Mg. T.M.

Robert Caballero Bardales

DIAGNOSTICO VIROLOGICO
MUESTRA CLINICA

DETECCION SEROLOGICA

DETECCION DIRECTA DEL VIRUS

VISUALIZACION DEL VIRUS O EFECTO

CELULAR ESPECIFICO

AISLAMIENTO
VIRAL

MICROSCOPIA

DETECCION INMUNOLOGICA DE
ANTIGENOS VIRALES

TECNICAS
MOLECULARES

INMUNOFLUORESCENCIA
(IFA)

HIBRIDACION

FIJACION DE COMPLEMENTO
(FC)

REACCION EN
CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

INMUNOFLUORESCENCIA
(IFA)

FIJACION DE COMPLEMENTO
(FC)

NEUTRALIZACION
CULTIVO
CELULAR

OPTICA

ELECTRONICA
HUEVO
EMBRIONARIO

RATONES

INMUNOENSAYOS
RIA)

(EIA,

NEUTRALIZACION
SECUENCIAMIENTO
INMUNOENSAYOS
RIA)

HEMAGLUTINACION (HA) E
INHIBICION DE LA HA

(EIA,

HEMAGLUTINACION (HA) E
INHIBICION DE LA HA

HEMADSORCION (Had)E
INHIBICION DE LA Had

REACCION EN
CADENA DE LA
LIGASA (LCR)

HEMADSORCION (Had)E
INHIBICION DE LA Had

AND RAMIFICADO
BRANMCHED bADN

WESTERN BLOT Y DOT BLOT

SISTEMA QB
REPLICASA

LA TOMA DE LAS MUESTRAS

Un factor determinante y definitivo

para el aislamiento viral es la
obtencin temprana de una muestra
adecuada,
La excrecin del virus tiende a ser por

pocos das
La concentracin de partculas virales
disminuye progresivamente con el tiempo.
La aparicin de anticuerpos en la fase
aguda neutraliza el virus y ayuda a formar
complejos inmunes.

Las muestras se deben tomar en las

condiciones de mayor esterilidad
posibles,
Identificar con el nombre del paciente,
Lugar de procedencia,
Tipo de muestra, la fecha y hora de la
toma y un resumen corto de la historia
clnica con la solicitud de examen que
se desea realizar.

Una muestra clnica adecuada

Garantice la conservacin de las partculas

virales activas,
Tiempo de transporte de la muestra,

Temperatura
Medio de preservacin o medios de

transporte que mantengan la viabilidad viral.

No se deben dejar a temperatura ambiente

o en incubadora,
No es recomendable congelar y
descongelar las muestras, se podra alterar
la estructura del agente viral

Evidencia del Patgeno

Aislar el virus de una muestra
aguda
Aumento de 4 veces ms en los
niveles de anticuerpo IgM o IgG,
comparando las muestras agudas
y convalescientes

Pruebas de laboratorio
Serolgicas:
Neutralizacin

Captacin de anticuerpos por Elisa

Aislamiento viral:
Cultivo celular
Biologa molecular:
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Viremia (1~7 das)

Formas para identificar el virus:
PCR (Reaccin en Cadena de la
Polimerasa)
Aislamiento por cultivo celular

Aislamiento del Virus en Cultivo

Celular
Principios:
Virus en la muestra
El virus puede infectar la clula
El virus se replica en las clulas
Visualizar el efecto citoptico en la clula
Anticuerpos de diagnstico contra el virus
Visualizar la interaccin del virus con los
anticuerpos

AISLAMIENTO VIRAL
MUESTRA

Inoculacin en cultivo
celular (Vero,C6/36)

I FA

Inoculacin en Cerebro
de ratn lactante

Observar:
Signos- Sntomas

Clulas de Mosquito (C6/36)

no infectadas

Clulas de Mosquito (C6/36)

infectadas

Inmunofluorescencia Negativa

Inmunofluorescencia positivo

Fases de la tcnica Elisa Sandwich.

