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N0 ..

/SNV/2021

Dpartement de Biochimie

MEMOIRE
Prsent par : HARRAR Abd El Nacer
Pour obtenir le diplme de Magister
Option : Biochimie et physiologie exprimentale

THEME :

Activits antioxydante et
antimicrobienne dextraits de Rhamnus
alaternus L.
Soutenu publiquement le...//2012
Devant le jury

Prsident :

Pr. Benboubetra Mustapha

Pr. Universit de Stif

Rapporteur :

Dr. Belhattab Rachid

Dr. Universit de Stif

Examinateur :

Pr. Laouar Hocine

Pr. Universit de Stif

Dr. Zerroug Mohamed Mihoub

Dr. Universit de Stif

Anne universitaire 2011-2012

DEDICACE
Je ddie ce travail mes Parents quils trouvent ici toute ma
gratitude
Pour leur soutien tout le long de mes tudes
A ma Sur et mes Frres
mes Amis
A ceux qui mont tout donn sans rien en retour

REMERCIEMENTS

Je remercie DIEU tout puissant, matre des cieux et de la terre,


qui ma permis de mener bien ce travail.
Tout d'abord je tiens surtout adresser mes plus vifs
remerciements mon promoteur Mr. Belhattab Rachid, Matre
de confrences qui ma fait lhonneur de raliser ce travail sous
sa direction, pour sa grande patience, pour sa disponibilit et
ses conseils judicieux.
Je remercie galement Mr Benboubetra Mustapha, Professeur
la facult des Sciences de la Nature et de la Vie luniversit
de Stif davoir accept de prsid le jury.
Je remercie Mr Laouar Houcine, Professeur la facult des
Sciences de la Nature et de la Vie luniversit de Stif davoir
accept de juger ce modeste travail et participer au jury.
Je remercie Mr Zerroug Mohamed Mihoub, Matre de confrences
la facult des Sciences de la Nature et de la Vie luniversit
de Stif, davoir accept dtre parmi les membres du jury de ce
mmoire.
Je remercie toute personne ayant contribu de prs ou de loin
la ralisation de ce travail.
Un grand merci tous

Sommaire
Rsums
Liste des abrviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction ........................................................................................................................... 1

Partie bibliographique
Chapitre I
Proprits biologiques de Rhamnus alaternus L.
1.

Proprits botaniques ..................................................................................................... 2


1.1.

Gnralits ............................................................................................................. 2

1.2.

Classification .......................................................................................................... 2

1.3.

Caractristiques morphologiques ............................................................................ 2

1.4.

Nomenclature ......................................................................................................... 5

1.5.

Ecologie et rpartition gographique ....................................................................... 5

2.

Usage traditionnel .......................................................................................................... 5


3.

Proprits biochimiques ............................................................................................. 5

Chapitre II
Les polyphnols
1.

2.

Les composs phnoliques ............................................................................................. 7


1.1.

Gnralits ............................................................................................................. 7

1.2.

Biosynthse des composs phnoliques .................................................................. 7

1.3.

Principales classes des polyphnols ........................................................................ 8

Activits biologiques .................................................................................................... 14


2.1.

Activit antioxydante ............................................................................................ 14

2.2. Activit antimicrobienne ........................................................................................... 17

Partie Exprimentale
Chapitre III
MATERIEL ET METHODES
1.

2.

Matriel........................................................................................................................ 20
1.1.

Matriel vgtal .................................................................................................... 20

1.2.

Appareils et produits chimiques ............................................................................ 20

1.3.

Les souches microbiennes utilises ....................................................................... 20

Mthodes danalyses .................................................................................................... 21


2.1.

Prparation des extraits ......................................................................................... 21

1.2.

Analyse chimique ................................................................................................. 25

1.3.

Activit antioxydante ............................................................................................ 27

1.4.

Activit antimicrobienne ....................................................................................... 29

Chapitre VI
Rsultats et discussion
1.

Rsultats et discussion .................................................................................................. 31


1.1.

Rendements des extractions .................................................................................. 31

1.2.

Composition chimique .......................................................................................... 31

1.3.

Lactivit antioxydante et antiradicalaire .............................................................. 37

1.4.

Lactivit antimicrobienne .................................................................................... 46

Conclusion ........................................................................................................................... 58
Rfrences bibliographiques ................................................................................................ 59
Annexes ............................................................................................................................... 67

Rhamnus alaternus

Rhamnaceae

Soxhlet

()EMR

% 11

% 10

)(EMTF

( )EATF ( )EAR % 6 ( % 8/)


. Folin-Ciocalteu
36 7 / ( )EATF ( )EMTF ,
7

19

/ ( )EMR( )EAR

6 14 18 AlCl3 5 /
EMR ,EMTF ,EAR ,EATF
2 6 7 2 / .
/ 72

% 82

% 95 BHT 2/ . )CI50( % 50
(DPPH.) 1-picrylhydrazyl 37
66 EATF EAR 71

11

2,2-diphenyl-

52 BHT EMR

/ .EMTF

+ 3

( .)EMR
6,25/ :

faecalis K. pneumoniae S. aureus E. coli

()CMI

E. 0.2/

.aeruginosa

,. Rhamnus alaternus , , .

P.

Abstract
Rhamnus alaternus L. a shrub which belongs to the Rhamnaceae family. Its a
medicinal plant largely used in Algerian traditional medicine. The aerial parts of the plant
(stems and leaves) were subjected to maceration in methanol (EMTF), whereas the roots were
extracted with methanol (EMR) using a Soxhlet apparatus. The decoction has been conducted
both on the aerial parts (EATF) and roots (EAR) using distilled water. The yields were 11 %,
10 %, 6 % and 8 % (w/w) for EMTF, EMR, EATF and EAR respectively. Total phenolic
contents were determined using Folin-Ciocalteu reagent and found to be 36 (EATF), 19
(EAR), 7 (EMTF) and 7 (EMR) mg cafeic acid equivalent/ g of fresh weight. Flavonoids were
evaluated by AlCl3 method and shown to be 18 (EATF), 14 (EAR), 6 (EMTF) and 5 (EMR)
mg quercetin equivalent/ g of fresh weight. The flavones and flavonols were estimated to be 7
(EATF), 6 (EAR), 2 (EMTF) and 2 (EMR) mg quercetin equivalent/ g of fresh weight.
Antioxidant activity was evaluated using -carotene/linoleic acid system, it ranged between
72 and 82 % for all extracts and seems to be closed to that of BHT 95 % when used at 2
mg/ml. Free radical scavenging effects were evaluated using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH.), The 50 percent inhibitory concentration for DPPH. (IC50) were 37 (BHT), 52
(EMR), 66 (EATF), 66 (EAR) and 71 g/ml (EMTF). The antimicrobial sensitivity of the
extracts towards eleven bacterial strains (Gram+ and Gram-) and three fungi strains was
assessed using to the disc diffusion agar test; only one extract (EMR) has developed an
inhibitory effect against five bacteria tested namely E.coli, S.aureus, K. pneumoniae , E.
faecalis and P.aeruginosa. The minimal Inhibitory Concentrations (MICs) was 0,2 mg/ml for
P.aeruginosa and 6,25 mg/ml for the remaining bacteria.

Key word: phenolic content, Rhamnus alaternus L., antimicrobial activity, antioxidant
activity.

Rsum
Rhamnus alaternus L. est un arbuste qui appartient la famille des Rhamnaceae. Cest
une plante mdicinale largement utilise en mdecine traditionnelle en Algrie. La partie
arienne de la plante (tiges et feuilles) a t soumise une macration dans le mthanol
(EMTF), alors que lextrait mthanolique des racines (EMR) est obtenu par extraction au
Soxhlet, la dcoction est ralise sur la partie arienne (EATF) et les racines (EAR) dans leau
distille. Les rendements taient de 11 %, 10 %, 6 % et 8 % (m/m) pour EMTF, EMR, EATF
et EAR respectivement. La teneur en polyphnols totaux a t dtermine en utilisant le
ractif de Folin-Ciocalteu, elle est de 36 (EATF), 19 (EAR), 7 (EMTF) et 7 (EMR) mg
quivalent dacide cafique/ g de matire fraiche. Les flavonodes ont t valus par la
mthode utilisant les chlorures daluminium AlCl3, la teneur est estime 18 (EATF), 14
(EAR), 6 (EMTF), 5 (EMR) mg quivalent querctine/ g de matire fraiche. Le dosage des
flavones et flavonols a rvl des teneurs de 7 (EATF), 6 (EAR), 2 (EMTF) et 2 (EMR) mg
quivalent querctine/ g de matire fraiche. Lactivit antioxydante a t ralise par la
mthode de dcoloration du -carotne / acide linolique en utilisant des concentrations de 2
mg/ml pour les quatre extraits et varie entre 72 et 82 % alors que celle du tmoin positif BHT
est de 95 %. Quant au test anti radicalaire valu en utilisant le 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyle (DPPH.), les concentrations inhibitrices 50 % (CI 50) sont estimes 37
(BHT), 52 (EMR), 66 (EATF), 66 (EAR) et 71 g/ml (EMTF). Lactivit antimicrobienne a
t dtermine sur onze souches bactriennes (Gram+ et Gram-) et trois champignons selon la
mthode de diffusion de disque, un seul extrait (EMR) a manifest un effet inhibiteur sur 5
souches bactriennes. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour E.coli, S.aureus,
K. pneumoniae et E. faecalis est de 6,25 mg/ml et 0,2 mg/ml pour P.aeruginosa.

Mots cls: Polyphnols, Rhamnus alaternus L., activit antimicrobiennes, activit


antioxydante.

Liste des abrviations


AAR : Activit antioxydante relative.
Abs : Absorption.
ATCC : American type culture collection = Collection amricaine des cultures type.
BHT : Butylhydroxytoluene.
CI50 : Concentration inhibitrice 50 %.
CMB : Concentration minimale bactricide.
CMI : Concentration minimale inhibitrice.
DMSO : Dimethylsulfoxyde.
DO : Densit optique.
DPPH : 2,2-diphnyl-1-picrylhydrazyle.
EAC : Equivalent en acide cafique.
EAG: Equivalent en acide gallique.
EAR : Extrait aqueux des racines.
EATF : Extrait aqueux tiges et feuilles.
EMR : Extrait mthanolique des racines.
EMTF : Extrait mthanolique tige et feuille.
EQ : Equivalent en querctine.
m/m : Masse par masse.
MF : Matire fraiche.
R2 : Coefficient de corrlation.
ROS : Reactive oxygen species = Espces ractifs de loxygne.
UV : Ultraviolet.

Liste des figures


Figure 1 : Rhamnus alaternus................................................................................................. 3
Figure 2 : Fleures, nectar, friuts et pollen de R. alaternus ....................................................... 4
Figure 3 : Structures chimiques de quelques flavonodes de R. alaternus................................ 6
Figure 4 : Principaux acides hydroxycinnamiques .................................................................. 9
Figure 5 : Principaux acides hydroxybenzoques .................................................................... 9
Figure 6 : Principaux types de coumarines ............................................................................. 9
Figure 7 : Structure chimique de base des flavonodes .......................................................... 10
Figure 8 : les systmes de dfense contre les radicaux libres ................................................ 16
Figure 9 : Protocole de prparation de l'extrait aqueux ......................................................... 22
Figure 10 : Protocole de prparation de l'extrait EMTF par macration ................................ 23
Figure 11 : Systme d'extraction au Soxhlet ......................................................................... 24
Figure 12 : Comparaison des rendements des quatre extraits de R. alaternus ........................ 32
Figure 13 : Courbe d'talonnage dacide cafique pour le dosage des polyphnols totaux ..... 33
Figure 14 : Teneurs en polyphnols des quatre extraits ......................................................... 33
Figure 15 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavonodes totaux ...... 35
Figure 16 : Teneurs en flavonodes totaux des quatre extraits ............................................... 35
Figure 17 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavones et flavonoles . 36
Figure 18 : Teneurs en flavones et flavonols des quatre extraits............................................ 36
Figure 19 : Comparaison des diamtres des halos de rtention de couleur............................. 39
Figure 20 : Cintique de blanchissement du - carotne 470 nm ........................................ 41
Figure 21 : Activit antioxydante relative des extraits, BHT et contrle ngatif aprs 48 h ... 41
Figure 22 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration du BHT ....... 43
Figure 23 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EMR ....... 43
Figure 24 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EATF ...... 44
Figure 25 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EAR ........ 44
Figure 26 : : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EMTF ... 45
Figure 27 : Activit anti-radicalaire des extraits de R. alaternus et le BHT ........................... 45
Figure 28 : Effet du DMSO sur les bactries et les champignons tudis .............................. 47
Figure 29 : Effet des antibiotiques sur les bactries tudies ................................................. 52

Liste des tableaux


Tableau 1 : Classification scientifique de R. alaternus ............................................................ 2
Tableau 2 : Rsultats du test visuel de -carotne ................................................................. 37
Tableau 3 : Diamtre de zone dinhibition en mm en prsence de quelques antibiotiques ..... 51
Tableau 4 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec E. coli .............................. 56
Tableau 5 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec P. aeruginosa .................. 56
Tableau 6 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec S. aureus. ........................ 56
Tableau 7 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec E. faecalis........................ 57
Tableau 8 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec K. pneumoniae................. 57
Tableau 9 : Les CMI exprimes pour EMR sur les souches testes en mg/ml ....................... 57
Tableau 10 : Effet des quatre extraits de R. alaternus sur les champignons tudis ............... 57

