Vous êtes sur la page 1sur 49

1

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Laut menghasilkan sejumlah besar zat dengan berbagai kegiatan karena lingkungan
dengan salinitas tinggi, tekanan tinggi, suhu rendah, intensitas cahaya rendah dan kondisi
oligotrophic. Di beberapa tahun terakhir, semakin banyak ilmuwan mengalihkan untuk
mengeksploitasi obat dari laut untuk berbagai macam bioaktivitas, termasuk antioksidan,
antivirus influenza, antiparasit, kegiatan antihiperlipidemia, dan lain-lain. Para ilmuwan
menemukan sejumlah senyawa dari lingkungan laut, yang menunjukkan aktivitas antitumor
yang baik. Salah satu sumber daya laut yang berpotensi sebagai penghasil antioksidan alami
adalah rumput laut atau alga.
Berdasarkan hasil penelitian Tambaru, dkk (2009) pada bulan Agustus sampai
Oktober 2009 di lima perairan di Sulawesi Selatan, yaitu perairan Bantaeng, Sinjai, Bone,
Takalar dan Pangkep didapat hasil sebanyak 51 jenis alga dari kelompok alga merah, alga
hijau dan alga coklat dari lokasi penelitian. Jumlah spesies yang paling banyak didapat di
Perairan Pangkep yaitu ditemukan sebanyak 30 spesies rumput laut, sedangkan yang paling
sedikit spesies rumput laut yang ditemukan dari Perairan Bone sebanyak 3 spesies. Jumlah
spesies alga coklat yang paling banyak ditemukan adalah di Perairan Pangkep. Spesies yang
paling potensial untuk dibudidayakan adalah kelompok alga coklat

jenis Sargasum

polycistum.
Penelitian yang mengarah pada penemuan senyawa antioksidan yang menghambat
tumor akhir-akhir ini merupakan topik yang menarik untuk dikembangkan sebagai contoh
analisis mengenai efek biota laut seperti Sargassum filipendula, Dilophus spiralis, Turbinaria
decurrens dan lainnya dari kelas alga coklat disinyalir dapat digunakan untuk keperluan
tersebut.

Penelitian yang telah dilakukan bahwa alga coklat dari species Sargassum sp
merupakan salah satu biota yang banyak ditemukan diperairan laut Indonesia, khususnya
untuk perairan Sulawesi Selatan (perairan Pangkep). Perairan Sulawesi Selatan merupakan
penyumbang alga terbesar di Indonesia, termasuk kabupaten Pangkep dimana budidaya alga
telah menjadi mata pencaharian alternatif bagi masyarakat pesisir dan nelayan skala kecil.
Hasil penelitian terakhir menunjukkan bahwa alga coklat Sargassum sp memiliki aktivitas
terhadap sel tumor (Khotimah, dkk, 2013).
Alga coklat kaya akan fukoxantin, pigmen fotosintesis (klorofil a dan c) (Zapata et
al., 2006), -karoten dan violaxantin (Burtin, 2003). Hasil penelitian menunjukkan komposisi
karotenoid pada Sargassum sp yaitu fukosantin, xantofil dan -karoten (Merdekawati, 2009).
Menurut penelitian Chasanah, dkk (2007), diduga senyawa yang berperan dalam
aktivitas antioksidan berasal dari golongan pigmen karotenoid yang teroksigenasi dalam
strukturnya yaitu fucosantin. Selain senyawa ini, secara umum alga coklat juga mengandung
violaksantin, flavosantin serta neosantin a dan b sedangkan kelompok karotenoid yang umum
adalah - karoten yaitu karotenoid yang tidak mengandung atom oksigen dalam strukturnya.
Golongan senyawa ini sudah dikenal memiliki aktivitas antitumor yang baik.
Senyawa antioksidan memiliki peran yang sangat penting dalam dunia kesehatan
mengingat kemampuannya dalam menghambat pembentukan radikal bebas, dalam
menghambat oksidasi asam nukleat, protein, lemak dan DNA sehingga mengurangi berbagai
penyakit degeneratif serta mencegah penyakit tumor.
Hingga saat ini, suatu penelitian yang sistematik mengenai kandungan -karoten
dalam alga coklat Sargassum polycystum yang terdapat banyak pada perairan Pangkep
Sulawesi Selatan belum pernah dilakukan. Penelitian dimulai dengan isolasi dan fraksinasi
untuk mendapatkan karotenoid, dilakukan standarisasi dan diakhiri dengan pemanfaatan
sebagai antioksidan, dan antitumor.

B. Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:
1. Apakah -karoten dari alga coklat Sargassum polycystum dapat diekstraksi?
2. Apakah ekstrak -karoten yang diperoleh memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas?
3. Apakah ekstrak -karoten memiliki aktivitas antitumor terhadap sel He La?
C. Tujuan
Adapun tujuan dalam penelitian ini adalah:
1. Mengekstraksi -karoten dari alga coklat Sargassum polycystum.
2. Menentukan aktivitas antioksidan dan toksisitas dari ekstrak -karoten yang diperoleh.
3. Menentukan aktivitas antitumor terhadap sel He La dari ekstrak -karoten yang diperoleh.
D. Manfaat
Adapun manfaat dalam penelitian ini adalah:
1. Sebagai informasi bagi civitas akademika terutama potensi -karoten dari alga coklat
Sargassum polycystum.
2. Menjadikan alga coklat Sargassum polycystum agar lebih termanfaatkan khususnya dalam
bidang terapi antitumor.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Tentang Alga (Rumput Laut)


Rumput laut atau sea weeds secara ilmiah dikenal dengan istilah alga atau ganggang.
Rumput laut termasuk salah satu anggota alga yang merupakan tumbuhan berklorofil. Dilihat
dari ukurannya, rumput laut terdiri dari jenis mikroskopik dan makroskopik. Jenis
makroskopik inilah yang sehari-hari dikenal sebagai rumput laut (Taurino, 2006).
Rumput laut tergolong tanaman berderajat rendah, umumnya tumbuh melekat pada
substrat tertentu, tidak mempunyai akar, batang maupun daun sejati, tetapi hanya menyerupai
batang yang disebut thallus. Bentuk thallus ini beragam, ada yang bulat seperti tabung, pipih,
gepeng, bulat seperti kantong, atau ada juga yang seperti rambut. Rumput laut tumbuh di
alam dengan melekatkan diri pada karang, lumpur, pasir, batu dan benda keras lainnya.
Selain benda mati, rumput lautpun dapat melekat pada tumbuhan lain secara epifitik
(Anggadiredjo, 2006).
Makroalga (Rumput laut), hidup di laut yang tidak memiliki akar, batang dan daun
sejati dan pada umumnya hidup di dasar perairan dan menempel pada substrat (benda lain).
Fungsi akar (holdfas) pada rumput laut bukan sebagai penyerap makan melainkan saebagai
alat pelekat pada substrat. Karena tidak memiliki akar, batang dan daun seperti umumnya
pada tanaman, maka rumput laut digolongkan ke dalam tumbuhan tingkat rendah
(Thallophyta). Morfologi dari rumput laut merupakan salah satu dasar untuk membedakan
antara satu jenis alga dengan alga yang lain, bentuk thallus, kandungan pigmen, fungsi-fungsi
bagian rumput laut serta beberapa hal mendasar yang membedakan rumput laut.
Rumput laut (seaweed), alga, ganggang dan lamun (seagrass) adalah tumbuhan yang
memiliki perbedaan. Rumput laut atau yang biasa disebut dengan seaweed merupakan

tanaman makro alga yang hidup di laut yang tidak memiliki akar, batang dan daun sejati dan
pada umummnya hidup di dasar perairan. Rumput laut disebut tanaman karena memiliki
klorofil (zat hijau daun) sehingga bisa berfotosintesis. Rumput laut juga sering disebut
sebagai alga atau ganggang pada daerah-daerah tertentu di Indonesia. Akan tetapi rumput laut
(seaweed) berbeda dengan lamun (seagrass). Lamun adalah tanaman yang hidup dilaut dan
tidak memiliki klorofil. Lamun merupakan kompetitor bagi rumput laut, dan biasanya
tumbuh di daerah dekat pantai yang cenderung kotor. Rumput laut bersama-sama dengan
lamun adalah kontributor penting pada rantaimakanan di perairan pantai (Luning, 1990).
Tumbuhan bentik ini pada lingkungan laut terbukti sebagai penyedia habitat dan makanan
untuk herbivora (Dawes, 1981).
Menurut Anggadiredja et al.(2007), secara taksonomi alga dikelompokkan ke dalam
divisio Rhodophyta. Alga berdasarkan kandungan pigmennya dibagi kedalam empat kelas,
yaitu sebagai berikut:
1. Chlorophyceae (ganggang hijau) yakni makroalga yang didominasi oleh zat warna hijau
daun (klorofil)
2. Cyanophyceae (ganggang biru-hijau) yakni makroalga yang didominasi zat warna biru
sampai kehijauan (fikosianin)
3. Phaeophyceae (ganggang coklat) yakni makroalga yang didominasi zat warna coklat atau
pirang. Alga kelas ini dapat menghasilkan alginat.
4. Rhodophyceae (ganggang merah) yakni makroalga yang didominasi zat warna merah,
ungu, lembayung (fikoeritrin). Rhodophyceae lebih banyak dibudidayakan karena dapat
menghasilkan karaginan dan agar.
Pada umumnya, rumput laut juga melakukan aktivitas metabolisme. Hasil
metabolisme primer sebagai komposisi utama dari lumput laut yang dapat digunakan sebagai
bahan pangan adalah karbohidrat (Agustina, 2010). Ekstrak dari hasil metabolisme primer

