIENTO:
4.1.

PREPARACION DE 3 SISTEMAS.

Utilizando la tabla a continuacin se debe prepara 3 sistemas.

Favor utilizar pipetas individuales por reactivo utilizado (no

contaminar pipetas).

Tabla 01: Sistema Experimentales:

Solucin de Glucosa 1 g/L (mL)

1
-

SISTEMA (Tubos)
2
0.1

3
-

Solucin de Fructosa 1 g/L (mL)

0.1

2.0

2.0

2.0

3.0

3.0

COMPONENTES Y PROCESO

Solucin GOD/POD (mL)

Incubar a 37 C por 10 minutos.

Agua destilada (mL)

3.1
Mezclar por inversin

Posteriormente leer mediante el colormetro a 420 nm la

absorbancia.

Factor=

1.0 g / L
Lecturatestigo

Glucosa=|Problemas|x Factor

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5. ESQUEMA.

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6. RESULTADO
6.1. Muestreo en el colormetro:
- Tuvo n 1: 0.139 mm ( GOD / POD)
- Tuvo n 2: 0.151 mm ( GLUCOSA)
- Tuvo n3: 0.140 mm (FRUCTUOSA)
6.2.

Factor:

Factor=

1.0 g / L
Lecturatestigo

Factor=

1.0 g / L
=7.194
0.139

6.3.

Glucosa:

Glucosa=|Problemas|x Factor

Glucosa=0,151 x 7.194=1.086

6.4.

Fructuosa:

Fructuosa=|Problemas|x Factor

Fructuosa=0.140 x 7.194= 1.007

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7. DISCUSION.
Las enzimas son protenas, al igual que otros catalizadores son efectivas en
muy baja concentracin, se recuperan sin alterar luego de la reaccin, no
cambian la posicin del equilibrio de la reaccin que catalizan sino que
mediante la formacin de un complejo enzima-sustrato, disminuyen la energa
de activacin aumentando la velocidad a la cual sta transcurre.
A diferencia de los catalizadores inorgnicos las enzimas actan en
condiciones moderadas de pH y temperatura. En su mayora presentan
especificidad por el sustrato aunque en grado variable, por ejemplo glucosa
oxidasa (GO) una enzima presente en hongos y bacterias, cataliza la oxidacin
de D-glucosa a cido glucnico, pero no oxida L-glucosa. La velocidad de
oxidacin de -D-glucosa es 157 mayor que la de oxidacin de -D-glucosa. La
especificidad de esta enzima es de tal grado que diferencia los esteroisomeros.
Otras enzimas presentan menor grado de especificidad, como la enzima xilosa
isomerasa, presente en varias especies bacterianas, que cataliza la
isomerizacin de xilosa en xilulosa, ambas pentosas, pero tambin cataliza la
transformacin de glucosa en fructosa, ambas hexosas. reaccin sin enzima
reaccin con enzima estado final estado inicial Energa libre estndar
coordenada de reaccin Captulo 1 Naturaleza y clasificacin de enzimas 3 El
sitio activo de las enzimas consiste en un grupo de 3-12 aminocidos
organizados en una estructura tridimensional, en una zona de la protena. Este
sitio tiene una fuerte afinidad por el sustrato debido a la naturaleza qumica de
los residuos aminoacididos que la componen.

8. CONCLUSION.

Se logro demostrar la especificidad enzimtica de la enzima de glucosa

oxidasa sobre la glucosa.

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9. CUESTIONARIO.
1. Explicar el diseo experimental:

Cul es el propsito de cada tubo.

-

Esto nos especifica cada muestra y nos hace ms

factible el desarrollo de la prctica para la determinacin
de cada resultado.

Cul es el tubo control? Es necesario ms de un tubo

control? Explicar
-

El tubo control es el tubo C, aqu solo se le agrega H2O

y la enzima GOP.

2. Observar los tubo y anotar sus observaciones en la seccin

resultados. Explicar la discusin y conclusiones.
-

En prctica realizada en el laboratorio se logr observar,

que la glucosa oxidasa tiende a unirse a la glucosa y no
a la fructuosa. Dando un resultado mayor en la unin de
la glucosa oxidasa con la glucosa y menor con la

fructuosa.
Este comportamiento enzimtico se da porque la
glucosa oxidasa es una enzima catalizadora de

oxidacin de la glucosa usando el oxgeno molecular.

GLUCOSA
Reacciona con la enzima.
FRUCTUOSA
No reacciona con la enzima.
3. Disear una tabla con resultados.
MUESTRAS

TUBO 1
0.139 mm

TUBO 2
0.151 mm

TUBO 3
0.140 mm

PROMEDIO

(GOD / POD)

(GLUCOSA)

(FRUCTUOSA)

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4. Explique usted los tipos de especificidad enzimtica.

La especificidad es una caracterstica de mayor relevancia en las enzimas y es
determinante en la regulacin del mecanismo celular. Esta propiedad reduce la
variabilidad de sustratos sobre los que una enzima puede actuar. Se conocen
varios tipos de especificidad, entre ellos:

Especificidad Optica: Las enzimas presentan generalmente una

especificidad ptica absoluta por lo menos para una porcin de la
molcula del substrato.