INTRODUCTION

Introduction
Les plantes mdicinales restent encore le premier rservoir de nouveaux mdicaments.
Elles sont considres comme source de matire premire essentielle pour la dcouverte de
nouvelles molcules ncessaires la mise au point de futurs mdicaments (Maurice, 1997).
Ltude de la chimie des plantes est toujours dune brlante actualit malgr son
anciennet. Cela tient principalement au fait que le rgne vgtal reprsente une source
importante dune immense varit de molcules bioactives. Cette matire vgtale contient un
grand nombre de molcules qui ont des intrts multiples mis profit dans lindustrie
alimentaire, en cosmtologie et en pharmacie. Parmi ces composs on retrouve, les
coumarines, les alcalodes, les acides phnoliques, les tannins, les terpnes et les flavonodes
(Bahorun et al., 1996).
Les polyphnols sont en effet dous de multiples vertus thrapeutiques, ils jouent un
rle trs important, principalement, dans la lutte contre les cancers, les maladies
cardiovasculaires et la peroxydation lipidique. Expliquant de ce fait leur grande utilisation
dans la fabrication des mdicaments. Ils interviennent aussi dans la protection des plantes
contre les diffrentes attaques microbiennes (surtout fongiques) risquant de causer la perte
dune grande quantit de vgtation (Bruneton, 1999).
Cependant, lvaluation des proprits phytopharmaceutiques, antioxydante et
antimicrobienne demeure une tache trs intressante et utile, en particulier pour les plantes
dune utilisation rare ou moins frquente ou non connue dans la mdecine traditionnelle. Ces
plantes reprsentent une nouvelle source de composs actifs (Teixeira da Silva, 2004).
Le genre Rhamnus (Rhamnaceae) inclut des espces vgtales mdicinales bien connue
possdants diverses proprits biologiques (Mai et al., 2001). Les proprits thrapeutiques de
lespce Rhamnus alaternus L. ont t mises en vidence in vitro, elles sont dues des
composs actifs tels que les polyphnols (Ammar et al., 2008).
Quoique certains auteurs de pays mditerranens ont entrepris des tudes limites sur
cette plante (Ben Ammar et al., 2007; Ben Ammar et al., 2008; Djeridane et al., 2007),
surtout sur la composition de ses huiles essentielles, en Algrie, du moins notre
connaissance cette espce vgtale na pas fait lobjet dtudes antrieures.
Lobjectif de notre tude est destimer la teneur de cette espce vgtale en ces
composs actifs essentiels, les polyphnols obtenus dans les diffrentes parties de la plante et
den valuer leur pouvoir biologique.

PARTIE
BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I

Proprits biologiques de
Rhamnus alaternus L.

Etude Bibliographique

Chapitre I : Proprits biologiques de R. alaternus

1. Proprits botaniques
1.1.

Gnralits

Rhamnus alaternus L. est une espce vgtale qui appartient la famille des
Rhamnaceae, les plantes de cette famille sont utilises en mdecine traditionnelle et en
prparation culinaire, cest une famille cosmopolite darbres, arbustes et herbaces qui
contient environ 50 genres et 900 espces (Richardson et al., 2000). En Algrie, 9 espces
vgtales appartenant 3 genres sont rpertories dans diverses rgions et classes selon leurs
caractristiques morphologiques (Quezel et Santa, 1963).

1.2.

Classification

La classification des plantes de la famille des Rhamnacea est la suivante (Tab. 1)


(MobileReference, 2008).
Tableau 1 : Classification scientifique de R. alaternus

Rgne

Plantae

Division

Magnoliophyta

Classe

Magnoliopsida

Ordre

Rhamnales

Famille

Rhamnaceae

Genre

Reynosia

Sous genre

Rhamnus

Espce

Rhmanus alaternus

Sous espce

R. alaternus eu-alaternus Maire (Quezel


et Santa, 1963)

Tableau 1 : Classification scientifique de R. alaternus

1.3.

Caractristiques morphologiques

Rhamnus alaternus L. est un Arbuste toujours vert, parfois trs grand, feuilles
luisantes, ovodes ou lancoles, sont alternes, lisses, ptioles (3-6 cent, sur 2-3), bords
cartilagineux et dentes, Elles restent sur larbre pendant deux annes environ, coriaces,
nervure mdiane paisse, trinerves la base; stipules linaires, caduques; grappes axillaires
plus longues que le ptiole, multiflores; fleurs dioque verdtres, disposes en grappes denses,
ttra-pentamres, ptales nuls, trs petites; baie ou fruit petite cest est une drupe 2 ou 3
sillons extrieurs, rouge puis noire, 4 noyaux , partout, broussailles, haies (Battandier et al.,
1888). La tige est dresse et rameuse ; les rameaux sont alternes, non pineux (Fig. 1 et 2)
(Chancerel, 1920).
2

Etude Bibliographique

Chapitre I : Proprits biologiques de R. alaternus

La croissance de R. alaternus est lente, sa longvit considrable. Son bois est fibre
courte et cassante, trs lourd, trs homogne, d'un grain fin, blanc jauntre ltat daubier,
brun clair ou fonc l'tat parfait comme le chne. Il prend beaucoup de retrait et exhale,
quand on le travail, une odeur dsagrable (Mathieu, 1860).

Figure 1 : Rhamnus alaternus

Figure 1 : Rhamnus alaternus L. (Penzig, 1902).

Etude Bibliographique

Chapitre I : Proprits biologiques de R. alaternus

Figure 2 : Fleures, nectar, friuts et pollen de R. alaternus

Figure 2 : Fleures, nectar, friuts et pollen de R. alaternus (Aronne et Wilcock, 1995).


a : Fleure male, b : Fleure femelle, c : vue des grains de pollen, d : vue d'un nectar avec les
stomates modifis, e : vue des tubes de pollen dans le canal du pistil aprs la dcoloration
avec du bleu d'aniline, f : fruits rouges et noirs montrant le changement d'agrandissement et
de couleur des fruits pendant la maturation, Barres : a et b = 1 mm, c et d = 10 m, f = 1 cm.

Etude Bibliographique

1.4.

Chapitre I : Proprits biologiques de R. alaternus

Nomenclature

En arabe : Amlilece, Mlila, Soitfar, Oud El-khir ou bien Safir. En Kabyl : Mlils
(Bhouri et al., 2012; Debeaux, 1984). En anglais : Buckthorn. En Franais : Nerprun, En
Allemand : Krelzdorn. En Espagnol : Aladierna, Cosco Unia, Sanguino de Andalucia. En
Italien : Alaterno, Legno Puzzo (Gubb, 1913).

1.5.

Ecologie et rpartition gographique

Cet arbrisseau est caractristique de la zone littorale et, uni aux lentisques, larbousier,
au myrte et dautres plantes feuilles persistantes, il joue un rle important dans la
composition des maquis qui couvrent une bonne partie du littoral et des les de la
Mditerrane. En France, il se trouve encore dans lIsre, lArdche, lAveyron, le Lot, la
Vienne, le Maine-et-Loire et en Bretagne (Penzig, 1902). R. alaternus habite les coteaux secs
et calcaires du Sud de la France, de la Corse, de l'Algrie, du Nord de la Tunisie (Ben Ammar
et al., 2008; Chancerel, 1920).

2. Usage traditionnel
En mdecine traditionnelle R. alaternus a t employ en tant que digestif, diurtique,
laxatif, hypotensif et pour le traitement des complications hpatiques et dermatologiques
(Bhouri et al., 2012). Les baies de R. alaternus ont une action purgative, d'une saveur pre,
employs en mdecine vtrinaire (Gubb, 1913). Les feuilles en infusion constituent des
gargarismes astringents (Chancerel, 1920). A cause de son feuillage persistant, touffu et
sombre, R. alatenms est souvent cultiv dans les parcs, comme plante ornementale, pour
former des passifs ou des haies compactes; il fait un trs joli effet, surtout lorsquil est charg
de ses fruits qui sont des baies globuleuses, luisantes et rouges. Son bois, dun grain fin et
compact, peut servir des travaux de menuiserie (Penzig, 1902), cest un petit arbrisseau
charmant, trs recherch pour la dcoration des jardins et des bosquets. Il fleurit vers la fin du
printemps (Bergeret et al., 1909).

3. Proprits biochimiques
Ltude phytochimique sur les extraits de la partie arienne et les racines de R.
alaternus a rvl La prsence de diverses quantits danthraquinones, de coumarines, de
tannins et en particulier des flavonodes (Ben Ammar et al., 2008).
Gnralement, les espces du genre Rhamnus contiennent des anthraquinones telles que
l'modine ou chrysophanol (Wei et al., 1992), leurs formes rduites ou leurs glycosides
(Abegaz et Peter, 1995), tandis que dautres contiennent des flavonodes (Marzouk et al.,
1999). Trois flavonodes tri-glycosidiques ont t isols partir des feuilles de R. alaternus, le
5

Etude Bibliographique

Chapitre I : Proprits biologiques de R. alaternus

Kaempferol 3-O--isorhamninoside, rhamnocitrin 3-O- isorhamninoside et le rhamnetin-3O isorhamninoside, en revanche, trois flavonodes aglycones ont t identifis :
lapignine, le kaempferol et la querctine (Ammar et al., 2009). Dans une autre tude quatre
anthraquinones aglycones ont t isoles (Fig. 3) partir de la partie arienne de la plante :
l'modine tait l'aglycone le plus abondant, il a t trouv dans toutes les parties examines de
la plante, en mme temps, cest le seule aglycone dtecte dans les graines et dans le
pricarpe mr, le Chrysophanol existe abondamment dans les parties les plus jeunes de la
plante mais totalement absent dans les feuilles entirement mres. Alaternin atteint sa
concentration maximale dans l'corce. Le quatrime anthraquinone, le Physcion a t trouv
dans toutes les parties de la plante lexception des graines et du pricarpe mr (Abou-chaar
et Shamlian, 1980).

R = H Emodine

R = OCH3 Physcion

R = OH Alaternine (Bortolomeazzi et al., 2007)

R = OH Emodine
R = H Chrysophanol (Jain et
Patil, 2010)

Kaempferol (Jain et Patil,

Querctine (Jain et Patil,

Apignine (Kawasaki et al.,

2010)

2010)

2010)

Figure 3 : Structures chimiques de quelques flavonodes de R. alaternus

Figure 3 : Structures chimiques de quelques flavonodes de R. alaternus.

Chapitre II

LES POLYPHENOLS

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

1. Les composs phnoliques


1.1.

Gnralits

Les composs phnoliques sont des mtabolites secondaires vgtaux. Ils peuvent tre
dfinis comme des molcules indirectement essentielles la vie des plantes (do la
dnomination de mtabolites secondaires). Par opposition aux mtabolites primaires qui
alimentent les grandes voies du mtabolisme basal, mais ils sont essentiels dans l'interaction
de la plante avec son environnement.
Ces composs ont tous en commun la prsence dun ou de plusieurs cycles benzniques
portant une ou plusieurs fonctions hydroxyles. La structure des composs phnoliques
naturels varie depuis les molcules simples (acides phnoliques simples) vers les molcules
les plus hautement polymrises (tanins condenss). Avec plus de 8000 structures
phnoliques identifies (Urquiaga et Leighton, 2000).
Les composs phnoliques peuvent constituer des signaux de reconnaissance entre les
plantes, ou bien lui permettant de rsister aux diverses agressions vis--vis des organismes
pathognes. Ils participent de manire trs efficace la tolrance des vgtaux des stress
varis, donc ces composs jouent un rle essentiel dans l'quilibre et ladaptation de la plante
au sein de son milieu naturel, D'un point de vue thrapeutique, ces molcules constituent la
base des principes actifs que l'on trouve dans les plantes mdicinales (Macheix et al., 2005).

1.2.

Biosynthse des composs phnoliques

1.2.1. La voie de Shikimate


Cest souvent la voie de biosynthse des composs aromatiques, elle joue un rle
critique pour contrler le mtabolisme de la voie de phnylpropanoide (Yao et al., 1995).
1.2.2. La voie des phnylpropanoides
La voie de phnylpropanoide commence par la phnylalanine (Phe) qui fournit en plus
des principaux acides phnoliques simples, coumarines, isoflavonodes, flavonodes, acide
salicylique, des prcurseurs de lignine, qui est quantitativement le second biopolymre le plus
important aprs la cellulose.
1.2.3. La voie de biosynthse des flavonodes
Tous les flavonodes ont une origine biosynthtique commune et, de ce fait, possdent
le mme lment structural de base, Ltape cl de la formation des flavonodes est la
condensation, catalyse par la chalcone synthase, dune unit phnyle propanode avec trois

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

units malonyl-CoA. Cette chalcone est lintermdiaire caractristique de la synthse des


divers flavonodes (Bruneton, 1999).

1.3.

Principales classes des polyphnols

1.3.1. Les acides phnoliques simples


1.3.1.1.

Acides hydroxycinnamiques

Drivent de l'acide cinnamique et ont une structure gnrale de base de type (C6-C3).
Existent souvent sous forme combine avec des molcules organiques. Les degrs
d'hydroxylation et de mthylation du cycle benznique, conduisent une ractivit chimique
importante de ces molcules (Fig. 4).
1.3.1.2. Acides hydroxybenzoques
Sont des drivs de l'acide benzoque et ont une structure gnrale de base de type (C6-C1).
Ces molcules existent souvent sous forme d'esters ou de glycosides. Les acides
hydroxybenzoques les plus abondants sont rpertoris dans la figure (5).
1.3.1.3. Coumarines
Les coumarines drivent des acides hydroxycinnamiques par cyclisation interne de la
chane latrale. Les coumarines ont frquemment un rle cologique ou biologique (Fig. 6).

