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c a p t u l o
Tipos de marcadores
genticos y mtodos
de determinacin
de genotipos
Marcadores genticos: Definiciones y conceptos bsicos

El genoma nuclear humano comprende aproximadamente 3.200.000.000 nucletidos de cido desoxirribonucleico (ADN) empaquetados en molculas
lineales de ADN, cada una contenida en un cromosoma
diferente (Brown, 2002) (ver pgina web http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html para estadsticas
generales sobre el genoma humano). Los cromosomas
consisten en 22 autosomas y 2 cromosomas sexuales
(X e Y). La inmensa mayora de las clulas nucleadas
del organismo humano son diploides y poseen dos copias de cada autosoma ms dos cromosomas sexuales
(XY en hombres y XX en mujeres), lo que lleva a un total
de 46 cromosomas en cada clula. Estas clulas son
las llamadas somticas, en contraste con las clulas de
la lnea germinal (gametos) que son haploides y slo
tienen 23 cromosomas. En las clulas somticas, los
cromosomas se organizan en pares llamados pares homlogos (uno heredado desde la madre y otro desde
el padre) que contienen la misma sucesin de genes y
marcadores genticos. Sin embargo, la secuencia nucleotdica de estos genes no siempre es exactamente
igual en los genes del cromosoma paterno respecto a
los genes del cromosoma materno debido a la existencia de variaciones genticas. A lo largo de este libro,
se asumir por parte del lector un conocimiento bsico
de la estructura y funcin del ADN, en especial en referencia a la secuencia especfica de nucletidos adenina
(A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), que define
la informacin gentica contenida en el genoma. La
secuencia nucleotdica en el genoma nuclear se organiza de forma general en secuencias relacionadas con
Epidemiologa gentica (int).indd 55
genes (secuencias codificantes, promotoras, intrones,

UTRs) y no-codificantes (repetitivas o no repetitivas).
Un porcentaje sensible del genoma estara compuesto por las llamadas duplicaciones segmentarias o duplicones. Las duplicaciones segmentarias se definen
como fragmentos de ADN mayores de 1 Kb, que se
encuentran ms de una vez en el genoma, ya sea en
un mismo cromosoma o en diferentes cromosomas, y
que comparten una identidad de secuencia superior al
90% (Emanuel y cols., 2001). Hay que mencionar que
el proyecto ENCODE (The ENCODE Project Consortium,
2007) ha revelado una gran actividad transcripcional
y una gran complejidad en los elementos funcionales
del genoma, que van mucho ms all de las originales
visiones del gen como unidad discreta de la herencia
(Gerstein y cols., 2007). El examen conjunto de los
diferentes tipos de variaciones genticas, junto con el
anlisis funcional del genoma, ser decisivo en el futuro prximo para estimar la contribucin de la gentica
frente a la susceptibilidad a desarrollar enfermedades,
as como al estudio de la diversidad gentica humana
(Redon y cols., 2006; Wong y cols., 2007; The ENCODE
Project Consortium, 2007).
El material gentico humano tambin incluye la
presencia del ADN mitocondrial (ADNmt). El ADNmt se
diferencia claramente del ADN nuclear debido a su localizacin en un organelo citoplasmtico, su alta tasa de
mutacin, su reducido tamao (incluye slo 37 genes
en algo ms de 16.500 nucletidos) y en la disposicin
continua de sus genes (Anderson y cols., 1981). Se han
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Epidemiologa gentica
descrito diferentes haplogrupos del ADNmt que se han

relacionado con grupos tnicos y con susceptibilidad a
enfermedades comunes (Moraga y cols., 2000; Huerta y
cols., 2005). El ADNmt se hereda por va materna, lo que
significa que las enfermedades mitocondriales presentan una herencia desde la madre hacia la progenie en un
patrn vertical no mendeliano. El ADNmt se caracteriza
por presentar poliplasmia, lo que significa que existe un
alto nmero de copias de ADNmt tanto por mitocondria
(entre 2 y 10 copias) como por nmero de copias por
clula (entre 1.000 y 100.000 copias de ADNmt por clula en la mayora de los tejidos). En humanos, se ha
descrito tambin la existencia de heteroplasmia o coexistencia de diferentes mutaciones en el ADNmt dentro
de un mismo sujeto, lo que se ha asociado generalmente con la severidad de ciertas enfermedades mitocondriales (Chinnery y cols., 2000; Strachan y Read, 1999).
Las diferencias que ocurren en la secuencia de ADN
en una localizacin gentica determinada (locus gentico; en plural loci) dan lugar a diferentes versiones de
un gen que se denominan alelos. Por tanto, un alelo
se define como cada una de las formas alternativas de
un gen que pueden existir en una localizacin especfica o locus. En los genes localizados en autosomas,
cada persona tiene dos copias o versiones del mismo
gen: una copia proviene del padre y otra proviene de la
madre. Cuando en un mismo locus gentico no hay diferencia de secuencia entre la copia heredada del padre
y la copia heredada de la madre, se dice que el sujeto
es homocigoto en esa posicin (posee dos copias del
mismo alelo), mientras que si coexisten dos alelos diferentes dentro de un mismo sujeto en ese locus, se
dice que el sujeto es heterocigoto. Cuando en la poblacin existen al menos dos alelos, y ambos relativamente frecuentes en la poblacin (con frecuencia de
al menos el 1% al 2% en el alelo menos frecuente),
se dice que existe polimorfismo en ese locus (Vogel y
Motulsky, 1997). En esta situacin, existe ms de un
genotipo en la poblacin (genotipo = combinacin de
alelos en un locus gentico), siendo el nmero de genotipos posibles dependiente del nmero de alelos que
existan para ese gen, mientras que el nmero de genotipos observados en un grupo de sujetos depender del
nmero de alelos existentes y de su frecuencia relativa
en la poblacin. Cuando slo existen variantes genticas raras (definidas arbitrariamente como frecuencia
menor del 1% al 2% en la poblacin) (Vogel y Motulsky, 1997), generalmente se habla de una mutacin
en lugar de un polimorfismo, especialmente si esta

variante rara desemboca inevitablemente en una enfermedad. En cualquier caso, existe en la literatura gentica y epidemiolgica cierta inconsistencia sobre el uso
de los trminos mutacin y polimorfismo (Cotton,
2002). En un sentido clnico, tambin se usa el trmino
mutacin para referirse a alelos que conducen a un
fenotipo patolgico severo, mientras que los cambios
en la informacin gentica que no producen efecto visible sobre la enfermedad se denominan comnmente
polimorfismos. Este tipo de denominaciones corre en
paralelo con la clsica definicin de polimorfismo que
se refiere a los cambios genticos que se encuentran al
menos en el 1% de la poblacin. En general, las variantes genticas muy abundantes tienen frecuentemente
un sentido clnico escaso o nulo, por lo que ambas
definiciones (clnica y clsica) coinciden en muchos
casos (Cotton, 2002).
El examen exhaustivo de la estructura del genoma
humano est fuera del alcance de este libro. Por el contrario, en el presente captulo y en adelante, nos centraremos en la descripcin de la naturaleza y el uso de los
marcadores ms comnmente empleados en estudios
de epidemiologa gentica, que son los marcadores microsatlites (STR) y los polimorfismos simples de cambios de una sola base (SNP). Se mencionar tambin
otros tipos de polimorfismos genticos, tales como repeticiones en tndem de tipo minisatlite (Mata y cols.,
2004), pequeas inserciones/deleciones (INDELS)
(Mills y cols., 2006) u otros polimorfismos particulares
como la variacin gentica en la regin HLA (acrnimo
del trmino Human Leukocyte Antigen) (Undlien y cols.,
2001). Para efectos netamente pedaggicos, usaremos
la terminologa de alelo M (mutado) y N (normal) para
designar loci genticos causantes de enfermedad en
patologas mendelianas (definiendo genotipos NN, NM
y MM). En enfermedades multifactoriales, usaremos la
terminologa de alelo S (o alelo de susceptibilidad) y
alelo N (normal) para loci biallicos que otorgan susceptibilidad frente a enfermedades multifactoriales
(genotipos NN, NS o SS). Para loci biallicos que aparentemente no estn relacionados de forma causal con
enfermedades, se usar la terminologa de alelos A y
a o alelos B y b para loci biallicos, (genotipos
del tipo aa, Aa y AA o bb, Bb y BB). En loci multiallicos (por ejemplo, marcadores de tipo microsatlite),
se usar la terminologa de alelos basados en nmeros
(1, 2, 3, etc.) para expresar los genotipos 1/1, 1/3, 2/3
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CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos
etc. Dado que el ADN es una molcula lineal, es posible

definir las posiciones de las variaciones de secuencia
que existen entre individuos. Una medicin simple de la
localizacin de las variaciones genticas se refiere a la
posicin de cada variacin dentro de los cromosomas
con respecto a posiciones fijas como telmero/centrmero o brazo corto/largo del cromosoma. De forma ms
exacta, sera deseable medir las distancias directamen-
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te en pares de bases (pb). Dado que el nmero de pares

de bases es muy elevado, frecuentemente se refieren
las distancias en pares de bases como kilo-bp (1 Kb =
1.000 pares de bases) o mega-bp (1 Mb = 1.000.000
pares de bases). De forma alternativa y como se ver en
el Captulo 7: Estudios de ligamiento, es posible estimar
la distancia gentica basndose en la frecuencia de los
eventos de recombinacin.
Marcadores genticos medidos a nivel fenotpico