(1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antgeno suele estar ya unido a la placa.
(2) se incuba con la muestra problema.
(3) se aade el conjugado.
(4) por ltimo el sustrato.

Fase de la tcnica Elisa indirecto.

(1) El antgeno se pega a la placa
(2) se aade el suero problema.
(3) posteriormente, el conjugado.
(4) y por ltimo, el sustrato.

(1)
(2)
(3)
(4)

Fases de la Tcnica Elisa de competicin.

Se incuba el suero problema con el antgeno.
La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente
se ha fijado un suero anti antgeno
se aade el conjugado.
despus, el sustrato. En este caso la ausencia de color sera
positivo.

Principios Generales del ELISA

Sustrato
Enzima
Enzima marcada
con anticuerpos
anti-humanos

Muestra de suero

Antgeno de
lisado viral

ELISA para deteccin de igm

SUSTRATO

ENZYMA MARCADA
CON ANTICUERPOS

ANTICUERPO VIRAL
ANTIGEN VIRAL
MUESTRA

IgM ANTI-HUMAN

Resultados del ELISA

Resultados del ELISA

Interpretacin:

CASOS CONFIRMADOS:
Aislamiento Viral
Seroconversin

Primera muestra negativa (aguda)

Segunda muestra positiva (convalesciente)

CASOS PROBABLES:
Slo se tiene muestra aguda y es positiva para IgM
Se tiene muestra aguda y convalesciente, y se
observa un incremento de cuatro diluciones en las
titulaciones.

Prueba de Neutralizacin en Placa

(PRNT)
Utilizada para tipificar los anticuerpos
contra un determinado virus
En un cultivo celular, el virus puede infectar
las clulas, expandirse a las clulas vecinas y
hacer que stas produzcan placas (muerte
celular)
Si el anticuerpo especfico para el virus est
presente, ste puede inhibir la infeccin
viral y no producir placas

Simulacro de PRNT

Prueba de Neutralizacin en Placa

(PRNT)

Virus
(Antgeno)

Inoculacin e
Incubacin

Incubacin

Muestras
(sin anticuerpos
especificos)

No hay reaccin
Ag-Ac

Clulas
BHK21-CL15

Reaccin
Negativa

Prueba de Neutralizacin en Placa

(PRNT)
Virus
(Dilucin de Trabajo)

Anticuerpos del
Suero
(Diluciones seriadas)

Cultivo de Clulas VERO

No-formacin de placas virales en la monocapa

Conteo de UFP/dilucin
Dilucin del suero: 70% Reduccin del # de placas virales
% PRNT = 100

(N placas formadas en diluc. Suero x 100)

N placas de la diluc. de respaldo

Prueba de Neutralizacin en Placa

(PRNT)

Virus
(Antgeno)

Inoculacin e
Incubacin

Incubacin

Muestras
(con anticuerpos
especificos)

Reaccin
Ag-Ac

Clulas
BHK21-CL15

Reaccin
Positiva

Prueba de Neutralizacin en Placa

(PRNT)

Virus
(Antgeno)

Inoculacin e
Incubacin

Incubacin

Muestras
(sin anticuerpos
especificos)

No hay reaccin
Ag-Ac

Clulas
BHK21-CL15

Reaccin
Negativa

Inhibicin de la
Hemaglutinacin

La presencia de anticuerpos especficos

en el suero del paciente evitan la
aglutinacin de los eritrocitos por tales
antgenos.
Se puede cuantificar con el fin de hacer
una titulacin y determinar el nivel de
anticuerpos del paciente.
Se ha reemplazado por ELISA, pues la
IH no puede diferenciar entre
anticuerpos tipo IgM (infeccin aguda) o
IgG (infeccin antigua).