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols


R1

R2

R3

Acides phnoliques

Acide cinnamique

OH

Acide p coumarique

OH

OH

Acide cafique

OCH3

OH

Acide frulique

OCH3

OH

OCH3

Acide sinapique

Figure 4 : Principaux acides hydroxycinnamiques

Figure 4 : Principaux acides hydroxycinnamiques (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006).

R1

R2

R3

R4

Acides phnoliques

Acide benzoque

OH

OH

OH

OCH3

OH

Acide vanillique

OH

OH

OH

Acide gallique

OCH3

OH

OCH3

Acide syringique

OH

Acide salicylique

OH

OH

Acide gentisique

Acide p hydroxy
benzoque
Acide
protocatechique

Figure 5 : Principaux acides hydroxybenzoques

Figure 5 : Principaux acides hydroxybenzoques (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006).

R6

R7

R8

Acides phnoliques

OH

Umbellifrol

OH

OH

Aescultol

OCH3

OH

Scopoltol

OCH3

OH

OH

Fraxtol

OH

OH

Daphntol

Figure 6 : Principaux types de coumarines

Figure 6 : Principaux types de coumarines (Macheix et al., 2005).

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

1.1.1. Les flavonodes


1.1.1.1.

Gnralits

Le nom flavonode proviendrait du terme flavedo, dsignant la couche externe des


corces d'orange (Piquemal, 2008), cependant d'autres auteurs supposaient que le terme
flavonode a t plutt prt du flavus ; (flavus = jaune) (Male_ev et Kunti_, 2007).
Les flavonodes ont t dsigns sous le nom de vitamine P, en raison de leur efficacit
normaliser la permabilit des vaisseaux sanguins, cette dnomination fut abandonne
lorsqu'on se rendit compte que ces substances ne correspondaient pas la dfinition officielle
des vitamines, il devient clair que ces substances appartiennent aux flavonodes (Nijveldt et
al., 2001).
Les travaux relatifs aux flavonodes sont multiples depuis la dcouverte du clbre
"french paradox" correspondant un bas taux de mortalit cardiovasculaire observ chez les
habitants des rgions mditerranennes, associant une consommation de vin rouge une prise
importante de graisses satures, Prs de 4000 flavonodes ont t dcrits (Ghedira, 2005).
1.1.1.2.

Structure chimique et classification

La structure de base des

flavonodes est le noyau du flavone (2-phenyl-benzo--

pyrane) mais de point de vue classification, le groupe des flavonodes peut tre divis en
plusieurs catgories. Cette division dpend de lhydroxylation du noyau du flavonode aussi
bien que du sucre li.
Tous les flavonodes ont une origine biosynthtique commune, et de ce fait, possdent
le mme lment structural de base, savoir lenchanement phenyl-2 chromane. (Fig. 7) Ils
peuvent tre regroups en diffrentes classes selon le degr doxydation de noyau pyranique
central (Krishna et al., 2001).

Figure 7 : Structure chimique de base des flavonodes

Figure 7 : Structure chimique de base des flavonodes (Krishna et al., 2001).

10

Etude Bibliographique
1.1.1.3.

Chapitre II : Les polyphnols

Localisation et distribution des flavonoides

Les flavonodes sont largement rencontrs dans le rgne vgtal. On signale environ 2%
de la proportion du carbone photosynthtique global incorpor dans la biosynthse
flavonique. Ils sont cependant rares chez les vgtaux infrieurs. De plus, leur localisation au
sein de la plante est caractristique. En effet, les flavonodes sont omniprsents dans les
organes ariens jeunes o ils sont localiss dans les tissus superficiels (Remsy et al., 1996).
Au niveau cellulaire, on a observ que les flavonodes, sous forme dhtrosides, sont
dissous dans le suc vacuolaire ou localiss dans les chloroplastes et les membranes des
vgtaux. Lorsque les flavonodes sont prsents dans la cuticule foliaire, il sagit presque
toujours de gnines libres dont la lipophilie est accrue par la mthylation partielle ou totale
des groupes hydroxyles (Bruneton, 1993).
En dfinitive, les flavonodes possdent une large rpartition dans le monde vgtal. Ils
sont largement abondants dans les lgumes feuills (salade, choux, pinards, etc.), ainsi que
dans les tguments externes des fruits. On les trouve principalement dans les agrumes :
citrons, orange, pamplemousses et dans une moindre mesure : abricots, cerises, mres, raisins,
papayes, tomates et sarrasin. On en trouve galement en quantit importante dans nombreuses
plantes mdicinales et trs spcifiquement dans les herbes aromatiques comme le thym, le
persil, le romarin et le cleri (Bronner et Beecher, 1995).
1.1.1.4.

Biodisponibilite des flavonoides

Les effets des flavonodes sur la sant ne dpendent pas seulement de leurs niveaux de
consommation mais aussi de leur biodisponibilit. Peu dtudes systmatiques ont t menes
sur la pharmacocintique des flavonodes chez lhomme. Toutefois, daprs des expriences
menes sur des flavonodes provenant de lalimentation, il apparat que seuls les flavonodes
sous forme de gnines (ou aglycones) sont susceptibles dtre absorbs. Lhydrolyse des
liaisons htrosidiques (reliant la gnine la chane sucre) nintervient que dans le clon o
les micro-organismes dgradent simultanment les flavonodes dorigine alimentaire. Le foie
est largement impliqu dans le mtabolisme des flavonodes absorbs, Une meilleure
connaissance de la biodisponibilit des flavonodes est indispensable pour expliquer leurs
effets protecteurs sur la sant (Walle, 2004).

11

Etude Bibliographique
1.1.1.5.

Chapitre II : Les polyphnols

Quelques proprits des flavonodes

Les flavonodes protgent les plantes contre les radiations UV, elles sont galement
impliques dans les processus de dfense de la plante contre les infections bactriennes et
virales. Agissent comme des pigments ou des co-pigments. Peuvent moduler la distribution
dauxine, comme elles fonctionnent comme des signaux molculaires de reconnaissance entre
les bactries symbiotiques et les lgumineuses afin de faciliter la fixation de lazote
molculaire. Agis sur la rgulation de llongation des tiges et interviennent dans la maturit
des fruits. Sont lorigine des gots amers et astringents afin de repousser les animaux
herbivores (Subramanian et al., 2007).
1.1.2. Les tannins
1.1.2.1.

Gnralits

Les tannins sont des composs phnoliques trs abondants chez les angiospermes, les
gymnospermes (tannins condenss) et les dicotyldones (tannins hydrolysables). Ces
composs ont la capacit de se combiner et de prcipiter les protines. Ces combinaisons
varient dune protine une autre selon les degrs daffinits (Harborne, 1997).
Le terme tannin vient de la source de tannins utilise pour le tannage des peaux
danimaux en cuir. Dans ce processus, les molcules de tannins se lient aux protines par des
liaisons rsistantes aux attaques fongiques et bactriennes. Le poids molculaire des tannins
varie entre 500 et 2000 K Da (3000 pour les structures les plus complexes) (Hagerman et
Butler, 1981).
Dans notre alimentation, lastringence est la qualit organoleptique qui indique la
prsence des tannins. Elle a un rle important dans le choix des aliments (corrlation inverse
entre les espces vgtales choisies et leur teneur en tannins) (Larwence et al., 1984).
1.1.2.2.

Types et structures

Selon la structure, on a deux types de tannins : les tannins hydrolysables et les tannins
condenss, dits aussi : proanthocyanidines.
1.1.2.2.1. Les tannins hydrolysables
Sont forms par liaison de plusieurs acides galliques un carbohydrate (gnralement
le glucose). On parle de gallotannins. Aussi des units galloyles peuvent tre ajoutes par
liaisons esters, gnralement en position C3 de lacide gallique. Et les units dacide gallique
voisines saccouplent formant les esters dacide hexahydroxydiphnique, dits : ellagitannins.

12

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

Ces deux groupes, les gallotannins et les ellagitannins sont appels tannins
hydrolysables. Comme leur nom lindique, ces composs peuvent tre dgrads en fragments
simples (acides phnols et sucres).
Lacide gallique provient de la -oxydation des composs C6-C3, comme lacide
coumarique ou les acides oxygns correspondants. Mais, lacide shikimique est considr
comme le meilleur prcurseur (Seigler, 1998).
1.1.2.2.2. Les tannins condenss
Ce sont des proanthocyanidines, composs phnoliques htrognes : dimres,
oligomres ou polymres du flavanes, flavan-3-ols, 5-flavanols, 5-deoxy-3-flavanols et
flavan-3,4-diols (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006).
Les deux groupes majeurs des proanthocyanidines sont les procyanidines et les
prodelphinidines. Les monomres constitutifs des procyanidines sont la catchine et
lpicatchine qui peuvent tre substitues par lacide gallique ou des sucres, gnralement en
position 3 ou plus rarement en position 7. Ces monomres de prodelphinidines sont la
gallocatchine et lpigallocatchine, mais on distingue galement des monomres de
querctine et de myrictine (Andersen et Markham, 2006).
En shydrolysant, les tannins condenss ne donnent pas de composs simples comme le
glucose ou les acides phnols comme cest le cas pour les tannins hydrolysables, mais plutt
des anthocyanidines (Andersen et Markham, 2006).
1.1.2.3.

Proprits pharmacologiques des tannins

Plusieurs observations, chez les humains comme chez les animaux de laboratoires
suggrent que les tannins exhibent un large spectre de proprits pharmaceutiques,
thrapeutiques et chimioprotectrices dues leur proprit antiradicalaire (Tohge et al., 2005).
En effet, les tannins protgent contre les toxicits induites par diffrents agents
(hydrogne peroxyde, actaminophne, extraits contenus dans la fums du tabac), contre
lhypercholestrolmie et les changements de la formule sanguine (ALT, BUN et CK). Ils
jouent aussi un rle dans la prvention contre les deux formes de mort cellulaire connues,
apoptose et ncrose, diminuant ainsi les dommages causs dans lADN lors de ces deux
dernires. Laction cytoprotectrice des proanthocyanidines est suprieure celle des vitamines
C, B et btacarotne (Ray et al., 2000).

13

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

2. Activits biologiques
2.1.

Activit antioxydante

De nos jours, Il existe un intrt croissant vis--vis de la biologie des radicaux libres.
Ce nest pas seulement d leur rle dans des phnomnes aigus tels que le traumatisme ou
lischmie, mais aussi leur implication dans de nombreuses pathologies chroniques
associes au vieillissement tels que le cancer, les maladies cardiovasculaires et inflammatoires
et la dgnrescence du systme immunitaire (Guinebert et al., 2005).
2.1.1. Dfinition dun radical libre
Les radicaux libres sont des atomes ou des molcules portant un lectron non appari.
Cette proprit rend ces lments trs ractifs du fait de la tendance de cet lectron se rapparier, dstabilisant ainsi dautres molcules. Les molcules ainsi transformes deviennent
leur tour dautres radicaux libres et initient ainsi une raction en chane. Cest typiquement
ce qui se passe lors de la peroxydation lipidique (Dacosta, 2003).
Parmi toutes les espces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il
convient de distinguer un ensemble restreint de composs radicalaires qui jouent un rle
particulier en physiologie et que nous appellerons radicaux libres primaires, qui drivent
directement de loxygne. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires (radical
peroxyle ROO, radical alkoxyle RO), se forment par raction de ces radicaux primaires sur
les composs biochimiques de la cellule (Novelli, 1997).
Lensemble des radicaux libres primaires est souvent appel espces ractives de
loxygne (ROS). Cette appellation nest pas restrictive. Elle inclut les radicaux libres de
loxygne proprement dit : radical superoxyde O2, radical hydroxyl OH, monoxyde dazote
NO, mais aussi certains drivs oxygns ractifs non radicalaires dont la toxicit est
importante : loxygne singulet 1O2, peroxyde dhydrogne H2O2, peroxynitrite ONOO
(Favier, 2003).

14

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

2.1.2. Les antioxydants


Les antioxydants sont des substances capables de neutraliser ou de rduire les
dommages causs par les radicaux libres dans lorganisme et permettent de maintenir au
niveau de la cellule des concentrations non cytotoxiques de ROS. Notre organisme ragit
donc de faon constante cette production permanente de radicaux libres et on distingue au
niveau des cellules deux lignes de dfense ingalement puissantes pour dtoxifier la cellule
(Favier, 2003).
2.1.2.1.

Les antioxydants primaires

La cellule est pourvue denzymes antioxydantes qui sont des systmes de dfense trs
efficaces. Cette ligne de dfense est constitue de superoxyde dismutase (SOD), de catalase et
de peroxydase (glutathion et ascorbate) (Favier, 2006). Ces enzymes antioxydantes permettent
llimination des radicaux libres primaires, selon les ractions suivantes :

De ce fait elles prviennent la formation de radicaux libres organiques partir des


lipides membranaires notamment et contribuent donc la protection des membranes de la
peroxydation lipidique (Dacosta, 2003).
2.1.2.2.