Aunque a lo largo de este captulo nos referiremos
fundamentalmente a la variacin gentica medida a nivel de ADN, el trmino marcador gentico se usa de
una manera amplia para definir cualquier variacin observable (fenotpica) que se deriva directamente de una
variacin subyacente a nivel de ADN. Un tipo de marcador gentico medido a nivel fenotpico es la propia
deteccin de los signos clnicos de enfermedades, tales
como la fibrosis qustica, acondroplasia, anemia falciforme, fenilquetonuria y otras enfermedades genticas
clsicas, cuyas manifestaciones clnicas son indicativas
de un defecto gentico subyacente. Por otro lado, los
marcadores genticos ms usados en dcadas pasadas eran aqullos relacionados con grupos sanguneos
(Crow, 1993) y los marcadores del sistema HLA (Hsu y
cols., 1981) determinados inicialmente mediante tcnicas serolgicas, en lugar de tcnicas basadas en la evaluacin directa del ADN. Otros ejemplos de marcadores
genticos medidos a nivel fenotpico son los alelos E2,
E3 y E4 de la apolipoprotena E (ApoE) determinados
a travs de la tcnica de isoelectroenfoque (Quiroga y
cols., 1999) o la determinacin de alelos de la enzima
aminolevulnico deshidratasa (ALA-D) determinados a
nivel de protenas (Battistuzzi y cols., 1981). Para cada
uno de estos tests fenotpicos, existe un test equivalente basado en la deteccin directa a nivel del ADN
(Yip, 2002; Infante-Rivard y cols., 2003; Santos y cols.,
2001).
Un marcador fenotpico clsico relacionado con la
presencia de una variacin gentica simple subyacente
es el test de la sensibilidad al sabor amargo al 6-propiltiouracilo (PROP) o del compuesto relacionado feniltiocarbamida (PTC). El PTC es equivalente al PROP, aunque se usa en raras ocasiones en pruebas fenotpicas
debido a su olor desagradable. La prueba de sensibili-
dad al sabor amargo del PROP clasifica a las personas

como no-gustadores (no perciben el sabor amargo
del PROP), gustadores medios y supergustadores
(Figura 4-1) (Kim y Drayna, 2004; Tepper, 1998).
Se han descrito importantes diferencias en la prevalencia de no-gustadores en diferentes poblaciones: del
3% en poblaciones africanas hasta el 40% en poblaciones asiticas (Tepper, 1998). Para determinar el nivel
de sensibilidad al sabor amargo del PROP, se aplica el
llamado test de tres soluciones (Zhao y cols., 2003)
que consiste en la administracin de tres soluciones
de PROP (0,032; 0,32 y 3,2 mmol/L) y tres soluciones
de cloruro sdico (NaCl) (0,01; 0,1 y 1,0 mol/L). Las
soluciones se sirven aleatoriamente en pares formados
por una solucin de NaCl y otra de PROP, en vasos codificados con dgitos al azar. La comparacin de niveles
de intensidad de sabor en muestras de concentraciones
pareadas de PROP y NaCl permite clasificar a los sujetos de estudio como supergustadores (Figura 4-1A)
cuando perciban el sabor amargo de las muestras de
PROP ms intenso que el sabor salado de las muestras
de NaCl; como gustadores-medios (Figura 4-1B)
cuando la percepcin es similar para las muestras de
PROP y NaCl; y como no-gustadores (Figura 4-1C)
en el caso de percibir como ms intenso el sabor de las
muestras de NaCl que el de las muestras de PROP. Para
evaluar la intensidad de sabores amargo y salado se utiliza una escala semilogartmica semntica de magnitud
sensorial (Figura 4-1D) (Santos y cols., 2006).
Se ha determinado que el gen que controla de
forma predominante la sensibilidad al sabor amargo
del PROP es TAS2R38 (GeneID = 5726; 7q34), que
pertenece a una familia de receptores de sabor (Kim y
cols., 2003). Especficamente se ha descrito que una
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Figura 4-1
Evaluacin fenotpica de la sensibilidad gentica al sabor amargo del PROP
A: Supergustador
100
NaCl
PROP
75
50
D: Escala semilogartmica semntica

de magnitud sensorial de sabor
amargo/salado
25
0
Mnimo
Mediano
Lo ms fuerte imaginable
Mximo
B: Gustador medio
100
NaCl
PROP
75
50
Muy fuerte
25
Fuerte
0
Mnimo
Mediano
Mximo
Moderada
C: No-gustador
100
NaCl
PROP
75
Dbil
Casi indetectable
50
25
0
Mnimo
Mediano
Mximo
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gran parte de la variabilidad fenotpica de la percepcin

del sabor amargo del PROP est regulada por tres SNPs
presentes en TAS2R38 que producen cambios en la secuencia de aminocidos: 145C > G (P49A), 785C >
T (V262A) y 886G > A (I296V) (Kim y cols., 2003). Se
ha propuesto que la sensibilidad al sabor amargo del
PROP podra estar relacionada con una menor acepta-
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bilidad de ciertos tipos de frutas y verduras, as como

a una mayor preferencia de alimentos ricos en grasas
(Goldstein y cols., 2005). Por tanto, la sensibilidad al
sabor amargo del PROP podra constituir un marcador
gentico relacionado con diferentes patrones de dieta
e inclinaciones hacia los alimentos (Keller y Tepper,
2004).
Obtencin de ADN genmico

En estudios epidemiolgicos, lo ms frecuente es
obtener ADN a partir de linfocitos de muestras de sangre
(Austin y cols., 1996), a partir de clulas bucales (King
y cols., 2002) o mediante muestras de saliva (Rylander-Rudqvist y cols., 2006). Generalmente la cantidad
de ADN es relativamente abundante para su uso en la
mayora de los estudios epidemiolgicos utilizando
mtodos clsicos de extraccin por fenol-cloroformo,
mtodos de precipitacin salina o kits comerciales
(Santella, 2006). Por ejemplo, el kit QIAGEN QIAamp
DNA Blood Mini Kit es capaz de extraer entre 2 y 12
g de ADN a partir de 200 L de sangre total. Adicionalmente, existen tcnicas que permiten el aislamiento
de clulas blancas de la sangre que representan el reservorio de ADN en sangre (por ejemplo, uso de gradiente de ficoll), as como tcnicas de amplificacin de
genoma completo (por ejemplo, Genomiphi DNA amplification kit), que entrega la posibilidad de generar
grandes cantidades de ADN genmico de forma simple
a partir de nfimas cantidades iniciales de esta molcula (Barker y cols., 2004; Paez y cols., 2004; Santella,
2006). Una vez extrado el ADN genmico, es necesario
evaluar la integridad y la concentracin del mismo. La
extraccin de ADN genmico de alto peso molecular es
importante para la fiabilidad de los posteriores anli-
sis genticos. La integridad del ADN genmico puede

comprobarse al cargar una pequea cantidad de ADN
en un gel de agarosa 0,8% y comparar su migracin
tras electroforesis con el marcador /HindIII: el ADN genmico de alto peso molecular debe traducirse en una
banda nica con peso molecular entre 10 y 23,1 Kb. La
concentracin de ADN genmico se puede calcular mediante mediciones espectrofotomtricas de absorbancia con longitud de onda de 260 nm (A260), mientras
que la pureza del ADN genmico se evala mediante
el cociente A260/A280, que debe situarse entre 1,7 y
1,9. La concentracin de ADN tambin puede determinarse de forma an ms sensible mediante el uso de
un fluorforo (PicoGreen) que se intercala en la doble
hebra de la molcula de ADN, permitiendo calcular su
concentracin a travs del registro de la fluorescencia a
una longitud de onda de 525 nm tras una excitacin a
470 nm (http://www.nanodrop.com). El almacenaje de
muestras debe considerar una concentracin apropiada para posteriores experimentos de amplificacin (en
nuestro laboratorio se diluyen las muestras hasta una
concentracin de 50 ng de ADN por l), y tambin debe
prevenir la contaminacin y evaporacin del ADN (Lahiri
y Schabel, 1993; Santella, 2006).
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Una vez obtenido el ADN genmico, los investigadores pueden examinar la presencia de variaciones de
secuencia que puedan ser relevantes de acuerdo a los
objetivos particulares de cada estudio. Aunque existen
mtodos de deteccin de variaciones genticas que no
estn basados en la amplificacin inicial de material
gentico (Tsuchihashi y Dracopoli, 2002), la inmensa

mayora de los estudios en epidemiologa gentica contemplan una etapa de amplificacin del ADN en los segmentos genmicos de inters a travs de la reaccin en
cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en ingls son
PCR (Polymerase Chain Reaction) (Mullis y Faloona,
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Figura 4-2
Esquema de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
A: Detalle del primer ciclo de la PCR
Inicio
5
3
3
5
Desnaturalizacin
94C
Hibridacin
Extensin
B: Primeros ciclos de la PCR
Inicio
55 a 65C
Pol
Pol
5
3
72C
3
5
Primer ciclo
Segundo ciclo
Tercer ciclo
1987). El objetivo de la PCR es obtener un gran nmero

de copias del fragmento de ADN que contiene la variacin gentica buscada mediante la repeticin de 30 a
35 ciclos consistentes en tres pasos (desnaturalizacin
a 94C, hibridacin a 52C a 65C y extensin a 72C)
y que tienen lugar en un termociclador (Lorenz y cols.,
2002; Tefferi y cols., 2002) (Figura 4-2). Tras la aplicacin de la PCR, se genera una suficiente cantidad de
copias de la secuencia deseada (producto de PCR) para
poder continuar con diferentes sistemas de deteccin
de variantes genticas. Es posible visualizar el proceso