Inhibicin de la
Hemaglutinacin

Antgeno viral
aglutininas
de HA

Anticuerpos especficos

Ag-Ac bloquean
Inhibicin

Hemadsorcin

La hemadsorcin. Consiste cuando el

virus infectante incorpora protenas
virales con propiedad de hemaglutininas
en la membrana celular.
Las clulas infectadas se pueden
descubrir por la adsorcin de eritrocitos
de ciertas especies animales, que se
puede observar al microscopio de luz.
La identificacin se confirma con la
inmuno fluorescencia directa mediante
anticuerpos especficos.

Hemadsorcin
+ G.R. cobayo =

El virus infectante incorpora protenas virales

con propiedad de hemaglutininas en la
membrana celular, las clulas infectadas se
pueden descubrir por la adsorcin de eritrocitos
de ciertas especies animales, que se puede
observar al microscopio de luz.
Ejemplo: ortomixovirus y paramixovirus

Fijacin del Complemento

(FC)
Emplea el complemento para lisar los eritrocitos que, a su vez,
funcionan como indicadores.
El Ag reacciona con el Ac que se encuentra en la muestra de
suero del paciente, en presencia de complemento titulado
previamente.

Si el Ag y el Ac reaccionan, se activa la va clsica del C, que al

aadir eritrocitos cubiertos con anticuerpos, ocurrir:
Si el complemento se fija y se activa por el complejo Ag viralAc del paciente, los eritrocitos no se lisarn.
Si no hay unin antgeno-anticuerpo el complemento
permanece libre y se une al complejo indicador y produce la
lisis de eritrocitos.

Fijacin del Complemento

(FC)

Ag

complemento

Ac

Ag-Ac

Eritrocitos
cubiertos

Fijacin del Complemento

(FC)

Ag y
complemento

Ac no
especfico No reaccin
C libre

Eritrocitos
cubiertos

HEMOLISIS

HEMAGLUTINACIN (HA)

La hemaglutinacin es la agrupacin de
glbulos rojos de la sangre en
presencia de partculas virales
hemaglutinantes. Este fenmeno es
debido a la presencia de protenas en la
superficie del virus hemaglutinante el
cal reconoce y se adhiere a los
receptores expresados en la superficie
celular de los glbulos rojos.

Para que el fenmeno de la

hemaglutinacin ocurra una partcula
viral debe unirse simultneamente a
dos glbulos rojos creando un
entrecruzamiento, si existe una baja
concentracin de partculas virales la
cantidad de glbulos rojos que se
entrelazar ser mnima y stos caern
hacia el fondo formando un pequeo
botn o pellet.

Los requerimientos para la

hemaglutinacin varan con
los diferentes viruses, estos
requerimientos incluyen
especies de eritrocitos, pH del
diluyente y la temperatura de
incubacin.

HEMAGLUTINACIN (H)

Ag viral
(Hemaglutinina)

Eritrocitos

Hemaglutinacin

HEMAGLUTINACIN (H)

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64 1/128

1/256 1/512

Titulo de hemaglutinacin = 128 UH

1/1024 1/2048 C GR

INHIBICIN DE LA
HEMAGLUTINACIN (HI)

La prueba de inhibicin de esta

prueba ser usada para la identificacin
y cuantificacin de anticuerpos contra
un determinado virus. Un requerimiento
es que el antgeno viral debe ser capaz
de aglutinar los glbulos rojos en un
proceso conocido como
hemaglutinacin. Es necesario un
antgeno viral conocido para la
identificacin y cuantificacin de los
anticuerpos.

La hemaglutinacin est basada en la

unin del anticuerpo al antgeno viral,
capturndolo y no permitindole la unin
con los glbulos rojos inhibiendo de esta
forma la hemaglutinacin. HI es una
prueba sensible, especfica, simple,
barata, rpida y ampliamente usada para
la identificacin y cuantificacin de
anticuerpos virales.

INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN
(IH)

Ag viral

Ac
especficos

Ag-Ac

Eritrocitos
Inhibicin de la
Hemaglutinacin

INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN
(IH)

Ag viral

Ac No Ag libre
especficos

Eritrocitos

Hemaglutinacin

Enfermedades
Virales
Zoonticas
Residen naturalmente en un husped reservorio
animal.
Son totalmente dependientes de sus huspedes
para replicacin y sobreviviencia.
Para la mayora, los roedores y artrpodos son
los principales reservorios.
Sus vectores son las garrapatas y mosquitos.

Hbitats para muestrear

Hbitats para muestrear

COLOCACIN Y REVISIN DE LAS TRAMPAS

Para mamferos de hbitos

diurnos, las trampas se
colocan por la maana y se
revisan varias veces en el da

Si se dejan varios das se

debern levantarse por la
tarde y volver a activarlas y
recebarlas por la maana

Colocacin de
trampas

MEDICIN

Sangradoretro-orbital

Autopsia

Separacin de muestra

Conservacin
de muestras

Registro de datos

Captura de murcilagos

MUESTRAS EN ANIMALES DOMSTICOS

Para la manipulacin de
perros es bueno usar
bozales que cubran el
hocico para evitar que
muerdan a las personas

Ropa de Proteccin

LNEAS CELULARES

Lneas Celulares
Son establecidas a partir de una
suspensin celular preparada
por disociacin enzimtica de
un fragmento de rgano el cal
es inoculado en un frasco de
cultivo conteniendo medio para
su crecimiento e incubado a una
atmsfera controlada.

CULTIVOS CELULARES

Lneas celulares. Son clulas

inmortalizadas en el laboratorio,
resisten (n) nmero de pases y se
caracterizan por derivarse de tejidos
normales o de tumores malignos.
Clulas Vero (rin de mono verde
africano), LLC-MK2 (rin mono rhesus)
y BSC-1 (tambin de tejido normal de
rin de mono) y HeLa y HEp-2
derivadas de clulas humanas
malignas.

CULTIVOS VIRALES

Para los cultivos virales se utilizan

monocapas celulares adheridas al
lecho de un tubo, que requieren de
sustratos esenciales para su
mantenimiento, una solucin
amortiguadora y un pH adecuado,
adems se deben suplementar con
suero fetal bovino, que contiene
mltiples factores promotores de
crecimiento celular.

Medios de Cultivo
El cultivo celular se realiza en medios artificiales
obtenidos de mezcla de componentes
purificados o soluciones orgnicas complejas,
en condiciones fsico-qumico ptimas y sobre
soportes o recipientes que aislan del medio
externo. Consideramos que el medio de cultivo
est formado por 4 elementos importantes:
El sustrato del cultivo
La fase gaseosa
Propiedades fsicas
Condiciones fisiolgicas

Elementos Importantes
a) El sustrato de cultivo: Gran parte de las lneas celulares
crecen en forma de monocapa (Ejemplo: C6/36, Vero,
BHK-21) unidas a un soporte ms o menos slido, otras
crecen en suspensin (Ejemplo: K-562). Tipos de
sustratos ms empleados en la actualidad:
* Vidrio: empleado usualmente, de bajo costo, facilidad
de limpieza y esterilizacin, de fcil visualizacin al
microscopio.
* Plstico: muy empleado en la actualidad (material
desechable estril por irradiacin). El ms empleado es
el polietireno, de buena calidad ptica.

*Otros: microsoportes, microcapilares permeables, etc.

Elementos Importantes
b) La fase gaseosa: componentes ms significativos son:

* Oxgeno
* Dixido de carbono
c) Propiedades fsicas:

* pH: es de 7.4
* Temperatura:
* Viscosidad: evitar dao celular
* Tensin superficial: desnaturalizacin de protenas.
d) Condiciones fisiolgicas: relacionado a la composicin del medio

* Medio Basal de Eagle (BME)-fibroblastos de ratn y HeLa

* Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM)

Componentes del Medio

* Soluciones salinas equilibradas (BSS)

* Aminocidos

* Vitaminas
* Glucosa
* Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular
* Hormonas y factores de crecimiento: suero