Les antioxydants secondaires

Ce sont des molcules exognes. Contrairement aux enzymes antioxydantes, une


molcule dantioxydant pige un seul radical libre. Pour pouvoir fonctionner nouveau, cette
molcule dantioxydant doit donc tre rgnre par dautres systmes (Fig. 8) (Dacosta,
2003).
Plusieurs substances pouvant agir en tant quantioxydants in vivo ont tait proposs.
Elles incluent : la vitamine E, lacide ascorbique, le -carotne, les flavonodes, les composs
phnoliques,etc. (Kohen et Nyska, 2002)

15

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

Figure 8 : les systmes de dfense contre les radicaux libres

Figure 8 : les systmes de dfense contre les radicaux libres (Kohen et Nyska, 2002).

2.1.3. Balance Oxydants /Antioxydants et stress oxydant


Les ROS ont des rles physiologiques trs importants en agissant, faibles
concentrations, sur la rgulation des rponses biologiques, la transduction du signal et autres
voies de signalisation (Favier, 2003).
Dans lensemble de nos tissus sains, les dfenses antioxydantes sont capables de faire
face et dtruire les radicaux produits en excs. On dit que la balance Oxydants /Antioxydants
est en quilibre. Mais dans certaines situations, en raison dune surproduction radicalaire
(tabac, alcool, pollution, ) ou dune diminution des capacits antioxydantes (insuffisance
dapports des micronutriments antioxydants, inactivation enzymatiques) un dsquilibre entre
la production des radicaux libres et le systme de dfense est lorigine dun tat redox altr
de la cellule appel stress oxydatif (Sohal et al., 2002).
Pour enrayer le stress oxydant, il faut donc aider la cellule et lorganisme par lapport
dantioxydants secondaires (vitamine C, E, carotnodes, polyphnols) (Kohen et Nyska,
2002).
2.1.4. Mcanismes daction des antioxydants
Les mcanismes daction des antioxydants sont divers, incluant le captage de loxygne
singulier, la dsactivation des radicaux par raction daddition covalente, la rduction de
radicaux ou de peroxydes, la chlation des mtaux de transition (Favier, 2006).

16

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

2.2. Activit antimicrobienne


Ds la naissance, l'homme se trouve en contact avec des micro-organismes qui vont
progressivement coloniser son revtement cutano-muqueux. Pour rsister ces

micro-

organismes de nombreux moyens sont mis en jeu. On peut schmatiquement en distinguer 3


groupes : les barrires anatomiques, les mcanismes de rsistance naturelle (ou inns) et
l'immunit acquise (Kaufmann, 1997).
La thrapeutique des infections bactriennes se base principalement sur lusage des
antibiotiques. La prescription grande chelle et parfois inapproprie de ces agents peut
entraner la slection de souches multirsistantes do limportance dorienter les recherches
vers la dcouverte de nouvelles voies qui constituent une source dinspiration de nouveaux
mdicaments base des plantes (Billing et Sherman, 1998).
Les polyphnols notamment les flavonodes et les tannins sont reconnus par leur
toxicit vis- -vis des microorganismes. Le mcanisme de toxicit peut tre li l'inhibition
des enzymes hydrolytiques (les protases et les carbohydrolases) ou d'autres interactions pour
inactiver les adhesines microbiennes, les protines de transport et d'enveloppe cellulaire
(Cowan, 1999).
2.2.1. Les principales substances antimicrobiennes
2.2.1.1. Les antibiotiques
Les antibiotiques, au sens strict, sont des produits labors par des micro-organismes,
mais on inclut gnralement parmi eux les drivs semi-synthtiques et les produits
entirement synthtiques. La thrapeutique des infections bactriennes se base principalement
sur lusage des antibiotiques qui inhibent slectivement certaines voies mtaboliques des
bactries, sans exercer habituellement d'effets toxiques pour les organismes suprieurs. Cette
proprit les distingue des antiseptiques (Bergogne-Berezin et Dellamonica, 1995).
2.2.1.2. Les composs phnoliques
Plusieurs tudes in vitro et in vivo ont t focalises sur lvaluation des proprits
antimicrobienne des polyphnols. A lheure actuelle, cet effet est certain et dmontr par de
nombreuses recherches exprimentales. Les tudes du pouvoir inhibiteur des flavonodes sur
la croissance bactrienne ont dmontr que de nombreux composs flavoniques (apigenine,
kaempferol et dautres) sont dous dun effet important sur diffrentes souches bactriennes
Gram ngatif (Escherichia coli) et Gram positif (Staphylococcus aureus) (Ulanowska et al.,
2007).
Des flavonodes, une flavone et une flavanone, respectivement isols des fruits de
Terminalia bellerica et de l'arbuste Eysenhardtia texana ont t montr comme possdant
17

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

l'activit contre le microbe pathogne opportuniste Candida albicans (Wchter et al., 1999).
Deux autres flavones isols de la plante Artemisia giraldi ont tait rapports exhiber une
activit contre lespce Aspergillus flavus une espce de mycte qui cause la maladie
envahissante chez les patients immunosuppressifs (Valsaraj et al., 1997).

2.2.2. Micro-organismes utiliss dans les tests antimicrobiennes


2.2.2.1. Escherichia coli
Cest une bactrie Gram ngatif, commensal du tube digestif de lhomme et de
lanimal, (Kaper et al., 2004), de forme non sporule, de type arobie facultative,
gnralement mobile grce aux flagelles, sa longueur varie de 2 6 m, alors que sa largeur
est de 1,1 1,5 m, E. coli reprsente la bactrie la plus implique dans les infections aigues
dappareil urinaire, elle provoque galement les diarrhes dt ,diarrhe infantile et les
intoxications alimentaires (Percival, 2004).
2.2.2.2. Staphylococcus aureus
Ce sont des cocci Gram positif avec un diamtre de 0,5 1,5 m, de forme non
sporule, qui tendent se grouper en paires, petites chaines, elles sont habituellement non
capsule, ou possdant des capsules limites, elles sont anarobies facultatives.
Staphylococcus aureus reprsente lagent commun des infections postopratoires de
blessures, endocardite aigue, intoxication alimentaire (Dworkin et Falkow, 2006).
2.2.2.3. Pseudomonas aeruginosa
Ce sont des bacilles Gram ngatif, de forme non sporule, elles sont arobies, mobiles
grce la prsence de 1 2 flagelles, ce type de bactrie synthtise de types principaux de
pigments pyocyanine : bleue phnazine, pyoverdine: jaune vert, il sagit de bactries
rsistantes pour plusieurs antibiotiques (Percival, 2004). Pseudomonas aeruginosa est
responsable de 16% des cas de pneumonie nosocomiale, 12% des infections urinaires, 8 %
des infections suites aux blessures chirurgicales (Van Delden et Iglewski, 1998).
2.2.2.4. Candida albicans
Actuellement, le genre Candida comprend 81 espces de champignons levuriformes.
Candida albicans est la plus souvent lorigine de la plupart des manifestations
pathologiques chez lhomme. On la rencontre habituellement, ltat saprophytique, dans le
tube digestif de lhomme et, par contigut, elle peut tre retrouve au niveau de la muqueuse
vulvo- vaginal, (ou de la bouche). Mais on ne retrouve quexceptionnellement Candida
albicans au niveau de la peau. Cette espce est responsable de plus de 80 % des infections
18

Etude Bibliographique

Chapitre II : Les polyphnols

connues sous le terme de candidose, comme les infections superficielles cutanes, infections
superficielles muco- cutanes (Delorme et Robert, 1997).
2.2.2.5. Aspergillus sp
Aspergillus sp. sont les espces fongiques les plus communes qui sont capables de
produire des mycotoxines dans les produits alimentaires. Les mycotoxines sont connues pour
tre une cause puissante capable de produire un cancer hpatique chez les animaux et les
humains. La prsence et la croissance des champignons peuvent entraner la dtrioration et la
rduction de la qualit et la quantit des aliments (Rasooli et Abyaneh, 2004).
Dans diffrentes parties du monde, il y a une inquitude croissante au sujet de la
contamination des aliments, l'exposition environnementale et professionnelle aux spores
fongiques de diffrentes espces, en particulier l'aflatoxine produit par ces espces
fongiques comme le cas dA. flavus et A. niger (Takahashi et al., 2004) ; qui sont des
ascomycte filamenteux qui ont une distribution ubiquitaire dans l'environnement. Ils sont
connus par ses implications dans les infections opportunistes humaines. Le mode de la
transmission principal aux humains est par l'inhalation des conidies (Desai et Ghosh, 2003).
En plus de l'inhalation, une voie secondaire de transmission a t rapporte soit par contact
avec la peau ou travers une blessure (Krishnan et al., 2009).

19

PARTIE
EXPERIMENTALE

Chapitre III

MATERIEL ET METHODES

Partie Exprimentale

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

1. Matriel
1.1.

Matriel vgtal

Rhamnus alaternus L. a t collecte au mois doctobre 2010 dans la rgion de Bougaa


situe au nord de la wilaya de Stif, lidentification botanique de lespce a t ralise au
niveau du dpartement dcologie et de biologie et physiologie vgtale, Universit Ferhat
Abbes, Stif. Un chantillon de rfrence est conserv au niveau du laboratoire.

1.2.

Appareils et produits chimiques

Appareillage

Balance de prcision (Kern).

Oscilateur (Prolabo).

Rotavapeur (Bchi).

Spectrophotomtre (type Spectronic 20 Genysis TM).


Ractifs

Acide cafique (Sigma).

Ractif de Folin-Ciocalteu (Sigma Aldrich).

Acide linoleique (Merck).

BHT (Sigma).

- carotene (Sigma).

DPPH (Sigma).

Quercetine (Sigma).

Tween 40 (Sigma).

1.3.

Les souches microbiennes utilises

1.3.1. Les bactries


Les souches utilises sont des souches de rfrence de lAmerican type culture
collection (ATCC), gracieusement fournies par le laboratoire de microbiologie des centres
hospitalo-universitaires (CHU) de Stif et Tlemcen puis conserves 4 C dans des tubes
essais contenant de la glose incline.
1.3.1.1.

Les bactries Gram

Acinetobacter baumanii ATCC 19606, Citrobacter freundii ATCC 8090, Salmonella


typhimurium ATCC 13311, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 et Proteus mirabilis ATCC 35659.
20

Partie Exprimentale
1.3.1.2.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Les Bactries Gram +

Lysteria monocytogenes ATCC 15313, Enterococcus faecalis ATCC 49452, Bacillus


cereus ATCC 10876 et Staphylococcus aureus ATCC 25923.
1.3.2. Les champignons
La levure Candida albicans et les moisissures Aspergillus flavus et Aspergillus niger
sont respectivement obtenues du laboratoire de microbiologie CHU Stif et du laboratoire de
microbiologie applique universit Ferhat Abbas Stif.

2. Mthodes danalyses
2.1.

Prparation des extraits

2.1.1. Extrait aqueux


L'extrait aqueux de R. alaternus a t obtenu par dcoction de 20 g de broyat de la
partie arienne de la plante (tiges et feuilles) ou de racines dans 500 ml d'eau distille pendant
10 min sous agitation magntique. La solution est laisse reposer sur la plaque chauffante
pendant 15 minutes, le mlange est dabord filtr sur une gaze et ensuit sur papier Whatman
(n3). Des aliquotes du filtrat sont places dans une tuve 40 C pendant 24 h pour scher.
Lextrait sec est conserv au rfrigrateur (Fig. 9) (Belhattab et al., 2004; Ben Ammar et al.,
2007).

1.1.1. Extrait mthanolique


1.1.1.1.

Extrait mthanolique de la partie arienne

L'extrait mthanolique de la partie arienne de R. alaternus a t prpar partir de 50


g de broyat des tiges et des feuilles, qui ont t mis macrer dans 200 ml de mthanol la
temprature ambiante et labri de la lumire pendant 24 heures, avec un maximum
dagitation. Ensuit le mlange est filtr sur la gaze et une deuxime fois sur papier Whatman
(n3). Lopration est rpt une seconde fois sur le marc. Les filtrats obtenus sont
additionns et vapors sec laide dun vaporateur rotatif BCHI une temprature de
40 - 50 C. Lextrait sec est conserv au rfrigrateur (Fig. 10) (Belhattab et al., 2004; Ben
Ammar et al., 2008).

21

Partie Exprimentale

Chapitre IV : Matriel et Mthodes


20 g de matriel vgtal sec
+
500 ml de leau dstile

Dcoction pendant 10
minutes avec
Agitation magntique

Repos 15 min sur la plaque chauffante

Filtration sur la gaze

Filtration sur papier Wattman (3 mm)

Etuve (40C)

Extrait aqueux sec

Figure 9 : Protocole de prparation de l'extrait aqueux (Belhattab et al., 2004).


Figure 9 : Protocole de prparation de l'extrait aqueux

22

Partie Exprimentale

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Figure 10 : Protocole de prparation de l'extrait EMTF par macration

50 g de matriel vgtal sec

Addition de 200 ml du mthanol

Macration 24 h
Temprature ambiante
Lopration

A labri de la lumire

est rpte
une fois
Filtration sur la gaze

Filtration sur papier Wattman (n3)

Filtrat

Marc

Filtrat

Marc

Evaporation au rotavapeur (50C)

Extrait mthanolique brut


Figure 10 : Protocole de prparation de l'extrait mthanolique de la partie arienne par
macration (Belhattab et al., 2004).

23

Partie Exprimentale
1.1.1.2.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Extrait mthanolique des racines

L'extrait mthanolique des racines de R. alaternus a t prpar laide dun Soxhlet


partir de 50 g de racines broyes, Le matriel vgtal broy est plac dans une cartouche qui
sera expose au solvant dextraction men une temprature dvaporation (40 C). Aprs
environ 6 cycles dextraction, la cartouche est retire et le solvant charg dextrait de la plante
est rcupr pour tre concentr sec sous vide laide dun vaporateur rotatif BCHI.
lextrait est conserv au rfrigrateur jusqu' son utilisation (Fig. 11) (Belhattab et al., 2004;
Bruneton, 1999).