de PCR en la pgina web http://www.sumanasinc.com/
webcontent/animations/content/pcr.html.
Como su nombre indica, la PCR se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa termorresistente
que es capaz de fabricar in vitro una cadena de ADN
complementaria a otra ya existente. Sus nicos requerimientos son el ADN genmico, nucletidos en el
medio, cofactores de la reaccin, polimerasa termorresistente (Taq polimerasa) y un buffer que contenga
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Tabla 4-1
Protocolo estndar para una PCR
Componente
Buffer PCR
Concentracin inicial
Concentracin final
Volumen
10X
1X
3 L
dNTPmix
2 Mm
0,2 mM (200 (M)
3 L
MgCl2 50 mM
50 Mm
1,5 mM
0,9 L
P1
20 M
0,5 M
0,75 L
P2
20 M
0,5 M
0,75 L
Taq
5 unidades / L
1 unidad
0,2 L
Agua
20,4 L
29 L
ADN
1 L (~ 50 ng)
~ 50 ng
cationes Mg+2, adems de un par de oligonucletidos

complementarios y flanquentes al fragmento que queremos copiar (los partidores o cebadores; en ingls
primers) (Roux 1995), y pueden disearse usando programas especficos, tales como PRIMER3 (http://frodo.
wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). La Tabla 4-1 muestra un protocolo estndar de PCR.
Una vez elegidos los primers adecuados, es aconsejable realizar una PCR virtual en el sitio web (http://
genome.ucsc.edu), que entrega el tamao y secuencia
esperado del fragmento que se amplificar por PCR.
Adicionalmente, el sitio web http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp (link: protocol-writer) sugiere un protocolo de condiciones de
amplificacin especfico para cada PCR. Tal y como se
muestra en la Figura 4-3, es importante realizar una
optimizacin de la PCR probando diferentes condiciones de los componentes de la reaccin (por ejemplo,
cambiando la concentracin de MgCl2 o incorporando
cosolventes como el BSA o el DMSO), as como diferentes temperaturas de hibridacin, lo que puede realizarse fcilmente en un termociclador con gradiente de
temperatura (Roux, 1995; Altshuler, 2006).
La Figura 4-3 muestra un gel de agarosa que
corresponde a una PCR cuyas condiciones se optimizaron al probar diferentes temperaturas de hibridacin y
diferentes concentraciones de MgCl2 para amplificar un
1 L
30 L
fragmento de 86 pares de bases de la regin promotora

del gen MC3R (Schalin-Jantti y cols., 2003). En esta
PCR, finalmente se eligi un protocolo de trabajo con
una temperatura de hibridacin de 58C a una concentracin final de 1,5 mM de MgCl2.
Adicionalmente, es posible incrementar la especificidad de la PCR mediante el procedimiento llamado
touch-down, que consiste en elegir altas temperaturas
de hibridacin en los ciclos iniciales, para despus ir
bajando paulatinamente la temperatura de hibridacin
en los ciclos sucesivos (Don y cols., 1991). Otro enfoque utiliza el procedimiento de PCR en inicio caliente (PCR Hot Start), que se realiza iniciando la reacin
al agregar la polimerasa al medio de reaccin en alta
temperatura, o alternativamente mediante el uso de polimerasas especiales que slo se activan despus del
calentamiento de la mezcla de reaccin por un tiempo predeterminado (Torok y cols., 2004). En muchos
procedimientos de laboratorio que requieren mayor eficiencia del trabajo, es deseable obtener una amplificacin simultnea de mltiples fragmentos de ADN, lo
que se puede conseguir a travs de un estricto control
de la temperatura de hibridacin, la compatibilidad de
los diferentes primers en una reaccin comn de PCR
multiplex y la compatibilidad de las regiones amplificadas de modo que no se solapen en la electroforesis
(Markoulatos y cols., 2002).
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Figura 4-3
Optimizacin bsica de una PCR
MgCl2 1,5 mM
MgCl2 2,5 mM
Fragmento de 86 pb
54
58
61
63
54
58
61
63
L50
Temperatura de hibridacin (C)
Tipos de marcadores genticos comnmente usados en estudios

de epidemiologa gentica
Pequeas inserciones/deleciones
(INDELs)
Se ha descrito un elevado nmero de polimorfismos de variantes genticas consistentes en pequeas
inserciones/deleciones (INDELS) (Mills y cols., 2006),
tambin llamadas en ocasiones polimorfismos DIP
(acrnimo de Deletion-Insertion Polymorphims). En general, las inserciones de pequeo tamao encontradas
en el genoma humano bsicamente consisten en:
Inserciones/deleciones de bases nucleotdicas nicas, siendo ms frecuentes las inserciones de A o T
en relacin con las inserciones de C o G.
Expansiones monomricas, donde se destaca la
insercin de (A)n.
Expansiones de 2 a 15 pares de bases.
Transposones.
Inserciones/deleciones de secuencias de ADN al
azar, con tamaos de insercin variable, aunque
ms del 99% de estas variantes descritas corres-
ponden a inserciones/deleciones de un tamao

menor a 100 pb (Mills y cols., 2006).
La base de datos de variacin gentica (http://projects.tcag.ca/variation/) (Iafrate y cols., 2004) ha descrito un total de 17.323 indels de tamao entre 100 pb
y 1 Kb (revisado en enero de 2008).
Un indel de pequeo tamao sera la insercin del
hexmero CAGACC en la posicin +2138 desde el
inicio de la secuencia codificante del gen del receptor
3 de melanocortina humano (MC3R) (Boucher y cols.,
2002). Otro ejemplo de este tipo sera la insercin de
cinco nucletidos (CTTTA) en la regin 3 no traducida
del gen del receptor de leptina humano (LEPR) (Oksanen y cols., 1998), cuyo cromatograma de secuencia
se muestra en la Figura 4-4 para los genotipos Del/Del
e Ins/Ins. Se han descrito otras inserciones/deleciones
que involucran fragmentos de ADN de mayor tamao
como el polimorfismo del gen del recepor de la hormona de crecimiento que consiste en la delecin o la
retencin del exn 3 completo de este gen (Audi y cols.,
2006).
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Figura 4-4
Insercin/delecin de CTTTA en el gen LEPR humano
30
G T
40
G
G T
G T
G T
del/del
Insercin
A
30
G T A
40
T
ins/ins
Polimorfismos de tipo microsatlite

(STR)
Los marcadores consistentes en repeticiones en
tandem de secuencias cortas de nucletidos han sido
ampliamente usados en diferentes estudios de gentica humana (Weber y May, 1989). Las repeticiones de
los mononucletidos A y T son muy frecuentes (dan
cuenta de aproximadamente el 0,3% del genoma nuclear), mientras que las repeticiones de dinucletidos
(especialmente del dinucletido CA) son relativamente
abundantes y frecuentemente son tambin polimrficas,
existiendo una alta heterocigosidad por el alto nmero
de alelos posibles. Los marcadores de tipo microsatlite, tambin llamados Short Tandem Repeats (STR) o
Short Sequence Repeats (SSR), consisten en repeticiones de nmero variable en tndem de secuencias cortas
de 2 a 6 pares de bases (por ejemplo, la repeticin del
dinucletido CA), as como otras repeticiones de trinucletidos, tetranucletidos u otras secuencias cortas
ms complejas (Butler, 2006; Beckmann y cols., 2007;
Beckman y Weber, 1992; Collins y cols., 2003; Ellegren,
2004; Subramanian y cols., 2003). Otro tipo de variacin gentica basada en repeticiones de secuencias con
los llamados minisatlites, que en general se definen
como regiones de ADN en las que existen repeticiones
en tndem de 7 a 100 bp que se extienden sobre un segmento de 0,5 a 30 Kb (Beckmann y cols., 2007; Jeffreys
y cols., 1985). Un ejemplo de marcador minisatlite es
el que se localiza en el extremo 3 del gen ApoB (Verbenko y cols., 2003). Para muchos autores, el trmino
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) es usado
frecuentemente como sinnimo de minisatlite (Verbenko y cols., 2003), mientras que para otros autores el
trmino VNTR se aplica tanto para microsatlites como
para minisatlites (Beckmann y cols., 2007).
Los microsatlites son marcadores que pueden
ser analizados mediante PCR seguida de una electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (Weber y May, 1989; Rojas y cols.,
2002), mediante la que los productos de PCR se separan atendiendo a su tamao, que depende del nmero
de repeticiones. Alternativamente, la determinacin de
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Figura 4-5
Secuenciacin y anlisis de fragmentos para el marcador microsatlite (TTTC)n del gen de la leptina
en un sujeto homocigoto (Valladares y cols., 2007)
A: Anlisis de secuenciacin
1
20
30
40
50
60
G G G G G C T C T G T T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C
10
11
12
13
70
80
90
T T T C T T T C T T T C T T T C T T T C T A A C T T T T T T G C C A G
La secuencia corresponde a un homocigoto con 13 repeticiones del tetranucletido TTTC

(tamao del producto de PCR = 157 pb).
B: Anlisis de fragmentos en electroforesis capilar

140
160
180
200
220
240 pb
161 pb
225 pb
Los marcadores de peso molecular en la electroforesis capilar se muestran en gris claro, y los alelos de la muestras
problema se muestran en negro. El genotipo corresponde a un heterocigoto con tamaos de fragmento
de 161 pb y 225 pb.
genotipos se realiza mediante electroforesis capilar de

productos de PCR con primers marcados con fluorocromos (Suazo y cols., 2005). La Figura 4-5 representa el
resultado de un anlisis de determinacin de genotipos
de un microsatlite hipervariable compuesto por la repeticin de cuatro nucletidos (TTTC)n, localizado en la
regin que flanquea el gen de la leptina (Hinuy y cols.,

