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Analyse quantitative de la mlamine dans le

lait, les produits alimentaires contenant du


lait, le chocolat et les aliments btail

Objet et domaine dapplication


Cette procdure dcrit lanalyse quantitative de la mlamine dans le lait par UPLC MS/MS.

Dfinitions et abrviations
Le nom officiel de la mlamine est: 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine.
Sa structure chimique est illustre ci-dessous:

Sa formule brute est: C3H6N6.


La mlamine fait partie de la grande famille des rsines amines drives de l'ure, de la thioure et des cyanamides.
La mlamine a plusieurs fois t volontairement introduite dans des aliments et des friandises
pour augmenter la concentration totale en azote et de ce fait la teneur calcule en protine.
Ce compos ne devrait pas tre prsent dans les aliments. En effet, haute concentration elle
forme des complexes insolubles avec lacide cyanurique en fonction du pH urinaire entrainant
ainsi des maladies de la fonction urinaire.
ACN : acetonitrile

Principe de la mthode
Lextraction de la mlamine se ralise laide dun mlange actonitrile-eau-dichloromthane
dans un milieu lgrement acide. Aprs prlvement du surnageant, lextrait est filtr sur micro
disque et inject en UPLC-MS/MS dans un mode MRM. La mthode de quantification se fait par
dilution isotopique avec un surrogat marqu de la mlamine en carbone 13.

Scurit
Outre les mesures habituelles de scurit, on apportera une attention particulire la
manipulation des solutions de mlamine.

Prlvement des chantillons


Le prlvement des chantillons se fait par le commettant.

Rception, circulation, stockage et vacuation des chantillons


Les chantillons sont achemins jusquau service des denres alimentaires en suivant les SOP
03/F/12 et 22/F/1203.

Partie exprimentale

7.1

Produits consommables
Tous les ractifs et matriaux doivent tre adapts pour lanalyse.
Actonitrile pour HPLC
Actate dammonium p.a. Merck 1.0116.1000 ou q
NaOH p.A. Merck 1.06498.1000 ou q.
Mthanol absolute HPLC Biosolve ou q
HCl AnalaR NORMAPUR analytical reagent 37% ou q
Ammoniaque : NH4OH 25% Merck 1.05422.1000
Dichloromthane HPLC Biosolve
Eau Milli Q : Eau distille au moyen de lunit de filtration Millipore Milli-Q Water System ou
quivalent

7.2

Equipement et matriel de laboratoire


Petit matriel
Outre le matriel classique de laboratoire, notons lutilisation de
-

Tubes falcon 15 ml, 50 ml


Tubes pour centrifugeuses en verre de 40 ml
Matras de 5, 25 ml
Colonne SPE isolute SCX de Sophachem ou q
Filtre 0,22 m de 13 mm ou q.

Appareillage
Centrifugeuse Epphendhorf centrifuge 5810 R ou q
Dispensettes
Micropipettes de 5 200 l et de 100 1000 l
Balance Mettler AE 160 ou q.
Bains ultra sons chauffant
Agitateur de type vortex
Agitateur rotatif Heidolph
LC-MS/MS : UPLC-Premier de Waters ou quivalent

7.3

Prparation des solutions

Prparation des ractifs


NaOH 0.1%
Peser 0,2 g (+/- 0,05 g) dhydroxyde de sodium, transfrer dans un ballon de 200 ml et porter au trait
avec de l'eau Milli-Q.
HCl 1N
8,33 ml dHCl 37% et mettre au trait 1 l avec de leau. Dure de stockage 6 mois
ACN acide
Prendre 2 ml dHCl 37% et mettre au trait 200 ml avec lACN. Dure de stockage 6 mois.

ACN 5% de NH4OH
Prlever 10 ml de la solution de NH4OH et mettre au trait 50 ml avec lACN. Dure de stockage 1
jour
Actate dammonium 0,5M
Peser 19,20g (+- 0,50), dissoudre dans de leau et porter au trait 500ml. Dure de stockage 6 mois.
Phase mobile
Pipeter 20 ml dactate dammonium et 80 ml deau mettre au trait 1l avec lACN. Filtrer la solution
sur membrane milipore 0,2m Dure de stockage 6 mois

