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Chromatographie liquide haute performance (CHLP)

La chromatographie liquide haute performance (CHLP en franais, HPLC en anglais) est une
technique analytique trs gnrale demploi. Elle correspond une volution de la chromatographie
sur colonne. Pour amliorer les performances de celle-ci (en particulier lefficacit de la rsolution),
il faut diminuer la taille des particules utilises pour constituer la phase stationnaire ; mais plus
les grains sont petits, plus la dure de llution et de la sparation est grande. Il faut donc utiliser
des pompes trs performantes pour maintenir un dbit dluant suffisant et constant
travers la colonne. Des pressions de plusieurs centaines de bars sont ncessaires pour assurer
des dbits raisonnables avec les nouveaux supports dont la taille des particules est comprise entre
3 et 10 m. Alors, la vitesse de la phase mobile de lordre de 0,1 1 cm.s -1, vitesses comparables
celles de la CPG.
I. Comparaison avec la chromatographie en phase gazeuse (CPG)
1. La CHLP est souvent plus efficace que la CPG dans le cas de sparations difficiles.
Il ny a en CPG que des interactions du solut avec la phase stationnaire alors quen CHLP il
y a des interactions du solut avec la phase stationnaire et avec la phase mobile do des
possibilits beaucoup plus grandes.
solut
phase stationnaire

solut
phase mobile

C.P.G.

phase stationnaire

C.L.H.P.

Les phases stationnaires sont beaucoup plus varies en CHLP quen CPG, en particulier on
peut oprer par change dions, par exclusion, alors que cest impossible en CPG. La temprature
est beaucoup moins leve quen CPG, la CHLP se pratiquant le plus souvent temprature
ordinaire.
2. Diffrences avec la CPG
Les coefficients de diffusion dans les liquides sont 104 105 fois plus faibles que dans les
gaz. De ce fait, la vitesse des changes entre phase stationnaire et phase mobile est faible ce qui fait
que lon est oblig de travailler avec des vitesses lentes, ce qui explique la lenteur des sparations.
La viscosit des liquides est environ 100 fois plus grande que celle des gaz. Les liquides sont
incompressibles jusqu 300 bars environ alors que les gaz sont compressibles.
3. Avantages de la CHLP par rapport la CPG
Seulement 20% des substances organiques connues peuvent tre analyses en CPG. On ne
peut pas utiliser cette mthode pour sparer des substances peu volatiles (cas des substances telles
que M > 300 g.mol-1), des substances sensibles une lvation mme modre de la temprature,
des substances ionises. Un avantage important de la CHLP tient ce que la prparation de
lchantillon avant son injection est souvent plus simple quen CPG. Ainsi, il nest pas toujours
ncessaire, pralablement lanalyse, dextraire les substances chromatographier du milieu o
elles se trouvent. Certaines sparations difficiles peuvent tre obtenues en CHLP alors quelles ne
peuvent pas ltre en CPG.

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II. Description de lappareillage


1. Schma de principe dun systme de CHLP

2. Rservoir de phase mobile et traitement de la phase mobile


Les appareils sont quips dun ou plusieurs rservoirs contenant chacun au moins 500 mL
de solvant. On y adjoint souvent des dispositifs qui permettent den liminer les poussires et les
gaz dissous qui sont gnants la fois pour la rsolution des pics et aussi pour le fonctionnement
du dtecteur. Llution peut se faire avec un seul solvant de composition constante, elle est dite
isocratique ou laide dun mlange de deux solvants de polarits diffrentes en proportions
variables, elle est dite alors gradient dlution. Le rapport des volumes des deux solvants quon
mlange est modifi de manire continue ou discontinue, selon un programme prtabli. La
programmation de solvant est destine amliorer lefficacit de la sparation, tout comme la
programmation de temprature du four en chromatographie en phase gazeuse.
3. Pompes
Les pompes demeurent la partie la plus dlicate de lappareillage car elles doivent rpondre
des critres rigoureux :
- obtention de pressions pouvant aller jusqu 420 bars,
- dbit compris entre 0,1 et 10 mL.min-1 et le plus rgulier possible,
- rsistance la corrosion quel que soit le solvant utilis
Les pompes les plus utilises comportent deux pistons, ce qui permet de rgulariser le dbit.
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a. aspiration par le gros piston et


refoulement par le petit
b.
situation
inverse,
rgulariser le dbit

pour

c. montage deux pistons de mme


diamtre mais dont lun a une
course (et une vitesse) double de
celle de lautre
d. graphe montrant les variations de
dbit en fonction du mouvement des
pistons au court du temps

Schma dun corps de pompe deux ttes en srie

Si lluant a une composition fixe pendant toute la dure de llution (chromatographie en


mode isocratique), une seule pompe suffit. Par contre, si on fait varier la composition de lluant au
cours de lanalyse, plusieurs pompes sont ncessaires.
4. Injecteur
Linjecteur le plus courant est une vanne dinjection boucle reprsent ci-dessous.

remplissage total de la
boucle avec lchantillon
injection du contenu de
la boucle sur la colonne
remplissage partiel de la
boucle avec lchantillon

Dans la position chargement, la vanne fait communiquer la pompe et la colonne.


