Manual de Microbiología y Parasitología-Versión 2016 PDF

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE ENFERMERA
MANUAL DE PRCTICAS:
MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
AUTOR: MSc. Orlando Prez Delgado
CHICLAYO - PER
2016
MANUAL DE PRCTICAS
DATOS DEL ESTUDIANTES

APELLIDOS Y NOMBRES:__________________________________________________________________________
CICLO:___________________________
SECCIN:________________________
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MANUAL DE PRCTICAS
PRESENTACIN
El avance tecnolgico sobre la base del conocimiento cientfico se ha
desarrollado vertiginosamente, avizorndose espectaculares logros en el siglo XXI.
La Microbiologa como ciencia se encarga del estudio de los
microorganismos como las bacterias, virus y hongos y la Parasitologa que estudia a
los parsitos y su interaccin con los hospedadores.
La aplicacin e integracin de los principios tericos de la asignatura de
Microbiologa y Parasitologa en la prctica, implica capacidad, competencia, habilidad
que se logra cuando se cultiva un espritu observador, que conociendo y haciendo uso
de tcnicas con habilidad y destreza, muestra capacidad analtica para su aplicacin.
Por ello este manual presenta un conjunto de prcticas de laboratorio, cada una de
ellas con una pequea informacin terica, descripcin de procedimientos, as como
cuestionarios, a fin de incentivar a aprender y obtener sus propias conclusiones.
Autor
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MANUAL DE PRCTICAS
NDICE
Prctica 01
: Bioseguridad, manejo de residuos, material y equipos de laboratorio
Prctica 02
: Tincin bacteriolgica: Tincin Gram y Ziehl-Nielsen, morfologa

bacteriana.
Prctica 03
: Principios de Inmunologa
Prctica 04
: Medios de Cultivo y tcnicas de siembra
Prctica 05
: Prueba de suceptibilidad antimicrobiana antibiograma
Prctica 06
: Aislamiento e Identificacin de Staphylococcus y Streptococcus
Prctica 07 : Demostracin toxinas y enzimas bacterianas.

Prctica 08
: Siembra de Enterobacterias y bacterias gram negativas no

fermentadoras
Prctica 09
: Identificacin de Enterobacterias y bacterias gram negativas no

fermentadoras
Prctica 10
: Accin de los agentes qumicos y fsicos en el crecimiento bacteriano
Prctica 11
: Micologa
Prctica 12
: Parasitologa
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 01
BIOSEGURIDAD, RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE
LABORATORIO
Competencias:
Reconoce las normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa

Identifica los principales mtodos de esterilizacin.
Reconoce los materiales y equipos de laboratorio de microbiologa
NORMAS BASICAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

1. Usar siempre guardapolvo dentro del laboratorio.
2. No se debe comer, beber, fumar guardar alimentos y aplicarse cosmticos dentro del
laboratorio.
3. Antes de cada trabajo limpiar el rea con el desinfectante y luego lavarse las manos.
Hacer lo mismo al finalizar la sesin.
4. Prohibido pipetear con la boca.
5. Los cultivos lquidos de microorganismos patgenos requiere de especial cuidado,
evite que se produzcan aerosoles.
6. Cuando se trate de sembrar y asilar microorganismos en medios de cultivo se debe
efectuar siempre en presencia de mechero para evitar su contaminacin.
7. Para centrifugar materiales txicos o infecciosas usar nicamente tubos con tapa.
8. En caso de producirse salpicaduras de algn material infectivo cubrir inmediatamente
el rea con un desinfectante apropiado.
9. En caso de cualquier accidente como rasguo, cortadura o quemadura reportarlo
inmediatamente al profesor o responsable de laboratorio.
10. Todos los materiales contaminados lquidos o slidos deben ser descontaminados
antes de su descarte o neutralizacin, primero colocados en recipiente autoclavables y
cerrados, para luego ser autoclavados o incinerados.
11. Dejar el rea de trabajo en perfecto orden al momento de retirarse. No debe quedar
algo til sobre la mesa de trabajo. Asegurarse que las llaves del gas estn cerrados.
(sistemas a gas).
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MANUAL DE PRCTICAS
NIVELES DE BIOSEGURIDAD (GRUPOS DE AGENTES DE RIESGO)

TIPOS DE REAS DE TRABAJO:
rea contaminada.- rea donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo:
Laboratorios donde se manipulan virus, produccin de antgenos etc.
rea de trnsito limitado.- rea donde el trnsito est permitido slo a personas
previamente autorizadas, debido a la presencia de agentes que corresponden a los grupos (Es
poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Es decir, los que no producen
enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los
antimicrobianos. Ejemplo: E. coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se
utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, embutidos, entre
otros) y II (Puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los
trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Como algunos que, perteneciendo a la propia
flora habitual del hombre, son capaces de originar patologa infecciosa humana de gravedad
moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella sp, otros), y/o al uso de
sustancias qumicas de bajo riesgo). El acceso del personal administrativo est
terminantemente prohibido.
rea de trnsito restringido.- rea en las que el trnsito est permitido slo al personal
adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes de los grupos III
(Puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a l
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patologa grave, de difcil y largo
tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir la muerte. El mayor y
ms frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por
fluidos biolgicos. Ejemplo: M. tuberculosis, Brucella sp, Coxiella burneti, entre otros. El
laboratorio debe tener caractersticas de diseo e ingeniera especiales. Sin embargo, se
reconoce que algunas instalaciones existentes pueden no presentar todas las caractersticas
recomendadas para el nivel de bioseguridad 3 (por Ejemplo, zona de acceso con doble puerta
y penetraciones selladas). En esta circunstancia, se puede lograr un nivel de seguridad
aceptable para la prctica de procedimientos de rutina. La decisin de implementar esta
modificacin a las recomendaciones del nivel IV (Aquel que causando una enfermedad grave
en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de
que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o
tratamiento eficaz.
Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo:
Arenavirus.
Tambin incluye los laboratorios de produccin de biolgicos y control de calidad de
alimentos, medicamentos y afines. El acceso del personal administrativo est
terminantemente prohibido.
rea limpia.- rea del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo.
Ejemplo: donde se mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de
cultivo y a la vez se realiza la formulacin de la vacuna.
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MANUAL DE PRCTICAS
rea libre.- rea de trnsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos comunes,
comedor y otras reas de uso comn.
MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

Grupo de riesgo
Microorganismo infectante
RIESGO 1
Agrupa
microorganismos
que tienen escaso o nulo
riesgo
de
provocar
enfermedades
Acanthamoeba
Plasmodium
Protozoarios
Helmintos intestinales
RIESGO 2
Agrupa a microorganismos
que
pueden
provocar
enfermedades humanas de
riesgo moderado.
Si provoca una infeccin al
personal de laboratorio, sta
tiene tratamiento y cura
Agrupa
microorganismos
que
pueden
provocar
enfermedades
humanas
graves. Tienen tratamiento,
cura y se limita.
Acinetobacter
Aeromonas
Bordetella
Bartonella bacilliformis
Clostridium
Corynebacterium
Entamoeba hystolitica
Escherichia
coli
entoropatgena
Leishmania
Mycobacterium
(excepto los de riesgo 3)
RIESGO 3
- Brucella
- Histoplasma capsulatum
- Mycobacterium
tuberculosis
- Mycobacterium bovis
Treponema pallidum
Vibrio
Neisseria
Salmonella typhi
Paratyphi A
Shigella
Yersinia
Pseudomonas
Sataphylococcus
Haemophylus
Leptospira
Virus de la hepatitis B
Paracoccidiodis
brasilensis
Taenia solium
Trypanosoma cruzi
Yersinia pestis
RIESGO 4
Agrupa
microorganismos
que provocan enfermedades
graves en el ser humano. No
hay tratamiento para su
cura.
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

Virus de fiebre hemorrgica Ebola.
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MANUAL DE PRCTICAS
SEALES DE SEGURIDAD
De Prohibicin: Redondas, con pictograma de color negro sobre fondo blanco, con bordes y
banda transversal de izquierda a derecha.
De Seguridad: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo

verde.
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MANUAL DE PRCTICAS
Contra Incendios: Rectangulares o cuadrangulares, con pictograma blanco sobre fondo rojo.
De Advertencia: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja.
De Obligacin: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.
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MANUAL DE PRCTICAS
GESTIN EN MANEJO DE RESIDUOS INTRAHOSPITALARIOS
1. Generalidades: La gestin de residuos debe ser considerada como una parte

importante de la seguridad en los laboratorios. Los desechos que se generan
pueden estar contaminados por microorganismos o contener sustancias qumicas
txicas y peligrosas. En menor medida, el personal del laboratorio puede estar
expuesto a los efectos de las radiaciones ionizantes.
Los casos de infecciones o intoxicaciones en el laboratorio son conocidos lo que obliga a
la adopcin de medidas de proteccin para el personal que trabaja en este mbito. La
visin que se pretende dar est sobre todo encaminada a la proteccin del personal de los
laboratorios, no olvidar que las actividades que en ellos se realizan pueden afectar a la
salud comunitaria.
La mejor manera de racionalizar los residuos es mediante una gestin integrada cuyos
pilares bsicos son la minimizacin, segregacin y eliminacin.
2. Clasificacin de los Residuos segn su Peligrosidad:

Clase A: Residuos Biocontaminados (Peligrosos)
Tipo A 1: Atencin al paciente. Instrumentos y materiales utilizados en la toma de
muestra de sangre, tejidos y otros.
Tipo A 2: Material biolgico.
Tipo A 3: Sangre humana y productos derivados.
Tipo A 4: Quirrgicos y anatomopatolgicos.
Tipo A 5: Animales contaminados.
Clase B: Residuos Especiales
Tipo B 1: Qumicos peligrosos.
Tipo B 2: Farmacuticos.
Tipo B 3: Radioactivos.
Clase C: Residuos Comunes: Similares a los domsticos. Incluye a los generados en
administracin como: cartn, papel, material de oficina, basura orgnica, etc.
3. Manejo de Residuos Slidos:

Las bolsas de recoleccin de residuos slidos se deben de diferenciar por colores:
Residuos Biocontaminados: Color roja.