2006). En la Figura 4-5A se puede apreciar la secuenciacin de un sujeto homocigoto para 13 repeticiones
del tetranucletido. En la Figura 4-5B se representa el
genotipo de un sujeto analizado a travs de electroforesis capilar, basndose en la deteccin de fluorescencia
21-10-10 3:27
con un equipo de electroforesis capilar. Otro ejemplo de

este tipo de marcadores es el microsatlite D20S32e
se encuentra en el cromosoma 20 y consiste en la repeticin de el dinucletido TG, que define seis alelos
identificables mediante productos de PCR de 115 a
125 pb segn el protocolo descrito por Yamada y cols.
(1991). En repeticiones de dinucletidos, los peak de la
electroforesis (correspondientes al tamao del producto
amplificado) presentan un caracterstico peak adicional
como resultado del llamado slippage (deslizamiento)
de la polimerasa (Clarke y cols., 2001).
Los STRs son los marcadores genticos ms utilizados en los estudios de ligamiento y en medicina forense
debido a su alta heterocigosidad y alto nmero de alelos
(Ellegren, 2004; Butler, 2006) (ver Captulo 7: Estudios
de ligamiento). El sistema de deteccin de alelos en
STR basada en fluorescencia permite adems la identificacin simultnea de fragmentos de diferente tamao,
lo que ha facilitado la determinacin de genotipos de
STR en paralelo a travs de paneles de microsatlites
(Reed y cols., 1994) (ver http://www.appliedbiosystems.com/index.cfm). En su mayora, las repeticiones cortas de nucletidos no tienen funcin biolgica
conocida y ocurren en segmentos intergnicos o en
intrones, aunque existen notables excepciones a esta
regla, como por ejemplo ciertas repeticiones de trinucletidos y su efecto causal en enfermedades como el
sndrome de X Frgil, debida a la expansin de la repeticin CGG (Kremer y cols., 1991), as como otras
expansiones de trinucletidos relacionadas con enfermedades neurolgicas, y que pueden ocurrir en regiones codificantes (por ejemplo, CAG en la enfermedad
de Huntington) (Sutherland y Richards, 1995; Mirkin,
2007). De manera interesante, la estructura repetitiva de
los microsatlites los hace propensos a deslizamientos
de la polimerasa durante la replicacin del ADN, lo que
podra generar errores de apareamiento y generacin de
pequeos bucles, que generalmente son corregidos por
el sistema de reparacin de errores de replicacin. Sin
embargo, en algunos tipos de cnceres, la maquinaria
de reparacin est alterada, generndose variaciones
genticas somticas y alelos nuevos en un fenmeno
que se conoce como inestabilidad de microsatlites
(Sreide y cols., 2006). La pgina web http://www.microsatellites.org/db_search.php permite la bsqueda de
microsatlites a lo largo del genoma humano. La herramienta Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/
trf/trf.html) es til para la localizacin de repeticiones
65
de nucletidos (Benson, 1999). La pgina web http://

www.cstl.nist.gov/div831/strbase/index.htm describe
los diferentes tipos de STR y su nomenclatura.
Variaciones en el nmero de copias

de segmentos genmicos (CNV)
Un tipo de variacin gentica consiste en variaciones estructurales en el nmero de copias de segmentos
cromosmicos amplios (mayores de 1 Kb) llamados en
la literatura Copy-Number Variations (CNV) (Komura y
cols., 2006), Copy Number Polymorphisms (CNP) (Sebat y cols., 2004) o Large-scale Copy number Variations
(LCV) (Iafrate y cols., 2004). Estas variaciones implican
la prdida o ganancia de copias de segmentos cromosmicos en sujetos normales (Carter, 2004). Se ha sugerido que alrededor del 12% del genoma estara sujeto
a este tipo de variacin en el nmero de copias (Sebat y
cols., 2004; Iafrate y cols., 2004; Redon y cols., 2006;
Wong y cols., 2007; Kehrer-Sawatzi, 2007), que podran
potencialmente afectar al equilibrio de dosis allica,
disrupcin de genes o la expresin gnica (Beckmann
y cols., 2007).
Mediante la aplicacin de tcnicas de hibridacin
genmica comparativa (CGH, acrnimo del trmino
Comparative Genomic Hybridization), PCR cuantitativa
y fiber-FISH, Iafrate y cols. (2004) encontraron que el
CNV ms frecuente observado consiste en el diferente
nmero de copias de un segmento que comprende los
genes de la amilasa salival y pancretica AMY1A y AMY2A situados en 1p2.1 (el 23,6% de ganancias relativas
y el 25,5% de prdidas relativas en relacin a la secuencia de referencia). Perry y cols. (2007) mostraron que el
nmero de copias del gen de la amilasa salival AMY1
se correlaciona de forma significativa con los niveles
de la a-amilasa en saliva, lo que implica la importante
potencial contribucin de los CNV en rasgos que presentan variacin interindividual. Las pginas web http://
projects.tcag.ca/variation/ y http://www.sanger.ac.uk/
PostGenomics/decipher/, contienen bases de datos de
variaciones estructurales del genoma que incluyen indels y CNVs.
Tanto los CNV como las sustituciones simples de
nucletidos (SNPs) se distribuyen ampliamente a lo largo del genoma. Aunque la frecuencia de eventos individuales de los SNPs es mucho mayor que la de los CNV
(http://www.hapmap.org), cada evento de CNV afecta
amplios segmentos genmicos mientras que cada SNP
21-10-10 3:27
66
Figura 4-6
Determinacin del nmero de copias variables del gen de la amilasa salival (AMY1)
en ensayos SYBR-Green de PCR de tiempo real
18.779
17.279
15.779
Fluorescencia (483-533)
14.279
12.779
11.279
9.779
8.279
Fase exponencial
PCR
6.779
5.279
3.779
25 ng
2.279
0.779
10 12
14 16 18 20 22 24 26
Ciclos
afecta a un solo nucletido, por lo que la variacin genmica humana estara fuertemente influenciada tanto
por la variabilidad en los SNPs como por la variabilidad
en CNVs. Se ha sugerido tambin que la existencia de
CNVs podra constituir un determinante importante en
la explicacin de la penetrancia reducida de enfermedades genticas clsicas (Beckmann y cols., 2007),
mientras que el impacto de los CNV sobre las enfermedades humanas de etiologa multifactorial ha sido an
escasamente explorado (Gonzlez y cols., 2005; Redon
y cols., 2006; Shelling y Ferguson, 2007; Beckmann y
cols., 2007; McCarroll y Altshuler, 2007). En uno de los
primeros estudios epidemiolgicos de asociacin CNV y
rasgos complejos, se ha determinado la posible existencia de asociacin entre el nmero de copias del gen de
la beta-defensina (rango de variacin habitual: 2 a 7 copias) y la presencia de psoriasis (Hollox y cols., 2008).
En relacin a la deteccin de CNVs, se ha propuesto el uso de tcnicas de microarrays de CGH de
28 30 32 34 36
12.5 ng
6.3 ng
3.13 ng
1.6 ng
alta resolucin para el escaneo de CNVs en el genoma

completo, as como otras tcnicas enfocadas a evaluar
la variabilidad de CNVs en regiones cromosmicas
delimitadas (Komura y cols., 2006; Beckmann y cols.,
2007). Perry y cols. (2007) aplicaron tcnicas de PCR
de tiempo real para determinar el nmero diploide de
CNV y tcnicas de hibridacin in-situ con fluorescencia
de alta resolucin (Fiber FISH) para determinar el nmero de repeticiones presentes en cada cromosoma. La
Figura 4-6 muestra la determinacin de CNV del gen
de la amilasa salival usando tcnicas de PCR de tiempo
real (Santos y cols., 2009). Por otro lado, tambin se ha
descrito la tcnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) y MLGA (Multiplex Ligation
dependent Genome Amplification) (Isaksson y cols.,
2007) para la deteccin de inserciones/deleciones, con
potencial aplicacin a CNV (Schouten y cols., 2002;
White y cols., 2007). Especficamente, MLPA se utiliz
inicialmente para la deteccin de deleciones/duplicaciones como las que ocurren en el gen de la distrofina,
21-10-10 3:27
LI-1
119
LE-1
Pos. 183: Ile183Asn

(548T>A)
Pos. 81: Val81Ile

(241G>A)
rs3827103
60
LI-2
Citoplasma
180
LE-2
Medio extracelular
241
300
30
LI-3
LE-3
RTM
Pos. 6: Thr6Lys
(17C>A)
rs3746619
COOH
360
3,8 ; 4,5
1,8 ; 2,8
1,3 ; 0,4
4,5 ; 3,2
1
NH2
ndice de hidrofobicidad
LE: Loop extracelular

LI: Loop intracelular
RTM: Regin transmembrana
Pos. 311: Ser311Cys

(931T>A)
rs17847261
Figura 4-7
Variantes genticas en la regin codificante del receptor 3 de melanocortina humano (MC3R)