pada umumnya bersifat hidrofilik koloid atau hidrokoloid, antara lain agar, karaginan,
alginat, dan furcelaran. Hasil metabolisme primer rumput laut merupakan senyawa kompleks
polisakarida yang penggunaannya sangat bervariasi di dalam berbagai industri, seperti
industri makanan, industri farmasi dan kosmetika, industri tekstil dan industri cat.
B. Tinjauan Tentang Alga Coklat
Phaeophyceae atau alga coklat adalah salah satu kelas dari alga berdasarkan zat
warna atau pigmentasinya. Pigmen yang lebih dominan adalah pigmen xantofil yang
menyebabkan alga berwarna coklat. Pigmen lain yang terdapat dalam Phaeophyceae adalah
klorofil A dan C serta karoten.
Alga coklat kaya akan fukoxantin, pigmen fotosintesis (klorofil a dan c) (Zapata et
al., 2006), -karoten dan violaxantin (Burtin, 2003). Hasil penelitian menunjukkan komposisi
karotenoid pada Sargassum sp yaitu fukosantin, xantofil dan -karoten (Merdekawati, 2009).
Keberadaan klorofil a pada alga coklat dilengkapi dengan pigmen aksesoris yaitu klorofil c
dan karotenoid yang berfungsi melindungi klorofil a dari fotooksidasi (Atmaja, 1996).
Sebagian besar Phaeophyceae terdapat dilaut, hanya ada tiga jenis saja yang hidup di
air tawar dan jenis-jenis ini merupakan jenis yang langka. Phaeophyceae banyak terdapat
didaerah yang beriklim dingin. Alga ini banyak mendominasi bagian lateral daerah artik dan
antartik. Walaupun demikian, ada jenis-jenis lainnya yang hidup didaerah tropik dan
subtropik. Sebagian besar dari phaeophyceae hidup melekat pada subtrat karang dan lainnya.
Beberapa diantaranya hidup sebagai epifit.
Phaeophyta atau alga coklat dibagi menjadi tiga golongan, berdasarkan tipe
pergantian keturunan. Alga coklat ini hidup pada air laut, hanya beberapa jenis saja yang di
temukan di air laut, hanya beberapa saja yang hidup di air tawar, laut samudra, daerah iklim
sedang dan dingin.

Alga coklat ini masuk dalam satu kelompok yang sangat besar, Heterokontopyta,
suatu eukaryotic kelompok organisme yang di bedakan secara mencolok, ganggang ini lebih
banyak ditemukan irtidal, terutama pada daerah belahan utara. Anggota phaeophyta di
temukan sekitar 500 genus dengan 5600 spesies. Pada daerah tropis, beberapa spesies ini
dapat membentuk biomasa penting.
Semua ganggang coklat berbentuk benang atau lembaran, bahkan ada yang
menyerupai tumbuhan tingkat tinggi dengan bagian-bagian serupa akar, batang, dan daun.
Umumnya ganggang coklat bersifat makroskopis,dan dapat mencapai ukuran lebih dari 30
meter, dan mempunyai gelembung-gelembung udara yang berfungsi sebagai pelampung. Dan
phaeophyta sendiri mempunyai peranan penting bagi kehidupan manusia di antaranya:
Sebagai bahan makanan, penghasil alginate di laboratorium, dalam industri sebagai bahan
kosmetik, farmasi, dan penyusun fosil. Contoh spesies Phaeophyta, Fucus vesiculosus,
Sargassum duplicatum, Sargassum binderi, Turbinaria decurens, Padina australis hauck dan
sebagainya.
Hampir semua jenis alga coklat hidup diperairan laut dan melekat pada substrat
keras dan dapat tumbuh dengan subur dilautan bersuhu dingin pada pinggiran pantai dengan
kedalaman tidak lebih dari 20 meter (Winarno, 1996).
Beberapa jenis alga coklat (Phaeopyceae) yang hidup diperairan Indonesia adalah
marga Sargassum, Dictyota, Turbinaria, Padina, Hydroclathrus, dan Harmophysa.
Penyebaran alga coklat di Indonesia dapat dilihat pada Tabel 2.1 berikut:

Tabel 2.1 Penyebaran Alga Coklat Di Indonesia


Jenis

Daerah Penyebaran

Dictyota dichotoma
Hormophysa sp

Kepulauan Seribu, Sulawesi, Pulau Komodo, Kepulauan


Kangean, Bali
Sumatera Utara

Hydrochlatrus chlatharus

Jawa, Kalimantan, Sulawesi, Timor, Sumbawa, Kepulauan Seribu

Padina autralis

Jawa, Sumatera, Ambon, Sumba, Sulawesi, Kepulauan Seribu

Sargasum siliquasum

Jawa, Sulawesi, Sumatera Utara, Lombok, Kepulauan Aru, Irian

Turbinaria conoides
Jawa, Sumatera, Maluku, Irian, Flores
Sumber : Indriati & sumarsih (1996)
Umumnya alga coklat bersel banyak (multiselluler), dengan pigmen coklat
(fukosantin) yang dominan disamping memiliki klorofil a dan b. Bentuk tubuhnya yang
menyerupai tumbuhan tingkat tinggi karena memiliki bagian menyerupai akar, batang, dan
daun membuat alga ini mudah dikenali. Banyak ditemukan di pantai atau perairan laut
dangkal. Cara reproduksi alga coklat secara vegetatif dengan fragmentasi dan generatif
melalui isogami atau oogami.
Jenis-jenis alga coklat, antara lain:
a. Laminaria, memiliki batang, daunnya berbentuk lembaran, mengandung yodium dan asam
alginat.
b. Macrocystis, menghasilkan yodium dan asam alginat yang berfungsi sebagai bahan
industri.
c.

Sargasum,

daunnya

berbentuk

lembaran,

di antara

batang

dan

tangkainya

terdapat gelembung udara.


d. Fucus, bentuk daun berupa lembaran dan pada bagian tepi daun terdapat gelembung.

Cara reproduksi vegetatif alga coklat mirip dengan tumbuhan tinggi yaitu, pada
ujung daun fertil terbentuk reseptakel, yaitu badan yang mengandung alat pembiak. Alat
pembiaknya disebut konseptakel yang menghasilkan ovum dan spermatozoid.
Alga laut cokelat (brown seaweed) banyak mengandung vitamin dan mineral yang
seimbang dan bermanfaaat seperti : kalsium, magnesium, besi, tembaga, mangan, zink, boron
dan iodine, selain itu mengandung serat, asam amino, dan B-komplex. Alga Laut Cokelat
(brown seaweed) juga mengandung beberapa zat aktif, yang dapat mengurangi risiko terkena
stroke akibat penyumbatan pembuluh darah, seperti:

Alginate, yakni serat tak larut yang berperan mengurangi kadar lemak, trigliserida serta
kolesterol dalam darah, sehingga terkontrol.

Laminarin sebagai zat anti penggumpalan darah yang membantu mengurangi risiko
penyakit jantung dan stroke.

Iodium organik membantu mengoptimalkan fungsi tiroid untuk metabolisme tubuh lebih
baik

Mineral koloidal yang mudah diserap oleh tubuh.

Kandungan lain yang berguna bagi pasien pasca stroke adalah fucoidan yaitu suatu
polisakarida kompleks yang membantu memperbaiki daya ingat dan sistem motorik pasca
stroke serta meregenerasi sel-sel baru untuk kesehatan menyeluruh.

Fucoidan dalam alga coklat mampu menghambat pembentukan bekuan darah sehingga
menurunkan resiko terserang penyakit jantung dan stroke (Malmo University Hospital,
Swedia).

Fucoidan dalam alga coklat mempercepat fungsi motorik pada minggu pertama dan
perbaikan memori (University of Manitoba, Winnipeg-Canada)

10

Alga coklat mengubah aktivitas enzim di liver yang mengontrol metabolisme asam lemak,
sehingga menurunkan kadar lemak dalam darah. Selain itu, dapat juga meningkatkan
pembakaran lemak di liver (Laboratory of Lipid Chemistry, Yokohama- Jepang)

Alga laut coklat (brown seaweed) membantu menurunkan kadar kolesterol sebanyak
26,5% dan trigliserida sebanyak 36,1% (Cardiovascular Center di RS Sakhalin, Rusia).

C. Tinjauan Tentang Sargassum polycystum


1) Habitat Tumbuh
Sargassum tersebar luas di Indonesia, tumbuh di perairan yang terlindung maupun
yang berombak besar pada habitat batu. Beberapa jenis atau varietas dari Sargassum terdapat
dalam jumlah besar di laut Sargasso. Alga di laut ini berasal dari daerah pantai. Saat
Sargassum patah dari induknya, hanyut ke laut lepas dan berkembang biak disana (Ahmad,
2005).
2) Morfologi Tumbuhan
Morfologi Sargassum polycystum tidak jauh berbeda dengan ciri-ciri umum
Phaeophyta. Talus silindris berduri-duri kecil merapat, holdfast membentuk cakram kecil dan
di atasnya terdapat perakaran/stolon yang rimbun berekspansi ke segala arah. Batang
pendek dengan percabangan utama tumbuh rimbun. Mempunyai gelembung udara (bladder)
yang umumnya soliter (berkelompok), panjangnya mencapai 7 meter,warna talus umumnya
coklat (Aslan, 1991).