Figure 11 :
Systme
d'extraction au
Soxhlet

Figure 11 : Systme d'extraction au Soxhlet.

24

Partie Exprimentale

1.2.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Analyse chimique

1.2.1. Dosage des polyphnols totaux


Le dosage des polyphnols totaux dans les diffrentes extraits est ralis par la mthode
de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., 1999).
1.2.1.1.

Principe

Le ractif de Folin-Ciocalteu est constitu par un mlange dacide phosphotungstique


(H3PW12O40) et phosphomolibdique (H3PMo12O40), il est rduit par les phnols en un mlange
doxydes bleus de tungstne (W8O23) et de molybdne (Mo8O23), (Ribreau-Gayon et al.,
1972). Cette coloration bleue dont lintensit est proportionnelle aux taux de composs
phnoliques prsents dans le milieu donne un maximum dabsorption 760 nm.
1.2.1.2.

Mode opratoire

Mettre 20 l de chaque extrait de R. alaternus dans des tubes essais ; ajouter 1.58 ml
deau distille et 100 l de ractif de Folin-Ciocalteu dilu dans H2O distille (v/v) dans
chaque tube; agiter vigoureusement puis laisser agir 6 min avant dajouter 300 l de carbonate
de sodium 7.5%.
Aprs 2 heures dincubation temprature ambiante et labri de la lumire, lire les
absorbances partir du spectrophotomtre UV-visible (Spectronic 20 Genysis TM) 760 nm.
Effectuer la mme opration pour lacide cafique diffrentes concentrations en
introduisant 20 l de ces dernires dans une srie de tubes et ajout des autres ractifs.
Le blanc est reprsent par lthanol additionn du Folin-Ciocalteu, de leau distille et
de carbonate de sodium.
Toutes les mesures sont ralises en triplicata.
Les concentrations des polyphnols totaux contenus dans les extraits de R. alaternus
sont calcules en se rfrant la courbe dtalonnage obtenue en utilisant lacide cafique
comme standard.
Les rsultats sont exprims en mg quivalent en acide cafique/ g de matire fraiche.
1.2.2. Dosage des flavonodes totaux
Lestimation de la teneur en flavonodes totaux contenus dans les extraits de R.
alaternus est ralise par la mthode de Bahorun et al. (1996).
1.2.2.1.

Principe

Les flavonodes possdent un groupement hydroxyle (OH) libre, en position 5 qui est
susceptible de donner avec le groupement CO, un complexe color avec le chlorure
daluminium. Les flavonodes forment des complexes jauntres par chlation des mtaux (fer
25

Partie Exprimentale

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

et aluminium). Ceci traduit le fait que le mtal (Al) perd deux lectrons pour sunir deux
atomes d'oxygne de la molcule phnolique agissant comme donneur dlectrons (RibreauGayon et al., 1972).
1.2.2.2.

Mode opratoire

Mettre 1 ml dextrait de R. alaternus dans un tube essai ; Ajouter 1 ml de solution


mthanolique de chlorure daluminium 2 % ; laisser incuber 15 min temprature ambiante.
Lire les absorbances partir du spectrophotomtre UV-visible (Spectronic 20 Genysis
TM) 430 nm.
Effectuer la mme opration pour la querctine diffrentes concentrations en
introduisant 1 ml de ces dernires dans une srie de tubes et ajout de 1 ml dAlCl3 2%.
Le blanc est reprsent par lthanol additionn lAlCl3, toutes les oprations sont
ralises en triplicata.
Les concentrations des flavonodes contenus dans les extraits de R. alaternus sont
calcules en se rfrant la courbe dtalonnage obtenue en utilisant la querctine comme
standard, les rsultats sont exprims en mg quivalent en querctine/ g de matire fraiche.
1.2.3. Dosage des flavones et flavonols
La mthode utilise pour lestimation de taux de flavonols est celle dcrite par (Kosalec
et al., 2004).
1.2.3.1.

Mode opratoire

Mettre 0.50 ml dextrait de R. alaternus dans un tube essai ; ajouter 1.5 ml dthanol,
0.1 ml de solution mthanolique de chlorure daluminium 10 % puis 0.1 ml dactate de
sodium et 2.8 ml deau, laisser incuber 30 min temprature ambiante.
Lire les absorbances partir du spectrophotomtre UV-visible (Spectronic 20 Genysis
TM) 415 nm.
Toutes les oprations sont ralises en triplicata.
La concentration des flavones et flavonols contenus dans les extraits de R. alaternus est
calcule en se rfrant la courbe dtalonnage obtenue en utilisant la querctine comme
standard.
Les rsultats sont exprims en mg quivalent en querctine/ g de matire fraiche.

26

Partie Exprimentale

1.3.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Activit antioxydante

1.3.1. Test qualitatif au -carotne


1.3.1.1.

Principe

Ce test permet de mettre en vidence le pouvoir antioxydant des extraits de R. alaternus


En effet, lacide linolique oxyd en radical peroxyl agit sur le -carotne de couleur orange
qui devient incolore. La prsence dantioxydant, extrait de plante par exemple inhibe cette
dcoloration dans le milieu glos (Graven et al., 1992).
1.3.1.2.

Mode opratoire

Prparer le milieu glos, dans un bcher, en dissolvant 0,75 % (m/v) dagar dans leau
distille ; chauffer en agitant sur une plaque chauffante. Laisser refroidir jusqu environ
50C, y transvaser 7,5 ml de solution actonique de -carotne (1 mg/ ml) et 1,5 ml de
solution thanolique dacide linolique (5 l ml dthanol) ; couler dans des boites Ptri ;
laisser solidifier puis creuser des puits et y verser 30 l de chaque extrait (1mg/ml) de R.
alaternus. Laisser incuber 3 4 h 45C (Belhattab, 2007).
Dans des boites tmoins les extraits sont remplacs par la querctine et le BHT
(tmoins positifs), lthanol (tmoins ngatifs).
Une zone de rtention de la couleur orange autour des puits indique lactivit
antioxydante des extraits.
1.3.2. Test de blanchissement du carotne
1.3.2.1.

Principe

Lactivit antioxydante des quatre extraits de R. alaternus est mesure selon la mthode
de (Tepe et al., 2006), Loxydation de lacide linolique gnre des radicaux peroxydes, ces
radicaux libres vont par la suite oxyder le -carotne entrainant ainsi la disparition de sa
couleur rouge, qui est suivie par spectromtrie 470 nm. Cependant la prsence dun
antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres drivs de lacide linolique et donc
prvenir loxydation et le blanchissement du -carotne. Dans ce test la capacit antioxydante
est dtermine en mesurant linhibition de la dgradation oxydative de -carotne
(dcoloration) par les produits doxydation de lacide linolique (Tepe et al., 2006).
LOO. + -carotne

LOO

LOO + AH

e-

Blanchissement
LOO-

LOOH
.

A + LOOH

27

Partie Exprimentale
1.3.2.2.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Mode opratoire

Dissoudre 2 mg de -carotne dans 1 ml de chloroforme. La solution obtenue est


introduite dans un ballon contenant 2 mg dacide linolique et 200 mg de Tween 40. Aprs
vaporation du chloroforme, 100 ml deau distille sature en oxygne sont ajouts avec
agitation vigoureuse. De cette nouvelle solution 2.5 ml sont transfrs dans des tubes
auxquels sont additionns 350 l de chaque extrait ou de BHT (2 mg/l).
Un tube contenant 2.5 ml dmulsion et 350 l dthanol servira de tmoin ngatif.
Labsorbance est immdiatement mesure 470 nm, Dautres lectures sont faites
diffrents intervalles de temps (2h, 4h, 6h, 12h, et 48h) (Tepe et al., 2006), Toutes les mesures
sont ralises en triplicata.
Lactivit anti-oxydante relative aprs 48 heures est calcule selon la relation suivante :
AAR = (Abs chantillon/ Abs BHT) x 100
O :

AAR : activit anti-oxydante relative.

Abs chantillon : absorbance de lchantillon aprs 48 heures.

Abs BHT : absorbance du BHT aprs 48 heures.

1.3.3. Test au DPPH


1.3.3.1.

Principe

Le test au 2,2-diphnyl-2-picryl-hydrazyle (DPPH.) est ralis par la mthode dcrite


par (Ammar et al., 2009) qui permet de mesurer le pouvoir rducteur par le calcul de la CI 50
des substances antioxydantes contenues dans un extrait. Le DPPH est un radical libre de
couleur violette qui devient jaune quand il est rduit par un donneur de proton H +.
DPPH + AH

DPPH-H + A.

O AH est un compos capable de cder un H+ au radical DPPH.


1.3.3.2.

Mode opratoire

Une solution thanolique de 0,06 mM de DPPH. est mlange avec diffrentes


concentrations des extraits de R. alaternus (1, 3, 10, 30, 100 g/ml), Mettre 1ml de chaque
dilution de ces extraits dans un tube essai, ajouter 1ml de solution thanolique de DPPH,
puis laisser incuber 30 min labri de la lumire temprature ambiante. Lire labsorbance
517 nm contre un blanc qui contient de lthanol pur.
Rpter les mmes oprations, en remplaant lextrait de R. alaternus par le BHT
(control positif) et lthanol pur (control ngatif).
Toutes les oprations sont ralises en triplicata.
28

Partie Exprimentale

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Lvaluation de lactivit anti-oxydante en utilisant la mthode DPPH est exprime en


pourcentage selon la relation suivante :
% Inhibition =

(Abs Control Abs Extrait)


Abs Extrait

Le pourcentage dinhibition est exprim ensuit par la valeur de la CI 50, sachant que
lIC50 est la concentration dextrait ncessaire pour lobtention de 50% de la forme rduite du
radical DPPH..

1.4.

Activit antimicrobienne

Lvaluation de lactivit antimicrobienne a t ralise par la mthode de diffusion de


disque o les disques sont imbibs de 10 l de chaque extrait (Sokmen et al., 2004).
1.4.1. Activit antibactrienne
1.4.1.1.

Prparation du milieu de culture

Le milieu de culture appropri cette tude est le milieu Muller-Hinton prpar comme
suit :
Dissoudre 38 g de la glose Muller-Hinton (Annexe I) dans un litre deau distille.
Faire bouillir avec agitation jusqu' dissolution complte, puis auto-claver pendant 15 minutes
121C et finalement couler le milieu dans les boites de Ptri.
1.4.1.2.

Strilisation du matriel

Leau distille, le milieu de culture, les tubes essai utiliss dans la prparation des
solutions bactriennes et les disques en papier Wattman (6 mm de diamtre) enrobs dans du
papier aluminium ont t striliss lautoclave 121C pendant 15 minutes.
1.4.1.3.

Prparation des dilutions dextraits de R. alaternus

Les extraits de R. alaternus ont t dissous dans le dimthyle sulfoxyde (DMSO) pour
prparer les diffrentes concentrations avec des dilutions successives au demi, sachant que la
concentration de la solution mre de chaque extrait est de 200 mg/ml.
1.4.1.4.

Prparation de linoculum

Les souches bactriennes sont ensemences dans la glose nutritive et incubes 37C
pendant 24 h, pour optimiser leur croissance. On racle laide dune anse de platine quelques
colonies bien isoles et identiques de chacune des souches bactriennes tester. Dcharger
lanse dans 10 ml deau distille strile, La suspension bactrienne est bien homognise,
son opacit doit tre quivalente 0.5 Mc Farland (annexe 05) ou une DO de 0.08 0.10
625 nm. Linoculum peut tre ajust en ajoutant, soit de la culture sil est trop faible, ou bien
de leau physiologique strile sil est trop fort.
29

Partie Exprimentale
1.4.1.5.

Chapitre IV : Matriel et Mthodes

Ensemencement et dpt des disques

Lensemencement est ralis par couvillonnage sur boites Ptri, un couvillon est
tremp dans la suspension bactrienne, puis lessorer en pressant fermement sur la paroi
interne du tube. Lcouvillon est Frott sur la totalit de la surface glose, de haut en bas en
stries serres.
Lopration est rpte deux fois en tournant la boite de 60 chaque fois.
Lensemencement est fini en passant lcouvillon une dernire fois sur toute la surface
glose. Lcouvillon est recharg chaque fois quon ensemence plusieurs boites de Ptri
avec la mme souche. Les disques imprgns dextraits sont dposs dlicatement sur la
surface de la glose inocule laide dune pince strile.
De mme les antibiogrammes raliss avec des disques contenants des antibiotiques
(tmoin positif) appropris prts lemploi ont t utiliss pour la comparaison avec les
rsultats des extraits tests et les disques Wattman imprgns de DMSO (tmoin ngatif).
Finalement, les boites de Ptri sont incubes pendant 18 24 heures 37C.
1.4.1.6.

Lecture des antibiogrammes

La lecture des antibiogrammes a t faite par la mesure des diamtres des halos
dinhibitions au tour des disques.
1.4.1.7.