Standards
Conservation des solutions
Les solutions sont conserves au rfrigrateur. La solution stock de 100 g/ml dans de leau se
conserve 6 mois. Le temps de conservation est dun mois pour les solutions intermdiaires et de
calibration.
Solutions de standards (ST)
- Solution 1mg/ml : peser 20 mg de mlamine et dissoudre dans 20 ml de NaOH 0,1%.
- Solution 100 g/ml : Prlever 1ml de la solution 1mg/ml et mettre au trait 10ml avec de leau.
- Solution 10 g/ml : Prlever 250 l de la solution 1 mg/ml et mettre au trait 25 ml avec de leau.
- Standard de mlamine marqu en C13 : ce standard est utilis tel quel comme surrogat, une
concentration de 100 ng/l.
Solutions de calibration (SC)
Les solutions de calibration sont prpares dans des matras avec les solutions intermdiaires suivant
les proportions reprises dans le tableau ci-dessous, 25 l de la solution de surrogat y sont ajouts
pour la droite de calibration des produits alimentaires contenant du lait avant la mise au trait de jauge
avec de leau. Ensuite les solutions sont filtres sur micro disque.

Pour le lait (matras de 25 ml) :

Conc (g/g ou
ppm)

0,5

50

100

ST 10g/ml
(l)
ST 100g/ml
(l)

10

20

50

100

200

ST 1 mg/ml
(l)

30

40

50

30

40

50

Pour les produits alimentaires base de lait (matras de 25 ml) :

Conc (g/g ou
ppm)
ST 10g/ml (l)

0,5

10

20

30

40

25

50
25

50

100

150

200

25

50

200

400

600

200

400
160

320

480

2,5

10

20

50

100

200

400

ST 100g/ml (l)
Pour le chocolat au lait (matras de 10 ml) :

Conc (ng/g ou
ppb)
ST 1g/ml (l)
ST 10g/ml (l)

Pour les aliments btail (matras de 20 ml) :

Conc (g/g ou ppm)

0,5

ST 1g/ml (l)

100

ST 10g/ml (l)
7.4

Mode opratoire
7.4.1

Mode opratoire pour le lait

Prlever 1 g (+- 0,01g) de lchantillon


Ajouter 2 ml deau et 5 ml dactonitrile
Vortexer 10 s
Centrifuger 5C 4000 rpm pendant 10 minutes
Prlever le surnageant et le placer dans les tubes pour centrifugeuses de 40 ml avec 110 l
dHCl 1N, 7,5 ml de dichloromthane et 10 ml deau.
Placer les tubes 20 minutes lagitateur rotatif une vitesse de 8
Centrifuger 10 minutes 4000 rpm
Prlever le surnageant et le placer dans le matras de 25 ml
Porter au trait avec de leau

Mlanger et filtrer sur filtre 0,22 m et injecter suivant la squence explicite plus loin
7.4.2

Mode opratoire pour les produits alimentaires contenant du lait

Si lchantillon se prsente sous forme daliment prt tre consomm, broyer la totalit laide du
broyeur jusqu lobtention dun mlange homogne. Si lchantillon se prsente sous forme de
poudre, passer directement ltape suivante :

Peser 0,500 g (+- 0,005g) dchantillon broy dans un tube Falcon de 15 ml


Y ajouter 10 ml de solvant dextraction (ACN:H2O 1 :1) et 25 l de solution 100 ng/l de
surrogat.
Homogniser le tout pendant 10 secondes au Vortex (vitesse maximum).
Passer lchantillon au bain ultra-sons pendant 20 minutes.
Centrifuger 4000 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prlever la totalit du surnageant laide une pipette Pasteur et lintroduire dans un tube
centrifuger en verre fond plat de 40 ml.
Ajouter 200 l de la solution dacide chlorhydrique 1N et 10 ml de dichloromthane.
Mlanger le tout lagitateur rotatif pendant 20 minutes.
Centrifuger au moins 1500 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prlever la micropipette 1 ml de la phase aqueuse (suprieure) et le transvaser dans un
tube assai en verre.
Ajouter 4 ml deau Milli-Q et homogniser le tout pendant 10 secondes au Vortex.
Transvaser dans une fiole dinjection environ 1,2 ml aprs filtration laide dune seringue de
2 ml munie dun filtre 0.22 m.
7.4.3

Mode opratoire pour le chocolat au lait

Si lchantillon se prsente sous forme daliment prt tre consomm, broyer la totalit laide du
broyeur jusqu lobtention dun mlange homogne. Si lchantillon se prsente sous forme de
poudre, passer directement ltape suivante :