11

Gambar 2.1 Alga Coklat


3) Taksonomi Tumbuhan
Divisi

: Phaeophyta

Kelas

: Phaeophyceae

Bangsa : Fucales
Suku

: Sargassaceae

Marga

: Sargassum

Spesies : Sargassum polycystum

12

4) Kandungan Kimia
Sargassum polycystum mengandung alginat, vitamin C, vitamin E (-tokoferol),
mineral, karotenoid, klorofil, florotanin, polisakarida sulfat, asam lemak, dan asam amino
(Matanjun, 2008 ; Raghavendran, 2005). Sargassum polycystum juga mengandung senyawa
metabolit sekunder yaitu steroid/ triterpenoid (Anggadiredja, 2009).
5) Kegunaan
Sargassum polycystum memiliki potensial dalam penyembuhan penyakit kantung
kemih, gondok, kolesterol, digunakan sebagai kosmetik, sumber alginat, antioksidan
(Anggadiredja, 2009; Matanjun, 2008).
D. Tinjauan Tentang -Karoten
Karotenoid merupakan pigmen alami dan dikenal secara luas dari warnanya
terutama warna kuning, oranye dan merah. Pigmen ini ditemukan pada tumbuhan besar,
ganggang, jamur dan bakteri dalam jaringan fotosintesis maupun jaringan non fotosintesis.
Selain pada tumbuhan, karoten juga ditemukan pada hewan, misalnya sebagai pigmen warna
pada burung, ikan dan beberapa hewan invertebrata.
Nama carotenoids ini diperoleh dari salah satu tipenya yang terkenal yaitu Bkaroten, yang merupakan pigmen yang pertama kali diisolasi dari wortel (Daucus carota) oleh
Wackenroder pada tahun 1983 (Gross, 1991 ; Anonim, 2006).
Karotenoid merupakan lipid sehingga pigmen ini bersifat liposoluble (larut dalam
lemak) dan larut dalam pelarut nonpolar. Secara struktur, karotenoid merupakan poliena
dengan rantai terkonjugasi linier dari atom-atom karbon yang berhubungan dengan ikatan
rangkap dua dan tunggal. Karotenoid tersusun atas 8 unit isoprene (C5) yang terhubung satu
sama lain dengan bentuk geometris jika diputus pada tengah strukturnya. Pada -karoten,
pemecahan pada pusat molekul yang dikatalisis oleh enzim 15-15-dioksigenase membentuk
2 molekul retinal yang kemudian direduksi menjadi molekul retinol yang merupakan vitamin

13

A (Glover, 1960). Bentuk retinol mengalami esterifikasi, lalu diangkut ke getah bening dan
disimpan dalam hati (Gross, 1991 ; Rodriguez-Amaya, 2001).

Gambar 2.2 Struktur -karoten (Rodriguez-Amaya, 1991)


Beberapa struktur kimia -karoten yang diproduksi oleh Alga, dapat dilihat pada
Gambar 2.3 berikut:

Gambar 2.3 Struktur Kimia -Karoten Yang Diproduksi Oleh Alga


Berdasarkan beberapa hasil penelitian, alga merupakan salah satu penghasil
karotenoid terbesar dimana menunjukkan keragaman struktur kimianya, sekitar 100 jenis
karotenoid (Fretes, 2012).
Di alam, karotenoid berfungsi sebagai energi dissipation pada sel fotosintesis dalam
pusat reaksi (RC). Tanpa adanya karoten, energi yang ditangkap oleh klorofil melalui
penyerapan sinar matahari terakumulasi secara berlebihan. Kelebihan energi tersebut dapat
dilepaskan kembali ke alam oleh molekul karotenoid (dalam bentuk cis-). Selain sebagai
energi dissipation karotenoid juga berfungsi dalam light-harvesting sebagai photo-protector

14

dimana pada penyerapan sinar yang berlebihan karoten mengubah karoten dari bentuk singlet
menjadi triplet. Klorofil dalam kondisi triplet sangat berbahaya karena memicu timbulnya
singlet oksigen yang merupakan radikal bebas yang akan merusak sel tersebut. Karoten
menangkap triplet klorofil dan mengubah singlet oksigen menjadi oksigen normal (Frank,
1995).
-karotenoid dipercaya dapat menurunkan resiko penyakit jantung dan kanker. karotenoid berperan sebagai antioksidan. -karotenoid terdapat pada aprikot, wortel dan
mangga. Dengan mengkonsumsi 50 mg -karotenoid tiap hari dalam menu makanan dapat
mengurangi risiko terkena penyakit jantung (Kosasih, 2004).
Sebagai antioksidan -karotenoid bekerja dengan cara memperlambat fase inisiasi.
-karotenoid merupakan salah satu provitamin A. Pemberian vitamin A dalam dosis tinggi
dapat bersifat toksis. Akan tetapi, -karotenoid dalam jumlah banyak mampu memenuhi
kebutuhan vitamin A, dan selebihnya tetap sebagai -karotenoid yang berfungsi sebagai
antioksidan.
E. Tinjauan Tentang Radikal Bebas
Radikal bebas adalah setiap molekul yang mengandung satu atau lebih elektron yang
tidak berpasangan. Radikal bebas bertendensi kuat memperoleh elektron dari atom lain,
sehingga atom lain yang kekurangan satu elektron ini menjadi radikal bebas pula yang
disebut radikal bebas sekunder (Kosasih, 2004).
Radikal bebas sangat reaktif dan dengan mudah menjurus ke reaksi yang tidak
terkontrol menghasilkan ikatan silang (cross-link) pada DNA, protein, lipida, atau kerusakan
oksidatif pada gugus fungsional yang penting pada biomolekul. Perubahan ini akan
menyebabkan proses penuaan. Radikal bebas juga terlibat dan berperan dalam patologi dari
berbagai penyakit degeneratif, yakni kanker, aterosklerosis, rematik, jantung koroner,
katarak, dan penyakit degenerasi saraf seperti parkinson (Silalahi, 2006).

15

Radikal bebas memiliki reaktivitas yang sangat tinggi dan mudah bereaksi dengan
molekul lain yaitu DNA, protein, karbohidrat dan lainnya. Radikal bebas tidak dapat
mempertahankan bentuk asli dalam waktu yang lama dan berusaha untuk berikatan dengan
molekul yang bersifat stabil dan mengambil elektronnya.
Namun, bila ada dua senyawa radikal bebas bertemu, elektron-elektron yang tidak
berpasangan dari kedua senyawa tersebut akan bergabung dan membentuk ikatan kovalen
yang stabil. Sebaliknya, bila senyawa radikal bebas bertemu dengan senyawa bukan radikal
bebas, akan terjadi tiga kemungkinan (Winarsih, 2007) yaitu :
a) Radikal bebas akan memberikan elektron yang tidak berpasangan kepada senyawa bukan
radikal.
b) Senyawa radikal bebas akan menerima elektron dari senyawa yang bukan radikal bebas.
c) Radikal bebas akan bergabung dengan senyawa yang bukan radikal bebas.
Senyawa yang terambil elektronnya akan menjadi radikal bebas juga sehingga akan
membentuk reaksi yang berantai dan akan merusak sel. Mekanisme reaksi radikal bebas
merupakan suatu deret reaksi-reaksi bertahap yaitu: (1) permulaan (inisiasi, inisiation) suatu
radikal bebas, (2) perambatan (propagasi, propagation) reaksi radikal bebas; (3) pengakhiran
(terminasi, termination) reaksi radikal bebas. Tahapan mekanisme reaksi radikal bebas dapat
di lihat pada contoh di bawah ini (Fessenden, 1986).
Tahap 1 (Inisiasi):

Tahap 2 (Propagasi):

16

Tahap 3 (Terminasi):

F. Tinjauan Tentang Antioksidan


Antioksidan atau reduktor berfungsi untuk mencegah terjadinya oksidasi atau
menetralkan senyawa yang telah teroksidasi dengan cara menyumbangkan hidrogen dan atau
elektron (Silalahi, 2006).
Atas dasar fungsinya antioksidan dapat dibedakan menjadi 5 (lima) seperti berikut:
1. Antioksidan Primer
Antioksidan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal bebas yang baru
karena dapat merubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak
negatifnya.
2. Antioksidan Sekunder
Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang berfungsi menangkap radikal bebas
serta mencegah terjadinya reaksi berantai sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih besar.
Contoh yang populer, antioksidan sekunder adalah vitamin E, vitamin C, dan betakaroten
yang dapat diperoleh dari buah-buahan.
3. Antioksidan tersier
Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki sel-sel dan jaringan yang
rusak karena serangan radikal bebas, biasanya yang termasuk kelompok ini adalah jenis
enzim misalnya metionin sulfoksidan reduktase yang dapat memperbaiki DNA dalam inti sel.
Enzim tersebut bermanfaat untuk perbaikan DNA pada penderita kanker.
4. Oxygen Scavanger
Antioksidan yang termasuk oxygen scavanger mengikat oksigen sehingga tidak
mendukung reaksi oksidasi, misalnya vitamin C.

17

5. Chelators atau Sequesstrants


Mengikat logam yang mampu mengkatalisis reaksi oksidasi misalnya asam
sitrat dan asam amino (Kumalaningsih, 2006).
a. Antioksidan alami
Sayur-sayuran dan buah-buahan kaya akan zat gizi (vitamin, mineral, serat pangan)
serta berbagai kelompok zat bioaktif lain yang disebut zat fitokimia. Zat bioaktif ini bekerja
secara sinergis, meliputi mekanisme enzim detoksifikasi, peningkatan sistem kekebalan,
pengurangan agregasi platelet, pengaturan sintesis kolesterol dan metabolisme hormon,
penurunan tekanan darah, antioksidan, antibakteri, serta efek antivirus (Silalahi, 2006).
b. Vitamin C
Rumus bangun Vitamin C dapat dilihat pada Gambar 2.1

Gambar 2.4 Rumus bangun vitamin C


Vitamin C atau asam askorbat mempunyai berat molekul 176,13 dengan rumus
molekul C. Asam askorbat mengandung tidak kurang dari 99,0% Pemerian vitamin C adalah
hablur atau serbuk putih atau agak kuning. Oleh pengaruh cahaya lambat laun menjadi
berwarna gelap. Dalam keadaan kering stabil di udara, dalam larutan cepat teroksidasi.
Melebur pada suhu lebih kurang 190oC. Kelarutan vitamin C mudah larut dalam air, agak
sukar larut dalam etanol, praktis tidak larut dalam kloroform, dalam eter dan dalam benzene
(DepKes RI, 1995).