Dtermination des CMI et CMB

Pour les concentrations minimales inhibitrices (CMI), Il sagit de dterminer les plus
petites concentrations auxquelles les extraits prsentent encore une activit antibactrienne
visible lil nu. Des dilutions successives au demi ont permis de prparer une gamme de
dilution allant de 200 0,095 mg/ml pour les extraits, en effet de chaque dilution on prlve
10 l et on la mit dans les disques qui sont dj dans les boites de ptri. Aprs dtermination
de la CMI, pour la dtermination des concentrations minimales bactricides (CMB) un
prlvement lanse est ralis autour chacun des disques ne prsentant aucune culture
visible. Chaque prlvement est dpos en strie sur glose Mueller-Hinton. La bote
ensemence est incube 24 heures 37C.
1.4.2. Activit antifongique
Les mmes oprations sont effectues avec les souches des champignons, mais dans ce
cas le milieu de culture utilis est le milieu Sabouraud (Annexe I). Les champignons sont
activs pendant 7 jours dans des boites de Ptrie une temprature de 28C avant le test,
aprs incubation linoculum des champignons est prpar et lensemencement est ralis par
couvillonnage sur boites Ptri couls qui contient du Sabouraud.
La lecture des antibiogrammes est faite aprs 72 heures dincubation 28C.
30

Chapitre VI
RESULTATS ET
DISCUSSION

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

1. Rsultats et discussion
1.1.

Rendements des extractions

1.1.1. La macration
Lopration de lextraction par macration de la partie arienne EMTF (tiges et feuilles)
de R. alaternus dans le mthanol a permis dobtenir un rsidu sec dextrait brute avec un
rendement de 11 % (m/m).
1.1.2. La dcoction
Les rendements des extraits respectifs de la partie arienne EATF et des racines EAR
aprs dcoction ont t estims 6 % et 8 % (m/m).
1.1.3. Extraction au Soxhlet
Le rendement de lextrait mthanolique des racines EMR obtenu par Soxhlet a t
estim 10 % (Fig. 12) (m/m).

Les rendements des extraits mthanoliques (10 et 11 %) sont suprieurs par rapport aux
extraits aqueux (6 et 8 %), La diffrence de rendement entre les extraits est due aux
techniques d'extraction utilises, qui sont totalement diffrentes et la composition chimique
qui diffre d'un extrait l'autre.
Dans une tude ralise par Ben ammar et al. (2008) sur la mme espce originaire de
Tunisie, des rsultats similaires ont t trouvs. En effet la macration des feuilles dans le
mthanol suivi par le butanol sature en eau a donn un rendement de 9 % (m/m).

1.2.

Composition chimique

1.2.1. Teneur en polyphnols totaux


La dtermination de la teneur en polyphnols totaux des diffrents extraits a t
ralise selon la mthode utilisant le ractif de Folin-Ciocalteu. La courbe montre une
linarit de labsorbance en fonction des concentrations. Les quantits des polyphnols
correspondantes de chaque extrait ont t rapportes en quivalent gramme dacide cafique
et dtermin par lquation de type : y = 0,0031 x - 0,0898 sachant que R2 = 0,98 (Fig. 13).
Les teneurs en polyphnols totaux (Fig. 14) des extrais mthanoliques EMTF et EMR
sont 7 mg EAC/g de matire fraiche, relativement faibles par rapport aux extraits aqueux 19 et
36 mg EAC/g de matire fraiche pour EAR et EATF respectivement. Il parait clairement que
leau chaude est le solvant qui permet davoir un rendement en polyphnols totaux plus lev

31

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

par rapport au mthanol, ce qui peut tre expliqu par la lyse des cellules dans leau chaude et
la libration dun maximum de molcules poly-phnoliques.
Djeridane et al. (2007) ont trouv une valeur assez proche de notre rsultat avec une
teneur en polyphnols de 6 mg EAG/ g de matire fraiche pour un extraits thanolique de la
partie arienne de la mme varit du nord de Laghouat.
Nos rsultats ressemblent ceux trouvs par Ben ammar et al. (2008) sur la mme
espce vgtale. En effet, ils ont dtermin 7 mg EAG/ g de matire fraiche pour un extraits
mthanoliques suivie par une extraction dans le butanol satur en eau des corces des racines,
mais infrieure une teneur de 13 mg EAG/ g dun extrait mthanolique suivi aussi par une
extraction dans le butanol satur en eau des feuilles.
La faible spcificit du ractif de Folin-Ciocalteu est l'inconvnient principal du dosage
colorimtrique. Le ractif est extrmement sensible la rduction de tous les groupes
dhydroxyles non seulement celles des composs phnoliques, mais galement de certains
sucres et de protines etc. (G__mez-Caravaca et al., 2006; Vuorela, 2005).
Le solvant d'extraction lu des substances non phnoliques comme les sucres, les
protines et les colorants qui peuvent interfrer pendant toute valuation phnolique
(Djeridane et al., 2007). Le dosage par ce ractif donne donc une valuation brute de tous les
composs phnoliques dun extrait. Il n'est pas spcifique aux polyphnols, mais beaucoup de
composs peuvent ragir avec le ractif, donnant un taux phnolique apparent lev (Tawaha
et al., 2007).

Rendement d'extraction en %

Figure 12 : Comparaison des rendements des quatre extraits de R. alaternus

12
10
8
6
4

10

11

8
6

2
0

EATF

EAR
EMR
Les extraits

EMTF

Figure 12 : Comparaison des rendements des quatre extraits de R. alaternus.

32

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 13 : Courbe d'talonnage dacide cafique pour le dosage des polyphnols totaux

0,7

Absorbance 760 nm

0,6
y = 0,0031 x - 0,0898
R = 0,9803

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

50

100
150
200
Concentration d'acide cafique en g/ml

250

Figure 13 : Courbe d'talonnage dacide cafique pour le dosage des polyphnols totaux.

Concentration en mg EAC/g de MF

Figure 14 : Teneurs en polyphnols des quatre extraits

40
35
30
25
20
15
10
5
0

36
19
7
EMTF

7
EMR
EAR
Les extraits

EATF

Figure 14 : Teneurs en polyphnols des quatre extraits de R. alaternus.

33

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

1.2.2. Teneur en flavonodes


1.2.2.1.

Teneur en flavonodes totaux

Le dosage des flavonodes a t ralis selon la mthode au trichlorure daluminium


(AlCl3) et ltalon t la querctine (Fig. 15). La teneur en flavonodes est exprime en
milligramme d'quivalent de querctine par gramme de matire fraiche (mg EQ/g de MF). Les
taux des flavonodes des quatre extraits ont t obtenu partir de la courbe dtalonnage qui
suit une quation de type : y = 0,0344 x + 0,0181 sachant que R = 0,9992.
Les concentrations des flavonodes (Fig. 16) sont relativement importants dans les
extraits dans leur majorit, les teneurs en flavonodes sont de 18 mg EQ /g de matire fraiche
dans lextrait EATF suivie de celles de Lextraits EAR et EMTF avec 14 et 6 mg EQ /g de
matire fraiche respectivement et enfin celle dextrait EMR avec 5 mg EQ/g de matire
fraiche.
Ces rsultats obtenus sont nettement suprieurs au rsultat trouv par Djeridane et al.
(2007) qui est de 1 mg EQ/ g de MF pour un extrait thanolique de la mme varit de la
rgion de Laghouat. De mme, ils sont nettement suprieure aux rsultats trouvs par Ben
ammar et al. (2007) qui sont respectivement 28 et 21 mg EQ/100g de matire fraiche pour les
extraits mthanolique et aqueux des feuilles de la mme espce de la rgion de la Tunisie.
Mais lgrement infrieurs aux rsultats trouvs par Ben ammar et al (2008) soit des teneurs
de 15 et 20 mg EQ/g de matire fraiche pour des extraits mthanoliques des corces des
racines et des feuilles respectivement.

1.2.2.2.

Teneurs en flavones et flavonols

La querctine a t utilise comme talon diffrentes concentrations, La teneur en


flavones et flavonols est exprime en milligramme d'quivalent de querctine par gramme
d'extrait (mg EQ/g dextrait). Le taux des flavones et flavonols des quatre extraits ont t
obtenus partir dune courbe dtalonnage (Fig. 17) qui suit une quation de type :
y = 0,0344 x + 0,0181 sachant que R = 0,9992.
Les teneurs en flavones et flavonols (Fig. 18) des extraits aqueux EATF et EAR sont
suprieurs compars aux extraits mthanoliques EMTF et EMR 7 mg EQ/g et 6 mg EQ/g
contre 2 mg EQ/g de matire fraiche respectivement.
A notre connaissance, Aucun rsultat sur le dosage des flavones et flavonols na t
rapport par dautres auteurs sur Rhamnus alaternus pour pouvoir comparer nos rsultats.

34

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 15 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavonodes totaux

1,6
y = 0,0344x + 0,0181
R = 0,9992

Absorbance 430 nm

1,4
1,2

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

10

20
30
40
Concentration de la querctine en g/ml

50

Figure 15 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavonodes totaux.

Concentration en mg EQ/g de MF

Figure 16 : Teneurs en flavonodes totaux des quatre extraits

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

18
14
5
EMR

EMTF
EAR
Les extraits

EATF

Figure 16 : Teneurs en flavonodes totaux des quatre extraits de R. alaternus.

35

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 17 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavones et flavonoles

0,8

Absorbance 415 nm

0,7

y = 0,0066x - 0,004
R = 0,9991

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

20

40
60
80
Concentration de la querctine en g/ml

100

120

Figure 17 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavones et flavonoles.

Concentration en mg EQ/g de MF

Figure 18 : Teneurs en flavones et flavonols des quatre extraits

7
6
5
4
6

2
1

0
EMR

EMTF
EAR
Les extraits

EATF

Figure 18 : Teneurs en flavones et flavonols des quatre extraits de R. alaternus.

36

Partie Exprimentale

1.3.

Chapitre V : Rsultats et discussion

Lactivit antioxydante et antiradicalaire

1.3.1. Mise en vidence de lactivit antioxydante par la mthode du - carotne


Le test de dcoloration du - carotne, nous a permis de percevoir des halos de couleur
orange autour des puits contenant les extraits de R. alaternus et les comparer au BHT et la
querctine comme tmoin positif, Sachant que la concentration de chaque extrait et tmoins
positifs est de 1 mg/ml (Tab. 2). Dans chaque boite cinq puits ont t ralise diffrentes
concentrations dextraits et tmoins (10 l, 20 l, 30 l, 40 l et 50 l).
Le diamtre des halos de rtention de la couleur orange est proportionnel au volume
dpos. Cependant, il diffre dun extrait un autre. Pour un volume dextrait de 50 l
dpos, lextrait aqueux des racines montre le plus petit diamtre (25 mm) soit le plus faible
pouvoir antioxydant alors que lextrait mthanolique de tiges et feuilles a manifest le plus
fort effet avec un diamtre de (32 mm) (Fig. 19), les valeurs trouves restent lgrement
infrieures celles obtenus avec des antioxydants standard tels que la querctine (38 mm) et
le BHT (37 mm) en loccurrence.
Sharififar et al. (2009) ont tudi lactivit antioxydante de lextraits mthanolique de
Teucrium polium, et ont trouv un diamtre dhalos de rtention de couleur de 26 mm, Nos
valeurs trouvs pour les extraits mthanoliques sont suprieurs cette valeur.
Ces rsultats montrent que les extraits mthanoliques et aqueux de R. alaternus
possdent un potentiel antioxydant important d aux polyphnols notamment les flavonodes
qui stabilisent le radical peroxyde par donation dhydrogne.

Tableau 2 : Rsultats du test visuel de -carotne

37

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Tableau 2 : Rsultats du test visuel de -carotne des quatre extraits plus les contrles + et .
30 l

20 l
30 l

40 l

50 l

20 l

50 l
10 l

40 l
10 l

EAR

EATF

40 l

30 l

30 l

20 l

50 l

50 l

10 l

40 l

20 l
10 l

EMR

EMTF
BHT 30 l

Querctine 50 l
BHT 50 l

Ethanol

Querctine 30 l

Querctine et BHT

38

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Diamtres en mm des halos de couleur


orange

Figure 19 : Comparaison des diamtres des halos de rtention de couleur

40
35
30
25
20
15

25

27

28

32

37

38

10
5
0

Les extraits + Tmoins Positifs

Figure 19 : Comparaison des diamtres des halos de rtention de couleur dans le cas du
dpt de 50 l des extraits de R. alaternus et des tmoins positifs (Querctine et BHT).
1.3.2. Test de blanchissement du - carotne (the bleaching test)
La technique de dcoloration du -carotne/ acide linolique permet dvaluer lactivit
antioxydante des quatre extraits par inhibition de la peroxydation des lipides en suivant
labsorbance dans le temps, Les absorbances des milieux ractionnels en absence des extraits
diminuent rapidement dans le temps, alors que lajout des extraits ou du BHT ralentit ce
dclin.
Dans ce test, l'oxydation de lacide linolique gnre des radicaux peroxydes suite
labstraction des atomes dhydrogne partir de groupements mthylnes de lacide
linolique. Ces radicaux libres vont par la suite oxyder le - carotne hautement insatur
entranant ainsi la disparition de sa couleur rouge, qui est suivie spectrophotomtriquement
470 nm. Cependant, la prsence d'un antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres
drivs de Lacide linolique et donc prvenir loxydation et le blanchissement du carotne. La cintique de blanchissement du - carotne en absence et en prsence des extraits
de R. alaternus et dantioxydant standards (BHT) a t suivie (Fig. 20).
Le BHT une concentration de 2mg/ml montre une courbe sous forme dun plateau ce
qui signifie que le pouvoir antioxydant est trs efficace. Il est suivi de faon moins importante
par lextrait EMR, EMTF, EAR et EATF dans lordre. En absence dantioxydant (BHT ou
extrait) le dclin est trs remarqu. Nos rsultats montrent que les extraits les plus riches en
polyphnols, par consquent les plus polaires (les extraits aqueux EAR et EATF) montrent
39

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

lactivit antioxydante la plus faible par rapport au extraits relativement pauvres en


polyphnols, qui prsentent une faible polarit (les extraits mthanoliques EMTF et EMR).
Nos rsultats sont similaires aux rsultats dune tude ralise par Yang et al. (2007)
sur des extraits du rhizome du lotus ou lextrait mthanolique est plus riche en polyphnols,
20.1mg quivalent en catechine/100g de matire fraiche mais ne montre quune faible activit
antioxydante compar aux extraits ther de ptrol et dichloromethane dont la composition
chimique et moins riches en composs phnoliques (2.2 et 2.4 mg quivalent en
catechine/100g de matire fraiche respectivement).
Ceci peut tre expliqu par un phnomne nonc comme " paradoxe polaire " comme
il est dcrit par Frankel et al. (1994). Etant donn que le test de blanchissement du -carotne
est similaire un systme dmulsion des lipides dans leau, Frankel et Meyer (2000) ont
propos que les antioxydants apolaires exposent des proprits antioxydantes plus importantes
car ils sont concentrs au sein de l'interface lipide-eau, permettant ainsi de prvenir la
formation de radicaux lipidiques et loxydation du -carotne. Alors que les antioxydants
polaires restent dilus dans la phase aqueuse et sont ainsi moins efficaces dans la protection
des lipides.
Selon Haddadi (2005) plusieurs facteurs semblent moduler les rsultats dinhibition de
loxydation de lacide linolique savoir la nature liposoluble ou hydrosoluble des
antioxydants et leur concentration.