Especificidad de Grupo: Cuando una enzima acta solo sobre grupos

qumicos y particulares. algunas enzimas actan sobre un grupo
determinado de molculas, por ejemplo, las enzimas que digieren las
protenas: catalizan reacciones hidrolizando enlaces entre aminocidos
especficos; sin embargo, estos enlaces sern hidrolizados en cualquier
protena que los contenga y, por eso, su especificidad es relativa.

Especificidad de sustrato: acepta solo un tipo de sustrato.

Especificidad de reaccin: llevan a cabo una reaccin especfica,

independiente del sustrato

Activacin energtica: No todas las molculas poseen la misma

energa, ya que tienen un promedio energtico lo que significa que
mientras la mayora de las molculas tienen un valor medio energtico,
algunas lo tienen muy bajo y otras muy alto.

5. Qu tipo de especificidad enzimtica representa glucosa

oxidasa.

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La reaccin de la glucosa oxidasa junto con una reaccin auxiliar se ha

utilizado ampliamente para la determinacin de la glucosa en los fluidos
biolgicos. Se han desarrollado multitud de reacciones auxiliares distintas a
fin de mejorar la especificidad global del sistema de reaccin o para retener
la especificidad inherente de la glucosa oxidasa.
1. La glucosa se oxida por accin de la glucosa oxidasa para dar cido
glucnico y perxido de hidrgeno.
2. El perxido de hidrgeno reacciona en presencia de peroxidasa con
HBA y con 4-aminoantipiridina (4-AAP) para dar lugar a un tinte de
quinonimina rojo. La intensidad del color formado es proporcional a la
concentracin de glucosa y se puede medir fotomtricamente entre 460
y 560 nm.
3. El mtodo utilizado en este reactivo se basa en la reaccin indicadora de
perxido de hidrgeno que une 4-aminoantipirina a un compuesto
fenlico, como propuso inicialmente Trinder.
4. Este mtodo se ha validado en un amplio estudio realizado por Pennock
et al.5 Pennock compar el mtodo de Trinder con otros seis mtodos
comunes y descubri que era muy fiable tanto en lo referente a la
exactitud como a la precisin. Pennock5 y Sharp6 y Szasz et al7
mostraron adicionalmente que el mtodo era resistente a los
compuestos interferentes bien conocidos, tales como el cido rico, la
glutationa y la creatinina. La enzima glucosa oxidasa (GOD) deriva
normalmente del hongo Aspergillus, a veces del Penecillium. La miel
tambin es una fuente abundante de GOD. La enzima procede de las
glndulas farngeas de las abejas. Sin embargo, su idoneidad est
bastante limitada por el gusto de su portador. Un efecto del GOD en la
masa es la oxidacin de la glucosa para formar cido glucnico con la
ayuda del oxgeno atmosfrico, pero la ligera acidificacin que se
produce en el proceso es negligible; su otro efecto es la transformacin
del agua en perxido de hidrgeno. Este agente oxidante acta sobre

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los grupos de tiol del gluten, ya sea directamente o a travs de varias

vas de acceso, incluyendo la formacin de enlaces de disulfuro y de
este modo reforzando la protena. El factor limitador en este proceso es
la disponibilidad de oxgeno. Junto a otras reacciones qumicas que
consumen oxgeno, la levadura necesita oxgeno antes de empezar la
fermentacin real, ya que inicialmente respira en lugar de fermentar.
Esto significa que las condiciones para GOD slo son buenas en la
superficie de la masa cuando hay mucho oxgeno disponible
permanentemente. Esta limitacin puede solucionarse con medidas
tcnicas durante la preparacin de la masa, por ejemplo, la sobrepresin
o el suministro de oxgeno adicional a travs de la herramienta de
mezclado. En el mtodo GOD-POD, en un primer paso la glucosa
oxidasa cataliza la oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico
conformacin de perxido dehidrgeno. ste es utilizado por la
peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a
una quinonaimina coloreada. La intensidad de color ser proporcional a
la concentracin de glucosa presente inicialmente.

6. Citar ejemplos de enzima que catalizan reacciones

especficas.
Tipo de enzimas

Actividad

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Catalizan reacciones de hidrlisis. Rompen las biomolculas con

hidrolasas

molculas de agua. A este tipo pertenecen las enzimas digestivas.

Isomerasas

Catalizan las reacciones en las cuales un ismero se transforma en

otro, es decir, reacciones de isomerizacin

Ligasas

Catalizan la unin de molculas.

Liasas

Catalizan las reacciones de adicin de enlaces o eliminacin,

para producir dobles enlaces.
Catalizan reacciones de xido-reduccin. Facilitan la transferencia

Oxidorreductasas

de electrones de una molcula a otra. Ejemplo; la glucosa,

oxidasa cataliza la oxidacin de glucosa a cido glucnico.

Tansferasas

Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a

otra. Ejemplo: la transmetilasa es una enzima que cataliza la
transferencia de un grupo metilo de una molcula a otra.

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

Ubalde, M., Villadniga, C., Giacomini, C., & Graz, v. (2002).

generalidades de enzimas. Obtenido de Naturaleza y clasificacin de
enzimas:

https://clasesparticularesdebioquimica.files.wordpress.com/2015/07/repartidoenzimas.pdf