18

Vitamin C berkhasiat sebagai antiskorbut maka dinamakan asam skorbut atau


vitamin C. Vitamin C berkerja sebagai suatu koenzim dan pada keadaan tertentu merupakan
reduktor dan antioksidan. Vitamin C berperan juga dalam proses pembentukan kolagen.
Angka Kecukupan Gizi (AKG) vitamin C adalah sekitar 35 mg untuk bayi dan 60 mg pada
orang dewasa ( Tjay, 2002).
G. Tinjauan Tentang Karotenoid Sebagai Antioksidan dan Antitumor
Karoten dalam hal ini -karoten merupakan salah satu senyawa antioksidan alami.
Antioksidan berfungsi sebagai quencher singlet oksigen, seperti yang disampaikan di atas,
dan penangkal radikal bebas. Ini tidak hanya terjadi dalam sistem fotosintesis tumbuhan,
tetapi juga dalam tubuh manusia maupun hewan.
Singlet oksigen adalah tingkat tenaga molekul O2 yang sangat reaktif, dapat
menginisiasi peroksida lipid hingga terjadi reaksi berantai radikal bebas yang dapat
mengoksidasi komponen sel lain, seperti protein dan DNA. Contoh yang sederhana
kerusakan-kerusakan ini memicu penuaan dini pada manusia. Sejumlah penelitian
menunjukkan bahwa singlet oksigen yang berbahaya ini dapat di non-aktifkan oleh -karoten.
Selain itu, B-karoten juga mampu bereaksi dengan radikal bebas (R.) dengan proses
transfer muatan (elektron). Pada reaksi ini akan diperoleh radikal bebas dari B-karoten yang
relatif lebih stabil dan tidak memiliki energi yang cukup untuk dapat bereaksi dengan
molekul

lain

membentuk

radikal

baru

(Britton,

1995

Gordon,

1990).

-karoten adalah zat yang termasuk provitamin A, yang memberi warna kuning
kemerahan pada buah pepaya. Selain membuat warna buah papaya menjadi lebih cerah, karoten juga punya fungsi yang besar (Almatsier, 2003). -karoten berfungsi sebagai antiaging (anti penuaan), dan anti-cancer (anti kanker) Hal ini disebabkan karena sifat -karoten
sebagai anti oksidan, yang mampu melawan radikal bebas yang dapat merusak sel tubuh.
Radikal bebas sendiri terdapat di dalam polusi udara, atau makanan, yang sangat mudah

19

untuk masuk ke dalam tubuh manusia. Penelitian membuktikan bahwa orang yang diet tinggi
-karoten mempunyai resiko yang lebih rendah terkena kanker payudara, kanker kolon (usus
besar) dan kanker paru (Mayne, 1996).
Beberapa penelitian terkait dengan aktivitas antioksidan dan antitumor dari alga,
dapat dilihat pada Tabel 2.2 berikut:
Tabel 2.2 Beberapa Penelitian Terkait Dengan Aktivitas Antioksidan Dan Antitumor
Dari Alga
No

Nama Peneliti

Judul
Penelitian/Tahun
Penelitian

Spesies Alga

Fransisca Biranti,
Muhammad
Nursid, Bambang
Cahyono

Analisis Kuantitatif
karoten dan uji aktivitas
karotenoid Dalam alga
coklat
Turbinaria
deccurens, 2 April 2009

Alga Coklat
Turbinaria
deccurens

Costa, et al., 2011

Alga coklat
Sargassum
fillipendulla

Khusnul
Khotimah,
Darius,Bambang
Budi Sasmito

Antioxidant
and
Antiproliferative Activities
of Heterofucans from the
Seaweed
Sargassum
filipendula
Uji Aktivitas Senyawa
Aktif
Alga
Coklat
(Sargassum fillipendulla)
Sebagai Antioksidan Pada
Minyak Ikan Lemuru
(Sardinella longiceps), 15
Mei 2013

Swantara, dkk

Identifikasi
Senyawa
Antiradikal Bebas Pada
Rumput Laut Sargassum
ringgoldianum

Sargassum
ringgoldianum

Rastian Zahra,
Mehranian
Mehrnaz,
Vahabzadeh
Farzaneh

Antioxidant activity of
extract from a brown alga,
Sargassum boveanum

Alga coklat

Alga coklat
Sargassum
fillipendulla

Sargassum
boveanum

Hasil Penelitian
1) Kadar -karoten dalam alga coklat
Turbinaria decurrens yang diambil
dari daerah pasang surut pantai
Binuangeun, Banten Pada bulan
Februari 2008, sebesar 38,7 ppm
dari ekstrak kasar
2) Dalam penelitian ini Karotenoid
yang diisolasi dari Turbinaria
decurrens
tidak
menunjukkan
aktivitas
antioksidan
terhadap
radikal DPPH tetapi menuniukkan
aktivitas sitotoksik terhadap sel
tumorHeLa.
Efek menguntungkan dari S. filipendula
polisakarida sebagai antiproliferatif dan
antioksidan menunjukkan aktivitas yang
cukup dengan nilai IC50 15,69 dan
13,83 M.
1) Analisis senyawa aktif alga coklat
Sargassum fillipendula merupakan
jenis karotenoid yang merupakan
golongan
fenol
dan
benzenedicarboxyl acid
2) Ekstrak senyawa aktif Sargassum
fillipendula
diperoleh
aktivitas
antiradikal bebas DPPH sebesar
81,281ppm
Identifikasi senyawa antiradikal bebas
dengan
menggunakan
GC-MS
diidentifikasi 6 senyawa, yaitu etil
miristat, dibutil ftalat, etil palmitat, metil
isostearat, dioktil ftalat, 3-bromokolest5-ena.
Jumlah total Senyawa fenolik dari
Sargassum boveanum adalah 17 mg
dari berat sampel kering dan aktivitas
antioksidan (AOA) adalah tinggi sekitar
90% penghambatan peroksidasi dari
asam linoleat .

20
6

Zheu, et al

Pereira, et
al.,2011

Acute Toxicity Study and


Antipyretic Effect of the
Brown
Alga Turbinaria
Conoides (J.
Agardh)
Kuetz
Anti-Proliferative Activity
of
Meroditerpenoids
Isolated from the Brown
Alga
Stypopodium
flabelliforme
against
Several Cancer Cell Lines

Alga Coklat
Turbinaria
Conoides

Analisis
fitokimia
dari
ekstrak
mengungkapkan
adanya
steroid,
flavonoid dan gula tereduksi, ekstrak
sikloheksana menunjukkan aktivitas
antipiretik lebih signifikan (P <0,01)
dibandingkan dengan ekstrak lainnya
pada dosis 200 mg/kg (54.43%)

Alga coklat
Stypopodium
flabelliforme

Diperoleh 6 senyawa meroditerpenoid


dan senyawa monoacetate epitaondiol
aktif sebagai antimikroba.

H. Tinjauan Tentang Ekstraksi


Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan kandungan senyawa kimia dari jaringan
tumbuhan maupun hewan. Sebelum ekstraksi dilakukan biasanya bahan-bahan dikeringkan
terlebih dahulu kemudian dihaluskan pada derajat kehalusan tertentu (Harborne, 1987).
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan beberapa zat atau senyawa dengan pelarut
tertentu. Pemisahan terjadi berdasarkan kemampuan yang berbeda dari komponen dalam
campuran. Pelarut yang digunakan adalah pelarut dengan kemampuan menjerap bahan yang
dibutuhkan (Purba, 2011).
Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahapan yaitu pencampuran bahan dengan
pelarut, pemisahan dan isolasi ekstrak. Pada pencampuran bahan ekstrak dengan pelarut
dibiarkan saling berkontrak sehingga terjadi perpindahan massa. Setelah terjadi penjerapan,
maka pemisahan dilakukan dengan alat pemisah. Pemisahan bertujuan untuk memisahkan
larutan ekstrak dan pelarut. Setelah didapatkan fase ekstrak pelarut, maka pelarut lalu
diuapkan dan didapatkan ekstrak murni. Ekstraksi dilakukan berulang sehingga zat yang
dijerap lebih optimal (Dirjen POM 2000).
Pemilihan pelarut untuk ekstraksi menurut Harbone (1987), dimulai dari pelarut
organik yang tidak polar seperti heksan dan peningkatan kepolaran dengan etil asetat atau
pelarut yang lebih polar lainnya. Pelarut yang memiliki kepolaran paling tinggi yaitu air

21

murni > metanol > etanol > propanol > aseton > dietil eter > kloroform > benzen > karbon
tetraklorida > sikloheksana > heksan.
Menurut Guenther (1987), menyatakan bahwa faktor yang paling menentukan
keberhasilan proses ekstraksi adalah mutu dari pelarut yang digunakan. Pelarut yang ideal,
harus memenuhi syarat sebagai berikut :
a) Harus dapat melarutkan semua zat wangi bunga dengan cepat dan sempurna dan sedikit
mungkin melarutkan bahan seperti lilin, pigmen, dan senyawa albumin atau pelarut harus
bersifat selektif.
b) Harus memiliki titik didih yang cukup rendah agar pelarut mudah

diuapkan tanpa

menggunakan suhu tinggi.


c) Pelarut tidak boleh larut dalam air.
d) Pelarut harus bersifat inert sehingga tidak bereaksi dengan komponen minyak bunga.
e) Harga pelarut harus serendah mungkin dan tidak mudah terbakar.
f) Tidak boleh bersifat karsinogenik, berbahaya, dan beracun.
Menurut Departemen Kesehatan RI (2000), beberapa metode ekstraksi yang sering
digunakan dalam berbagai penelitian antara lain yaitu:
a. Cara dingin
1. Maserasi
Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan
pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserasi yang dilakukan
pengadukan secara terus-menerus disebut maserasi kinetik sedangkan yang dilakukan
pengulangan panambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap maserat pertama
dan seterusnya disebut remaserasi.
Metode ini sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun untuk jumlah besar.
Pengadukan sesekali ataupun secara konstan (dengan menggunakan alat pengocok mekanik)