40

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 20 : Cintique de blanchissement du - carotne 470 nm

1,2

Absorbance 470 nm

1
0,8

EATF
EAR

0,6

EMTF
EMR

0,4

BHT (c+)
(c-)

0,2
0
0

10

20

30
Temps (h)

40

50

60

Figure 20 : Cintique de blanchissement du - carotne 470 nm en absence et en prsence


des extraits de R. alaternus et du BHT.

Figure 21 : Activit antioxydante relative des extraits, BHT et contrle ngatif aprs 48 h

Activit anti-oxydante relative

100%
90%
80%
70%
60%
50%

95%

40%

72%

82%

82%

EMR

EMTF

79%

30%
20%
10%

16%

0%
C (-)

EATF

EAR

BHT

Figure 21 : Activit anti-oxydante relative des extraits de R. alaternus (EATF, EAR, EMTF
et EMR) , BHT et le contrle ngatif C (-) aprs 48 h.

41

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

1.3.3. Test anti-radicalaire (Test DPPH)


Lactivit anti radicalaire est ralise par la mthode du radical 2,2-diphnyl-1
picrylhydrazyle (DPPH) qui est une mthode frquemment utilise pour sa simplicit. Cette
mthode est base sur la rduction dune solution alcoolique de DPPH en prsence d'un
antioxydant qui donne un hydrogne ou un lectron, la forme non radicalaire DPPH-H est
forme (Bortolomeazzi et al., 2007). Linhibition de la dcoloration du radical DPPH est en
fonction de la concentration des diffrents extraits utiliss et du tmoin BHT (antioxydant de
rfrence) (1, 3, 10, 30, 100 g/ml).
Lactivit antioxydante des extraits est exprime en CI50, ce paramtre a t employ
par plusieurs groupes de chercheurs pour prsenter leurs rsultats (Abdulmajed et al., 2005;
Ahmad et al., 2012; Ranga et al., 2009), il dfinit la concentration efficace du substrat qui
cause la perte de 50% de lactivit du radical DPPH. (couleur). Ces CI50 sont dtermines
partir des graphes (Fig 22, 23, 24, 25 et 26) dont labscisse reprsente la concentration de
lextrait brut et lordonn lactivit antioxydante en pourcentage. Elle est de 71 pour lextrait
EMTF et 66 g/ml pour les deux extraits aqueux EATF et EAR, alors quavec lextrait EMR
la valeur est 52 g/ml assez proche de celle du BHT qui est de 37 g/ml.
Tous les extraits ont un pouvoir anti-radicalaire envers le DPPH. (Fig. 27), plus la
valeur de lIC50 est petite plus lextrait est considr comme un antioxydant puissant.
Une tude mene par Ben ammar et al. (2008) sur la mme espce de plante de la
Tunisie a montr des IC50 de 7 et 19 g/ml des corces des racines et des feuilles
respectivement, lorsque lextraction a t mene par le mthanol suivie par une extraction
dans le butanol satur en eau. Cette valeur est nettement infrieure celle trouve avec nos
extraits.

42

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

100

y = 0,7047x + 23,736
R = 0,9951

90

80

% d'inhibition

70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60
80
Concentration g/ml

100

120

Figure 22 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration du BHT.


Figure 22 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration du BHT
Figure 23 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EMR

80
y = 0,5245x + 22,558
R = 0,9897

70

% d'inhibition

60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60
80
Concentration g/ml

100

120

Figure 23 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de lextrait


EMR.

43

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 24 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EATF

80
y = 0,7588x + 0,3076
R = 0,9997

70

% d'inhibition

60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60
80
Concentration g/ml

100

120

Figure 24 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de lextrait EATF.


Figure 25 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EAR

80
y = 0,7412x + 1,3096
R = 0,9712

70

% d'inhibition

60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60
80
Concentration g/ml

100

120

Figure 25 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de lextrait EAR.

44

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 26 : : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de EMTF

70
y = 0,4475x + 18,405
R = 0,9993

60

% d'inhibition

50

40
30
20
10
0
0

20

40

60
Concentration g/ml

80

100

120

Figure 26 : Variation de linhibition du DPPH en fonction de la concentration de lextrait


EMTF.

Figure 27 : Activit anti-radicalaire des extraits de R. alaternus et le BHT

80
70

Valeurs des IC 50

60
50
40
66
30
20

66

71

52
37

10
0
BHT

EMR

EATF
Extraits et BHT

EAR

EMTF

Figure 27 : Activit anti-radicalaire des extraits de R. alaternus et le BHT.

45

Partie Exprimentale

1.4.

Chapitre V : Rsultats et discussion

Lactivit antimicrobienne

Nous avons tudi in vitro le pouvoir antimicrobien des extraits isols de R. alaternus
par la mthode de diffusion des disques sur un milieu gloss solides, Mueller-Hinton pour
les bactries et Sabouraud pour les champignons.
Lactivit antimicrobienne des extraits a t estime en termes de diamtre de la zone
d'inhibition autour des disques contenant les extraits tester vis--vis de quatorze (14) germes
pathognes d'origine hospitalire dont onze (11) bactries Gram + et Gram - et trois (3)
champignons savoir deux moisissures et une levure.
1.4.1. Rsultats du test prliminaire
Si les extraits doivent tre soumis aux essais biologiques, la toxicit du solvant peut
galement tre critique car mme en traces, le solvant ne devrait pas empcher le procd
biologique. L'attention devrait galement tre prte aux interactions possibles entre le solvant
et les corps dissous pendant que le solvant peut ragir avec certains composs pour produire
des complexes ou pour causer la dcomposition, la dshydratation, ou l'isomrisation de ces
composs (Fig. 28) (Yrjen, 2004).
Pour cela le DMSO a t test comme solvant, les rsultats montrent que le solvant est
appropri et ne prsente aucun effet sur la croissance normale des souches microbiennes.

46

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 28 : Effet du DMSO sur les bactries et les champignons tudis.

DMSO

DMSO

Acinetobacter baumanir ATCC 19606

Bacillus cereus ATCC 10876

Figure 28 : Effet du DMSO sur les bactries et les champignons tudis

DMSO
DMSO

Citrobacter freundii ATCC 8090

Enterococcus faecalis ATCC 49452

47

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

DMSO

DMSO

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

DMSO
DMSO

Lysteria monocytogenes ATCC 15313

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

DMSO
DMSO

Salmonella typhimurium ATCC 13311

Staphylococcus aureus ATCC 25923


48

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

DMSO

Proteus mirabilis ATCC 35659

DMSO
DMSO

Aspergillus flavus

Asperagillus niger

DMSO

Candida albicans

49

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

1.4.2. Les antibiogrammes


Les souches de bactries Gram + et Gram - (Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus) ont montr des sensibilits diffrentes aux antibiotiques
standards tests : amoxilline + Ac. clavulanique (AMC), norfloxacine (NO), imipnme
(IPM), cfotaxime (CTX), cfoxitine (FOX), acide nalidixique (NA), ciprofloxacine (CIP),
fosfomycine (FOS), gentamicine (G), colistine (CS), ticarcilline (TIC), aztronam (ATM),
pipracilline (PIP), erythromycine (E), chloramphnicol (C), rifampicine (RA), vancomycine
(VA), pristinamycine (PT), acide fusidique (FA), kanamycine (K), benzylpnicilline (P),
oxacilline (OX). En plus des bactries suscites, la gentamicine a t teste contre le reste des
bactries (Tab. 3).
La bactrie E.coli est sensible ciprofloxacine, imipnme et cfoxitine avec des
diamtres de zones dinhibition de 42, 36 et 32 mm respectivement, alors quelle est plus ou
moins rsistante la gentamicine, fosfomycine et colistine avec un diamtre de 24 mm.
Pseudomonas aeruginosa est une bactrie Gram -, elle est relativement rsistante
certains antibiotiques tels que G, NA et CS (diamtres des zones dinhibition de 14, 14 et 12
mm respectivement) alors quelle a montr une certain sensibilit vis--vis de IPM, CIP et
FOS (diamtres des zones dinhibition de 29, 30 et 34 mm respectivement).
Staphylococcus aureus est une bactrie Gram +, elle est plus ou moins sensible aux
diffrents antibiotiques la CIP (38 mm), FOX, NA (34 mm) et la G (26 mm).
Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii,
Acinetobacter baumanir et Lysteria monocytogenes et Klebsiella pneumoniae ont montrs une
sensibilit dcroissante lantibiotique gentamicine 30, 18, 15, 13, 11 et 9 mm, alors que la
gentamicine na donn aucun effet sur Proteus mirabilis (Fig. 29).

50

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Tableau 3 : Diamtre de zone dinhibition en mm en prsence de quelques antibiotiques.

Antibiotiques
Souches
Escherichia coli
ATCC 25922

IPM

FOX

NA

CIP

FOS

CS

24

36

32

24

42

24

24

14

29

ND

14

30

34

12

26

ND

34

34

38

ND

ND

Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 27853
Staphylococcus
aureus ATCC
25923

Souches
Acinetobacter

Citrobacter freundii

ATCC 10876

ATCC 8090

11

18

13

30

Klebsiella

Lysteria

Proteus

Salmonella

pneumoniae

monocytogenes

mirabilis ATCC

typhimurium

ATCC 700603

ATCC 15313

35659

ATCC 13311

11

15

baumanir ATCC

Antibiotiques

Souches

Antibiotiques

Enterococcus

Bacillus cereus

19606

faecalis ATCC
49452

Tableau 3 : Diamtre de zone dinhibition en mm en prsence de quelques antibiotiques

51

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Figure 29 : Effet des antibiotiques sur les bactries tudies.


Figure 29 : Effet des antibiotiques sur les bactries tudies

GM

VER
CTX

FOS

CS

NO

NA

CIP

AMC

FOX

IPM

Escherichia coli ATCC 25922


OX

K
E

FOX
FA
GM

RA

PT

NA
VA

Staphylococcus aureus ATCC 25923

CZ

GM

NA

TIC
IPM
TZP

CIP
FOS

CS

ATM
PIP

52

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion


Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

GM

Acinetobacter baumanir ATCC 19606

Bacillus cereus ATCC 10876

GM
GM

Citrobacter freundii ATCC 8090

Enterococcus faecalis ATCC 49452

GM

GM

53

Partie Exprimentale
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

GM

Salmonella typhimurium ATCC 13311

Chapitre V : Rsultats et discussion


Lysteria monocytogenes ATCC 15313

GM

Proteus mirabilis ATCC 35659

54

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

1.4.3. Sensibilit aux extraits bruts :


Les effets inhibiteurs de la croissance des germes sont manifests par un seul extrait
EMR partir dune concentration mre de 200 mg/ml, sur 5 bactries E.coli, S.aureus, K.
pneumoniae, E. faecalis et P.aeruginosa. Les diamtres dinhibition sont en fonction de la
dose dpose sur le disque.
E. faecalis est la souche la plus sensible, 200 mg/ml le diamtre dinhibition est de 21

mm, suivie de S.aureus avec un diamtre de 19 mm, puis P.aeruginosa, E.coli et K.


pneumoniae avec les diamtres dinhibition de 14, 13 et 10 mm respectivement.
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) (Annexe II) exprimes par EMR sur
les souches testes ont t de 6,25 mg/ml pour E.coli, S.aureus, K. pneumoniae, E. faecalis et
0,2 mg/ml pour P.aeruginosa.
Ben ammar et al. (2008) ont trouvs des valeurs de CMI dextrait mthanolique de
Rhamnus alaternus tunisienne suprieurs 6 mg/ml avec les souches de E.coli, S.aureus et E.
faecalis.