Residuos Especiales: Color amarilla.
Residuos comunes: Color negra.
Si los residuos son punzantes o cortantes debe utilizarse recipientes rgidos resistentes
a la perforacin cuyo volumen no supere los 2 L y que contengan desinfectante
(hipoclorito de sodio al 10%), el cual debe ocupar los 2/3 del volumen del recipiente.
ACTIVIDADES A DESARROLLAR
1. Mencione 5 tipos de residuos biocontaminados, 5 especiales y 5 comunes, en

laboratorio.
2. Mencione 5 Normas de Bioseguridad que usted estime conveniente debe de tener
un laboratorio de prcticas.
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MANUAL DE PRCTICAS
3. Seale que institucin norma la Bioseguridad en las reas de salud de nuestro

pas.
4. Reconozca segn las definiciones determinadas, 3 seales de Prohibicin, 3 de
Seguridad, 3 de Advertencia, 3 obligatorias y 3 Contra incendios y esquematcelas
segn lo establecido.
5. Identifique las probables fuentes de que generen residuos slidos en la USS y
disee un sistema de gestin de dichos residuos.
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MANUAL DE PRCTICAS
RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO
Material de Vidrio:
Tubos de Ensayo: Son tubos de vidrio de paredes gruesas,
resistentes a altas temperaturas. Son de diferentes
tamaos y capacidad. Para utilizarlos, estos deben estar
taponados con algodn absorbente y esterilizarlos.
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MANUAL DE PRCTICAS
Placas Petri: Son cajas cilndricas, constituidas por una tapa

y una base, de paredes gruesas. Son de diversos tamaos y
se emplean para colocar en la base los medios de cultivo
slidos.
Pipetas: Son tubos cilndricos largos, constituidos por una boquilla y el cuerpo de la pipeta son de
dos tipos:
Graduadas: Se caracterizan por presentar un nmero fraccin donde el numerador representa el

volumen total de la pipeta y el numerador las veces en que est dividida (ml). Las pipetas
graduadas pueden ser terminales: cuando el vaciado del lquido a medir se realiza hasta la punta
de la pipeta y las No terminales: cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la ltima lnea de
graduacin.
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MANUAL DE PRCTICAS
Pipetas No Graduadas: Llamadas tambin pipetas Pasteur, son fabricadas con

varillas de vidrio de 4 mm x 30 40 cm de longitud. Las pipetas para ser utilizadas
deben ser taponadas con algodn no absorbente en la zona de la boquilla y luego
envueltas en papel para ser esterilizadas
Probetas:
Son
recipientes
cilndricos graduados, de diferente
tamao y capacidad una base
plana. Se les emplea para medir
volmenes grandes de lquidos.
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MANUAL DE PRCTICAS
Matraz Erlenmeyer: Son frascos de

vidrio de forma cnica de cuello
corto y base plana, son de
diferentes tamaos y capacidad,
pueden estar o no graduadas. Para
su empleo se taponan con algodn
no absorbente; en l se preparan
soluciones y medios de cultivo.
Balones: Son frascos de vidrio de

forma redonda, de cuello largo y
base plana. Cumplen la misma
finalidad que el matraz.
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MANUAL DE PRCTICAS
Baguetas o Agitadores: Son varillas

de vidrio compacto, de extremos
romos, se emplean para disolver
sustancias en una solucin.
Lminas porta y cubre objetos:

Los portaobjetos son lminas de
vidrio transparente de forma
rectangular y pequeos grosor. Los
cubreobjetos son finas laminillas de
menor tamao que la lmina
portaobjetos, de rectangular o
cuadrada. Ambos son importantes
en la observacin microscpica de
los microorganismos.
Frascos goteros: Son frascos de

vidrio
de
paredes
gruesas,
transparentes o de color mbar;
algunos con tapas especiales para
facilitar el vaciado del colorante.
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MANUAL DE PRCTICAS
Material de Metal
Gradillas: Sirven para colocar los

tubos durante la sesin de trabajo.
Esptulas:
Es
de
material
inoxidable. Se utiliza para coger el
material a pesar.
Pinzas:
Para sujetar y llevar al calor tubos
de ensayo, introducir y sacar
crisoles del horno, etc.
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MANUAL DE PRCTICAS
Material de Madera
Pinzas:
Para sujetar y llevar al calor tubos
de ensayo, introducir y sacar
crisoles del horno, etc.
Equipos de Laboratorio
Bao Mara: Es un recipiente de forma rectangular, que est constituido en su

parte inferior por una resistencia que va conectado a un termostato, que permite
regular temperatura; por encima se encuentra una cubeta en la que se coloca el
agua a calentar. Se emplea para disolver medios de cultivo, inactivacin de sueros,
pruebas de reductasa, etc.
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MANUAL DE PRCTICAS
Horno Pasteur: Es un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco.

Tiene varias formas, pero bsicamente est constituido por una resistencia y un
termostato que regula altas temperaturas.
Centrfugas: Son aparatos diseados para

acelerar la separacin de partculas
slidas suspendidas en lquidos. La
velocidad a la cual sedimentan las
partculas en
un lquido de varios
factores como el tamao de la partcula,
el peso, la viscosidad del lquido y la
fuerza gravitacional.
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MANUAL DE PRCTICAS
Refrigeradoras y Congeladoras:
Son pequeos aparatos que
proporcionan
temperaturas
muy bajas. Se emplean para
almacenar medios de cultivo,
sueros, reactivos y soluciones
perecederas.
Las congeladoras: Se requieren
para almacenamientos ms
Micropipetas:
La micropipeta es un instrumento de
laboratorio empleado para succionar y
transferir pequeos volmenes de
lquidos y permitir su manejo en las
distintas tcnicas analticas.
Los volmenes captables por estos
instrumentos varan segn el modelo: los
ms habituales, denominados p20, p200 y
p1000, admiten un mximo de 20, 200 y
1000 l, respectivamente.
Es de destacar que el uso de micropipetas
permite emplear distintos lquidos sin
tener que lavar el aparato: para ello, se
emplean puntas desechables, de plstico,
que habitualmente son estriles.
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MANUAL DE PRCTICAS
TERMOCICLADOR:
Tambin conocido como mquina PCR
(reaccin en cadena de la polimerasa)
que es usado en Biologa Molecular.
En Microbiologa es empleado como
ayuda al diagnstico molecular de
microorganismos que estn asociados
como causantes de enfermedades.
Vortex o Agitador de tubo:

un dispositivo simple que se usa
comnmente en los laboratorios para
agitar pequeos tubos o frascos de
lquido.
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 02
TINCIN y MORFOLOGA BACTERIOLGICA
Competencias:
Reconoce la importancia de la tincin bacteriana
Reconoce la Morfologa bacteriana.
Material:
- Lminas portaobjeto, lminas cubreobjeto.
- Lminas escavadas.
- Asas bacteriolgicas
- Mechero
- Lminas con preparaciones fijas
- Microscopio
- Lminas portaobjetos
- Cristal Violeta
- Lugol
- Alcohol-Acetona
- Safranina
- Fucsina fenicada
- Alcohol-cido
- Azul de metileno
Procedimiento:
1.
2.
3.
4.
Limpiar el rea de trabajo.

Colocar cerca al mechero todo el material necesario para realizar su experiencia.
Colocarse frente al mechero y empezar a trabajar segn las indicaciones.
No olvidarse de esterilizar el asa bacteriolgica antes y despus de usarla.
Determinacin de motilidad:
Examen en fresco: Montaje hmedo
- Sobre una lmina portaobjeto colocar dos gotas de cultivo microbiano.
- Colocar sobre la muestra una lmina cubreobjeto.
- Observar al microscopio con objetivo (40 x).
- Diferenciar entre motilidad y movimiento browniano.
Examen en fresco Gota pendiente
- Sobre una lmina cubreobjeto colocar dos gotas de cultivo microbiano.
- Colocar rpidamente la lmina cubreobjeto sobre la depresin de la lmina escavada.
- Observemos que la gota quede suspendida (pendiente) en la lmina cubreobjeto.
- Observar al microscopio.
Preparacin de Frotis y Fijado
-
Limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizar el frotis, dejarlo secar, una vez
seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces.
Cuando este fri, marcar la cara donde se har el frotis.
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MANUAL DE PRCTICAS
Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo.
Tomar el cultivo del que se har el frotis y flamear la boca de este. Tomar la porcin de
la muestra que se va a examinar por medio de un asa o
escobilln.
Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin

grasa, debidamente marcado
***Si la muestra se encuentra en un medio lquido, basta con colocar una pequea gota
con el asa estril sobre el portaobjetos.
***Si la muestra est en un medio slido, colocar una gotita de solucin salina o agua
destilada estril sobre el portaobjetos y con el asa estril se transfiere una pequea
muestra de bacterias en la gotita.
Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda con el asa la gotita
para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire.
Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.
Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10 min o hasta que seque
completamente.
Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero, pasndolo tres veces a travs
de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre el dorso
de la mano.
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MANUAL DE PRCTICAS
Tincin de Gram.
Consta de cuatro reactivos diferentes: el cristal violeta es el primer colorante o colorante
primario que imparte color a todos los microorganismos del frotis. Enseguida se utiliza una
solucin del yodo (lugol), la que acta como mordente (que aumenta o refuerza la unin,
entre un colorante y un sustrato ), el tercer reactivo es un decolorante que disuelve y arrastra
el colorante primario, los organismos que resisten la decoloracin y conserva una tonalidad
azul son Gram (+), el cuarto reactivo es el colorante de contraste la safranina que se aplica
como contra tincin ya que los organismos se destieron con el decolorante, ahora toman el
color rojo de la safranina denominndose gram (-).
PASOS A SEGUIR EN LA TCNICA DE GRAM
1.- Preparar los frotis como en la tcnica de tinciones simples. Y preparacin de frotis y fijado.
2.- Preparar los frotis con cultivos de S. epidermis, E. coli.
3.- Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
5.- Cubrir los frotis con yodo lugol durante 1 minuto.
6.- Lavar como se indic en el paso (4).
7.- Decolorar con alcohol-cetona hasta que no escurra lquido azul.
8.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).
9.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.
10.- Lavar como en el paso (4).
11.- Observar al microscopio a inmersin. OB (100 X). Ver figura Tincin Gram.
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MANUAL DE PRCTICAS
COLORACIN ALCOHOL-CIDO RESISTENTE TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN

Se utiliza para el diagnstico de la tuberculosis, producida por Mycobacterium tuberculosis,
difcil de teir debido a que posee grandes cantidades de lpido en su superficie. Adems, es
cido alcohol resistente, por lo que una vez que se tie no pierde la coloracin.
Procedimiento:
-
En una lmina limpia, colocar una gota de la muestra y realizar el frotis.