Cultivo Celular
El cultivo de clulas in vitro tiene como uno de sus
objetivos fundamentales el aislamiento del
microorganismo.
Diferentes lneas celulares se manejan en el laboratorio:
- Vero (clulas de rion de mono verde Cercopithecus
aethiops)
- C6/36 (clulas de larva de mosquito Aedes albopictus)
- BHK-21 (clulas de hamster Mesocricetus auratus)
El manejo de estas lneas celulares requieren de varias
condiciones y cuidados:
- Requerimientos para el crecimiento celular.
- Dispersin y rotura de tejidos.
- Uso de antibiticos.
- Esquemas de pasajes celulares.

Requerimiento para el
Crecimiento Celular
1. El medio que provee los nutrientes escenciales:
- para sntesis de nuevas clulas
- como sustrato para producir energa matablica
- vitaminas y minerales: funcin cataltica
- iones inorgnicos importantes: funcin cataltica y
fisiolgica.
2. Parmetros fisiolgicos como:
- Temperatura
- Osmolaridad
- PH
- tensin superficial
- viscosidad

Requerimiento para el
Crecimiento Celular
3. El cultivo debe estar libre de efectos txico o
inhibidores
4. Precisar los ajustes cuantitativos, incluyendo las
relaciones del balance entre los componentes del
sistema.
5. Suero Bovino Fetal (inactivado a 56C por 30 minutos)

Dispersin y Rotura de Tejidos

* Los mtodos usados para preparar suspensiones de tejidos
intactos pueden ser clasificados como:
a) Mecnicos (cortado, desmenuzado, cizallado, tamizado)
b) Qumicos (usualmente la omisin de cationes divalentes
con sin adicin de agentes quelantes).
c) Enzimticos (digestin con tripsina, colagenasa, pronasa,
hialuronidasa).
* Dos precauciones deben ser observadas siempre en cultivos
celulares:
el tejido debe estar hmedo y
- una mnima cantidad de tiempo debe transcurrir entre la
extirpacin del tejido y la iniciacin del cultivo.

Uso de Antibiticos en Cultivos

Celulares
El mantenimiento de lneas celulares in vitro requiere la conservacin
de la clula en un medio de cultivo adecuado, con los requerimientos
antes mensionados y en condiciones de esterilidad.
Un complemento que favorece el mantenimiento del medio sin que se
produzca contaminacin ,es el uso de antibitico.
- Ser bactericida antes que bacteriosttico.
- No debe inhibir el crecimiento y desarrollo de las lneas celulares.
- No debe ser txico para el personal del laboratorio ni para la clula.
- Debe ser compatible con los otros componentes del medio
Ms usados son: Penicilina G, Estreptomicina, Amfotericina B

Esquemas de Pasajes Celulares

Pasaje de clulas Vero/BHK-21:
Eliminar el medio actual
Lavar con medio base y eliminar

Lavar con tripsina-EDTA y eliminar

Agregar tripsina-EDTA
Reposo hasta desprendimiento
Agregar cantidad aprop. de medio

Retirar todo el contenido

Depositar en nuevo(s) flask con medio

Esquemas de Pasajes Celulares

Pasaje de clulas C6/36:
Eliminar el medio actual
Lavar con medio base y eliminar
Scrapear y hogenizar bien

Agregar cantidad aprop. de medio

Retirar todo el contenido
Depositar en nuevo(s) flask con medio

Frasco de Cultivo

Materiales
Equipo : Cabina de Flujo Laminar
Incubadora (CO2 opcional)
Microscopio de Fase Invertida
Refrigeradora 4C
Congeladora -20C
Bao Mara 37C
Otros :
25ml.

Pipetas serolgicas 1ml, 5ml, 10ml,

Frascos para cultivo celular 25ml, 75ml,

225ml.
Placas de 6, 12, 24 pozos

Equipos para cultivo celular

Equipos para cultivo celular

EXTRACCIN DE ARN
Kit QIAGEN :
Suero, cultivo de clulas