Lchantillon, en solution, est introduit laide dune seringue dans un petit volume tubulaire
appel boucle. Dans la position injection, lchantillon, gard dans la boucle pression
atmosphrique, est insr dans le flux de phase mobile. Des conditions de bonne reproductibilit
sont atteintes si la boucle est totalement remplie par lchantillon. Linjection doit se faire en un
temps trs bref afin de perturber le moins longtemps possible le rgime tabli dans la colonne et le
dtecteur. Il faut introduire en tte de colonne, sans stopper la circulation de la phase mobile, un
volume prcis dchantillon (compris entre 5 et 500 L), l o la pression dpasse souvent 104 kPa.
5. Colonne et phase stationnaire
La colonne est un tube droit, en acier, dune longueur de 3 25 cm et dun diamtre
intrieur de 0,5 5 mm. La phase stationnaire est maintenue entre deux disques poreux situs aux
extrmits. Le dbit de la phase mobile ne peut dpasser quelques mL.min -1. Il existe des
microcolonnes dune longueur de 5 cm et dun diamtre de 0,3 mm pour lesquelles le dbit de la
phase mobile ne peut dpasser quelques L.min-1. Ces colonnes ont lavantage de consommer trs
peu dluant et de conduire une meilleure rsolution.
5.1. Le gel de silice est le matriau de base pour le remplissage des colonnes
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Le gel de silice utilis a


trs peu de choses voir avec la
silice cristalline SiO2 qui sert de
matire
premire

son
laboration. Il est sous forme de
microsphres dun diamtre le
plus constant possible, de lordre
de 2 5 m.

OH
O

Si

OHHO

Si

OH

Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
O
HO

O
Si

Si
O

OH
Si
Si
OHO O
O
Si
O
O
Si
O

Reprsentations de la surface du gel de silice employ en


chromatographie

La qualit du gel de silice dpend de plusieurs paramtres parmi lesquels la structure


interne, la taille des grains, la dimension et la rpartition des pores, la surface spcifique, la
rsistance lcrasement et la polarit. Le gel de silice tant trs polaire (les groupements silanols
-Si-OH ont un pKa comparable celui du phnol, de lordre de 10), son mcanisme daction repose
sur ladsorption.
5.2. Les silices greffes
Le gel de silice volue au cours du temps, ce qui entrane un manque de reproductibilit des
sparations. Pour y remdier et pour diminuer la polarit du gel de silice, on fixe des molcules
organiques par des liaisons covalentes sur les fonctions silanols. La phase stationnaire greffe se
comporte alors comme un liquide et la sparation est due une chromatographie de partage.

Ces phases greffes, dont la polarit peut tre ajuste avec une trs grande souplesse, sont
lorigine de la chromatographie de partage polarit de phase inverse (luant polaire et phase
stationnaire apolaire). Parmi les transformations les plus classiques, on trouve la raction des
alkylchlorosilanes, en prsence dun agent basique.
A ct des phases greffes comportant des chanes linaires 8 ou 18 atomes de carbone de
type alkyle, il en existe dautres dont les chanes portent des fonctions (amines, nitriles, thers ou
hydrocarbures aromatiques), ce qui permet de changer la polarit de la phase stationnaire.

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5.3. Exemple dinfluence de la surface spcifique de la phase stationnaire


Influence de la surface spcifique dune silice Sphrosil sur la sparation dun mlange
dhydrocarbures aromatiques.

Colonne : longueur, 10 cm
diamtre intrieur, 4 mm.
Phase stationnaire : silice de type Sphrosil
exprimental de 5,6 m et de surfaces
spcifiques varies :
A : 470 m2.g-1 ; B : 590 m2.g-1 ; C : 900 m2.g1

Phase mobile : hexane sec.