Cubrir el frotis con solucin de Fucsina fenicada y calentar ligeramente hasta la
emisin de vapores sin llegar a hervir. Repetir esta operacin por tres veces en un
tiempo de 3 minutos.
Lavar a chorro de agua.
Decolorar el frotis con alcohol-cido.
Lavar a chorro de agua y cubrir la muestra con azul de metileno durante 1 minuto.
Lavar a chorro de agua y secar al medio ambiente o al calor suave del mechero.
Observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Comparar y esquematizar.
Cuestionario:
Qu diferencias exite entre bacterias gram positivas y gram negativas?
Para qu se necesita el aceite inmersin?

Cul es la estructura de la bacteria alcohol-cido resistente?
Explique, del por qu calentar la muestra hasta la emisin de vapores.
A qu se debe la motilidad bacteriana?
Por qu los colorantes bsicos tien las clulas bacterianas?
Por qu los colorantes cidos no tien las clulas bacterinas?
Complete en los siguientes espacios en blanco.
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MANUAL DE PRCTICAS
1m = ---------------------- ______ m
1____ = ---------------------10-9m
1m = --------------------- ______nm
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 03
PRINCIPIOS DE INMUNOLOGA
Competencias:
Reconoce la reaccin de aglutinacin
Identifica la presencia de anticuerpos mediante la utilizacin de los antgenos.
Explicar el fundamento inmunolgico de la prueba de inmunocromatografa
Materiales:
- Muestra de sangre
- Antisueros Anti A, Anti B y Anti D.
- Antisueros Tfico O, Tfico H, Paratfico A, Paratfico B y Brucella
- Suero Control positivo paciente con tifoidea , suero negativo
- Lminas portaobjetos
- Micropipetas Vol de 5-50 L.
- Palillos mondadientes o mezcladores de plstico
- Lancetas
- Colorante Wright
Procedimiento:
1. Formula Leucocitaria:
Extensin de sangre capilar en tincin de Wright, observaremos la morfologa de los
glbulos blancos en sangre perifrica y calcularemos la frmula leucocitaria.
-
Hacer una extensin de sangre bien mezclada con sangre con anticoagulante EDTA o
capilar con el mtodo de atraer y arrastrar.
Seque rpidamente al aire o en una corriente de aire tibio.
Tia el frotis con la tcnica indicada en el apartado de tinciones soluciones.
Formas incorrectas de extendido de frotis:
Examen microscpico
En 10x examinar calidad global del frotis, color y distribucin de clulas, la

formacin de rodillos por los eritrocitos o la aglutinacin de los mismos, debe
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MANUAL DE PRCTICAS
revisarse con rapidez en busca de cualquier clula anormal grande o incluso

parsitos inesperados.
En 40x se selecciona la zona correcta del extendido donde se debe iniciar el
recuento y evaluar la morfologa celular. Para ello se selecciona el rea en la
que los eritrocitos estn superpuestos de 2 a 3 pero que la mayora estn
separados entre s.
En 100x se coloca una gota de aceite de inmersin y se enfoca con este objetivo,
se cuentan y clasifican 100 leucocitos y se informan como porcentajes de
leucocitos (valores relativos). La morfologa de eritrocitos y plaquetas as como
la estimacin de estas ltimas se hacen tambin con este.
2. Prueba de Aglutinacin:
Grupos Sanguneos:
-
Para determinar el grupo sanguneo, obtener 3 gotas de sangre por puncin del dedo
en una lmina portaobjetos.
Agitar los antisueros previamente y depositar una gota sobre cada una de las gotas de
sangre. Mezclar suavemente.
Realizar movimientos vaivn de la lmina durante dos minutos.
Formacin de grumos gruesos, reaccin positiva.
Ausencia de grumos reaccin negativa.
Antgenos Sricos:
Mtodo de Prueba Rpida en Placa
Marcar en una placa de vidrio correctamente indicando el antgeno que se este usando.
NOTA: El reactivo as como los sueros, deben alcanzar la temperatura ambiente para
comenzar la prueba.
- Depositar en sitios diferentes de la placa las siguientes cantidades del suero a analizar:
0.08 mL, 0.04 mL, 0.02 mL, 0.01 mL y 0.005 mL (EL SUERO DEBE ESTAR
TOTALMENTE CLARO).
- Agitar el antgeno a utilizar para tener una suspensin uniforme.
- Aadir 30 mL de la suspensin de antgeno a cada una de las diferentes cantidades de
suero. Se recomienda utilizar pipetas automticas (el gotero incluido proporciona
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MANUAL DE PRCTICAS
una gota de 30-40 mL).

Mezclar el antgeno y el suero utilizando un aplicador diferente para cada una de las
cantidades de suero.
- Girar la placa manualmente o utilizando un agitador mecnico (120 rpm) durante 2
minutos.
- Realizar la lectura utilizando una fuente de luz directa y observar la aglutinacin
macroscpica.
- Se recomienda incluir controles Positivo y Negativo.
Interpretacin de los resultados
El grado de aglutinacin se registra como sigue:
4+ Aglutinacin del 100% de los organismos
- Aglutinacin del 0% de los organismos
-
El titulo del suero ser la inversa de la dilucin ms alta en donde se observa una aglutinacin
del 50% de microorganismos (2+)
Las diluciones del suero en la prueba en placa son aproximadamente equivalentes a las
diluciones para prueba en tubo como se muestra a continuacin.
Volumen del suero titulo
(80 L) 0.08 mL 1 : 20
(40 L) 0.04 mL 1 : 40
(20 L) 0.02 mL 1 : 80
(10 L) 0.01 mL 1 : 160
(5 L) 0.005 mL 1 : 320
3. Inmunocromatografa
- Anotar cada una de las pruebas a realizar
- Colocar una gota de muestra de suero de paciente en cada una de las pruebas rpidas
que se le proporcionan.
- Dejar que la muestra fluja a lo largo de la prueba de inmunocromatografa
- Anotar los resultados positivos y negativos.
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MANUAL DE PRCTICAS
Cuestionario:
- Cul es la base inmunolgica del rechazo del trasplante?
- Cul es la funcin del interfern gamma?
- Qu son las interleucinas y menciones los tipos interleucinas con su respectiva
funcin?
- Cul es la funcin de los linfocitos T y linfocitos B?
- A qu tipos de clulas se les denominas clulas presentadoras de antgenos?
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 4
MEDIOS DE CULTIVO Y TCNICAS DE SIEMBRA
Competencias:
- Identifica el uso de los medios de cultivo en Microbiologa
- Asla microorganismos mediantes los medios cultivos
Materiales:
Agar Mller-Hinton
Agar Manitol Salado
Agar SS
Agar Mc Conckey
Agar Sangre
Caldo Peptonado
Placas petri
Asas Bacteriolgicas
Matraces
Balones
Mechero Bunsen
Autoclave
Horno
Estufa
Medios de Cultivo:
Agar Sangre
Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos
microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo
de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran
variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio
agar chocolate.
Frmula (en gramos por litro)
Infusin de msculo de corazn
375.0
Peptona
10.0
Cloruro de sodio
5.0
Agar
15.0
pH: 7.3
Fundamento
La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que
permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos
nutricionalmente exigentes.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10%, aporta nutrientes
para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis.
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MANUAL DE PRCTICAS
Microorganismos
E. coli ATCC 25922
S. aureus ATCC 25923
S. pyogenes ATCC 19615
S. pneumoniae ATCC 6305
S. pneumoniae ATCC 49619
Crecimiento
Abundante
Abundante
Abundante
Abundante
Abundante
Hemlisis
-Beta
Beta
Alfa
Alfa
Agar Mc Conckey
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en
muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo.
Peptona
17.0
Pluripeptona
3.0
Lactosa
10.0
Mezcla de Sales biliares
1.5
Cloruro de Sodio
5.0
Agar
13.5
Rojo Neutro
0.03
Cristal Violeta
0.001
Instrucciones
Suspender 50 g del polvo por litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a
2 minutos hasta disolver. Esterilizar en
autoclave a 121C durante 15 minutos.
pH: 7.1
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el
cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora
Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las
colonias, y la precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Microorganismos
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Proteus mirabilis
Enterococcus faecalis
Colonias
Rojas con halo turbio
Rosadas mucosas
Incoloras, transparentes
Diminutas, incoloras, opacas
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MANUAL DE PRCTICAS
Agar Manitol Salado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de
estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras
clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, sino se
dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies
pueden no desarrollar.
Extracto de Carne
1.0
Pluripeptona
10.0
d-manitol
10.0
Cloruro de Sodio
75.0
Agar
15.0
Rojo Fenol
0.025
Instrucciones
Suspender 111 g de polvo por litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullicin durante 1 o 2
minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave
a 118-121C durante 15 minutos.
pH: 7.4
Fundamento:
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias
aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o
prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio
para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el
cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el
desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol,
producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color
rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias
amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de
una zona del mismo color o prpura.
Microorganismos
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Crecimiento
Exccelente
Bueno
Inhibido
Inhibido
Colonias
Amarillas
Rojas
Inhibido
Inhibido
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MANUAL DE PRCTICAS
Agar SS
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. Y de algunas especies de
Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su
presencia.
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
5.0
Lactosa
10.0
Mezcla de Sales Biliares
8.5
Citrato de Sodio
8.5
Tiosulfato de sodio
8.5
Citrato frrico
1.0
Agar
13.5
Verde Brillante
0.00033
Rojo Neutro
0.025
Instrucciones
Suspender 60 g del polvo por litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
homogeneizar. Calentar a ebullicin durante
2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN
AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y distribuir
unos 20 ml por placa. Secar la superficie del
medio unos minutos en la estufa.
pH: 7.0
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales biliares y
el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los
coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a
partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el
medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre
un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el
medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se
evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Microorganismos
Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Enterococcus faecalis
Colonias
Transparentes, centro negro
Incoloras
Incoloras
Transparentes, centro negro
Rosadas a rojas
Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy escaso crecimiento
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MANUAL DE PRCTICAS
Mueller Hinton Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a