22

untuk menjamin kehomogenan dan meningkatkan kecepatan ekstraksi. Proses ekstraksi dapat
dihentikan ketika tercapai keseimbangan antara konsentrasi metabolit dalam ekstrak dan
simplisisa. Setelah reaksi residu simplisia harus dipisahkan dari pelarut dengan cara
penyaringan.
Kelemahan dari maserasi adalah prosesnya cukup memakan waktu yang lama dapat
berlangsung beberapa jam atau sampai beberapa minggu. Ekstraksi menyeluruh juga dapat
menyebabkan jumlah besar volume pelarut dan dapat berpotensi hilangnya metabolit.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah proses penyarian simplisia dengan pelarut yang selalu baru sampai
terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses
perkolasi terdiri dari tahap pelembaman bahan, tahap perendaman antara, tahap perkolasi
sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) terus-menerus sampai diperoleh perkolat yang
jumlahnya 1-5 kali bahan.
b. Cara panas
1. Refluks
Refluks adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan alat pada
temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif
konstan dengan adanya pendingin balik.
2. Digesti
Digesti adalah proses penyarian dengan pengadukan kontinu pada temperatur lebih
tinggi daripada temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50C.
3. Sokletasi
Sokletasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut yang selalu baru,
dilakukan dengan menggunakan alat soklet sehingga menjadi ekstraksi kontinu dengan
pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

23

4. Infundasi
Infundasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur
90C selama 15 menit.
5. Dekoktasi
Dekoktasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada
temperatur 90C selama 30 menit.
I. Tinjauan Tentang Uji Antioksidan
Kandungan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui melalui uji
aktivitas antioksidan. Pengukuran aktivitas antioksidan dapat menggunakan beberapa metode.
Salah satu metode yang umum digunakan yaitu dengan menggunakan radikal bebas stabil
diphenilpycrylhydrazil (DPPH) atau (1,1 Dhypenil-2-pycryhidrazil). Prinsip metode-metode
yang digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan adalah mengevaluasi adanya
aktivitas penghambatan proses oksidasi oleh senyawa antioksidan yang terdapat dalam bahan
pangan atau contoh ekstrak bahan alam (Nurjanah, 2009).
Pada metode DPPH, larutan DPPH yang berperan sebagai radikal bebas akan bereaksi
dengan senyawa antioksidan, sehingga DPPH akan berubah menjadi diphenilpycrilhydrazine
yang bersifat non-radikal yang tidak barbahaya sebagaimana dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Meningkatnya jumlah diphenilpycrilhydrazine akan ditandai dengan berubahnya warna ungu
pada larutan menjadi warna kuning pucat (Molyneux, 2004).

Gambar 2.5 Struktur Kimia Diphenylpicrylhydrazyl dan Diphenylpicrylhydrazine

24

Radikal bebas stabil DPPH merupakan radikal sintetik yang larut dalam pelarut
polar seperti metanol dan etanol. Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
menggunakan prinsip spektrofotometri. Senyawa DPPH (dalam metanol) berwarna ungu tua
terdeteksi pada panjang gelombang sinar tampak sekitar 517 nm. Suatu senyawa dapat
dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan
atom hidrogennya untuk berikatan dengan DPPH membentuk DPPH tereduksi, ditandai
dengan semakin hilangnya warna ungu (menjadi kuning pucat) (Molyneux 2004). Prinsip
penurunan nilai absorbansi digunakan untuk mengetahui kapasitas antioksidan suatu
senyawa.
Hasil dari metode DPPH umumnya dibuat dalam bentuk IC50 (Inhibitor
Concentration 50), yang didefinisikan sebagai konsentrasi larutan substrat atau sampel yang
akan menyebabkan tereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin besar aktivitas
antioksidan maka nilai IC50 akan semakin kecil. Molyneux (2004) menyatakan bahwa suatu
senyawa antioksidan dinyatakan baik jika nilai IC 50-nya semakin kecil.
Persentase hambatan radikal bebas ditentukan dengan rumus:

Keterangan , A: Absorbansi kontrol negatif (metanol + DPPH),


B : Absorbansi blanko (metanol),
C: Absorbansi perlakuan (Ekstrak+OPPH),
D : Absorbansi kontrol ekstrak (Ekstrak+metanol).
Data persentase penghambatan digunakan untuk mencari nilai

Inhibition

Concentration 50 (IC50) dalam g/mL. Nilai IC50 ditentukan dengan analisis probit (Tamat,
2007). Secara spesifik suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai

25

IC50 kurang dari 50 g/mL, kuat untuk IC

50antara

50-100 g/mL, sedang jika IC

50

bernilai

100-150 g/mL, dan lemah jika IC 50bernilai 150- g/mL.


J. Tinjauan Tentang Uji Toksisitas
Uji toksisitas adalah suatu uji pendahuluan untuk mengetahui aktivitas farmakologi
suatu senyawa. Prinsipnya komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan
dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
merupakan salah satu uji untuk mengetahui toksisitas suatu senyawa (Zebua, 2011).
Metode uji BSLT (Brine Shrimp 50 Lethality Test) biasa dilakukan dalam uji
pendahuluan atau screening atau penapisan bahan-bahan yang diperkirakan memiliki sifat
aktivitas antitumor atau antikanker sebelum melangkah pada uji in vitro menggunakan sel
tumor He La.
Artemia salina Leach merupakan organisme sejenis udang-udangan yang berukuran
kecil dan dikenal dengan nama brine shrimp. Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan
uji untuk menentukan ketoksikan suatu senyawa dalam ekstrak tumbuhan yang diwujudkan
sebagai racun (Baraja, 2008).
Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) sering digunakan untuk praskrining
terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan karena murah, cepat,
mudah dan dapat dipercaya. Suatu metode yang menggunakan Artemia salina Leach telah
diperkenalkan sebagai metode bioassay yang sederhana untuk penelitian produk alam. Sifat
toksisitas suatu senyawa dapat dibandingkan dengan uji kultur sel sehingga dapat
diasosiasikan dengan aktivitas antikanker (Baraja 2008).
Parameter yang digunakan adalah jumlah Artemia yang mati 50 % dari total larva
uji. Kemudian dihitung nilai LC50 dengan memasukkan angka probit (50% kematian larva
uji). Efek toksisitas dianalisis dari pengamatan dengan persen kematian, menggunakan
rumus:

26

Dengan mengetahui kematian larva Artemia salina, kemudian dicari angka probit melalui
tabel dan dibuat persamaan garis : Y = Bx + A
Dimana, Y = log konsentrasi, dan
X = Angka probit
Dari persamaan tersebut kemudian dihitung LC50 dengan memasukkan nilai probit (50%
kematian). Apabila pada kontrol ada larva yang mati, maka % kematian ditentukan dengan
rumus Abbot (Meyer et al., 1982).

Keterangan :
T = Jumlah larva uji yang mati
K = Jumlah larva kontrol yang mati
10 = Jumlah larva uji

K. Tinjauan Tentang Uji Antitumor


Metode yang digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa aktif antitumor
adalah uji toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach. Metode yang menggunakan larva
udang untuk uji toksisitas disebut Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Brine Shrimp Lethality
Test (BSLT) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam
penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat
digunakan sebagai bioassay-guided fractionation dari bahan alam karena mudah, cepat, dan
murah. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan dimonitor aktivitasnya

27

dengan BSLT menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antitumor
(Mclaughlin,1991).
Apabila senyawa tersebut dinyatakan bersifat toksik terhadap larva Artemia salina
L., maka dapat dilakukan uji lanjutan antitumor terhadap sel sel HeLa. Sel HeLa merupakan
sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Anonim, 2010).
L. Kerangka Fikir
Laut menghasilkan sejumlah besar zat dengan berbagai kegiatan karena lingkungan
dengan salinitas tinggi, tekanan tinggi, suhu rendah, intensitas cahaya rendah dan kondisi
oligotrophic. Di beberapa tahun terakhir, semakin banyak ilmuwan mengalihkan untuk
mengeksploitasi obat dari laut untuk berbagai macam bioaktivitas, termasuk antioksidan,
antivirus influenza, antiparasit, kegiatan antihiperlipidemia, dan lain-lain. Para ilmuwan
menemukan sejumlah senyawa dari lingkungan laut, yang menunjukkan aktivitas antitumor
yang baik. Salah satu sumber daya laut yang berpotensi sebagai penghasil antioksidan alami
adalah rumput laut atau alga.
Penelitian yang telah dilakukan bahwa alga coklat dari species Sargassum sp
merupakan salah satu biota yang banyak ditemukan diperairan laut Indonesia, khususnya
untuk perairan Sulawesi Selatan (perairan Pangkep). Perairan Sulawesi Selatan merupakan
penyumbang alga terbesar di Indonesia, termasuk kabupaten Pangkep dimana budidaya alga
telah menjadi mata pencaharian alternatif bagi masyarakat pesisir dan nelayan skala kecil.
Hasil penelitian terakhir menunjukkan bahwa alga coklat Sargassum sp memiliki aktivitas
terhadap sel tumor (Khotimah, dkk, 2013).
Sargassum polycystum mengandung alginat, vitamin C, vitamin E (-tokoferol),
mineral, karotenoid, klorofil, florotanin, polisakarida sulfat, asam lemak, dan asam amino
(Matanjun, 2008 ; Raghavendran, 2005).