Cowan (1999) a rapport que les diffrentes classes de poly phnols essentiellement les
tanins et les flavonodes peuvent augmenter la toxicit des extraits envers les
microorganismes. Cette toxicit est fonction du site et du nombre de groupements hydroxyles
prsents sur le compos phnolique. En outre, il est vident que laugmentation de
lhydroxylation conduit une augmentation de la toxicit. Leffet antimicrobien de ces
phnols peut tre expliqu par linhibition de la croissance bactrienne suite leur adsorption
sur les membranes cellulaires, linteraction avec les enzymes et les effecteurs ou la privation
en substrats et ions mtalliques (Dhaouadi et al., 2010).
Lefficacit optimale dun extrait peut ne pas tre due un constituant actif majoritaire,
mais plutt laction combine (synergie) de diffrents composs (Essawi et Srour, 2000).
Le mcanisme des effets antimicrobiens des polyphnols est sans doute trs complexe. Parmi
les hypothses avances, linhibition de la synthse d'acide nuclique, laltration des
fonctions de la membrane cytoplasmique, la squestration de substrats ncessaires la
croissance microbienne et linhibition du mtabolisme nergtique microbien (Jungkind,
1995).
Il a t rapport que lactivit antimicrobienne chez dautres plantes est d la prsence
danthraquinones (Comini et al., 2011; Doughari et al., 2012).
Leffet bactricide (Annexe II) le plus important manifest par EMR est sur les trois
bactries E. coli, S. aureus et L. monocytogenes avec une CMB de 12,5 mg/ml, puis sur P.

55

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

aeruginosa avec une CMB de 25 mg/ml. Et le plus faible est sur la bactrie K. pneumoniae
avec une CMB de 100 mg/ml.
Tableau 5 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec Escherichia coli.
Extrait

EMR

Concentration en mg/ml

Diamtre dinhibition

200

13

100

10

50

25

8,5

12,5

7,5

6,25

Tableau 4 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec E. coli

Tableau 6 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec Pseudomonas aeruginosa.
Extrait

EMR

Concentration en mg/ml

Diamtre dinhibition

200

14

100

13

50

11

25

9,5

12,5

8,5

6,25

3,125

7,5

1,5625

7,5

0,78125

0,390625

0,1953125

0,09596929

Tableau 5 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec P. aeruginosa

Tableau 7 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec Staphylococcus aureus.
Extrait

EMR

Concentration en mg/ml

Diamtre dinhibition

200

19

100

17

50

14

25

11

12,5

7,5

6,25

Tableau 6 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec S. aureus.

56

Partie Exprimentale

Chapitre V : Rsultats et discussion

Tableau 8 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec Enterococcus faecalis.
Extrait

Concentration en mg/ml

Diamtre dinhibition

200

21

100

19

50

16,5

25

14

12,5

12,5

6,25

EMR

Tableau 7 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec E. faecalis

Tableau 9 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec Klebsiella pneumoniae.
Extrait

Concentration en mg/ml

Diamtre dinhibition

200

10

100

50

8,5

25

12,5

6,25

6,5

EMR

Tableau 8 : Diamtre de zones dinhibition (en mm) obtenu avec K. pneumoniae

Tableau 10 : Concentrations minimales inhibitrices exprimes pour EMR sur les souches testes en
mg/ml.

Escherichia
Souches
Extraits

EMR

Pseudomonas Staphylococcus

Klebsiella

Lysteria

coli ATCC

aeruginosa

aureus ATCC

pneumoniae

monocytogenes

25922

ATCC 27853

25923

ATCC

ATCC 15313

700603
CMI = 6,25

CMI = 0,195

CMI = 6,25

CMI = 6,25

CMI = 6,25

CMB = 12,5

CMB = 25

CMB = 12,5

CMB = 100

CMB = 12,5

Tableau 9 : Les CMI exprimes pour EMR sur les souches testes en mg/ml
Tableau 10 : Effet des quatre extraits de R. alaternus sur les champignons tudis

57

CONCLUSION

Conclusion

Conclusion
Les plantes mdicinales restent toujours la source fiable des principes actifs connus par
leurs proprits thrapeutiques. Une tude des proprits antioxydante et antimicrobienne a
concern une plante appartient la famille des Rhamnaces, employe en Algrie gras ses
proprits thrapeutiques.
Quantitativement, lvaluation du contenu des polyphnols totaux en adoptant la
mthode de Folin-Ciocalteu rvle la prsence des quantits moyennement importantes en
polyphnols. De mme nous avons dos les flavonodes par la mthode dAlCl3 qui nous
mne conclure que cette plante contient une quantit considrable de flavonodes. Il ressort
de ces analyses que R. alaternus est riche en flavonodes de types flavones et flavonols.
Le potentiel antiradicalaire des extraits a t dtermin par la mthode de DPPH dont
les rsultats montrent que ces extraits possdent une bonne activit, donc cette plante contient
des molcules qui sont considres comme des agents antioxydants de premire classe et
peuvent tre employes pour des applications thrapeutiques, sachant que les antioxydants
contribuent de manire trs efficace la prvention des maladies telles que le cancer, et les
maladies cardiovasculaires. Au cours de cette tude nous avons ralis galement un test
antimicrobienne vis--vis 11 bactries et 3 champignons pathognes, les rsultats
microbiologiques ont montr que les extraits de R. alaternus ont une action faible sur les
champignons et les espces bactriennes testes.
Sachant que notre pays possde une biodiversit immense dont chaque plante se
caractrise par un rservoir assez important de mtabolites secondaires avec des
caractristiques thrapeutiques et pharmacologiques particulires qui demandent dtre
exploites par les recherches, de cet effet, et comme perspectives on propose de :
Faire une tude biochimique sur les fruits de Rhamnus alaternus.
Dterminer de nouvelles substances bioactives naturelles pourront rpondre aux
diffrents problmes de la sant et dtre un alternatif des mdicaments synthtiques.
Dvelopper des mdicaments antiradicalaires base de plantes, dous dune activit
antioxydante.

58

REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES

Rfrences bibliographiques

Rfrences bibliographiques
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66

ANNEXES

Annexes
Annexe I
Composition du milieu Mueller-Hinton :
Extrait de viande de buf : 2.0g.
Peptone de casine : 17.5g.
Amidon de mas : 1.5g.
Agar : 17.0g.
pH : 7.4.
Composition du milieu Sabouraud :
Peptone : 10,0 g.
Glucose mass : 20,0 g.
Agar : 15,0 g.
pH = 6,0.

67

Annexe II : Dtermination du CMI et du CMB sur les bactries sensible lextrait EMR.
200

200

100

6,25
100
6,25

50

12,5

25

50

12,5

25

Escherichia coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 25923

200

3,125

6,25

100

12,5

0,095

1,562

0,195

50

0,781

25
0,390

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853


200

200

100

100
6,25
6,25
50

12,5
25

Enterococcus faecalis ATCC 49452

50
12,5
25

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

68

Tmoin

Tmoin
0,195

12,5

0,390
0,781
1,562
3,125
6,25

25
50
100

12,5

200

Escherichia coli ATCC 25922

25
50
100
200

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853


Tmoin

Tmoin

12,5

12,5
25
50

25

100

50
100

200

200

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Tmoin
12,5
25
50
100
200

Enterococcus faecalis ATCC 49452

69

Annexe III : Effet des quatre extraits de R. alaternus sur les champignons tudis.
EAR

EAR

200

200

Aspergillus flavus aprs 2 jours

Aspergillus flavus aprs 4 jours

EAR

EAR

200

200

Asperagillus niger aprs 2 jours

Asperagillus niger aprs 4 jours


EAR

200

Candida albicans aprs 24 heures

70

EATF

EATF

200

200

Aspergillus flavus aprs 2 jours

Aspergillus flavus aprs 4 jours

EATF

EATF

200
200

Asperagillus niger aprs 2 jours

Asperagillus niger aprs 4 jours


EATF

200

Candida albicans aprs 24 heures

71

EMR

EMR

200
200

Aspergillus flavus aprs 2 jours

Aspergillus flavus aprs 4 jours

EMR

EMR

200

200

Asperagillus niger aprs 2 jours

Asperagillus niger aprs 4 jours


EMR

200

Candida albicans aprs 24 heures

72

EMTF

EMTF

600

Aspergillus flavus aprs 2 jours

Aspergillus flavus aprs 4 jours

EMTF

EMTF

600

600

Asperagillus niger aprs 2 jours

Asperagillus niger aprs 4 jours


EMTF

600

Candida albicans aprs 24 heures

73


. Rhamnaceae Rhamnus alaternus
. % 10 % 11 : ) EMR( Soxhlet ( EMTF)
.) / (% 8 % 6 : ) EAR( ) EATF(
/ 153 74 ,) EMTF( ) EATF( 74 218 Folin-Ciocalteu
/ 49 66 113 108 : AlCl3 .) EAR() EMR(
/ 15 18 48 44 : EMR ,EMTF ,EAR ,EATF
92 )BHT( % 87 76 / .
( DPPH.) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl : % 50 ) CI50( ./ 2 %
11 .EMTF : / 71 ) EAR : 66( )EATF : 66( )EMR : 52( )BHT : 37( :
)CMI( .)EMR( 3 +
.P. aeruginosa / 0.2 E. faecalis K. pneumoniae S. aureus E. coli : / 6,25
. , ,. Rhamnus alaternus L. , :
Abstract
Rhamnus alaternus L. a shrub which belonging to the Rhamnaceae family. Its a medicinal plant largely used in
Algerian traditional medicine. The aerial parts of the plant (stems and lives) were subjected to maceration in methanol
(EMTF), whereas the roots were extracted in methanol (EMR) with Soxhlet. The decoction has been conducted both
on the aerial parts (EATF) and roots (EAR) using distilled water. The yields were: 11 %, 10 %, 6 % and 8 % (w/w) for
EMTF, EMR, EATF and EAR respectively. Total phenolic contents were determined using Folin-Ciocalteu reagent
and found to be: 218 (EATF), 153 (EAR), 74 (EMTF) and 74 (EMR) mg EAC/ g of fresh weight. Flavonoids were
evaluated by AlCl3 method and shown to be 108 (EATF), 113 (EAR), 66 (EMTF) and 49 (EMR) mg EQ/ g of fresh
weight. The flavones and flavonols were estimated to be: 44 (EATF), 48 (EAR), 18 (EMTF) and 15 (EMR) mg EQ/ g
of fresh weight. Antioxidant activity was evaluated using -carotene/linoleic acid system, it ranged between 76 and 87
% for all extracts and seems to be closed to that of BHT 92 % when used at 2 mg/ml. Free radical scavenging effects
were evaluated using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH.), The 50 percent inhibitory concentration for DPPH. (IC50)
were: 37 (BHT), 52 (EMR), 66 (EATF), 66 (EAR) and 71 g/ml (EMTF). The antimicrobial sensitivity of the extracts
towards eleven bacterial strains (Gram+ and Gram-) and three fungus strains was assessed using to the disc diffusion
agar test; only one extract (EMR) has developed an inhibitory effect against five bacteria tested namely: E.coli,
S.aureus, K. pneumoniae , E. faecalis and P.aeruginosa. The minimal Inhibitory Concentrations (MICs) were
respectively 6,25 mg/ml and 0,2 mg/ml.
Key word: phenolic content, Rhamnus alaternus L., antimicrobial activity, antioxidant activity.Rsum
Rsum
Rhamnus alaternus L. est un arbuste qui appartient la famille des Rhamnaceae. Cest une plante mdicinale
largement utilise en mdecine traditionnelle en Algrie. La partie arienne de la plante (tiges et feuilles) a soumis
une macration dans le mthanol (EMTF), alors que lextrait mthanolique des racines (EMR) est obtenu lextraction
au Soxhlet, la dcoction est ralise la fois sur les deux parties arienne (EATF) est racines (EAR) dans leau
distille. Les rendements taient de : 11 %, 10 %, 6 % et 8 % (m/m) pour EMTF, EMR, EATF et EAR respectivement.
La teneur en polyphnols totaux a t dtermine en utilisant le ractif de Folin-Ciocalteu, elle est de 218 (EATF), 153
(EAR), 74 (EMTF) et 74 (EMR) mg EAC/ g de matire fraiche. Les flavonodes ont t valus par la mthode
utilisant les chlorures daluminium AlCl3, la teneur est estime 108 (EATF), 113 (EAR), 66 (EMTF), 49 (EMR) mg
EQ/ g de matire fraiche. Le dosage des flavones et flavonols a rvl des teneurs de 44 (EATF), 48 (EAR), 18
(EMTF) et 15 (EMR) mg EQ/ g de matire fraiche. Lactivit antioxydante a t ralise par la mthode de
dcoloration du -carotne / acide linolique en utilisant des concentrations de 2 mg/ml pour les quatre extraits et
varie entre 76 et 87 % alors que celle du tmoin positif BHT est de 92 %. Quant au test anti radicalaire valu en
utilisant le 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyle (DPPH.), les concentrations inhibitrices 50 % (CI50) sont estimes 37
(BHT), 52 (EMR), 66 (EATF), 66 (EAR) et 71 g/ml (EMTF). Lactivit antimicrobienne a t dtermine sur onze
souches bactriennes (Gram+ et Gram-) et trois champignons selon la mthode de diffusion de disque, un seul extrait
(EMR) a manifest un effet inhibiteur sur 5 souches bactriennes. Les concentrations minimal inhibitrices (CMI)
pour E.coli, S.aureus, K. pneumoniae et E. faecalis est de 6,25 mg/ml et 0,2 mg/ml pour P.aeruginosa.

Mots cls: Polyphnols, Rhamnus alaternus L., activit antimicrobiennes, activit antioxydante.

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