los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes.
Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS), recomend su uso en forma rutinaria para la realizacin del
antibiograma en medio slido, debido a una serie de factores que se detallan a continuacin:
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en
inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayora de los patgenos
crece satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han sido evaluados y avalados usando
este medio de cultivo.
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las pruebas de
sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Instrucciones
Infusin de carne
300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de
Peptona cida de casena
17.5 agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos.
Almidn
1.5 Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1
minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50C y distribuir a cajas de Petri (o
Agar
15.0 agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel
de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en
placas de 9 cm de dimetro).
pH final: 7.3 0.1
Siembra
Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la metodologa
apropiada.
Incubacin
apropiada.
Resultados
apropiada.
Notas:
1-Los lotes de agar Mueller Hinton Britania cumplen con las normas descriptas en el
documento M6 - P del NCCLS: Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar.
Esto es muy importante pues algunos lotes pueden variar significativamente y si las bacterias
no crecen adecuadamente, las zonas de inhibicin en las pruebas de difusin son
generalmente ms grandes, quedan fuera de los lmites de control de calidad y pueden dar
resultados
errneos.
2-Los medios que contienen cantidades excesivas de timidina o timina pueden revertir el
efecto inhibitorio de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo as zonas de inhibicin
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MANUAL DE PRCTICAS
mas pequeas y por lo tanto informes de falsa resistencia. Para evaluar el contenido de
timidina del lote de agar Mueller Hinton, se prueba la cepa de control de calidad:
Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a discos de TMS. En un medio satisfactorio, se
produce una zona clara de inhibicin de 20 mm o ms.
3-Otro aspecto de cuidado en el control de calidad en el agar Mueller Hinton es que las
variaciones en cationes divalentes principalmente calcio y magnesio pueden afectar los
resultados con tetraciclina, polimixina y aminoglucsidos cuando se ensayan cepas de
Pseudomonas spp. Por tal motivo, se deben cumplir los lmites de control de calidad
publicados por el NCCLS.
4-Los resultados deben ser cuidadosamente observados con todos los organismos de control
para evitar datos aberrantes debido al medio de cultivo. Para aquellas cepas que fallan de
crecer satisfactoriamente sobre Agar Mueller Hinton no suplementado, se agrega sangre
desfibrinada de carnero al agar fundido y enfriado, a una concentracin final al 5% (v/v).
Para el control de precisin y exactitud del agar de Mueller Hinton se usan las siguientes cepas
control:
S. aureus
E. coli
P. aeruginosa
E. faecalis
Para evaluar
ATCC 25923
ATCC 25922
ATCC 27853
ATCC 29212
el desempeo de inhibidores de beta lactamasa, se utiliza la cepa control:
E. coli
ATCC 35218
Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.
Lowenstein-Jensen Medio Base.
Es esta una base para la preparacin de varios medios destinados al aislamiento, cultivo y
diferenciacin de micobacterias.
Fundamento
Los nutrientes de este medio basal, ms los aportados por el agregado de la mezcla de huevos,
constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. El
verde de malaquita inhibe a gran parte de la flora acompaante. Con el agregado de glicerina
se estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, aunque gran parte de M. bovis es
inhibido. Agregando un 5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal,
como es el caso de M. smegmatis.
Fosfato monopotsico
2.5
Sulfato de magnesio
0.24
Citrato de magnesio
0.6
Asparragina
3.6
Harina de papa
30.0
Instrucciones
Suspender 37,3 g del polvo en 600 ml de agua destilada y
agregar 12 ml de glicerina. Calentar agitando
continuamente y hervir un minuto. Esterilizar en
autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50C
aproximadamente. Mezclar aspticamente un litro de
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MANUAL DE PRCTICAS
Verde de malaquita
0.4
huevo ntegro, evitando la formacin de burbujas de aire

y agregar al medio base. Mezclar el huevo y la base hasta
uniformar. Distribuir en recipientes estriles adecuados y
tapar hermticamente. Colocar los mismos en posicin
inclinada y coagular a 85-90C durante 45 minutos.
pH final:4.8 0.1
Siembra
Se recomienda, en procedimientos de rutina, inocular la muestra previamente decontaminada,
sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubacin
A 35-37C. A los 7 das de incubacin, se observa por primera vez si hubo crecimiento. Luego,
observar cada semana, hasta un total de 8 semanas.
Resultados
Observar las caractersticas morfolgicas y la presencia o ausencia de pigmento en las
colonias.
Microorganismos
Crecimiento
Caractersticas de las colonias
Mycobacterium tuberculosis
Excelente
Grandes, secas, amarillentas, granulares
Mycobacterium avium
Excelente
Lisas, sin pigmentos
Mycobacterium gordonae
Excelente
Lisas
Mycobacterium bovis
----Caractersticas del medio
Medio preparado: verde plido, opaco.
TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Pluripeptona
20.0
Extracto de carne
3.0
Lactosa
10.0
Cloruro de Sodio
5.0
Sacarosa
10.0
Glucosa
1.0
Sulfato de hierro y amonio
0.2
Agar
13.0
Tiosulfato de sodio
0.2
Rojo fenol
0.025
Instrucciones
Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua
destilada. Mezclar bien y calentar con
agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos
hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera
parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a
121C por 15 minutos. Enfriar en pico de
flauta profundo.
pH: 7.3
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano.
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MANUAL DE PRCTICAS
La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el
sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido
sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Lisina Hierro Agar
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp. ,
basado en la decarboxilacin/desaminacin de la lisina y en la produccin de cido
sulfhdrico.
Peptona de gelatina
5.0
Extracto de levadura
3.0
Lisina
10.0
Citrato de hierro y amonio
0.5
Glucosa
1.0
0.2
Agar
15.0
Tiosulfato de sodio
0.04
Instrucciones
Suspender 35 g del medio deshidratado en
un litro de agua destilada. Dejar embeber
unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente,
agitando con frecuencia y hervir durante un
minuto hasta la disolucin completa.
Distribuir y esterilizar a 121C durante 15
minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un
fondo vertical apto para la puncin.
pH: 6.7
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para
detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y de aminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de
cido sulfhdrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o
menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por descarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y
esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La descarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de
la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24hs
de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el
fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido
a la formacin de sulfuro de hierro.
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MANUAL DE PRCTICAS
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la
lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Resultados
1-Decarboxilacin de la lisina:
- Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
- Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna
cepas de Morganellas pp.
3-Produccindecidosulfhdrico:
- Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y
fondo)
Agar Citrato de Simons
Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como nica fuente de carbono y energa.
Instrucciones
Citrato de sodio
2.0
Suspender 24,2 g del medio deshidratado por
litro de agua destilada. Dejar reposar 5
Cloruro de sodio
5.0
minutos y mezclar calentando a ebullicin
Fosfato dipotsico
1.0
durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y
Fosfato monoamnico
1.0
esterilizar en autoclave a 121C durante 15
Sulfato de magnesio
0.2
minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Azul de bromotimol
0.08
Agar
15.0
pH: 6.9
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de
sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de
pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno,
con la consiguiente produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a
travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos
orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato
permeasa.
Resultados
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MANUAL DE PRCTICAS
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no
hay cambio de color.
Microorganismos
S. typhimurium
E. coli
S. flexneri
Citrato permeasa
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Color del medio

Azul
Azul
Verde
Verde
MIO Medio
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de
ornitina descarboxilasa y produccin de indol.
Dextrosa
1.0
Extracto de levadura
3.0
Peptona
10.0
Triptena
10.0
Clorhidrato de L-ornitina
5.0
Agar
2.0
Prpura de bromocresol
0.02
Instrucciones
Suspender 31 g del polvo en un litro de agua
destilada. Calentar a ebullicin hasta
completa disolucin. Distribuir en tubos y
esterilizar 15 minutos a 121C.
pH: 6.5
Fundamento:
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y triptena.
Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima
triptofanasa, para la realizacin de la prueba de lindol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin
de la enzima ornitina descarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en
medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia
de ornitina descarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde
mas all de la lnea de inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la
fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que
el indicador de pH prpura de bromocresol vire a ladrillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina
descarboxilasa, la cual descarboxila la ornitina presente.
Por descarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el
color prpura.
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MANUAL DE PRCTICAS
El indol, es producido a partir del triptfano por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de
Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo.
Resultados
1-Movilidad:
- Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento ms all de la lnea de siembra.Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
- Resultado positivo: color prpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede
desarrollar un color violceo en la superficie del medio.
3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad
y la prueba de ornitina.
- Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
- Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
Medio SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de
hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la
triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con
el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las
cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por
la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que
el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Instrucciones
Triptena
20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de
Peptona
6.1 agua destilada. Mezclar hasta disolver;
0.2 calentar agitando y hervir durante un
Tiosulfato de sodio
0.2 minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos
de hemlisis y esterilizar en autoclave a
Agar
3.5 121C durante 15 minutos. Solidificar
en posicin vertical.
pH final: 7.3 0.2
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con
aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la
puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en lnea recta.
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MANUAL DE PRCTICAS
Incubacin
Durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis.
Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.
Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio.
Cepas
SH2 negativas: el
medio
permanece
sin
cambio
de
color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de
Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Microorganismo
E. coli ATCC 25922
K. pneumoniae ATCC
700603
P. mirabilis ATCC 43071
S. typhimurium ATCC
14028
S. enteritidis ATCC 13076
S. flexneri ATCC 12022
Movilidad
Indol
+
-
+
-
Produccin
de cido
sulfhdrico
-
+
+
+
+
+
-
+
-
Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser
difcil de observar.
-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco,
que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido sulfhdrico.
Caractersticas del medio
Medio preparado: mbar.
TCNICAS DE SIEMBRA
Se siembra en medios de cultivo para hacer que las bacterias se reproduzcan con el objetivo
de aumentar el nmero de individuos de una poblacin.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del
microorganismo a estudiar.
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MANUAL DE PRCTICAS
Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y sobre el
mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza para
microorganismos aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin. Una vez
solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la
capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este mtodo se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaeroflicos.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido,
se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con ayuda de una esptula
de Drigalsky se extiende el inculo hasta su absorcin total por el medio de cultivo.
Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos .
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se
deja solidificar.
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MANUAL DE PRCTICAS
Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio

de cultivo fundido y estril, se inclina el tubo y se deja enfriar.
En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce
mediante puncin en el medio contenido en la parte inferior del tubo.
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MANUAL DE PRCTICAS
En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el
mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.
Cuestionario:
Cules son los usos de los medios de cultivo en microbiologa?
Cmo se clasifican los cultivos segn su estado fsico, uso y finalidad?
Explicar, a que se debe el cambio de color de los medios de cultivo por determinadas
bacterias?
A qu se le denomina medio de transporte y para qu sirve?
Cmo puede incubarse microorganismos anaerobios estrictos?
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 05
PRUEBA DE SUCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA ANTIBIOGRAMA
Competencia:
- Reconocer la importancia del uso de la sensibilidad antimicrobiana.
- Identifica la sensibilidad y resistencia del antibitico
Material:
- Cepa bacteriana: cultivo de 16 a 18 horas de incubacin de la cepa problema, en caldo
nutriente.
- Medio de Cultivo: Placas con agar Mller Hinton
- Hisopos o torundas de algodn
- Discos de sensibilidad: Penicilina, Ampicilina, Clindamicina, Cefalotina, Cefotaxime,
Ceftriaxone, Gentamicinas, Amikacina, Amoxicilina, Ciprofloxacina, Norfloxacina,
cido Nalidixico
Procedimiento:
Mtodo de Difusin en Agar
- Preparacin del Inculo:
Sembrar la cepa problema en tubos con caldo nutriente e incubar durante 16 a 18
horas a 37 C. Ajustar la concentracin del inculo al tubo N 3 de la escala de Mac
Farland. Diluyendo en Solucin Salina.
- Inoculacin en Placa:
- Introducir un hisopo estril en el tubo con el cultivo bacteriano, humedeciendo
completamente.
- Restregar el hisopo por las paredes del tubo con la finalidad de eliminar el exceso
del cultivo.
- Sembrar la cepa cubriendo toda la superficie de la placa de agar Mller Hinton.
- Colocacin de los discos de sensibilidad:
Una vez secado la superficie de la placa colocar los discos de sensibilidad con
ayuda de una pinza, manteniendo una distancia de 2 cm entre cada disco
presionar ligeramente.
Incubar las placas a 37 C durante 24 horas.
Medir los halos de inhibicin y comparar con el halmetro
Cuestionario:
Para qu es til el antibiograma?
Qu factores influyen el dimetro de las zonas de inhibicin?
A que se debe la resistencia a los antibiticos?
Cundo se considera el antibitico es sensible al crecimiento bacteriano?
Qu entiendes por CMI y CMB?
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MANUAL DE PRCTICAS
RESULTADOS
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 06
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus y Streptococcus
Competencia:
Realiza el aislamiento e identificacin de las principales especies de cocos gram positivos que
afectan al hombre.
Establece diferencia entre gneros de cocos gram positivos.
Materiales:
- Asa curva
- Mechero
- Muestras biolgicas
- Agar Manitol salado
- Agar Sangre
Procedimiento:
Colocar la cabeza del paciente en hiperextensin y se iluminan las fauces en forma
conveniente.
Con el hisopo estril se frotan ambas amgdalas (o ambos papilares en pacientes
amigdalectomizados), si existiera un exudado visible se debera tratar de tocarlo con
la punta del hisopo y en cualquier caso se debe evitar el contacto del hisopo con el
paladar o la lengua, es por ello que resulta imprescindible ayudarse con un
bajalenguas.
Una alternativa recomendada ante una emergencia se debe colocar el hisopo en un
tubo estril con unas gotas de solucin fisiolgica estril o el medio de transporte.
Los medios de cultivo por utilizar deben estar a temperatura ambiente.
La siembra se realiza rotando el hisopo con muestra en una superficie de 3 x 2 cm
cerca al borde de la placa de agar sangre, manitol salado; en ese orden y con el asa se
estra por dispersin agotamiento de los cuatro cuadrantes de la placa, con el
propsito de obtener colonias aisladas e incubar los medios por 24 horas.
Los cultivos se incubaron a 37 C en atmsfera de CO2 al 5% durante 24 -48 hs para el
gnero de Streptococcus.
Con el hisopo con muestra se rota en la lmina para la identificacin de
microorganismos y diferenciacin celular microscpicamente para luego colocarlo en
caldo tioglicolato.
Revisar el cultivo observando el crecimiento tanto en los medios primarios como en
los diferenciales, as como el tipo de hemlisis en el agar sangre.
Realizar la identificacin bioqumica y microscpica as como a la vez el antibiograma
respectivo.
Sthaphylococcus. Diagnstico de Laboratorio
Las colonias de estafilococo son fciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a
3 mm o ms, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de
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MANUAL DE PRCTICAS
superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la
identificacin adems de las caractersticas de crecimiento tanto en medio lquido como
slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos
del gnero estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan
diferentes pruebas dentro de las cuales estn las siguientes.
Streptococcus y Enterococcus. Diagnstico de Laboratorio
Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de la especie; Para
iniciar la identificacin adems de las caractersticas de crecimiento tanto en medio lquido
como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite
diferenciarlos del gnero estafilococo, el cual produce esta enzima.
Resultados:
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MANUAL DE PRCTICAS
Cuestionario
Defina los diferentes tipos de hemlisis.

Escriba 5 enfermedades infecciosas producidos por Streptococcus
Staphylococcus
A que se debe el pigmento amarillento generado por Staphylococcus aureus.
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 07
DEMOSTRACIN DE TOXINAS Y ENZIMAS BACTERIANAS
Competencias:
- Identifica la presencia de toxinas y enzimas bacterianas
- Explica la presencia de txinas y enzimas bacterianas
Material:
Cepas Bacterianas
- Staphylococcus aureus
- Staphylococcus epidermidis
- Streptococcus pyogenes
- Escherichia coli
- Pseudomonas
- Neisseria
Material y reactivos
- Placas con agar sangre
- Tubos con caldo plasma
- Perxido de hidrgeno
- Reactivo Oxidasa (Clorhidrato de tetrametilparafenilendiamina)
- Pipetas automtica de 1000 uL
- Papel Filtro
- Hisopos
Procedimiento:
1. Prueba de la Catalasa:
- Colocar sobre una lmina porta objeto una gota de solucin d perxido de hidrgeno
- Colocar sobre el perxido de hidrgeno una asa de cultivo de S. aureus.
- Observar la presencia de burbujas (liberacin de oxgeno) que indican la prueba
positiva.
- Realizar el mismo procedimiento con una cepa control catalasa negativa.
2. Prueba de Oxidasa:
La prueba de oxidasa es una de las pruebas ms significativas para diferenciar ciertos
grupos de bacterias. Por ejemplo: todas las Enterobacteriaceae son oxidasa negativa y la
mayora de especies de Pseudomonas, como Neisseria son oxidasa positiva.
- Colocar sobre una lmina porta objeto o dentro de una placa petri un pedazo de papel
filtro.
- Colocar varias gotas de reactivo oxidasa sobre el papel filtro.
- Colocar una asada de cultivo de Pseudomonas o Neisseria sobre el papel con reactivo.
- Si la reaccin es de color negro o prpura oscuro indica una prueba positiva.
- Realizar el procedimiento con una cepa control negativa.
3. Prueba de la Coagulasa:
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MANUAL DE PRCTICAS
Los stafilococos patgenos producen un enzima que tiene la cualidad de coagular el