67
21-10-10 3:28
68
y que son causantes de distrofias musculares (Lalic y

cols., 2005). MLPA se basa en el uso de sondas de tamao variable que hibridarn en diferentes posiciones,
se ligarn entre s, y posteriormente se amplificarn
utilizando primers comunes, lo que permita visualizar
la presencia de deleciones/inserciones y CNVs (http://
www.mlpa.com). Finalmente, tambin se ha sugerido el
uso de SNPs como marcadores secundarios de la presencia de CNV basados en el patrn de desequilibrio
de ligamiento existente entre SNPs y CNVs (McCarroll
y Altshuler, 2007).
Polimorfismos de cambios de una sola

base (SNP)
Los marcadores genticos ms abundantes en el
genoma humano son los SNPs (acrnimo del trmino
en ingls Single Nucleotide Polymorphism) o sustituciones simples de una sola base nucleotdica, que
ocurren aproximadamente con una frecuencia de 1 SNP
por cada 100 a 1.000 pares de bases (Morton, 2005)
(dbSNP database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects
/SNP/; SNPedia http://www.snpedia.com). La pgina web de la base de datos dbSNP (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi) muestra
las estadsticas bsicas del nmero de SNPs descritos
en diferentes especies, mientras que la base de datos
HapMap (http://www.hapmap.org) contiene, hasta el
ao 2007, ms de 3,1 millones de SNPs validados y
evaluados en diferentes grupos tnicos (The International HapMap Consortium, 2007). Los SNPs incluyen
las transiciones purina-purina (AG) o pirimidina-pirimidina (CT) y las transversiones purina-pirimidina
o pirimidina-purina (AC, AT, GC o GT). Los
diferentes tipos de SNPs no se distribuyen uniformemente en el genoma, existiendo un predominio relativo
de las transiciones sobre la transversiones en relacin
con el nmero esperado al azar (Collins y Jukes, 1994).
Los SNPs pueden ocurrir en cualquier localizacin
cromosmica: regiones no codificantes, exnicas, intrnicas o reguladoras de la expresin gnica (Guttmacher y Collins, 2002; Hull y cols., 2007). El foco
inicial de bsqueda de variaciones genticas se centra
generalmente en el anlisis de secuencias codificantes,
pero tambin incluye frecuentemente otras secuencias
biolgicamente relevantes tales como regiones promotoras, zonas de unin intrn-exn, intrones y regiones
no traducidas (3-UTR y 5-UTR, acrnimos del trmino
en ingls Untranslated Region). Si el cambio de base

ocurre en una regin codificante, el SNP se clasifica
dependiendo de si la sustitucin que produce sea de
tipo sinnimo o silente (no cambia la secuencia de
aminocidos en la protena que codifica) o no-sinnimo
(cambia la secuencia de aminocidos). Si se cambia
la secuencia de aminocidos, la sustitucin puede ser
conservadora (se cambia un aminocido por otro
qumicamente similar) o no conservadora (se cambia un aminocido por otro de propiedades qumicas
diferentes). La nomenclatura de los SNPs se realiza con
respecto a su posicin nucleotdica; por ejemplo, el
SNP -174C > G de la interleuquina 6 (gen IL6) consiste en una sustitucin de una C por una G en la posicin
-174 de este gen (regin promotora) (Berthier y cols.,
2003). Si la variacin gentica afecta a la secuencia de
aminocidos de la protena, es tambin frecuente referir
esta condicin. Por ejemplo, el polimorfismo 241G>A
del gen del receptor 3 de melanocortina (MC3R) genera un cambio de valina por isoleucina en la posicin
aminoacdica 81, por lo que es frecuente encontrar
ese polimorfismo en la literatura como Val81Ile (Feng
y cols., 2005). La Figura 4-7 muestra la secuencia
de aminocidos y la estructura del receptor 3 de melanocortina, consistente en una tpica estructura de 7
dominios transmembrana. En la Figura 4-7 se indican
algunos de los SNPs descritos en la secuencia codificante incluyendo el SNP Val81Ile, mostrando colores
de los aminocidos segn su ndice de hidrofobicidad
(Kyte y Doolittle, 1982). Adicionalmente, la nomenclatura de los SNPs est basada en el llamado indicador
de identificacin rs o Reference SNP accession ID.
Por ejemplo, la identificacin para el SNP de 241G>A
(Val81Ile) del gen MC3R es rs3827103.
Los sitios web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://
www.hapmap.org, http://www.ensembl.org, y http://
www.genecards.org/index.shtml constituyen adecuados
puntos de partida para explorar los diferentes SNPs. La
pgina web de NCBI-SNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
SNP, el consorcio de SNPs (http://snp.cshl.org/), la base
de datos de variaciones genticas (http://hgvbase.cgb.
ki.se/), la base de datos del proyecto HapMap (http://
www.hapmap.org), y la base de datos de variacin del
genoma humano (http://www.gdb.org/) son lugares
tambin tiles en la bsqueda de variaciones genticas
humanas de diferente naturaleza. Existen publicaciones
que revisan los diferentes tipos de variaciones genticas
a nivel de ADN (Strachan y Read, 1999; Guttmacher y
21-10-10 3:28
Collins, 2002), as como guas para la nomenclatura de

dichas variaciones genticas (http://www.hgvs.org/).
El sistema de genotipado ms clsico es el basado
en la hibridacin del ADN con oligonucletidos especficos (ASO, acrnimo del trmino Allele-Specific Oligonucleotide hybridization). En este mtodo se construyen
dos sondas alelo-especficas que se unen al segmento
genmico de inters, hibridando cada oligonucletido
con un fragmento de ADN si sus secuencias son totalmente homlogas. La capacidad de la hibridacin especfica para discriminar alelos se puso inicialmente de
manifiesto en la determinacin de la mutacin que produce la anemia falciforme, usando ADN genmico mediante tcnicas de Southern Blot (Southern, 1975; Conner y cols., 1983). Esta tarea se facilit posteriormente
con el advenimiento de la PCR (Saiki y cols., 1988), en
el que las sondas marcadas hibridan con el producto de
PCR inmovilizado sobre un filtro de nylon (dot-blot). En
el anlisis llamado de dot-blot reverso, los oligonucletidos alelo-especficos son inmovilizados en un soporte
slido (Saiki y cols., 1989), lo que puede considerarse
como un enfoque precursor de los mtodos de determinacin de genotipos de SNPs basados en microchips de
alta densidad (Lipshutz y cols., 1995; Syvanen y cols.,
2001). En las siguientes subsecciones, se comentarn
diferentes mtodos de genotipado basados en el uso
de enzimas de restriccin (PCR-RFLP, PCR-dCAPS), en
la hibridacin alelo-especfica de los primers (PCRARMS, tetraprimer PCR-ARMS, MS-PCR) y en la hibridacin alelo-especfica de sondas con marcadores
fluorescentes (PCR-Taqman). La pgina del Centro Nacional de Genotipado (CEGEN) (http://www.cegen.org)
contiene informacin comprensible y actualizada sobre
los diferentes sistemas de genotipado de SNPs.
Determinacin de SNPs mediante el uso de
enzimas de restricccin (PCR-RFLP). Un mtodo clsico de deteccin de variantes conocidas es la
tcnica PCR-RFLP (RFLP es acrnimo del trmino en
ingls Restriction Fragment Length Polymorphism o polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin)
(Figura 4-8). En la PCR-RFLP, las diferencias de secuencia entre el alelo normal (silvestre, o wild-type)
y el alelo mutado crean (o destruyen) un sitio de restriccin que es reconocido en el producto de PCR por
enzimas de restriccin que generan un patrn de bandas
caracterstico en la separacin electrofortica (Figura
4-8; ver animacin de un gel de agarosa en la pgina
69
web http://learn.genetics.utah.edu/units/biotech/gel/).
La pgina web http://www.restrictionmapper.org/ es una
herramienta til para identificar secuencias que generan
sitios de restriccin.
No todos los cambios de una sola base generan la
creacin/destruccin de lugares de restriccin reconocibles por endonucleasas especficas y, consecuentemente, no son detectables por anlisis directo de PCRRFLP. En estas situaciones, puede aplicarse una una
modificacin en uno de los primers para que presente
una alteracin intencionada consistente en un cambio
de un nucletido con respecto a la secuencia original,
introducido con el objeto de generar un sitio de restriccin artificial en conjuncin con el polimorfismo que
se desea estudiar. Esta tcnica, llamada en ocasiones
dCAPS (acrnimo del trmino en ingls Derived Amplified Polymorphic Sequence) (Neff y cols., 1998), requiere igualmente de la digestin del producto de PCR
con una enzima de restriccin, examinndose el patrn
de la digestin en un gel de agarosa o de poliacrilamida (Neff y cols., 2002) (Figura 4-9A). Como ejemplo
de la aplicacin de PCR-dCAPS, el polimorfismo -239
A > G del gen MC3R (receptor 3 de melanocortina) no
genera la creacin/destruccin de un sitio de restriccin
(Schalin-Jantti y cols., 2003). Sin embargo, el uso de
un primer modificado, que permite la determinacin de
genotipos mediante la incubacin del producto de PCR
(86 pb) con la enzima AlwI a 37C (Figura 4-9B). Los
primers utilizados en este tipo de ensayos pueden disearse mediante la pgina web http://helix.wustl.edu/
dcaps/dcaps.html.
Determinacin de SNPs mediante el uso de
primers alelo-especficos (PCR-ARMS, tetraprimer PCR-ARMS y MS-PCR). Una tcnica simple que
puede utilizarse tambin para la deteccin de SNPs es
la llamada PCR-ARMS (ARMS es el acrnimo del trmino en ingls Amplification Refractory Mutation System: sistema de mutacin refractario a la amplificacin)
(Newton y cols., 1989). En la PCR-ARMS, se realizan
dos PCR diferentes para cada sujeto usando un primer
comn en ambas reacciones, y uno de los dos primers
alternativos, que son especficos para cada una de las
secuencias genmicas. Esta especificidad se consigue
mediante la alteracin del partidor directo de forma que
la existencia de un desapareamiento en su extremo 3
impide la elongacin en la PCR cuando se usa uno de
los partidores, mientras que la amplificacin tiene lu-
21-10-10 3:28
70
Figura 4-8
Representacin esquemtica de la deteccin de genotipos en polimorfismos de cambios
de una sola base (SNPs) mediante PCR-RFLP
Sitio polimrfico de cambio de una base (sustitucin
A G en la posicin 100) que define 2 alelos: A y G
Partidor directo
A
T
Partidor reverso
G
C
150 pb
Amplificado del fragmento de 150 pb