28

Menurut penelitian Chasanah, dkk (2007), diduga senyawa yang berperan dalam
aktivitas antioksidan berasal dari golongan pigmen karotenoid yang teroksigenasi dalam
strukturnya yaitu fucosantin. Selain senyawa ini, secara umum alga coklat juga mengandung
violaksantin, flavosantin serta neosantin a dan b sedangkan kelompok karotenoid yang umum
adalah - karoten yaitu karotenoid yang tidak mengandung atom oksigen dalam strukturnya.
Golongan senyawa ini sudah dikenal memiliki aktivitas antitumor yang baik.
Senyawa yang akan diisolasi dari sampel alga coklat Sargassum polysticum yang
memiliki aktivitas antioksidan dan antitumor adalah karotenoid. Karotenoid merupakan lipid
sehingga pigmen ini bersifat liposoluble (larut dalam lemak) dan larut dalam pelarut
nonpolar.
Didalam penelitian ini, ekstraksi -karotenoid dari sampel Sargassum polycystum
dilakukan dengan cara maserasi bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat
dan metanol kualitas p.a, pemurnian dari ekstrak dilakukan dengan metode Kromatografi
yaitu kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan selanjutnya dilakukan analisis kuantitatif -karoten
dengan menggunakan HPLC. -karoten yang diperoleh dilakukan pengujian aktivitas
antioksidan dan toksisitasnya.
Kandungan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui melalui uji
aktivitas antioksidan. Pengukuran aktivitas antioksidan dapat menggunakan beberapa metode.
Salah satu metode yang umum digunakan yaitu dengan menggunakan radikal bebas stabil
diphenilpycrylhydrazil (DPPH) atau (1,1 Dhypenil-2-pycryhidrazil). Prinsip metode-metode
yang digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan adalah mengevaluasi adanya
aktivitas penghambatan proses oksidasi oleh senyawa antioksidan yang terdapat dalam bahan
pangan atau contoh ekstrak bahan alam (Nurjanah, 2009). Hasil dari metode DPPH umumnya
dalam bentuk IC50 (Inhibitor Concentration 50), yang didefinisikan sebagai konsentrasi

29

larutan substrat atau sampel yang akan menyebabkan tereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%.
Semakin besar aktivitas antioksidan maka nilai IC50 akan semakin kecil.
Sedangkan metode yang digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa aktif
antikanker adalah uji toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach. Metode yang
menggunakan larva udang untuk uji toksisitas disebut Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak
digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode
ini dapat digunakan sebagai bioassay-guided fractionation dari bahan alam karena mudah,
cepat, dan murah. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan dimonitor
aktivitasnya dengan BSLT menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik
antitumor (Mclaughlin,1991). Parameter yang digunakan adalah jumlah Artemia sp yang mati
50 % dari total larva uji. Kemudian dihitung nilai LC 50 dengan memasukkan angka probit
(50% kematian larva uji).
Apabila senyawa tersebut dinyatakan bersifat toksik terhadap larva Artemia salina
L., maka dapat dilakukan uji lanjutan antitumor terhadap sel HeLa. Sel HeLa merupakan sel
manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Anonim, 2010).
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui kandungan -karoten
yang diperoleh dari alga coklat Sargassum polysticum untuk selanjutnya dilakukan pengujian
aktivitas antioksidan dan antitumor. Dengan dilakukan pengujian tersebut akan terlihat
korelasi antara kedua potensi tersebut sehingga menjadikan -karoten dari alga coklat
Sargassum polysticum lebih termanfaatkan dan menambah nilai ekonomi dari petani yang
membudidayakan alga coklat tersebut khususnya di perairan Pangkep Sulawesi Selatan.
Hingga saat ini, belum adanya penelitian yang sistematik mengenai kandungan karoten dalam alga coklat Sargassum polycystum yang terdapat banyak pada perairan

30

Pangkep Sulawesi Selatan, uji aktivitas antioksidan dan antitumor, maka perlu dilakukan
untuk uji aktivitas tersebut.
Adapun kerangka konsep penelitian ini dapat dilihat pada gambar 2.5 berikut:

Rumput
Laut

Sargassum
polycystum

-karoten

Uji Toksisitas

Uji antioksidan

Uji antitumor

Gambar 2.6 Kerangka Fikir


M. HIPOTESIS
1. -karoten dari alga coklat Sargassum polycystum dapat diekstraksi dengan beberapa
pelarut seperti n-heksan, etil asetat dan metanol.
2. Ekstrak -karoten yang diperoleh memiliki aktivitas antioksidan dan toksisitas.
3. Ekstrak -karoten yang diperoleh memiliki aktivitas antitumor terhadap sel He La.

31

BAB III
METODE PENELITIAN
A.Alat dan Bahan
1. Alat
a. Seperangkat alat maserasi
b. Rotary evaporator
c. Labconco Freeze dry
d. Neraca analitik
e. Seperangkat alat Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
f. HPLC Shimadzu (kolom pricenton omni C18, detector UV-VIS Photodiode Array, dengan
fase gerak metanol-asetonitril (3:1), pada flow 0.5 L/menit)
g. Microplate 96 well
h. Stopwatch
i. Tangki nitrogen cair
j. Waterbatch
k. Seperangkat peralatan gelas
l. Sentrifuge
m. Labu kultur
n. Termometer
o. pH meter
p. Kaca Pembesar
q. Inkubator CO2
2. Bahan
a. Sargassum polycystum
b. n-heksana

32

c. Etil asetat
d. Metanol
e. Aluminium sheets silicagel merck standar -karoten
f. DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
g. Asam askorbat
h. Kertas saring whatman
i. Artemia sp
j. MTT [3,(4,5-dimetilthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromida]
k. Medium RPMI 1640, FBS 10%, Fungision 0.5%, dan penisilin-streptomisin 2%
l. SDS 10%
m. Mikroskop inverted phasecontrast
B. Objek Penelitian
Isolat -karoten dari alga coklat Sargassum polycystum asal perairan Pangkep
Sulawesi Selatan untuk dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dan antitumor.
C. Tempat dan Waktu Penelitian
1. Tempat Penelitian
a. Tempat Pengambilan Sampel
Tempat pengambilan sampel Sargassum polycystum dalam penelitian ini adalah
perairan Pangkep Sulawesi Selatan.
b. Tempat Penelitian sampel
Tempat penelitian adalah Laboratorium Kimia FMIPA UNHAS.
2. Waktu Penelitian
Waktu penelitian dari bulan Agustus sampai dengan November 2013

33

D. Pelaksanaan Penelitian
1. Ekstraksi
Sampel Sargassum polycystum sebanyak I7,4 kg dimaserasi bertingkat (sampai
seluruh jaringan terendam) dengan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol kualitas p.a.
Filtrat disaring dengan menggunakan kertas saring Whatrnan, kemudian pelarut diuapkan
kembali dengan menggunakan rotary evaporator dan sisa pelarut yang mungkin tertinggal
diuapkan dengan Labconco Freeze dry. Ekstrak yang diperoleh ditimbang dengan
menggunakan neraca analitik, sehingga diperoleh ekstrak kasar n-heksana, etil asetat dan
metanol (Allen,2003).
Ketiga ekstrak diuji KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dengan bahan pengemban
Aluminium Sheets Silica Gel Merck, standar -karoten, dalam eluen n-heksana-etil asetat
(l:1). Ekstrak yang memiliki harga Rf sama dengan standar, difraksinasi dengan kolom
kromatografi silika gel 2 x 30 cm dengan sistem gradient eluen n-heksana diikuti etil asetat
dan kemudian metanol. Eluat yang diperoleh ditampung sehingga diperoleh 45 eluat. Semua
eluat tersebut kemudian diuji KLT kembali dengan eluen n-heksana-etil asetat (1:1), untuk
menggabungkan hasil eluat berdasarkan harga Rf-nya. Eluat yang memiliki spot sama
dikelompokkan menjadi satu fraksi. Fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya
dengan rotary evaporator dan sisa pelarut yang mungkin tersisa diuapkan dengan Labcorrco
Freeze dry kemudian ditimbang (Wikanta dkk., 2006).
2. Analisis Kuantitatif
Fraksi yang diperoleh, diuji dengan KLT menggunakan eluen n-heksana-etil asetat
(20:1) dengan standar -karoten, fraksi yang memiliki Rf sama dengan standar dielusi dengan
HPLC Shimadzu, kolom Princeton Omni C18, detector UV-VIS Photodiode Array, dengan
fasa gerak metanol-asetonitril (3:1) pada flow 0,5 L/menit.

34

Kromatogram Fraksi dibandingkan dengan kromatogram standar -karoten, dengan


konsentrasi masing-masing 25, 50, 100, 250 dan 500 ppm. Data yang diperoleh adalah waktu
retensi dan luas area standar, yang kemudian diplotkan menjadi kurva standar konsentrasi
versus luas area. Dari kurva tersebut maka luas area fraksi diplotkan, sehingga diperoleh
Hasil konsentrasi (Zhao, 2004).
3. Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian dilakukan pada fraksi (ekstrak) dengan menggunakan DPPH pada
microplate 96 well. Ekstrak dibuat dalam 5 seri konsentrasi 25,50,100, 500, 1000 g/ml
dalam larutan metanol p.a, masing-masing 2 kali ulangan. Sebanyak 160 L ekstrak dari
setiap seri konsentrasi dimasukkan ke dalam microplate, kemudian ditambahkan 40 l larutan
DPPH pada setiap seri konsentrasi.
Larutan DPPH dibuat dengan cara melarutkan 3,2 mg DPPH Dalam l0 mL metanol
p.a. Sebagai kontrol positif digunakan asam askorbat (vitamin C) dengan seri konsentrasi dan
volume yang sama dengan perlakuan ekstrak. Sebagai blanko digunakan metanol p.a
sebanyak 200 L. Kontrol negatif (tanpa perlakuan ekstrak) dibuat dengan cara
menambahkan 160 L metanol p.a pada 40 L DPPH, dan sebagai kontrol ekstrak, sebanyak
160 L ekstrak ditambahkan 40 L metanol p.a. Microplate kemudian diinkubasi pada suhu
ruang dan tempat yang gelap selama 30 menit. Setelah 30 menit absorbansi dari tiap sumuran
dibaca dengan dynex microplate reader pada panjang gelombang 510 nm. Persentase
hambatan radikal bebas ditentukan dengan rumus:

35

Keterangan, A: Absorbansi kontrol negatif (metanol + DPPH),


B : Absorbansi blanko (metanol),
C: Absorbansi perlakuan (Ekstrak+OPPH),
D : Absorbansi kontrol ekstrak (Ekstrak+metanol).
Data persentase penghambatan digunakan untuk mencari nilai