plasma sanguneo del conejo o del humano, considerndose esto como un factor de
virulencia de este microorganismo.
- Sembrar una cepa de Staphylococcus aureus en un tubo conteniendo plasma (puede
diluirse en solucin salina 1:4)
- Incubar a 37 C durante 1-4 horas. Realizar lecturas cada 30 minutos, observando la
formacin de cogulos de fibrina.
- Si no se observa cogulo al cabo de 4 horas dejarlo incubar por 24 horas.
- Realizar el mismo procedimiento con la cepa de S. epidermidis.
- Observar y esquematizar.
4. Demostracin de hemolisinas:
Las hemolisinas son toxinas que tienen actividad hemoltica y puede ser de varios tipos.
La alfa hemlisis se caracterizada por la hemlisis parcial de los glbulos rojos,
observndose como un halo opaco, alrededor de las colonias, la beta hemlisis se
caracteriza por la hemlisis total de los glbulos rojos, formando un halo claro alrededor
de la colonia
- Sembrar en un placa de agar sangre una asada de un cultivo joven de Streptococcus
pyogenes por el mtodo de agotamiento por estra.
- Realizar la misma operacin con las otras cepas bacterianas.
- Tomar muestra de hisopado farngeo y sembrar en una placa de agar sangre.
- Incubar a 37 C durante 24 horas en aerobiosis y anaerobiosis.
- Observar la misma operacin con otras cepas bacterianas.
- Reconocer los tipos de hemlisis
5. Deteccin de -lactamasas:
Una betalactamasa (a veces usado con el guion: beta-lactamasa) es una enzima
producida por algunas bacterias y es responsable por la resistencia que stas exhiben
ante la accin de antibiticos betalactmicos como las penicilinas, las cefalosporinas,
monobactamicos y carbapenmicos (carbapenemasas). Todos estos antibiticos tienen
un elemento en comn dentro de su estructura molecular denominado anillo
betalactmico, un anillo qumico de cuatro tomos. Las lactamasas rompen el anillo,
desactivando las propiedades antimicrobianas de la molcula. Las betalactamasas por lo
general son producidas por bacterias Gram positivas en forma secretada. Por lo general,
las cepas resistentes a la penicilina se relacionan directamente con el porcentaje de cepas
productoras de betalactamasa.
- Agregar en un tubo 0.1ml penicilina g
- Tomar una muestra de cultivo de Staphylococcus aureus, hasta obtener una
suspensin turbia.
- Agitar 30 s, dejar reposar 1h a T ambiente.
- Agregar 2 gotas de almidn.
- Luego agregar 1 gota de solucin iodurada.
- Agitar 1 minuto
- Lectura: si decolora rpidamente, hay produccin de -lactamasas, si permanece de
color azul no hay produccin de -lactamasas.
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MANUAL DE PRCTICAS
RESULTADOS
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MANUAL DE PRCTICAS
Actividades a desarrollar
Defina: infeccin, patogenicidad, virulencia

Cules son los patrones de la virulencia?
Cules son los factores del hospedero para resistir las enfermedades?
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 08
SIEMBRA DE ENTEROBACTERIAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO
FERMENTADORES
UROCULTIVO
Fundamento:
El urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye un mtodo excelente
para cultivar la mayor parte de microorganismos que infectan el aparato urinario
Procedimiento:
Para la recoleccin de muestras de orina en nios, puede utilizarse una bolsa de
plstico estril colectora de orina. La bolsa se colocar despus de haber lavado los
genitales adhirindola a la piel por medio de un anillo adhesivo. Si no es posible
recolectar orina en los siguientes 45 minutos, deber cambiarse la bolsa por una
nueva.
En mujeres se debe higienizar la zona genital con agua y jabn, de adelante hacia atrs,
secar con toalla limpia, y se debe colocar un tapn vaginal (torunda de gasa o
algodn). Se elimina el primer chorro (10 ml.) y se recolecta en frasco estril la
fraccin siguiente (10 20 ml.) Se recomienda orinar separando los labios mayores.
En hombres se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco balano prepucial

con agua y jabn, y secar con toalla limpia. Se elimina el primer chorro (10 ml.) y se
recolecta en frasco estril la fraccin siguiente (10 20 ml.)
Se homogeniza la orina agitndose suavemente (No centrifugar).
Con ayuda de una asa bacteriolgica calibrada (0.01 ml.) se siembra en agar sangre y
Mac conkey.
Dejar en incubacin de 37C por 24 horas

Despus de transcurrida las 24 horas de incubacin.
Se retira las placas de la estufa.
Se precede a analizar, en caso de estar positiva (crecimiento de colonias).
Realizar el recuento de colonias en UFC/ml.
Proceder a la identificacin Bioqumica del microorganismo.
Clculo de resultados:
N de Colonias / ml: N colonias en 1 cm2 x 6400
Valores de referencia:
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MANUAL DE PRCTICAS
No debe encontrarse bacterias en la muestra de orina.
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MANUAL DE PRCTICAS
COPROCULTIVO
Fundamento:
Este examen se basa en el aislamiento de microorganismos causantes de malestares
estomacales por medio de la muestra de heces.
En cuanto a las indicaciones del estudio microbiolgico podemos considerar razones tanto
clnicas como epidemiolgicas. Las primeras vienen dadas por la gravedad del proceso
(deshidratacin, fiebre elevada, pus o moco en las heces) o por la susceptibilidad del paciente
(granulopenia, sida, hospitalizacin, edades extremas de la vida, sndrome hemolticourmico). En las segundas, las indicaciones las tendramos en brotes epidmicos (banquetes,
guarderas, hospitales), diarrea del viajero y en sospecha de posibles agentes con potencial
epidmico como el clera.
Procedimiento:
Las muestras deben recogerse en recipientes limpios y de boca ancha en caso de las
heces.
Para un hisopado rectal se introduce el hisopo sobrepasando el esfnter anal.
Las muestras tanto de heces como de hisopado rectal deben ser obtenidas antes de la
administracin de antibiticos o antidiarreicos.
Con el asa bacteriolgica estril colectar una asada de muestra y proceder a sembrar
por estriamiento en los Agares Mac Conkey, XLD, Salmonella-Shiguella y colocar una
alicuota de heces en el Caldo Selenito. Colocar en la incubadora por 24 horas a 37c.
Revisar el cultivo observando el crecimiento tanto en los medios primarios como en los
diferenciales.
Realizar la identificacin bioqumica
Valoracin del resultado:

El coprocultivo se realiza en los tres primeros das de la diarrea, ya que muchos organismos
entricos mueren si no se cultivan con rapidez, y porque es en este perodo en el que se
encuentran en nmero significativo en las heces. Los medios a utilizar en un estudio bsico de
heces varan de unos laboratorios a otros, pero es necesaria la utilizacin de medios
selectivos, como MacConkey (E. coli, Shigella, Aeromonas, Yersinia) o Agar Salmonella
(Salmonella, Shigella). Cualquier crecimiento de estos enteropatgenos se valorar como
positivo y se informar de la especie as como de su antibiograma, la nica excepcin la
tendramos en el crecimiento puro y abundante de Candida spp. y de Pseudomonas spp. de
difcil valoracin como patgenos, incluso en pacientes inmunodeprimidos con diarrea.
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MANUAL DE PRCTICAS
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 09
IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO
FERMETADORAS
Competencias:
- Identifica el tipo de bacterias mediante las pruebas bioqumicas.
Materiales:
- Agar TSI
- Agar LIA
- Agar Citrato de Simons
- Caldo Peptonado
- Urea
- Tubos de ensayo 10 x 13
- Asas Bacteriolgicas
- Matraces
- Balones
- Mechero Bunsen
- Autoclave
- Horno
- Estufa
Procedimiento:
- Rotular tubos de pruebas bioqumicas: TSI, LIA, MIO o SIM, Citrato, Urea.
- Sembrar en TSI: 1 picadura + superficie
- Sembrar en LIA: 2 picaduras + superficie
- Sembrar en MIO: 1 picadura en el centro
- Sembrar en Citrato: superficie
- Sembrar en UREA: superficie o en el caldo.
Interpretacin y resultados de pruebas bioqumicas

MIO
Movilidad
Prueba negativa
Crecimiento slo a lo
largo de la picadura
Descarboxilacin de
ornitina
Prueba positiva
Medio turbio,
crecimiento en todo el
medio
El reactivo de Ehrlich o
Kovac toma una
coloracin roja
Color prpura en el
fondo del medio
TSI
Fermentacin de
glucosa
Fermentacin de
lactosa y sacarosa
Prueba positiva
Fondo del medio
amarillo (A)
Inclinacin del medio
amarillo (A)
Prueba negativa
Fondo del medio sin
cambio
roja (K)
Produccin de indol
No cambia la
coloracin del reactivo
Color amarillo en el
fondo del medio
Indicador de pH
Prpura de
bromocresol pH
neutro = morado pH
alcalino = K = prpura
= descarboxilacin
positiva pH cido =
amarillo =
descarboxilacin
negativa
Indicador de pH
Rojo de fenol pH
neutro = naranja pH
alcalino = K = rojo pH
cido = A = amarillo
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MANUAL DE PRCTICAS
Produccin de gas
Burbujas o
rompimiento del
medio
Precipitado negro en el
fondo o en todo el
medio
Sin formacin de
burbujas ni ruptura del
medio
Sin precipitado negro
LIA
Descarboxilacin de
lisina
Prueba positiva
Fondo del medio color
prpura
Prueba negativa
Fondo del medio color
amarillo
Desaminacin de lisina

color rojo o vino

color morado
Produccin de gas
Burbujas o
rompimiento del
medio
Precipitado negro en el
fondo o en todo el
medio
Prueba positiva
El reactivo toma una
coloracin roja
Color azul en la tira
reactiva
Prueba positiva
color azul
Ausencia de burbujas o
rompimiento del
medio
Ausencia de
precipitado en el fondo
o en todo el medio
Prueba negativa
No
cambia
la
coloracin del reactivo
Ausencia de coloracin
Prueba positiva
Prueba negativa
Produccin de H2S
Produccin de H2S
Caldo peptonado
Produccin de indol
Oxidasa
Citrato de Simmons
Utilizacin del Citrato
como nica fuente de
carbono
UREA DE
CHRISSTENSEN
Prueba negativa
color verde
Gas = producto de la
fermentacin de la
glucosa
H2S = reaccin
enzimtica con el
tiosulfito de sodio y
citrato frrico para
formar un precipitado
negro
Indicador de pH
Prpura de
bromocresol pH
neutro = morado pH
alcalino = K = prpura
= descarboxilacin
positiva pH = cido = A
= amarillo =
descarboxilacin
negativa
Prpura de
bromocresol pH
neutro = morado pH
alcalino= R = rojo =
desaminacin positiva
pH cido = A = amarillo
= desaminacin
negativa
Gas = producto de la
fermentacin de la
glucosa
Indicador de pH
Presencia de la enzima
citocromo oxidasa
Indicador de pH
Azul de bromotimol pH
neutro = verde pH
alcalino = azul =
utilizacin del citrato
como nica fuente de
carbono
Indicador de pH
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MANUAL DE PRCTICAS
Hidrlisis de la Urea