Dbit : 0,9 mL.min-1.
Temprature : ambiante.
Nature des soluts :
: tolune ; : naphtalne ; : biphnyle ;
: anthracne et : phnantrne

Remarques :
- On place souvent une courte colonne de protection (nomme colonne de garde) en amont de la
colonne analytique afin den augmenter la dure de vie, en liminant les poussires et les
contaminants contenus dans les solvants. Dans le cas dune chromatographie liquide-liquide, la
colonne de garde sert galement saturer la phase mobile en phase stationnaire afin de minimiser
les pertes en phase stationnaire de la colonne analytique. La composition de la colonne de garde
doit tre semblable celle de la colonne analytique mais la granulomtrie est plus grande afin de
minimiser les pertes de charge.
- On obtient de meilleurs chromatogrammes en maintenant la temprature de la colonne constante
quelques diximes de degr Celsius. Pour cela, les colonnes sont souvent places dans une
enceinte thermostate.
6. Phase mobile
6.1. Gnralits
Il est recommand de toujours employer des solvants traits spcifiquement pour la CHLP. Il
faut, de plus, les dgazer et les filtrer avant usage. Si la phase stationnaire est polaire, on choisit
une phase mobile peu polaire : la chromatographie est dite chromatographie en phases
normales. Si la phase stationnaire est trs peu polaire, on choisit une phase mobile polaire, le
plus souvent un mlange mthanol/eau ou actonitrile/eau : la chromatographie est dite
chromatographie polarit de phase inverse. Il existe quatre types dinteractions entre les
molcules du solvant et celles du solut :
- dipolaires quand solut et solvant ont tous deux des moments dipolaires
- de dispersion due lattraction entre elles des molcules voisines
- par liaison hydrogne, quand sont runis un solvant et un solut dont lun est donneur et
lautre accepteur de protons
- dilectriques, qui favorisent la dissolution des composs ioniques dans les solvants polaires
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phase polaire normale

solvants classs par polarit croissante

phase polarit inverse

FAIBLE

hexane
tolune
trichloromthane
dichloromthane
ther
actate dthyle
actonitrile
mthanol
eau

FORT

pouvoir dlution

pouvoir dlution

FORT
FAIBLE
On peut, en mlangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir dlution de la phase mobile.
Un paramtre qui dtermine la pression utiliser (pour la pompe) est la viscosit de l'luant.
Eluant

actonitrile

actate
d'thyle

mthanol

eau

acide
propan-2-ol
thanoque

Viscosit
0,37
0,45
0,60
1,00
1,22
2,30
(cP 20 C)
La faible viscosit de l'actonitrile est une des raisons de son utilisation frquente.
6.2. Exemples doptimisation de la sparation par variation de la composition de la phase mobile
Influence dun solvant secondaire en chromatographie de partage polarit de phases
inverses sur la sparation dun mlange dalcool benzylique et de phnol.

Colonne : longueur, 30 cm ;
diamtre intrieur, 4 mm.
Phase stationnaire : silice de type
octadcyle de type MCH-10 (Varian).

greffe

Phase mobile : mlange contenant 60% deau,


du THF la teneur indique sur les chromatogrammes et du mthanol (complment 100%
en volume).
Dbit : 2 mL.min-1.
On observe, avant llution des soluts, des pics
parasites dus linjection.

Optimisation de la sparation dun mlange dhydrocarbures benzniques halogns en


solution dans le propan-2-ol, laide dun appareil de gradient par variation rapide tage de la
composition de la phase mobile.

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Colonne : longueur, 1 m ;
diamtre intrieur, 2,1 mm.
Phase stationnaire : remplissage : 1% ODS-Permaphase.
Phase mobile : mlange eau/mthanol la teneur
indique sur les chromatogrammes.
Dbit : 2 mL.min-1. Pression dentre : 84 bars.
Temprature : 60 C.
Identit des pics : 1 : solvant ; 2 : benzne ;
3 : chlorobenzne ; 4 : 1,2-dichlorobenzne et 5 :
iodobenzne

7. Dtecteurs
Le dtecteur doit fournir un signal lectrique refltant en continu les variations de la
composition de lluat la sortie de la colonne, ce qui permet de dtecter le passage des composs
successifs. Aucun dtecteur nest universel, mais un bon dtecteur doit runir les qualits
suivantes :
- donner une rponse proportionnelle la concentration instantane pour un mme compos
- tre sensible
- avoir une faible inertie
- tre stable dans le temps
- avoir peu de bruit de fond
Il existe plusieurs types de dtecteurs dont les plus courants sont cits ci-dessous.
7.1. Dtecteur spectrophotomtrique
Les dtecteurs spectrophotomtriques peuvent faire une dtection monochromatique
(dtecteur UV avec lampe au deutrium) ou polychromatique (dtecteur barrette de diodes ce qui
permet dobtenir des renseignements spectraux pouvant servir lidentification des composs). On
mesure en permanence labsorbance de la phase mobile la sortie de la colonne une ou plusieurs
longueurs donde dans lUV/visible. Pour pouvoir reprer les soluts, il faut quils absorbent et que
la phase mobile nabsorbe elle-mme pas ou trs peu. Labsorbance dun compos est
proportionnelle sa concentration condition que celle-ci reste faible (loi de Beer Lambert).
7.2. Dtecteur spectrofluorimtrique
Certains composs sont fluorescents et lintensit de la fluorescence dun compos est
proportionnelle sa concentration condition que celle-ci reste faible.
7.3. Dtecteur rfractomtrique
Son principe est bas sur la diffrence dindice de rfraction entre la phase mobile et
leffluent la sortie de la colonne. Cest un dtecteur assez peu sensible et qui doit tre thermostat
ainsi que la colonne car sa rponse est trs sensible aux variations de temprature.