Peser 0,500 g (+- 0,005g) dchantillon broy dans un tube Falcon de 15 ml


Y ajouter 10 ml de solvant dextraction (ACN :H2O 1 :1)
Homogniser le tout pendant 10 secondes au Vortex (vitesse maximum).
Passer lchantillon au bain ultra-sons chauffs pendant 20 minutes.
Centrifuger 4000 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prlever la totalit du surnageant laide une pipette Pasteur et lintroduire dans un tube
centrifuger en verre fond plat de 40 ml.
Ajouter 110 l de la solution dacide chlorhydrique 1N et 20 ml de dichloromthane.
Mlanger le tout lagitateur rotatif pendant 20 minutes.
Centrifuger au moins 1500 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prparer la SPE :
o Conditionner les colonnes avec :
3 ml dACN 5% NH4OH
3 ml dACN acide
3 ml dACN
3 ml deau milli-Q
o Dposer 2 ml du surnageant
o Laver avec :
3 ml deau milli-Q
3 ml dACN
o Eluer avec 3 ml dACN 5% NH4OH
Evaporer lluat sec sous azote
Ajouter 500l deau milli-Q
Passer aux ultra-sons 5 minutes
Vortexer
Filtrer sur filtre 0,22 m et injecter suivant la squence explicite plus loin

7.4.4

Mode opratoire pour les aliments btail

Si lchantillon se prsente sous forme daliment prt tre consomm, broyer la totalit laide du
broyeur jusqu lobtention dun mlange homogne. Si lchantillon se prsente sous forme de
poudre, passer directement ltape suivante :

Peser 0,500 g (+- 0,005g) dchantillon broy dans un tube Falcon de 50 ml


Y ajouter 20 ml de solvant dextraction (ACN :H2O 1 :1)
Passer lultra turax jusqu lobtention dune solution homogne.
Passer lchantillon au bain ultra-sons pendant 20 minutes.
Centrifuger 4000 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prlever la totalit du surnageant laide une pipette Pasteur et lintroduire dans un tube
centrifuger en verre fond plat de 40 ml.
Ajouter 150 l de la solution dacide chlorhydrique 1N et 10 ml de dichloromthane.
Mlanger le tout lagitateur rotatif pendant 20 minutes.
Centrifuger au moins 1500 tours par minutes pendant 10 minutes.
Prparer la SPE :
o Conditionner les colonnes avec :
3 ml dACN 5% NH4OH
3 ml dACN acide
3 ml dACN
3 ml deau milli-Q
o Dposer 1 ml du surnageant
o Laver avec :
3 ml deau milli-Q
3 ml dACN
o Eluer avec 3 ml dACN 5% NH4OH
Evaporer lluat sec sous azote
Ajouter 1ml deau milli-Q et transvaser dans un matras de 5 ml nettoyer le tube au moins trois
fois et mettre au trait 5 ml
Mlanger
Filtrer sur filtre 0,22 m et injecter suivant la squence explicite plus loin

Blancs et chantillons de contrle


A chaque srie, traiter un chantillon deau (0,5 ou 1g selon la quantit traite dchantillon), cest le
blanc procdure (BP). Le CS (chantillon de contrle), pour le lait se fait comme suit 1 g de lait
auquel 10 l de la solution 1mg/ml est ajoute, pour les produits base de lait 0,5 g de gaufre auquel
50 l de la solution 100 g/ml est ajoute, pour le chocolat au lait 0,5 g de chocolat auquel 250 l de
la solution 1 g/ml est ajoute et pour les aliments btail 0,5 g auquel 50 l de la solution 100
g/ml.
Chromatographie
Injection : 0,5 l pour le lait ; 1l pour les autres matrices
Weak Wash : Mthanol/eau 90/10
Strong Wash : Mthanol/eau 10/90
Colonne : Acquity HILIC 1,7 m :2,1 x 100 mm
Temprature du four : 35C
Dbit : 0 ,7 ml isocratique
Spectromtrie
Les paramtres dacquisition sont sauvs dans la mthode MELAMINE.
Source : electro-spray ; Polarit : positif
Tempratures de dsolvatation :350C ; Temprature de la source: 130 C
Dbit de gaz sur le cone : 50 L/heure ; Dbit de gaz de dsolvatation: 800 L/heure
Cone : 40V

Transitions pour la mlamine :


m/z 127>85
22 eV nergie de collision (quantifiant)
m/z 127>68
17 eV nergie de collision (de confirmation)
Transitions de la mlamine marque en C13 :
m/z 129>87
22 eV nergie de collision (quantifiant)
m/z 129>70
17 eV nergie de collision (de confirmation)

7.4.5

Etalonnage

Les paramtres utiliss pour vrifier le bon fonctionnement de lappareil sont repris au 8.
7.4.6

Programme de mesure

La squence danalyse pour les chantillons se compose des injections suivantes :


-

Conditionnement (injection dun standard)


Droite de calibration
Solvant
CS
BP
Maximum 10 chantillons
Standard last : point 30 ppm de la droite de calibration