color rosa

sin cambio de color o
amarillo
Rojo de fenol pH
neutro = amarillo o
ligeramente rosa pH
alcalino = rosa =
hidrlisis de la urea
positiva pH cido =
amarillo o sin cambio =
hidrlisis de la urea
negativa
Resultados:
Especie bacteriana:
TSI
CITRATO
LIA
UREA
MIO
Especie bacteriana:
TSI
CITRATO
LIA
UREA
MIO
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MANUAL DE PRCTICAS
Especie bacteriana:
TSI
CITRATO
LIA
UREA
MIO
Especie bacteriana:
TSI
CITRATO
LIA
UREA
MIO
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 10
ACCIN DE LOS AGENTES FSICOS Y QUMICOS SOBRE EL DESARROLLO
BACTERIANO
Competencias:
- Demuestra la accin de los agentes fsicos y qumicos sobre las bacterias.
- Identifica las bacterias con resistencia a los agentes fsicos y qumicos.
Material:
- Cultivo de Cepas Bacterianas
- Agar Nutritivo
- Caldo Nutritivo
- Alcohol 70%
- Formol al 10%
- Fenol al 10%
- Leja (Hipoclorito de sodio al 5%)
- Bao mara
- Lmpara de Luz UV
Procedimiento:
1. Accin de los agentes qumicos:
- Colocar en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones desinfectantes. Alcohol al 70%,
Formol al 10%, Fenol al 1% y Leja; luego agregar a cada tubo 0.5 de mL de un cultivo
bacteriano
- Mezclar y someterlas a diferentes periodos de tiempo: 5, 15, 30, 60 minutos.
- Despus de cada exposicin de tiempo, repicar los cultivos en placas de Agar nutriente
- Incubar los cultivos durante 18 a 24 horas.
- Leer los resultados
2. Accin de la temperatura:
- Sembrar las cepas bacterianas en tubos con caldo nutriente e incubar a 37 C durante
18 a 24 horas.
- Someterlos a temperatura de ebullicin durante los siguientes periodos de tiempo: 1,
5, 15 y 30 minutos.
- Despus de cada exposicin repicar los cultivos sobre placas con Agar nutriente.
- Marcar y llevar los cultivos a incubar a 37 C durante 18 a 24 horas.
- Leer los resultados.
3. Accin de la luz ultravioleta (UV):
- Sembrar las cepas bacterianas en Agar nutritivo.
- Exponer las placas (retirando la tapa) a la accin de la luz Ultravioleta a una distancia
de 30 cm, durante diferentes periodos de tiempo: 30, 60, 120 y 240 segundos.
- Tapar las placas e incubarlas a 37 C durante 24 horas.
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MANUAL DE PRCTICAS
4. Accin del pH:

- Sembrar las cepas bacterianas en tubos con caldo nutritivo a diferentes
concentraciones de pH 3, 6 y 10.
- Incubar los tubos a 37 C durante 24 horas
RESULTADOS
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MANUAL DE PRCTICAS
Actividades a desarrollar
Mencione el fundamento de la accin de cada uno de los agentes fsicos y qumicos sobre el
desarrollo bacteriano.
Mencione aplicaciones de la Luz UV en con el control microbiano.
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 11
MICOLOGA GENERAL
Competencias:
- Reconoce las caractersticas morfolgicas de los hongos.
- Realiza aislamiento de diferentes tipos de hongos.
Materiales:
-
Lminas fijas
Muestra vegetales, frutos, pan otros afectados por hongos
Agar Sabouraud
Hidrxido de potasio al 10% y 40%
Azul de algodn lactofenol
Bistur, pinzas y asa micolgica
Laminas y laminillas
Mechero
Microscopio
Procedimiento:
a. Estudio de la morfologa Celular de los hongos:
- Se preparan montajes en fresco con azul de algodn o hidrxido de potasio a partir
de muestras conteniendo hongos.
- Se observarn lminas fijas al microscopio utilizando lentes objetivos secos.
- Los hongos unicelulares deben observarse al microscopio con lentes objetivos de
inmersin
- Esquematizar
b. Estudio macroscpico de las colonias de hongos:
- Observar y describir las caractersticas de las colonias de hongos cultivados en
placas y tubos de Agar Sabouraud.
- Esquematizar
c. Cultivo de hongos:
- Para cultivar hongos ambientales se deber exponer una placa petri con agar
sabouraud al medio ambiente y dejar 5 minutos.
- Luego incubar a 23 C o temperatura ambiente durante 7 a 14 das
- Observar las caractersticas de las colonias y estudiar su morfologa celular.
- Esquematizar
- Para cultivar hongos patgenos, se deber obtener la muestra asptica (escamas,
pelo, uas tejidos vegetales, etc.) y colocar una porcin de la muestra con la ayuda
de una pinza o el asa micolgica sobre una placa petri con agar sabouraud.
- Cuando se trata de esputo, secreciones u otros fluidos, la siembra se realiza con el
asa bacteriolgica por el mtodo de estriado.
- Incubar las placas a temperatura ambiente y a 37 C durante 7 das. Las levaduras
patgenas desarrollarn despus de 24 horas de incubacin.
- Observar y esquematizar
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MANUAL DE PRCTICAS
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MANUAL DE PRCTICAS
ACTIVIDADES A DESARROLLAR
Diferencias entre levadura y moho.
Qu se entiende por patgenos oportunistas?
A qu se de la accin patgena de los dermatofitos?
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MANUAL DE PRCTICAS
PRCTICA N 12
PARASITOLOGA
Competencias:
- Identifica los principales endoparsitos del mbito de salud.
- Reconoce la morfologa de principales helmintos de importancia clnica.
Materiales:
Lminas o portaobjetos
Laminillas o cubreobjetos
Lugol
Solucin salina
Placas esto
Microscopio
Procedimiento:
Tcnica de diagnstico coproparasitolgico:
Solucin Salina Fisiolgica:
Observacin microscpica: Formas mviles, de los parsitos, estructuras sin color.
Lugol:
Observacin de detalles finos de los parsitos: ncleo, vacuolas y flagelos.
PROTOZOOS
Son organismos eucariotas, microscpicos constituidos por una clula, que es una unidad
biolgica compleja, sumamente integrada; provista de membrana celular, lipoproteica, que
cumple un papel esencial en el control de las concentraciones intracelulares.
Se distingue el citoplasma o citosol, parte importante en el que se encuentran estructuras
fibrilares y vacuolas nutritivas o excreticias y el ncleo, en nmero de uno o ms, conteniendo
cromosomas en los que est presente el material gentico (ADN).
Algunas especies presentan organelos especiales como citostoma, flagelos o cilios que
cumplen funciones importantes.
Los protozoos importantes para el hombre son las amebas, los flagelados, los ciliados y los
esporozoarios. La reproduccin binaria es caracterstica de amebas, flagelada y ciliada, en
cambio la reproduccin sexual es propia de los esporozoarios.
AMEBAS:
Entamoeba histolytica. OBSERVE trofozoitos y quistes en preparaciones microscpicas de
heces humanas, teidas con Hematoxilina frrica. Reconozca el ncleo esfrico con cariosoma
central y cromatina fina adosada a la pared interna de la membrana nuclear. Diferencie el
trofozoito con un ncleo del quiste que posee de 1 a 4 ncleos y barras cromidiales.
Entamoeba coli. OBSERVE en preparaciones coloreadas y en nuestra preservadas trofozoitos
provistos de un ncleo; diferencie en este el cariosoma excntrico y la cromatina gruesa
adosada a la membrana nuclear. Identifique quistes provistos con ms de 4 ncleos.
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MANUAL DE PRCTICAS
K. cariosoma
f. Vacuola Digestiva
n. ncleo
ect. Ectoplasto
end. Endoplasma
Blastocystis hominis: es ms frecuente observar quistes de 5 a 10 micrones, de forma

redondeada o irregular con doble membrana y grnulos perifricos entre las dos membranas.
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MANUAL DE PRCTICAS
Giardiosis:
Infeccin parasitaria causada por Giardia lamblia, protozoo flagelado que tiene por hbitat el
intestino delgado, principalmente duodeno del hombre y de algunos animales.
Trchomoniasis:
La tricomoniasis es causada por un protozoo unicelular llamado Trichomonas vaginalis. Se
transmite durante la relacin sexual.
HELMINTOS
El trmino helminto, que significa gusano, se usa sobre todo en parasitologa, para referirse a
especies animales de cuerpo largo o blando que infestan el organismo de otras especies.
Las helmintiasis son enfermedades parasitarias en las que una parte del cuerpo est
infestada de gusanos, como lo son las lombrices intestinales, solitarias o gusanos redondos.
Comnmente los gusanos residen en la va gastrointestinal pero tambin se pueden encontrar
en el hgado, msculos y otros rganos.
Ascariosis
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MANUAL DE PRCTICAS
La ascariosis es una infestacin parasitaria provocada por el helminto o lombriz intestinal

