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Dosage multi-rsidu de pesticides organochlors , pyrethrinoides

organophosphors et PCB (Polychlorobiph2nyls) dans les aliments


dorigine animale comme( le lait
entier liquide , les ufs et les poissons ). Par LC-MS/MS et GC/MS

1-Avertissement et prcautions de scurit :


Les vapeurs de certains solvants volatils sont trs toxiques. Beaucoup de ces derniers
pntrent
par la peau. Utiliser un dispositif daspiration de fume efficace pour liminer les vapeurs
ds leur
dgagement.
La prparation des solutions de travail contenant des pesticides ncessite la manipulation
de
substances actives pures ou trs concentres. Eviter tout contact avec la peau et le
risque
dinhalation de particules par le port de blouse, de gants, de lunettes et/ou dun masque .

2-Objet et domaine dapplication :


Cette procdure dcrit lanalyse quantitative des organochlors , organophosphors et
pyrethrinoides dans les aliments dorigine animale comme( le lait entier liquide , les
ufs , les poissons , et autres denrs alimentaires grasses ). Par LC-MS/MS et GC/MS .

Les pesticides pour lesquels la mthode a t teste sont :


Tableau 1 : liste des pesticides entrant dans le champ dapplication de la mthode

Pesticides organophosphors

Phorate
Chlorpyriphos ethyl
Phorate oxon
Chlorpyriphos methyl
Phorate sulfone
Diazinon
Disulfoton
Disulfoton sulfone
Pirimiphos methyl
Triazophos
Methidathion

Pesticides organochlors

Chlorothalonil
Beta endosulfan
Endosulfan sulfate

Pesticides organochlors

Polychlorobiphnyls

Pyrthrinodes

HCB
HCH
HCH
HCH
Heptachlore
Dicofol op
Aldrine
Heptachlore-epoxy
Oxychlordane
Chlordane
DDE op
Endosulfan (1)
Chlordane
DDE pp
Dieldrine
Endrine
TDE op

PCB congnres
28
52
101
118
153
138
180

Cyalothrine
Permethrine
Cyfluthrine
Cypermethrine
Fenvalerate
Deltamethrine

TDE PP
DDT pp
Dicofol
3-Principe de la mthode :
Cette mthode comprend des techniques dextraction de la matire grasse (extraction
par centrifugation cryognique) ,dextraction des pesticides et des pyrthrinoides ainsi
que des techniques de purification pour le lait liquide . cest une chromatographie solideliquide sur cartouche prte lemploi (SPE extraction par phase solide ) .deux types de
phases sont utiliss successivement : C18 puis Florisil

4-Ractifs et produits

Solutions dtalonnage
Solution standard de 24 pesticides de concetration 20 ppb
un mlange de six pyrthrinoides prpar partir de solutions concentres de
(delthamthrine, prmthrine , cypermthrine ,fervalrate, cyfluthrine ,
cyhalothrine.)
Etalon interne
Les solvants utiliss de qualit HPLC :
Actone
Dithyl ther
Ether de ptrole

n-hexane
Actonitrile
Mthanol
Dichloromthane
Dodcane comme rtenteur des rsidus lors des vaporation
Les cartouches apolaires dextraction en phase solide( C18 de 1g)
Les cartouches polaires dextraction en phase solide( Florisil de 1g)
Laine de verre
Sable marin
Sulfate de sodium anhydre
Filtres papier

5- Appareillage :
Matriel courant de laboratoire en particulier :
Pour lextraction de la matire grasse et des rsidus :
Centrifugeuse rfrigre pouvant tourner 3000 tours par minute.
Evaporateur rotatif avec dispositif de mise sous vide (pompe eau) et
condenseur rfrigr
(ventuellement).
Ampoules dcanter, ballons, et verrerie usuelle de laboratoire
Platine ou bain dvaporation sous azote.
Pour la purification SPE :
Cuve hermtique dextraction sous vide pour cartouche, munie dune fuite
dair. Pompe vide. Un automate peut tre utilis.
Pour le dosage par Chromatographie en Phase Gazeuse :
Chromatographe en phase gazeuse quip dun injecteur appropri (avec
ventuellement un
systme dinjection automatique), dun four et dun dtecteur capture
dlectrons.
Les caractristiques de pr-colonne et de colonne sont prsentes titre
dexemple dans le
tableau 2.
Tableau 2 : Caractristiques de pr-colonne et de colonne de chromatographie
Pr-colonne

Colonne capillaire
Longueur en m
50
Diamtre interne en mm
0.32
Composition pr-colonne
Composition du film
Dimthyle-polysiloxane
(100 %)
Epaisseur du film en m
0.25
polarit
100 % apolaire

1.5
0.32
Silice fondue dsactive

Conditions chromatographiques utilises

Dtecteur
Gaz vecteur
Dbit en PSI
Gaz additionnel dtecteur
Colonne Cf
Volume dinjection en l
T C dtecteur
Programmation injecteur
T C initiale
Pente en C / min
T C seuil
Dure en min
Programmation du four
T C initiale
Plateau en min
Pente en C / min
T C seuil
Pente en C / min
T C seuil

ECD
Hlium
23
Azote
tableau 2
1
320
50
150
250
52

100
2
7
220, 10 min
3
285, 5 min

Les chromatogrammes sont enregistrs et traits par un logiciel dacquisition et de traitement


des donnes .

