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Universit de Sherbrooke

Centre universitaire de formation en environnement et dveloppement durable

VALUATION DU POTENTIEL DUTILISATION DUNE EAU USE INDUSTRIELLE


COMME SUBSTRAT DE CULTURE POUR DES MICROALGUES DEAU DOUCE
DANS UNE OPTIQUE DE PRODUCTION DE BIOCABURANTS DE 3e GNRATION

Marie-Eve BOILEAU
Mmoire prsent pour l'obtention du grade de Matre en environnement (M. env.)

Marie-Eve Boileau, 2015


Dpartement de gographie et tldtection
Facult des lettres et sciences humaines

RSUM
Ce projet sinsre dans la tendance qui veut souligner la pertinence des microalgues parmi les
solutions prometteuses au niveau environnemental et conomique pour la fabrication de
biocarburants. Cette recherche souhaite rpondre la demande de lindustrie qui est toujours
la recherche de mthodes de traitement des eaux uses peu coteuses. La faisabilit dutiliser
des eaux uses industrielles trs contamines en composs aromatiques divers comme substrat
de culture a t value avec des espces de microalgues vertes deau douce. Afin de jauger la
faisabilit, le projet a t divis en plusieurs sous-objectifs qui ont permis de slectionner une
souche de microalgues prometteuse et destimer la toxicit du phnol prsent dans leau sur les
microorganismes. Aprs avoir slectionn la souche la plus rsistante leau use, soit
Chlorella vulgaris (souche CPCC90), des essais de croissance dans diffrentes conditions ont
t raliss afin de pouvoir caractriser cette souche. Les conditions idales de croissance pour
CPCC90 sont 20 C et elle peut survivre jusqu des concentrations de 50 % deau use dans
le milieu. Leau use a toutefois un effet toxique important limitant lutilisation dans le milieu
30 % pour lobtention de croissances comparables ce qui est rapport dans la littrature
dans des conditions similaires. Dans ces conditions et avec un clairage important, une
concentration de biomasse de 0,84 g/L a pu tre obtenu. Les souches de Chlorella testes ont
prsent un potentiel de croissance prometteur dans ces eaux, mais la toxicit de ces dernires
sur les microorganismes a grandement limit leur potentiel dutilisation. Afin que leau use
puisse tre utilise comme substrat de culture, il faudrait veiller rduire sa toxicit par un
traitement pralable ou de travailler avec des microorganismes adapts ces types de
contaminants. De plus, il serait essentiel de complmenter le milieu avec des sources de
phosphore et dazote faibles cots. Cette recherche vient complmenter la littrature sur
lutilisation de lespce Chlorella en eaux uses pour la production de biocarburants de 3e
gnration.

Mots cls
Eaux uses, microalgues, biomasse, biocarburants, phnol

TABLE DES MATIRES


RSUM ..................................................................................................................................... 2
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. vii
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................... x
LISTE DES ANNEXES .............................................................................................................. x
LISTE DES ABRVIATIONS ET SYMBOLES ......................................................................xi
REMERCIEMENTS ................................................................................................................ xii
CHAPITRE 1 INTRODUCTION ............................................................................................ 13
CHAPITRE 2 TAT DE LART ET CONCEPTS DE BASE ................................................ 15
2.1 Prsentation du modle Les microalgues deau douce ................................................. 15
2.1.1 Dfinition, classification et cologie ......................................................................... 15
2.1.2 Structure et physiologie ............................................................................................. 15
2.1.3 Composition interne .................................................................................................. 16
2.1.4 Processus et cintique de transport et daccumulation des nutriments ..................... 17
2.1.4.1 Le carbone .......................................................................................................... 17
2.1.4.2 Le phosphore ...................................................................................................... 18
2.1.4.3 Lazote ................................................................................................................ 19
2.1.4.4 Les mtaux .......................................................................................................... 19
2.2 La phytoremdiation des eaux uses ............................................................................... 20
2.2.1 Dfinition .................................................................................................................. 20
2.2.2 Historique de lutilisation des microalgues dans le traitement des eaux................... 21
2.2.3 Le cas des eaux uses industrielles ........................................................................... 21
2.2.4 Les particularits des eaux uses de lindustrie gazire et ptrolire ........................ 22
2.2.4.1 La problmatique des phnols ............................................................................ 22
2.3 Biodgradation, bioaccumulation et prcipitation des contaminants .............................. 23

iii

2.3.1 Dfinitions ................................................................................................................. 23