Inhibition

Concentration 50 (IC50) dalam g/mL. Nilai IC50 ditentukan dengan analisis probit (Tamat
2007).
4.Uji Toksisitas
a. Bahan
Hewan uji berupa Nauplii Artremia sp yang berumur 24 jam pada instar III. Jumlah
hewan uji yang digunakan adalah 10 ekor untuk tiap wadah yang berupa vial berukuran 10
mL.
b. Prosedur Kerja
1. Penetasan Telur Artemia sp.
Artemia sp direndam di dalam air tawar selama 15-30 menit. Kemudian direndam
dalam 10 liter air laut. Suhu penetasan adalah 25-30 0C dan pH 6-7. Telur akan menetas
setelah 18-24 jam dan larvanya disebut Nauplii. Nauplii siap untuk uji BSLT setelah larva ini
berumur 48 jam (Subyakto, 2003).
2. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
Uji toksisitas dilakukan dengan uji BSLT (Ghisalberti, 1993). Pengujian dilakukan
dengan menentukan deret konsentrasi terlebih dahulu. Setelah itu, sepuluh ekor Nauplii
Artemia sp dimasukkan pada masing-masing sampel disetiap seri konsentrasi dan dipaparkan
pada suhu ruang selama 24 jam. Persentase kematian didapatkan dengan cara menghitung
mortalitas Nauplii Artemia sp yang terjadi setelah dilakukan pemaparan pada ketiga ekstrak
(ekstrak kasar n-heksana, etil asetat dan metanol). Kurva LC50 dibuat dengan nilai %

36

penghambatan sebagai sumbu Y dan seri konsentrasi sebagai sumbu X. Brine Shrimp
Lethality Test merupakan suatu pengujian dan suatu preskrining awal untuk menentukan
apakah suatu senyawa mempunyai kandungan bioaktif. Nauplii Artemia sp yang baru
menetas identik dengan sel kanker.
Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan ketiga ekstrak tersebut (ekstrak kasar nheksana, etil asetat dan metanol) dengan metode uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Uji
toksisitas dilakukan berdasarkan metode Meyer et al. (1982).
Masing-masing ekstrak dibuat berbagai dengan seri konsentrasi 12,5; 25; 50 dan 100
g/mL. Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ekor larva Artemia sp berumur 48 jam
ke dalam toples kaca yang telah berisi 1 ml larutan ekstrak dan 4 ml air laut. Setelah 24 jam,
jumlah larva yang mati dihitung dengan bantuan alat kaca pembesar (Khurniasari, 2004).
Parameter yang digunakan adalah jumlah Artemia yang mati 50 % dari total larva
uji. Kemudian dihitung nilai LC50 dengan memasukkan angka probit (50% kematian larva
uji). Efek toksisitas dianalisis dari pengamatan dengan persen kematian, menggunakan
rumus:

Dengan mengetahui kematian larva Artemia sp., kemudian dicari angka probit melalui tabel
dan dibuat persamaan garis : Y = Bx + A
Dimana, Y = log konsentrasi, dan
X = Angka probit
Dari persamaan tersebut kemudian dihitung LC50 dengan memasukkan nilai probit (50 %
kematian).
Apabila pada kontrol ada larva yang mati, maka % kematian ditentukan dengan rumus:
(Meyer et al., 1982).

37

Keterangan :
T = Jumlah larva uji yang mati
K = Jumlah larva kontrol yang mati
10 = Jumlah larva uji
5. Uji Aktivitas antitumor
Uji sitotoksik menggunakan MTT pada sel tumor HeLa phasage 30. Pencairan sel
(cell thawing) dilakukan dengan cara mengeluarkan tabung berisi sel dari tangki nitrogen cair
dan dibenamkan dalam waterbatch bersuhu 37oC. Seluruh cairan sel dipipet dan dimasukkan
ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 5 mL medium RPMI 1640, kemudian disentrifus
dalam kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Setelah itu supernatan dibuang dan pellet yang
diperoleh disuspensikan dalam 6 mL RPMI, suspensi sel dipipet dan dimasukkan ke dalam
labu kultur kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 pada 370C. Sel yang
telah berumur 24 jam dikultur dalam medium RPMI 1640, FBS l0%, Fungision 0,5% dan
penisilin-streptomisin 2%.
Ekstrak dibuat dengan seri konsentrasi 12,5; 25; 50 dan 100 g/mL dalam media
RPMI dengan 3 kali ulangan. Sel dimasukkan ke dalam microplate 96 well sebanyak 100 L
setara dengan 105 sel/100 L. Kemudian sel diinkubasi selama 24 jam pada 37oC dengan
aliran CO2 5 ml/menit sampai sel menempel dengan baik. Setelah 24 jam sebanyak 100 L
sampel ditambahkan pada tiap well.
Dalam pengujian ini digunakan 3 kontrol, yaitu kontrol sel (100 L sel + 100 L
media), kontrol media (200 L media) dan kontrol sampel (100 L sampel + 100 L media).
Microplate diinkubasi kembali selama 24

jam dalam inkubator CO2 Setelah 24

jam

ditambahkan MTT sebanyak 10 L ke dalam tiap well. Microplate diinkubasi kembali selama

38

4 jam, kemudian reaksi MTT dihentikan dengan cara menambahkan 100 L SDS 10 %.
Microplate diinkubasikan kembali selama 12 jam pada suhu kamar dan dalam keadaan gelap.
Setelah 2 jam, kondisi sel di cek dengan mikroskop inverted phasecontrast (Rajesh and
Gupta, 2007).

39

DAFTAR PUSTAKA

Achmad, Kadi, 2005, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di perairan Indonesia,
Jurnal Oseana, Volume XXX, Nomor 4, 2005 : 19 29, ISSN 0216-1877.
Atmadja, W.S., Kadi, A., Sulistijo, Rachmaniar, 1996, Pengenalan Jenis- jenis Rumput Laut
Indonesia, Puslitbang Oseanologi-LPl, Jakart4 5657,75-77.
Biranti, F., Muhammad Nursid and Bambang Cahyono. 2009. Analisis Kuantitatif -Karoten
Dan Uji Akttvitas Karotenoid Dalam Alga Coklat Turbinaria decurrens. Jurnal
Sains & Matematika (JSM), Volume 17 Nomor 2 April 2009, Artikel penelitian:9096, ISSN 0854-0675.
Chasanah, E.,Wikanta, T., Sri A.,Fajarningsih,N.D.,Marraskuranto, E.,Nursid M.,Januar,
H.L, 2007, Riset Isolasi Dan Uji Farmakologi Senyawa Bioaktif dari Biota Laut,
Laporan Teknis Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan
dan perikanan, Badan Riset Kelautan dan perikanan, Departemen Kelautan dan
Perikanan, Jakarta
Costa, S,L., Gabriel, F,S., et all, 2011. Antioxidant and Antiproliferative Activities of
Heterofucans from the Seaweed Sargassum filipendula, Journal Mar. Drugs 2011, 9,
952-966; doi:10.3390/md9060952, ISSN 1660-3397.
Fretes, D,H., A,B, Susanto., Budhi, P., dan Leenawaty Lemantara, 2012, Karotenoid Dari
Makroalga Dan Mikroalga; Potensi Kesehatan Dan Aplikasi Bioteknologi, Journal
Teknologi Dan Industri Pangan, Vol. XXIII No. 2 Tahun 2012.
Gross, J. 1991, Pigment in Vegetables, Van Nastrand Reinhold, New York, 351pp.
Guenther, E. 1987, Minyak Atsiri, Universitas Indonesia Press, Jakarta
Harborne, J. B. 1994, The Flavonoids, Chapman and Hall, London.
Harbone, J.B, 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan,
Institut Teknologi Bandung, Bandung.
Indriati, H, dan Sumarsih, E, 1996, Budidaya, Pengolahan dan Pemasaran Rumput Laut,
Penebar Swadaya, Jakarta.
Ioannou, E., Constantinos Vagias and Vassilios Roussis. 2013. Isolation and Structure
Elucidation of Three New Dolastanes from the Brown Alga Dilophus spiralis.
Journal Mar. Drugs 2013, 11, 1104-1112; doi:10.3390/md11041104.
Khotimah K., Darius and Bambang Budi Sasmito. 2013. Uji Aktivitas Senyawa Aktif Alga
Coklat (Sargassum fillipendulla) Sebagai Antioksidan Pada Minyak Ikan Lemuru
(Sardinella longiceps). THPi Student Journal, VOL. I NO. 1 pp 10-20 Universitas
Brawijaya.

40

Luning, K, 1990, Seaweed; Their Enviroment, Biogeography, and Ecophysiology, John


Willey and Sons, Inc, New York.
Merdekawati, W, 2009, Kandungan dan Aktivitas Antioksidan Klorofil a dan -karoten
Sargassum sp, Jurnal Kelautan Nasional 2; 144-145.
Merdekawati, W. & A. Susanto. 2011. Pigmen rumput Laut: Kajian dan Pemanfaatannya.
Dalam: Susanto, AB. (Ed.). Prosiding Seminar Nasional Aplikasi Pemanfaatan
Rumput Laut dan Bahan Hayati Laut dalam Bidang Pangan dan Energi. Semarang
29 Januari 2011. Yayasan Rumput laut Indonesia Semarang, Indonesia. Hal.122132
Meyer, B. N., N.R. Ferrigni, J.E. Putman, L.B. Jacbsen, D.E. Nicols, & J.L. McLaughlin.
1982. Brine Shrimp : A Convenient general Bioassay For Active Plant Constituents.
Planta Medica, 45:31-34.
Molyneux, P., 2004, The use of the stable free radical dyhenylpicrylhydrazil (DPPH) for
estimating antioxidant activity, Journals science and technology, 26:211-219.
Nurjanah, 2009, Karakterisasi lintah laut (Discodoris sp.) dari perairan pantai Pulau Buton
sebagai antioksidan dan antikolesterol, Disertasi tidak diterbitkan, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Pereira, M,D., Jose, C., Carlos, A., et all, 2011, Anti-Proliferative Activity of
Meroditerpenoids Isolated from the Brown Alga Stypopodium flabelliforme against
Several Cancer Cell Lines, Journal Mar. Drugs 2011, 9, 852-862;
doi:10.3390/md9050852, ISSN 1660-3397
Sheu, J.H.,Wang G.H., Sungo P.J., and Duh,C.Y.,1999, New Cytotoxic Oxygenated
Fucosterol from the Brown Algae Turbinaria conoides, J.Nat. Prod.,62 (2),224-22.
Silalahi, J. 2006. Makanan Fungsional. Kanisius, Yogyakarta. 175 hal.
Swantara, D., A,A Bawa Putra., dan Surya Udayana., Identifikasi Senyawa Antiradikal Bebas
Pada Rumput Laut Sargassum ringgoldianum, Jurnal Kimia, 6 (1): 23-28, ISSN
1907-9850.
Tamat, S.R., Wikanta T., Lina S.M.,2007, Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Senyawa
Bioaktif dari Ekstrak Rumput Laut Hijau Ulva Reticulata Forsskal, Jurnal llmu
Kefarmasian Indonesia, Jakarta vol. 5 no. I,3l-36.
Tambaru, R, 2009, Identifikasi Beberapa Spesies Rumput Laut Yang Potensial
Dibudidayakan
Diperairan
Sulawesi
Selatan,
(online),
http://repository.unhas.ac.id/xmlui/handle/123456789/3743 diakses 15 Mei 2012.
Wikanta, T.,Chasanah, E., Amini, S.,Nursid,M., Fajarningsih, N.D., Januar, H.I.,
Marraskuranto, E., 2006, Riset Isolasi dan Uji Farmakologi Senyawa Bioaktif dari
Biota Laut, Laporan Tefuris Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi
Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan
dan Perikanan, Jakarta,3, 9-I3, 32-36.