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Il ne peut tre utilis quen mode isocratique car la variation de la


composition de lluant au cours de lanalyse entrane une drive de
la ligne de base. Il conduit des pics soit ngatifs soit positifs, ce qui
implique un rglage de la ligne de base mi-hauteur du graphe.

III. Application la dtermination du degr de puret d'un produit brut de synthse


1. Principe
La technique utilise est une CHLP de partage polarit de phase inverse : la phase fixe, de
fine granulomtrie, est une silice greffe rendue apolaire et la phase mobile est souvent un mlange
actonitrile-eau utilis dans des conditions isocratiques. Llution est suivie par spectromtrie UV
254 nm ds qu'il y a un noyau aromatique dans les molcules tudies. Le dosage est effectu par
la mthode de ltalon interne. La mthode de ltalon interne est base sur lutilisation du
coefficient de rponse relatif de chaque compos doser vis--vis dun constituant
supplmentaire, introduit pour servir de rfrence et appel talon interne ; il est introduit
une concentration connue dans la solution de lchantillon analyser et dans la solution du
mlange de composition connue qui sert obtenir le chromatogramme dtalonnage. Les
compositions des solutions injectes sont alors exprimes laide des concentrations
massiques et on peut en dduire le % en masse dun compos dans lchantillon analyser. Ceci
permet de saffranchir de limprcision concernant le volume inject et de certaines erreurs
exprimentales difficilement contrlables, comme les drives dappareil ou les perturbations
mcaniques. Le choix de ltalon interne est assez complexe. Cet talon interne doit rpondre aux
critres suivants :
- il doit tre pur, chimiquement inerte vis vis des soluts et de la phase mobile,
- il doit avoir un temps de rtention diffrent de celui de tous les constituants de lchantillon,
mais le plus proche possible de la substance doser,
- il ne doit pas tre prsent comme impuret dans lchantillon,
- il doit tre ajout une concentration qui donne une aire de pic sensiblement quivalente
celle du produit doser.
- il doit tre dtect de la mme manire que la substance doser, donc il doit avoir un spectre
dabsorption proche de la substance doser aux environs de la longueur donde retenue.

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2. Exemple : analyse par HPLC d'un produit prpar, l'acide 4-bromomthylbenzoque


2.1. Raction et conditions de lanalyse
La raction effectue est la suivante :

CH3

CH2Br

O
+

Br

O
COOH
acide 4-mthylbenzoque N-bromosuccinimide

O
N H

O
COOH
acide 4-bromomthylbenzoque succinimide

L'analyse se fait sur une colonne C 18 (100*4) 3 en mode isocratique avec pour luant un
mlange actonitrile/tampon phosphorique (KH2PO4 50 mmol/L + 0,1% H3PO4) dans les
proportions 40/60. La colonne est thermostate 40 C. Le dbit de l'luant est fix 1 mL/min.
La dtection se fait par S.A.M. la longueur d'onde de 230 nm. L'talon interne est l'acide
benzoque la concentration 1,0 mg/L obtenue par addition de 20 L d'une solution 1,0000 g/L
dans toutes les solutions ralises dans des fioles jauges de 20 mL.
2.2. Etude de la solution talon
La solution talon comporte de l'acide 4-bromomthylbenzoque une concentration de
12,85 mg/L et de l'acide benzoque une concentration de 1,00 mg/L dans lluant.
Le chromatogramme talon donne les rsultats suivants :
compos

tR (min)

surface (u)

acide benzoque

1,81

2470

acide 4-bromomthylbenzoque

3,12

12128

2.3. Etude de l'chantillon


La solution mre du produit analyser est ralise par dissolution de 0,1013 g de ce
produit, pes exactement, dans l'luant dans une fiole jauge de 20 mL. La solution
chromatographier (solution fille) est obtenue en versant 50 L de la solution mre, 20 L de
solution talon 1,0000 g/L d'acide benzoque et en compltant jusqu'au trait de jauge avec
l'luant dans une fiole jauge de 20 mL. Le chromatogramme de la solution fille donne les rsultats
suivants :
compos

tR (min)

surface (u)

acide benzoque

1,78

2485

acide 4-bromomthylbenzoque

3,11

9952

Calculer le pourcentage (en masse) d'acide 4-bromomthylbenzoque dans l'chantillon.

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