Ascaris lumbricoides. La ascariosis es la infeccin humana provocada por lombrices ms
frecuente en el mundo. Las lombrices macho adultas miden de 15 a 25 cm de longitud, y las
hembras adultas de 25 a 35 cm.
Enterobiasis
La enterobiasis es una infeccin por el verme Enterobius vermicularis. Se trata de un
nematodo parsito del orden Rhabditida. La enfermedad suele referirse, pero con menos
precisin, como oxiuriasis, en referencia a la familia Oxyurudae a la que pertenece el gnero
Enterobius.
Fasciolasis
Fasciola estodos o duela del hgado es una especie de platelminto trematodo (duela) de la
subclase Digenea, caracterizado por su forma lanceolada, con dos ventosas, una bucal y otra
ventral, y un ciclo biolgico con dos generaciones (digeneo) en dos hospedadores, un molusco
gasterpodo anfibio y un mamfero. Es parsito de los canales biliares y la vescula biliar de
herbvoros y omnvoros, incluido el hombre; es el agente causal de una de las parasitosis ms
difundidas del ganado, la fasciolasis (o fasciolosis), que es considerada como una de las
enfermedades parasitarias ms importantes del mundo de los rumiantes domsticos.
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MANUAL DE PRCTICAS
Fasciola heptica
Teniasis
La teniasis es una enfermedad parasitaria intestinal causada por las formas adultas
de estodos del gnero Taenia. En el ser humano la teniasis es producida por Taenia solium o
Taenia saginata, comnmente conocidas como lombrices solitarias, porque, dado su gran
tamao, suele encontrarse un nico individuo parsito en el intestino de las personas
infestadas. Las tenias, cuyos adultos son hermafroditas, requieren de un husped
intermediario para cumplir su ciclo biolgico: el cerdo y el jabal, en el caso de la Taenia
solium, y el ganado vacuno para la Taenia saginata. El ser humano puede ser tambin
hospedero accidental del metacestodo, es decir la forma larvaria o intermedia de la T. solium,
en cuyo caso se desarrolla la enfermedad conocida como cistecercosis.
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MANUAL DE PRCTICAS
Himenolepiasis
Himenolepiasis, infeccin por la tenia enana, hymenolepis nana, tenia de la rata o infeccin por
tenia es la infestacin por una de las dos especies de tenia: Hymenolepis nana o Hymenolepis
diminuta.
La hymenolepis habita en los climas clidos y es comn en el sur de los Estados Unidos. Los
huevos de estos gusanos son consumidos por insectos.
Los humanos y otros animales resultan infectados cuando voluntaria o involuntariamente
consumen material contaminado por insectos. En una persona infectada, el gusano puede
completar su ciclo total de vida en el intestino, de manera que la infeccin puede persistir
durante aos.
En los humanos, las infecciones con Hymenolepis nana son mucho ms comunes que las
infecciones con Hymenolepis diminuta. Anteriormente, estas infecciones eran comunes en el
sudeste de los Estados Unidos y han sido descritas en ambientes de hacinamiento y en
personas recluidas en instituciones. Sin embargo, la enfermedad se presenta en todo el
mundo.
Hymenolepis nana
Hymenolepis diminuta
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MANUAL DE PRCTICAS
Artrpodos
Los artrpodos son animales invertebrados con patas articuladas, estructuras que otorgan el
nombre al Phylum.
El cuerpo est dividido en tres regiones que pueden estar diferenciados o no. Cuando estn
claramente diferenciadas las regiones, ellas son cabeza, trax y abdomen, sin embargo, las dos
primeras regiones pueden estar fusionadas constituyendo el cefalotrax y abdomen. En el
primer caso tenemos como ejemplo a los insectos y el segundo caso se hallan por ejemplo las
araas.
Un caso aparte lo constituyen los caros y las garrapatas, los que presentan una organizacin
corporal muy particular en que es difcil diferenciar las regiones.
El desarrollo de los artrpodos desde huevos a adultos, se efecta a travs de las mudas, que
consisten en la eliminacin de la cutcula, revestimiento externo del ectoesqueleto que no
tiene elasticidad.
Algunos grupos presentan variacin en el aspecto externo durante su desarrollo
caros
Los caros que son de tamao diminuto y algunos microscpicos, al igual que las garrapatas
que son relativamente grandes, presentan un cuerpo globoso en que se pueden distinguir, una
porcin anterior pequea denominado gnathosoma o captulo, el que comprende los
quelceros trisegmentados conformando pinzas y lateralmente a estos estn lo pedipalpos.
Los quelceros de las especies de caros predatores sirven para triturar, pero en especies
parsitas estn modificados para picar. La parte posterior denominada idiosoma, tiene en la
parte antero- ventral cuatro pares de patas.
Escabiosis
La especie Sarcoptes scabiei. Var. Hominis, causa la sarna humana, pero otras especies de
caros tambin pueden acarosis.
Pediculosis
Comprende al piojo del hombre Pediculus humanus, el que se presenta en dos variedades,
Pediculus humanus var. Capitis y Pediculus humanus var. Corporis (conocido por algunos
autores como vestimenta) y que trasmite en nuestro pas a Rickettsia prowasecki bacteria que
ocasiona el tifo epidmico. Cada una de estas variedades se localiza en la cabeza y en el
cuerpo, respectivamente. Esta ltima cuando reposa se halla en la vestimenta. Puede
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MANUAL DE PRCTICAS
comprenderse dentro de la pediculosis al piojo de la zona pblica o ladilla Phthirus pubis, sin
embargo, su infestacin es tratada por algunos autores como Ptiriasis.
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Cuestionario:
Qu tipo de protozoarios estn asociados a diarreas?
Qu tipo de histoparsitos se conocen en la actualidad?
Qu especies de Plasmodium son causantes de malaria en el Per?
A qu se debe la cistecercosis?
A qu se debe la babesiosis?
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MANUAL DE PRCTICAS
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Arenas R. Micologa mdica ilustrada 4 edicin. Editorial McGraw Hill Mexico,
2013. 417 p.
2. Ausina V, Moreno S. Tratado SEIMC Enfermedades Infecciosas y Microbiologa
Clnica 2 Edicin. Madrid, Editorial Panamericana. 2006. 1628 p.
ISBN: 9788479039219
3. Basualdo JA, Coto CE, De Torres RA. Microbiologa Biomdica 2a edicin
Editorial Atlante S.R.L Espaa 2006. 1537 p.
4. Brooks G, Batel J. Stephen M. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg.
16a edicin. Mxico. Editorial Manual Moderno. 2005. 790 p.
5. Ingrahan C, Ingrahan J. Introduccin a la Microbiologa 1 Edicin Barcelona.
Editorial Reverte 1999. 408p.
6. Koneman EW, Allen S. Koneman Diasgnstico microbiolgico. Ed. Mdica
Panamericana. 2008
7. Madigan M, Martinco J, Parker J. Brock Biologa de los Microorganismos, 10
Edicin, Madrid, Editorial Pearson, 2003, 1015 p.
8. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Microbiologa mdica. 6 edicin. Elsevier
Espaa. 2009.
9. Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Introduccin a la Microbiologa. 9na edicin.
Buenos aires. Ed. Mdica Panamericana. 2007
10. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. Microbiologa. 5 edicin. Editorial McGraw-Hill
Interamericana, 2003.
11. Rodrguez EG. Parasitologa mdica. 1 edicin. Editorial El Manual Moderno.

2013. 383 p.
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MANUAL DE PRCTICAS
ANEXOS
Imgenes de referencia Micologa
Alternaria
Cladophialophora
Cunninghamella
Aspergillus niger
Aspergillus
Cunninghamella
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MANUAL DE PRCTICAS
Curvularia
Lichtheimia
Microsporum canis
Exserohilum
Histoplasma capsulatum
Mucor
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MANUAL DE PRCTICAS
Nigrospora
Sporothrix
Epidermophyton floccosum
Scopulariopsis
Syncephalastrum
Trichoderma
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MANUAL DE PRCTICAS
Trichophyton mentagrophytes
Candida albicans
Trichophyton tonsurans
Rhizopus
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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE ENFERMERA

AUTOR: MSc. Orlando Prez Delgado

DATOS DEL ESTUDIANTES

: Bioseguridad, manejo de residuos, material y equipos de laboratorio

: Tincin bacteriolgica: Tincin Gram y Ziehl-Nielsen, morfologa

: Medios de Cultivo y tcnicas de siembra

: Prueba de suceptibilidad antimicrobiana antibiograma

: Aislamiento e Identificacin de Staphylococcus y Streptococcus

Prctica 07 : Demostracin toxinas y enzimas bacterianas.

: Siembra de Enterobacterias y bacterias gram negativas no

: Identificacin de Enterobacterias y bacterias gram negativas no

: Accin de los agentes qumicos y fsicos en el crecimiento bacteriano

Reconoce las normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa

NORMAS BASICAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

NIVELES DE BIOSEGURIDAD (GRUPOS DE AGENTES DE RIESGO)

MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

De Seguridad: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo

De Advertencia: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja.

De Obligacin: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.

GESTIN EN MANEJO DE RESIDUOS INTRAHOSPITALARIOS

1. Generalidades: La gestin de residuos debe ser considerada como una parte

2. Clasificacin de los Residuos segn su Peligrosidad:

3. Manejo de Residuos Slidos:

Residuos Biocontaminados: Color roja.

1. Mencione 5 tipos de residuos biocontaminados, 5 especiales y 5 comunes, en

3. Seale que institucin norma la Bioseguridad en las reas de salud de nuestro

RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO

Placas Petri: Son cajas cilndricas, constituidas por una tapa

Graduadas: Se caracterizan por presentar un nmero fraccin donde el numerador representa el

Pipetas No Graduadas: Llamadas tambin pipetas Pasteur, son fabricadas con

Matraz Erlenmeyer: Son frascos de

Balones: Son frascos de vidrio de

Baguetas o Agitadores: Son varillas

Lminas porta y cubre objetos:

Frascos goteros: Son frascos de

Gradillas: Sirven para colocar los

Bao Mara: Es un recipiente de forma rectangular, que est constituido en su

Horno Pasteur: Es un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco.

Centrfugas: Son aparatos diseados para

Vortex o Agitador de tubo:

Limpiar el rea de trabajo.

Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo.

Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin

Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.

COLORACIN ALCOHOL-CIDO RESISTENTE TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN

En una lmina limpia, colocar una gota de la muestra y realizar el frotis.

Qu diferencias exite entre bacterias gram positivas y gram negativas?

Para qu se necesita el aceite inmersin?

En 10x examinar calidad global del frotis, color y distribucin de clulas, la

revisarse con rapidez en busca de cualquier clula anormal grande o incluso

una gota de 30-40 mL).

Agar Manitol Salado

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a

Caractersticas del medio

huevo ntegro, evitando la formacin de burbujas de aire

La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Color del medio

Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio

Defina los diferentes tipos de hemlisis.