6-Echantillonnage :
Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie

7-Mode opratoire :
7-1-Extraction de la matire grasse (Lait entier- extraction de la crme)
Si lchantillon est congel, le dcongeler temprature ambiante pendant quelques heures.

Prlever 30 ml de lait dans un tube centrifuger. Centrifuger deux fois 10 minutes


3000tpm.
Rcuprer la crme aprs chaque centrifugation, y ajouter 10 g de sulfate de sodium
anhydre.

Extraire la crme avec 30 ml de n-hexane en mlangeant laide dune spatule.


Rcuprer la phase organique et la filtrer sur sulfate de sodium dans un ballon prpes.
Extraire nouveau la matire grasse avec 3 fois 10 ml de n-hexane, les filtrer sur le
sulfate de sodium puis rincer celuici avec 10 ml de n-hexane. Evaporer lextrait sous
vide 35 C environ, jusqu 1 ml et terminer sous azote. Peser lextrait. Prlever 500
mg de graisse pour ltape de centrifugation cryognique.

7-2- Extraction cryognique


Procder la centrifugation cryognique dcrite en 6.4.1.2. de la norme NF EN 1528.
Aprs soi on continu ltape de purification ,ou on procde par la Techniques dextraction des
matrices semi-solides : de la MSPD aux Quechers

7-3-1- Purification
. Le choix entre les diffrents types de cartouches apolaires dpend de la quantit de l'extrait dpose
- une cartouche de silice greffe de type C18 de 1g a une capacit spcifique de 50 mg ;
- une cartouche polymre de 0.5g a une capacit spcifique de 100 mg.
Le protocole de purification est identique quel que soit le type de cartouche utilis.
Conditionnement :

dposer successivement sur la cartouche et luer sans asschement entre chaque solvant :

5 ml de mthanol, 5 ml dactone, 5 ml de mlange actonitrile/dichloromthane (AN/DCM)


95/5 et luer jusquau mnisque.
Reprendre l'extrait obtenu aprs extraction cryognique dans 1 ml d'un mlange AN/DCM
95/5
Le dposer sur la cartouche, luer jusquau mnisque,
laisser en contact de 3 5 min.
Eluer par 10 ml de mthanol, sec 1 goutte/3 secondes environ.
Aspirer pour rcuprer le volume retenu par la cartouche.
Evaporer lluat 35C environ sous un lger courant dazote en prsence de 100 l de
dodcane puis reprendre dans 1 ou 2 ml dhexane.

7-3-2 la Techniques dextraction des matrices semi-solides : de la MSPD


aux Quechers
Matrices semi solides : comme le Yaourts; crmes : mulsion; prsence de micelles !Huile Olive, Miel

Les tapes dextraction QuEChERS :

10 15 g matrice broye (parfois congele)


Tampon citrate (pH=5-5.5) : norme EN
Tampon actate(pH=4.8) : norme AOAC 2007-01
+ 10 ml ACN (voire actate thyle mais pas de solvants
qui solubilisent les sels, genre mthanol).
Agitation (manuelle,vortex) 1 min
Transfer dans tube contenant MgSO4
(4 g) et NaCl (1g)
(salting out matrice aqueuse vers actonitrile)

Ajout talon interne : tri-phenylphosphate


Agitation manuelle 1 min + Centrifugation 2 min
Purification : dispersive solid-phase extraction (d-SPE)
1 ml surnageant dans tube contenant un adsorbant qui pige les
impurets co-extraites
Vortex 30 s, Centrifugation
Prlvement surnageant (500 ml)
Injection : LC/MS; GC/MS

QuEChERS : les adsorbants en d-SPE (retiennent les contaminants)


MgSO4 : pigeage deau rsiduelle
PSA (amine primaire et secondaire) : Pigeage acides organiques,
sucres
C18 : adsorption composs lipidiques (cholestrol) (le lait)
GCB : pigments (carotnodes; chlorophylle), strols, mais aussi
pesticides plan (HCB) Tolune comme extractant (Shrenck)
8- Analyse par chromatographie en phase gazeuse
-Injecter 1 2 l de lextrait obtenu prcdemment en chromatographie en phase gazeuse
quipe dun dtecteur spcifique du phosphore, PFPD, FPD ou NPD, en prsence dun
talon interne (par exemple le malathion).
-analyse par GC/MS et LC-MS/MS
9- EXPRESSION

DES RESULTATS

FORMULE DE CALCUL :
Rendement de purification :

[Ht*STr]
[-----------------] aprs C18
[Ht*SInt*STr]
Tx = --------------------------------------------- x 100
[Ht*STr]
[----------------------] avant.C18
[ Ht*Sit*STr]
Les rsultants des essaies sont calcules par le logiciel qui utilise la formule suivante

[Ht*Ech ]
----------------Ht*SInt*Ech ]
Q=

[ C*STr]

---------------------------- x -------------- x Vol(Masse)xFd


[Ht*STr]

[ M*Ech]

--------------[Ht*Sint*STr]

Ht : hauteur du pic
STr : solution de travail
SInt : standard interne
Tx : taux de rcupration
Ech : chantillon
C

: concentration en ng/ml (ou en ng/g)

Vol : volume final en ml (ou Masse en g)


Fd : facteur de dilution ventuel
Q : quantit de rsidu en ng/g