41

Wikanta T., Tamat,S.R, Magdalena S.M., 2006, Identifikasi, Uji Antioksidan, dan Uji
Toksisitas Senyawa Bioaktif dalam Caulerpo sertularioides (Vahl.) C. Agard, Jurnal
llmu Kefarmasian Indonesia,Jakarta JIFI vol.4 no.1, 25-32.
Winarno, F, G, 1996, Teknologi Pengolahan Rumput Laut, Pustaka Sinar Harapan, Jakarta.
Winarno, F, G.,S. Fardiaz dan D. Fardiaz, 1973, Pengantar Teknologi Pangan, PT.
Gramedia, Jakarta.
Winarno, F.G., Fardiaz, S., Fardiaz, D., 1973, Ekstraksi dan Khromatografi, Elektroforesis,
Bogor, Fakultas Mekanisasi dan Teknologi Pertanian.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisus, Yogyakarta.
Zahra.,et all., 2007, Antioxidant activity of extract from a brown alga, Sargassum boveanum,
African Journal of Biotechnology Vol. 6 (24), pp. 2740-2745, ISSN 16845315.

42

Lampiran 1 Alur Penelitian

Alga Coklat Sargassum polycystum

Ekstraksi dengan cara maserasi


bertingkat

Pemisahan dengan Kromatografi


Lapis Tipis & Kromatografi Kolom

Analisis Kuantitatif -karoten

Uji Antioksidan

Uji Toksisitas

Uji Antitumor Sel He La

43

Lampiran 2 Prosedur Kerja Ekstraksi -Karoten Alga Coklat Sargassum Polycystum


Alga Coklat Sargassum polycystum
sebanyak I7,4 kg dimaserasi bertingkat
dengan pelarut n-heksana, etil asetat,
dan metanol kualitas p.a

Hasil Maserasi bertingkat


Disaring dengan kertas saring
whatman, dan metanol kualitas p.a

Residu

Filtrat
-

pelarut diuapkan kembali dengan


menggunakan rotary evaporator
sisa pelarut yang mungkin tertinggal
diuapkan dengan Labconco Freeze dry

ekstrak kasar n-heksana,


etil asetat dan metanol
- diuji dengan KLT dengan bahan
pengemban Aluminium Sheets Silica
Gel Merck, standar -karoten, dalam
eluen n-heksana-etil asetat (1:1).

ekstrak dengan harga Rf sama dengan standar -karoten dikumpulkan


- difraksinasi dengan kolom kromatografi
silika gel 2 x 30 cm dengan sistem
gradient eluen n-heksana diikuti etil
asetat dan kemudian metanol

Eluat
- diuji KLT kembali dengan eluen nheksana-etil
asetat
(1:1),
untuk
menggabungkan hasil eluat berdasarkan
harga Rf-nya

Eluat yang memiliki spot sama dikelompokkan menjadi satu fraksi


Fraksi yang diperoleh diuapkan pelarutnya
dengan rotary evaporator dan sisa pelarut
yang mungkin tersisa diuapkan dengan
Labcorrco Freeze dry kemudian ditimbang

Fraksi

44

Lampiran 3 Prosedur Kerja Analisis Kuantitatif -Karoten


Fraksi
- diuji dengan KLT menggunakan eluen nheksana-etil asetat (20:1) dengan standar
-karoten

Fraksi dengan Rf sama


- dielusi dengan HPLC Shimadzu, kolom Princeton Omni C18,
detector UV-VIS Photodiode Array, dengan fasa gerak
metanol-asetonitril (3:1) pada flow 0,5 L/menit

Kromatogram Fraksi dibandingkan dengan kromatogram


standar -karoten, dengan konsentrasi masing-masing 25, 50,
100, 250 dan 500 ppm

Data waktu retensi & luas area standar

Konsentrasi Fraksi

45

Lampiran 4

Uji Aktivitas Antioksidan -Karoten Yang Diperoleh Dari Masing-Masing


Fraksi
Ekstrak dibuat dalam 5 seri konsentrasi 25,50,100, 500, 1000
g/ml dalam larutan metanol p.a, dilakukan secara duplo

Sebanyak 160 L ekstrak dari setiap seri konsentrasi


dimasukkan ke dalam microplate + 40 l larutan DPPH pada
setiap seri konsentrasi
Sebagai kontrol positif
digunakan asam
askorbat (vitamin C)
dengan seri konsentrasi
dan volume yang sama
dengan perlakuan
ekstrak

Ekstrak

Sebagai blanko
digunakan metanol
p.a sebanyak 200 L

Kontrol Positif

Kontrol negatif (tanpa


perlakuan ekstrak)
dibuat dengan cara
menambahkan 160 L
metanol p.a pada 40 L
DPPH

Blanko

Kontrol Negatif

Microplate dari masing-masing kemudian


diinkubasi pada suhu ruang dan tempat yang
gelap selama 30 menit

absorbansi dari tiap sumuran dibaca dengan


dynex microplate reader pada panjang
gelombang 510 nm

Dihitung Presentase Hambatan radikal

sebagai kontrol ekstrak,


sebanyak 160 L ekstrak
ditambahkan 40 L
metanol p.a

Kontrol Ekstrak

46

Lampiran 5 Uji Toksisitas -Karoten Yang Diperoleh Dari Masing-Masing Fraksi


1. Penetasan Telur Artemia sp.
Artemia sp
-

direndam di dalam air tawar selama 15-30 menit


Kemudian direndam dalam 10 liter air laut
0
Suhu penetasan adalah 25-30 C dan pH 6-7.
Telur akan menetas setelah 18-24 jam

Larva Artemia sp
(Nauplii)

2. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)


Masing-masing Ekstrak dibuat
berbagai dengan seri konsentrasi
12,5; 25; 50 dan 100 g/mL

10 ekor larva Artemia sp berumur 48 jam


dimasukkan ke dalam toples kaca yang telah berisi
1 ml larutan ekstrak dan 4 ml air laut

Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung


dengan bantuan alat kaca pembesar

Dihitung Nilai LC50

47

Lampiran 6 Uji Aktivitas Antitumor -Karoten Dari Fraksi Dengan Toksisitas Tertinggi
1. Pencairan Sel Tumor He La
tabung berisi sel dari tangki nitrogen cair dikeluarkan
dan dibenamkan dalam waterbatch bersuhu 37oC

Seluruh cairan sel dipipet dan dimasukkan ke dalam


tabung sentrifus + 5 mL medium RPMI 1640

disentrifuge dalam kecepatan


1500 rpm selama 5 menit

Supernatan

Pellet
disuspensikan dalam 6 mL RPMI

Suspensi
- suspensi
sel
dipipet
dan
dimasukkan ke dalam labu kultur
- kemudian diinkubasi selama 24
jam dalam inkubator CO2 pada
0
37 C.

Sel yang telah


berumur 24 jam
- dikultur dalam medium RPMI
1640, FBS l0%, Fungision 0,5% dan
penisilin-streptomisin 2%

48

2. Pengujian Aktivitas Antitumor


Ekstrak dengan toksisitas tertinggi dibuat
dengan seri konsentrasi 12,5; 25; 50 dan
100 g/mL dalam media RPMI dibuat
secara triplo

Sel dimasukkan ke dalam microplate 96


well sebanyak 100 L

diinkubasi selama 24 jam pada 37oC


dengan aliran CO2 5 ml/menit sampai sel
menempel dengan baik

Sel setelah 24 jam + 100 L sampel dalam


microplate 96 well

kontrol sel (100 L sel


+ 100 L media)

kontrol media (200 L


media)

kontrol sampel (100 L


sampel + 100 L media)

microplate 96 well

microplate 96 well

microplate 96 well

Microplate diinkubasi kembali selama 24 jam dalam inkubator CO 2


Setelah 24 jam + MTT sebanyak 10 L ke dalam tiap well

Microplate diinkubasi kembali selama 4 jam, kemudian reaksi MTT


dihentikan dengan cara menambahkan 100 L SDS 10 %

Microplate diinkubasikan kembali selama 12 jam pada suhu kamar dan


dalam keadaan gelap

Setelah 2 jam, kondisi sel dicek dengan mikroskop inverted


phasecontrast

49

Lampiran 7 Rancangan Jadwal Penelitian


Nomor
1
2
3
4
5
6

Kegiatan
Studi Literatur
Penyiapan alat dan bahan penelitian
Ekstraksi & Analisis Kuantitatif
Uji Antioksidan & Toksisitas
Uji Antitumor
Pembuatan laporan dan presentasi

Bulan
VIII

IX

XI