Incubacin con enzima de restriccin que
reconoce en el sitio polimrfico A G
(corta con el alelo G)
1
Electroforesis en gel
de agarosa
200 pb
150 pb
1. Marcador de peso molecular
100 pb
3. Homocigoto alelo G
50 pb
gar cuando se usa el otro partidor (Figura 4-10). Esta

tcnica se basa en la ausencia de actividad correctora
53 exonucleasa de las Taq polimerasas normalmente usadas en la PCR. Un ejemplo del uso de la tcnica
de PCR-ARMS es la deteccin de la mutacin 35delG
del gen de la conexina 26 (gen GJB2) causante de la
hipoacusia congnita (Dong y cols., 2001).
Un mtodo basado en el mismo principio que el
PCR-ARMS es el llamado mtodo tretaprimer ARMS
PCR (Ye y cols., 2001) (Figura 4-11). La ventaja del
tetraprimer ARMS en comparacin con el PCR-ARMS
2. Homocigoto alelo A
4. Heterocigoto
es que se requiere una sola PCR por cada muestra en

lugar de las dos PCR que utiliza el PCR-ARMS. Este
mtodo se basa en el uso de cuatro primers, dos de los
cuales son primers externos y otros dos son primers
especficos de cada alelo (primers internos). La combinacin de productos de PCR generados a partir de los
primers externos e internos permite la discriminacin
allica, mientras que el producto de PCR generado por
los primers externos se amplifica en todas las reacciones y sirve como control de la reaccin (ver http://
cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.html
para diseo de primers en este ensayo).
21-10-10 3:28
71
Figura 4-9
Deteccin de genotipos en polimorfismos de cambios de una sola base (SNPs) mediante PCR-RFLP
con primers modificados (dCAPS)
A: Representacin esquemtica
El asterisco indica la introduccin artificial de una mutacin
que crea un sitio de restriccin en conjunto con A G
Partidor directo
A
T
Partidor reverso
G
C
100 pb

Incubacin con enzima de restriccin
1
Electroforesis
en gel de agarosa
200 pb
150 pb
100 pb
50 pb
4
4. Heterocigoto
B: Genotipos del polimorfismo -239A>G del gen MC3R
Primer directo 5-GAGGGAGACAGAAGGAAGACAG3;Primer reverso: 5TTCCAGGAGGAGCAGTTTTGATC3.

El nucletido subrayado fue cambiado intencionadamente con el objeto de crear un sitio
de restriccin para AlwI.
21-10-10 3:28
72
Figura 4-10
Representacin esquemtica de deteccin de genotipos en polimorfismos de cambios
de una sola base (SNPs) mediante PCR-ARMS
Sitio polimrfico de cambio de una base (sustitucin A G)
que define 2 alelos: A y G
Partidor directo ARMS
A
A
T
Partidor directo anti-ARMS
G
G
C
Partidor reverso
100 pb
Electroforesis
en gel de agarosa
1
200 pb
150 pb
100 pb
50 pb
Tambin basado en la hibridacin alelo-especfica

de primers, el sistema llamado MS-PCR (acrnimo de
Mutagenically Separated Polymerase Chain Reaction)
(Rust y cols., 1993), asigna genotipos considerando la
especificidad de los primers en el extremo 3 frente a
cada alelo, la diferencia de tamao de los primers, y la
alteracin intencionada de nucletidos en los primers
que evitan la aparicin de reacciones cruzadas (Figura
4-12).
Usando mtodos con primers alelo-especficos y
con el objeto de aumentar el procesamiento de geno-
7
2 y 3. Homocigoto alelo A (A/A)
4 y 5. Homocigoto alelo G (G/G)
6 y 7. Heterocigoto (A/G)
tipos, se ha descrito adicionalmente el uso de electroforesis MADGE (acrnimo de Microtiter Array Diagonal
Gel Electrophoresis), que permite la carga eficiente de
un nmero relativamente alto de muestras en geles y un
mayor procesamiento de muestras (Ye y cols., 2001;
Day y Humphries, 1994; Hunt y cols., 1999). Sin embargo, las tcnicas de alto procesamiento de muestras
y determinaciones simultneas desarrolladas durante la
dcada del ao 2000 han sobrepasado amplsimamente
la capacidad de procesamiento de muestras de los mtodos basados en la deteccin de genotipos en geles.
21-10-10 3:28
73
Figura 4-11
de una sola base (SNPs) mediante tetraprimer PCR-ARMS
Primer directo
externo
Primer directo
interno
G>A
Primer reverso
interno
Primer reverso
externo
PCR
G/G
G/A
A/A
Electroforesis
en gel de agarosa
Fragmento externo
Fragmento especfico de alelo A
Fragmento especfico de alelo G
Figura 4-12
de una sola base (SNPs) mediante MS-PCR
Los asteriscos indican la introduccin artificial
de cambios de nucletidos
A
A
T
Partidor directo: alelo A
Partidor directo: alelo G
Partidor reverso
G
G
C
100 pb

Incubacin con enzima de restriccin
1
Electroforesis
en gel de agarosa
200 pb
150 pb
100 pb
50 pb
4
4. Heterocigoto
21-10-10 3:28
74
no hibridan perfectamente son desplazadas sin emitir

fluorescencia.
Determinacin de SNPs mediante sondas

fluorescentes (PCR-Taqman). Para llevar a cabo el
genotipado de SNPs mediante el mtodo PCR-Taqman,
se utilizan dos sondas (oligonucletidos), adems de
los dos primers de la PCR. Las sondas hibridarn de
forma especfica para cada alelo del SNP. Las sondas
llevan adheridas una molcula fluorescente (reporter)
y otra molcula apagadora de la fluorescencia (quencher) que inhibe esta fluorescencia mediante un fenmeno llamado FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer). Cuando la sonda hibrida perfectamente con la
secuencia que contiene el SNP, el reporter se libera de la
accin del quencher por la accin 53 exonucleasa
de la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold, emitiendo
una fluorescencia que ser proporcional a la cantidad
de ADN amplificado de cada secuencia especfica (De
la Vega y cols., 2005) (Figura 4-13). Las sondas que
La discriminacin allica (allele calling) puede

realizarse mediante la observacin de la fluorescencia
acumulada a travs de los ciclos de PCR en un equipo
de PCR de tiempo real (Kubista y cols., 2006) (Figura 4-14). Adicionalmente, la asignacin de genotipos
puede llevarse a cabo al registrar las seales estandarizadas de fluorescencia al final de la PCR. En este sentido, la Figura 4-15 muestra la asignacin de genotipos
del SNP Q223R (rs1137101) del gen del receptor de
leptina (LEPR) analizados mediante el ensayo Taqman
(Gotoda y cols., 1997; Yiannakouris y cols., 2001). La
ventaja del mtodo Taqman en relacin con los mtodos
basados en el uso de geles (por ejemplo, PCR-RFLP)
se refleja en una reduccin sustancial del tiempo del
Figura 4-13
Esquema de la discriminacin allica en ensayos Taqman
Sonda A
Sonda G
G
Fluorescencia
Hibridacin
Primer forward
A
T
Primer reverse
Fluorescencia
Hibridacin
Primer forward
G
C
Primer reverse
ADN polimerasa
FAM
Fluorescencia FAM
MGB
Minor groove binder

Q
VIC
Fluorescencia VIC
Inhibidor de la fluorescencia quencher
21-10-10 3:28
75
Genotipo
heterocigoto
Fluorescencia
Fluorescencia
Genotipo
homocigoto
normal
Ciclos
Fluorescencia
Figura 4-14
Representacin de la evolucin de las seales de fluorescencia en un equipo de PCR de tiempo real
en ensayos Taqman
Ciclos
Genotipo
homocigoto
alternativo
Ciclos
Figura 4-15
Representacin de la discriminacin de genotipos mediante fluorescencia en el mtodo PCR-Taqman
(SNP Q223R del gen LEPR)
Genotipos GG
Alelo 223G
0,6
0,2
Genotipos AG
Controles negativos
Genotipos AA
0,2
0,3
0,7
1,1
Alelo 223A
21-10-10 3:28
76
Figura 4-16
Hibridacin de sondas sealizadoras (molecular beacons)
F1
F2
Sondas sealizadoras
C
Fluorescencia
Fluorescencia
F1
C
G
ensayo, en la realizacin del genotipado en un solo paso

enzimtico y en un tubo cerrado (evita contaminacin
por producto de PCR), as como el uso de condiciones
estandarizadas de PCR para diferentes mutaciones. Paralelamente, existe la posibilidad de reducir el tiempo
de genotipado al solicitar sondas y primers a empresas
especializadas.
Una metodologa de genotipificacin tambin basada en FRET usa las llamadas sondas sealizadoras
(molecular beacons) que son oligonucletidos de hebra
simple que tienen secuencias autocomplementarias en
sus extremos, alrededor de un segmento que a su vez
es complementario al ADN que contiene el SNP de inters (Figura 4-16) (Tyagi y Kramer, 1996; Kostridis y
cols., 1998; Sobrino y cols., 2005). La composicin de
nucletidos permite a la sonda sealizadora mantener
una estructura en forma de bucle con un tallo. Los
dos extremos de la sonda sealizadora estn marcados
con un fluorforo y por un apagador de fluorescencia
respectivamente, que interaccionan mediante FRET.
Cuando la sonda sealizadora hibrida perfectamente
con una secuencia de ADN genmico, la estructura de
bucle se abre permitiendo la emisin de fluorescencia
por parte del fluorforo (Kostrikis y cols., 1998). Para
la genotipificacin de SNPs, es necesario contar con
F2
T
A
dos sondas sealizadoras marcadas con diferentes fluorforos, cuya intensidad ser registrada en el curso de
una PCR de tiempo real. Usando este procedimiento,
Kostrikis y cols. (1998) lograron asignar genotipos del
polimorfismo en el receptor 5 de chemoquinas consistente en una delecin de 32 nucletidos (CCR5delta32)
que confiere resistencia frente a la infeccin por virus
HIV (Liu y cols., 1996).
Determinacin de SNPs en estudios de gran
escala. Es posible aplicar tcnicas de hibridacin mltiple para identificar un alto nmero de mutaciones ya
conocidas, como es el caso de la hipercolesterolemia
familiar, cuyo diagnstico provisional puede ser entregado por signos clnicos tpicos, datos analticos bioqumicos o historia familiar del paciente. En esta enfermedad, se han descrito ms de 900 mutaciones en
el gen LDLR, lo que dificulta el diagnstico molecular,
que es considerado como gold standard. En este sentido, el lipochip (http://www.progenika.com) es capaz
de determinar de forma simultnea las mutaciones ms
frecuentes de los genes LDLR, PCSK9 y APOB. Adems
de su abundancia a lo largo del genoma, una caracterstica importante de los SNPs es que la determinacin
de sus genotipos puede ser automatizada mediante tecnologas que permiten un alto grado de procesamiento
21-10-10 3:28
(high-throughput = alto nmero de genotipos por da)

y una alta capacidad de determinaciones simultneas
(Wang y cols., 1998; De la Vega y cols., 2005; Sobrino
y cols., 2005; Isler y cols., 2007; Dunbar, 2006). Un
primer acercamiento para la determinacin simultnea de SNPs consiste en el diseo de ensayos de PCR
multiplex en los que se amplifican diferentes regiones
genmicas utilizando un conjunto de pares de primers
compatibles (Markoulatos y cols., 2002). Sin embargo,
la generacin de dmeros de primers es un importante
factor negativo que limita el nmero de amplificaciones simultneas que pueden realizarse (Syvanen y cols.
2005), lo que podra optimizarse mediante la inmovilizacin fsica de los primers en el medio de reaccin
(Meuzelaar y cols., 2007).
Un mtodo que permite reducir la complejidad del
proceso de genotipado a gran escala consiste en la fragmentacin del genoma con una enzima de restriccin y
la posterior ligacin de secuencias adaptadoras en los
fragmentos resultantes, lo que permite la amplificacin
de una gran cantidad de fragmentos genmicos usando
un nico par de primers universales (Kennedy y cols.,
2003; Syvanen y cols., 2005). Este enfoque permiti
el genotipado de ms de 10.000 SNPs utilizando hibri-
77
dacin alelo-especfica de los fragmentos amplificados

con sondas inmovilizadas en microarrays de oligonucletidos de alta densidad (Matsuzaki y cols., 2004a).
El nivel de determinaciones simultneas se pudo incrementar hasta un nmero de 116.204 SNPs mediante
el fraccionamiento del genoma con dos enzimas de
restriccin (XbaI y HindIII) y la posterior amplificacin
de fragmentos de hasta 2.000 pb (Syvanen, 2005).
Este procedimiento signific la cobertura del genoma
completo de marcadores SNPs separados por una distancia promedio de 23,6 kb (Matsuzaki y cols., 2004b;
Syvanen, 2005). Como ejemplos comerciales de mtodos de genotipado con cobertura de SNPs de genoma
completo, citaremos los paneles de Affymetrix Gene
Chip 100K (116.204 SNPs), 500K (500.568 SNPs) y
SNP array 6,0 (906.600 SNPs) (http://www.affymetrix.
com/), y los paneles de Illumina HumanHap300 y HumanHap550, que incluyen aproximadamente 318.000
y 550.000 tagSNPs, respectivamente (http:/www.illumina.com). El panel HumanOmni5.0 provee hasta 5
millones de SNPs, incluyendo informacin de variantes
comunes y variantes raras (con frecuencia allica menor al 1% y representadas recientemente en la fase 3 de
HapMap). La Tabla 4-2 muestra las caractersticas de
Tabla 4-2
Caractersticas de algunos paneles de polimorfismos simples (SNPs) disponibles comercialmente

HumanCyto SNP-12
Illumina
Human660w-QUAD
Illumina
Human1M-DUO
Illumina
Marcadores genticos
299.140
657.366
1.199.187
Cobertura del genoma

(promedio/mediana)
0,81/0,94
0,92/1,0
0,96/1,0
Frecuencia de alelos menos comunes

(promedio/mediana)
0,22/0,21
0,24/0,23
0,20/0,28
9,7/6,2
4,4/2,3
2,4/1,5
Espaciado entre marcadores (kb)

(promedio/mediana)
Percentil 90 de los espacios mayores (kb)
Marcadores que flanquean (10 kb)
a genes
SNPs no-sinnimos
SNPs DNA mitocondrial
18,7
10,6
6,0
148.987
332.756
672.002
2.420
10.051
21.877
135
138
Fuente: http://www.illumina.com. Datos referidos a la poblacin CEU. Ver paneles adicionales en http://www.affymetrix.com y
http://www.illumina.com
21-10-10 3:28
78
algunos paneles de SNPs disponibles comercialmente,

que tienen un grado variable de cobertura del genoma.
La tecnologa de genotipado est en constante evolucin, por lo que es necesario consultar las pginas web
de las compaas que desarrollan estas tecnologas con
el fin de estar al tanto de los ltimos avances en esta
materia (ver listado de pginas web en Perkel, 2008).
La Figura 9-4 muestra los resultados de un barrido de
genoma completo en un estudio de asociacin. Adems de estos paneles de SNPs, existen adicionalmente
compaas privadas que realizan determinaciones de
genotipos de SNPs a la carta (por ejemplo, http://
www.kbioscience.co.uk) (Perkel 2008). Desde 2007, se
ofrece un servicio de genotipado personalizado de hasta
un milln de SNPs por parte de una compaa privada
(http://www.decodeme.com).
La enumeracin y profundizacin de los diferentes
mtodos de amplificacin, discriminacin allica y
deteccin de SNPs a nivel masivo est lejos del alcance de este libro (ver http://www.cegen.org para la
descripcin de diferentes mtodos de genotipado a
gran escala) (Syvanen, 2001; Syvanen, 2005). Mencionaremos nicamente de forma breve la tecnologa
SNPlex (Applied Biosystems), la tecnologa MassArray
(Sequenom), la tecnologa xMap (LuminexCorp) y la
tecnologa BeadArray (Illumina). La tcnica de SNPlex
permite la discriminacin allica mediante una ligacin
especfica de alelo (OLA; acrnimo de Oligonucleotide

Ligation Assay), en la que se utilizan dos oligonucletidos alelo-especficos en el extremo 3 y otra sonda
comn adyacente que se ligar con el oligonucletido
especfico mediante una ADN ligasa. La amplificacin
tiene lugar con primers universales y permite deteccin
de SNPs mediante sondas fluorescentes (http://www.
appliedbiosystems.com). La teconologa MassArray
se basa en el uso de espectrometra de masas para la
deteccin allica, dado que esta metodologa permite
medir el peso molecular de los productos formados y
distinguir ADN con diferencias de una sola base nucleotdica. La deteccin puede realizarse mediante
la reaccin de extensin de un nico nucletido con
MALDI-TOF (acrnimo de Matrix-assisted laser desorption/ionization time of light) (http://www.sequenom.
com). La tecnologa xMAP est basada en el uso de
oligonucletidos adheridos a microesferas con diferentes combinaciones de dos colores, lo que permite que
puedan ser identificadas y separadas por citometra.
Este enfoque permite hasta 100 determinaciones simultneas de SNPs por muestra (http://www.luminexcorp.com). Finalmente, la tecnologa BeadArray se
basa tambin en el uso de microesferas, pero en este
caso las microesferas se inmovilizan en pocillos slidos previamente a la reaccin de genotipado (http://
www.illumina.com).
Secuenciacin de ADN
La secuenciacin del ADN es la forma conceptualmente ms directa de explorar la existencia de
polimorfismos de un gen en particular. El mtodo de
secuenciacin de ADN ms comnmente citado en la
literatura se basa en el uso de dideoxinucletidos (ddNTPs) que actan como terminadores de la elongacin
por parte de la ADN polimerasa en una reaccin de PCR
asimtrica llamada PCR de secuenciacin (Strachan
y Read, 1999). En esta reaccin, los dNTPs y los ddNTPs competirn entre s en su incorporacin al ADN. La
incorporacin al azar de ddNTPs marcados con fluorescencia resulta en fragmentos de diferente tamao que
permiten la identificacin de la secuencia de ADN en un
cromatograma tras una electroforesis capilar.
La Figura 4-17 muestra el cromatograma con el

inicio de la secuencia codificante (de 999 nucletidos
en total en un nico exn) del gen MC4R, sealndose
el codn de inicio con una flecha. En nuestro laboratorio, este gen se secuenci en dos fragmentos solapados como una forma de cubrir la secuencia completa
del gen (Hinney y cols., 1999; Santos y cols., 2007).
Una vez obtenido el cromatograma, se puede comparar la secuencia obtenida con una secuencia consenso mediante el uso de programas informticos como
CLUSTALW (Larkin y cols., 2007; http://www.ebi.ac.uk/
tools/clustalw2). Las tecnologas de secuenciacin estn evolucionando rpidamente (Rusk y Kiermer, 2008;
Chi, 2008) (ver por ejemplo, http://www.454.com),
21-10-10 3:28
habindose reducido sustancialmente tanto el tiempo

de secuenciacin como sus costos (Gharizadeh y cols.,
2006; Service, 2006; Levy y cols., 2007).La aplicacin
79
de tcnicas de secuenciacin masiva paralela est permitiendo obtener secuencias del total del exoma de forma dirigida y eficiente (Gnirke y cols., 2009).
Figura 4-17
Inicio de la secuencia codificante del gen MC4R (geneID 4160; 18q22)
C
Bsqueda sistemtica de nuevas variaciones de secuencia en genes

candidatos
Aunque la secuenciacin es el mtodo ms directo
para la bsqueda de mutaciones en genes candidatos,
se ha procedido frecuentemente a la aplicacin de mtodos de bsqueda rpida (screening) que permitan
identificar la presencia de variaciones genticas en
muestras que si resultan positivas frente a la presencia de alguna variante gentica, posteriormente seran
sometidas a secuenciacin directa para la identificacin de las alteraciones de secuencia particulares (Shi,
2001; Gmez-Gonzlez y cols., 2002). Por tanto, la
secuenciacin actuara como mtodo cualitativo de referencia para la identificacin de mutaciones, mientras
que los mtodos de screening actuaran como mtodos alternativos, cuya validez debe ser contrastada con
la eficacia de mtodo de referencia. Como ejemplos
de estos mtodos de screening podemos citar SSCP
(acrnimo del trmino en ingls Single Strand Conformational Polymorphism o Polimorfismo conformacional
de hebra monocatenaria) (Marti y cols., 2003; Santos y
cols., 2006), DGGE (acrnimo de Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis o electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) (Patio-Garca y cols., 1999), as
como las tcnicas basadas en la deteccin de heterodplex de ADN como el mtodo DHPLC (acrnimo
de Denaturing High-Pressure Liquid Cromatography o
cromatografa lquida de alta presin desnaturalizante)
(Yamanoshita y cols., 2005) y el mtodo CSGE (acrnimo de Conformational Sensitive Gel Electrophoresis o
electroforesis en gel sensible a conformacin) (Korkko
y cols., 1998) (Figura 4-18). Finalmente, la determinacin de la temperatura de fusin (Tm) del producto de
PCR mediante el anlisis de disociacin del amplicn,
permite efectuar un screening de mutaciones mediante
la tcnica llamada HRM (High Resolution Melting).
Esta tcnica se lleva a cabo en un equipo de PCR de
tiempo real que incorpora fluorforos de alta sensibilidad (Vorkas y cols., 2010). Todas estas tcnicas (revisadas por Ferrari y cols., 1996; Gmez-Gonzlez y
cols., 2002) poseen diferentes grados de sensibilidad
y especificidad (Gerhardus y cols., 2007).
El principio del SSCP se basa en el diferente comportamiento electrofortico del ADN monocatenario
segn su estructura conformacional que depende a
su vez de la secuencia nucleotdica. La aplicacin de
SSCP requiere la amplificacin previa de un segmento
particular de ADN que es desnaturalizado y cargado en
un gel de poliacrilamida de condiciones no-desnaturalizantes, en el que se examina la diferente movilidad
de los fragmentos de hebra simple (Figura 4-19). El
anlisis de heterodplex est basado en la deteccin de
los heterodplex, que son molculas de ADN bicatenario que contienen alguna base desapareada (Ferrari
21-10-10 3:28
80
Figura 4-18
Principio de deteccin de heterocigotos mediante anlisis de heterodplex
A
T
Amplificacin de segmento
de inters (PCR)
G
C
94C
68C
1
1. Homodplex (normal)
2. Heterodplex
Figura 4-19
Representacin de deteccin de variantes genticas mediante PCR-SSCP
ADN genmico
Amplificacin de segmento de inters (PCR)

A
T
Desnaturalizacin del producto de PCR
G
C
Renaturalizacin en gel
de poliacrilamida no
desnaturalizante
1 y 2. Homocigoto normal
2. Homocigoto variante alternativa
3. Heterocigoto
21-10-10 3:28
81
Figura 4-20
Bsqueda sistemtica de mutaciones en el gen MC4R
A: PCR-SSCP (mtodo de screening)
Muestra con una banda adicional que sugiere la presencia de una mutacin
B: Secuenciacin (mtodo de identificacin)

A
449C > T (Thr150Ile) en estado heterocigoto
C: PCR-RFLP
Sujeto heterocigoto Thr150Ile
21-10-10 3:28
82
y cols., 1996). En el anlisis clsico de heterodplex,

el ADN genmico se desnaturaliza mediante calor y se
vuelve a renaturalizar. En presencia de una variacin
gentica, se producirn cuatro tipos de molculas tras
la renaturalizacin: dos de ellas sern homodplex (de
los fragmentos mutados y normales respectivamente) y
dos sern heterodplex (con secuencias desapareadas).
Los homodplex y los heterodplex tienen diferente migracin electrofortica, lo que permite la deteccin de
nuevas variantes genticas.
La Figura 4-20 muestra el proceso que se emple
en la identificacin de la alteracin Thr150Ile del gen
del receptor 4 de melanocortina (MC4R) relacionada
con la obesidad de tipo monognico a travs de la aplicacin inicial de SSCP en un grupo de personas con
obesidad, seguida de un mtodo rpido de bsqueda
en familiares (secuenciacin) y un mtodo de confirmacin (PCR-RFLP) (Santos y cols., 2006). Segn se
indica en la Figura 4-19, se evidenci en primer lugar
la presencia de la mutacin mediante el examen del
patrn de electroforesis tras una PCR-SSCP, donde se
encontr una banda adicional en una de las muestras
de ADN tras revelado con nitrato de plata (carril de la
izquierda de la Figura 4-20A). En la muestra de ADN
genmico de esta persona se identific la presencia
de la sustitucin 449C > T en estado heterocigoto
(Thr150Ile) mediante una secuenciacin bidireccional
por electroforesis capilar (Figura 4-20B). A pesar de
que la secuenciacin mostr un claro patrn de genotipo heterocigoto en la posicin 449C > T (sealado
en la Figura 4-20B tanto en la secuenciacin utilizada
con el primer directo como con el reverso). Adicionalmente se realiz un anlisis de PCR-RFLP, en el que se
dise una pareja de primers en las que uno de ellos
generaba artificialmente un lugar de restriccin para la
enzima MaeIII (Figura 4-20C). Esta estrategia permiti
confirmar la presencia de un heterocigoto en la posicin 449C > T. Este proceso (PCR-SSCP + secuenciacin + PCR-RFLP) representa un ejemplo de protocolo sistemtico para la bsqueda de alteraciones de
secuencia que intenta reducir al mnimo la posibilidad
de errores de genotipificacin mediante la aplicacin
de mtodos independientes de deteccin de variantes
genticas. La tcnica de PCR-RFLP tiene por objeto
fundamental el detectar de forma rpida la presencia de
mutaciones en familiares del caso ndice.
Es importante destacar que la bsqueda actual de
nuevas mutaciones puede ser realizada de forma eficiente mediante las tecnologas de secuenciacin masiva paralela (Gnirke y cols. 2009). El proyecto de los
1.000 genomas (http://www.1000genomes.org) est
elaborando una base de datos de un alto nmero de
secuencias del genoma, cuyos resultados sern depositados en bases de datos pblicas. Estos esfuerzos han
permitido averiguar la presencia de variaciones allicas
de baja frecuencia que se han incorporado en la fase 3
de HapMap. La aplicacin de estas nuevas tecnologas
han permitido, por ejemplo, abordar la secuenciacin
del exoma completo con la identificacin de mutaciones causantes de enfermedades monognicas (Ng y
cols. 2010).
21-10-10 3:28

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Marcadores genticos: Definiciones y conceptos bsicos

Epidemiologa gentica (int).indd 55

genes (secuencias codificantes, promotoras, intrones,

descrito diferentes haplogrupos del ADNmt que se han

Epidemiologa gentica (int).indd 56

en lugar de un polimorfismo, especialmente si esta

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

etc. Dado que el ADN es una molcula lineal, es posible

te en pares de bases (pb). Dado que el nmero de pares

Marcadores genticos medidos a nivel fenotpico

Epidemiologa gentica (int).indd 57

dad al sabor amargo del PROP clasifica a las personas

D: Escala semilogartmica semntica

Epidemiologa gentica (int).indd 58

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

gran parte de la variabilidad fenotpica de la percepcin

bilidad de ciertos tipos de frutas y verduras, as como

Obtencin de ADN genmico

sis genticos. La integridad del ADN genmico puede

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Epidemiologa gentica (int).indd 59

gentico (Tsuchihashi y Dracopoli, 2002), la inmensa

B: Primeros ciclos de la PCR

1987). El objetivo de la PCR es obtener un gran nmero

Epidemiologa gentica (int).indd 60

de variantes genticas. Es posible visualizar el proceso

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

0,2 mM (200 (M)

cationes Mg+2, adems de un par de oligonucletidos

Epidemiologa gentica (int).indd 61

fragmento de 86 pares de bases de la regin promotora

Temperatura de hibridacin (C)

Tipos de marcadores genticos comnmente usados en estudios

Epidemiologa gentica (int).indd 62

ponden a inserciones/deleciones de un tamao

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

Polimorfismos de tipo microsatlite

Epidemiologa gentica (int).indd 63

La secuencia corresponde a un homocigoto con 13 repeticiones del tetranucletido TTTC

B: Anlisis de fragmentos en electroforesis capilar

genotipos se realiza mediante electroforesis capilar de

Epidemiologa gentica (int).indd 64

regin que flanquea el gen de la leptina (Hinuy y cols.,

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

con un equipo de electroforesis capilar. Otro ejemplo de

Epidemiologa gentica (int).indd 65

de nucletidos (Benson, 1999). La pgina web http://

Variaciones en el nmero de copias

Epidemiologa gentica (int).indd 66

alta resolucin para el escaneo de CNVs en el genoma

Epidemiologa gentica (int).indd 67

Pos. 183: Ile183Asn

Pos. 81: Val81Ile

LE: Loop extracelular

Pos. 311: Ser311Cys

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

y que son causantes de distrofias musculares (Lalic y

Polimorfismos de cambios de una sola

Epidemiologa gentica (int).indd 68

en ingls Untranslated Region). Si el cambio de base

CAPTULO 4 Tipos de marcadores genticos y mtodos de determinacin de genotipos

Collins, 2002), as como guas para la nomenclatura de