2.3.2. Les composs phnoliques, les aromatiques divers et les hydrocarbures ................ 24
2.3.3 Les mtaux ................................................................................................................ 27
2.4 La production de biocarburants de 3e gnration............................................................. 29
2.4.1 Principales voies de valorisation nergtique de la biomasse ................................... 31
2.5 Culture en photobioracteur ............................................................................................. 31
2.5.1 Particularits de la culture batch et semi-continue.................................................... 32
2.5.1.1 Turbidostat .......................................................................................................... 33
2.5.2 Limportance des conditions de culture .................................................................... 33
2.5.2.1 Source de lumire ............................................................................................... 33
2.5.2.2 La temprature .................................................................................................... 35
2.5.2.3 Le pH .................................................................................................................. 35
CHAPITRE 3 OBJECTIFS, HYPOTHSES ET LIMITES DE LTUDE ............................ 36
3.1 Cadre thorique global ..................................................................................................... 36
3.2 Objectif #1 : Croissance des microalgues dans les eaux uses industrielles ................... 38
3.3 Objectif #2 : Optimisation de la croissance et mise lchelle ....................................... 39
3.4 Objectif #3 : Analyse de leffet de la prsence de phnol ............................................... 39
3.5 Objectif #4 : Optimisation de la concentration deau use .............................................. 40
CHAPITRE 4 CROISSANCE DANS LES EAUX USES INDUSTRIELLES ..................... 42
4.1 Mthodologie ................................................................................................................... 42
4.1.1 Conditions de culture ................................................................................................ 42
4.1.2 Suivi de culture.......................................................................................................... 43
4.1.3 Calcul du taux de croissance ..................................................................................... 44
4.2 Prsentation et analyse des rsultats ................................................................................ 45
4.2.1 Exprience en eaux uses prleves le 22 mars 2013 Essais prliminaires ........... 45
4.2.2 Exprience en eaux uses prleves le 26 juin 2013 Essais principaux................. 47
iv

4.2.3 Importance de certains minraux .............................................................................. 48


4.3 Discussion et conclusions intermdiaires ........................................................................ 49
CHAPITRE 5 OPTIMISATION DE LA CROISSANCE ........................................................ 53
5.1 Mthodologie ................................................................................................................... 53
5.1.1 Conditions de culture ................................................................................................ 53
5.1.2 Mesure de la fluorescence ......................................................................................... 54
5.1.3 Calcul du taux de croissance ..................................................................................... 55
5.1.4 Culture dans le photobioracteur de 3 L ................................................................... 55
5.2 Prsentation et analyse des rsultats ................................................................................ 56
5.3 Discussion et conclusions intermdiaires ........................................................................ 58
CHAPITRE 6 EFFET DE LA PRSENCE DE PHNOL ...................................................... 61
6.1 Mthodologie ................................................................................................................... 61
6.1.1 Conditions de culture ................................................................................................ 61
6.1.2 Suivi de la croissance ................................................................................................ 61
6.1.3 Mesure du phnol ...................................................................................................... 61
6.2 Prsentation et analyse des rsultats ................................................................................ 62
6.3 Discussion et conclusions intermdiaires ........................................................................ 67
CHAPITRE 7 OPTIMISATION DE LA CONCENTRATION DEAU USE ...................... 69
7.1 Mthodologie ................................................................................................................... 69
7.2 Prsentation et analyse rsultats ...................................................................................... 69
7.3 Discussion et conclusions intermdiaires ........................................................................ 72
CHAPITRE 8 CONCLUSIONS ............................................................................................... 75
ANNEXE 1 DTAILS SUR LA MHODOLOGIE ............................................................. 77
A1.1 Calcul des taux de croissance (Chapitre 4) ................................................................... 77
A1.2 talonnage du fluorimtre maison (Chapitre 5) ............................................................ 79
A1.3 Mthodologie des traitements sur leau use (chapitre 7)............................................. 80
v

ANNEXE 2 DTAILS SUR LES RSULTATS .................................................................. 82


A2.1 Concentration de cellules dans les cultures en eaux uses prleves le 22 mars 2013
(Chapitre 4) ............................................................................................................................ 82
A2.2 Optimisation de la concentration deau use (Chapitre 7) ............................................ 83
ANNEXE 3 ANALYSES DES EAUX USES ..................................................................... 84
ANNEXE 4 RECETTE DU MILIEU BBM .......................................................................... 89
RFRENCES .......................................................................................................................... 90

vi

LISTE DES FIGURES


Figure 1-1 Reprsentation schmatique du projet global dans lequel sinsre ce projet de
matrise ...................................................................................................................................... 14
Figure 2-2 Structures cellulaires dune algue eucaryote [Prescott et al., 2002] ........................ 16
Figure 2-3 tapes confirmes dans le mcanisme de meta-clivage du phnol par des cultures
axniques de O. danica [Semple et Cain, 1996]........................................................................ 26
Figure 2-4 Nombres darticles publis dans les 20 dernires annes sur le sujet des
biocarburants de 3e gnration (obtenu dune recherche dans Web of Science pour le sujet :
algal and biofuels or algae and biofuels ). ........................................................................... 30
Figure 2-5 Courbe de croissance thorique de microalgues [Richmond, 2004] ....................... 33
Figure 2-6 Cintique de croissance de Synecoccus sp. : Taux de croissance spcifique de la
culture en fonction de lclairement [MacIntyre et al., 2002]. .................................................. 34
Figure 4-7 Mthode graphique permettant de calculer le taux de croissance de la souche en
priode de division exponentielle en culture batch ................................................................... 44
Figure 4-8 Comparaison des taux de croissance spcifiques de chacune des souches en milieu
BBM avec 5% (v/v) et 10% (v/v) d'eau use prleve le 22 mars 2013 ................................... 46
Figure 4-9 Comparaison des taux de croissance spcifiques des souches de Chlorella dans un
milieu BBM diffrentes concentrations (v/v) deau use prleve le 26 juin 2013 ............... 48
Figure 4-10 Croissance de Chlorella vulgaris (CPCC90) avec 30% (v/v) deau use et ajout de
minraux slectionns uniquement. ........................................................................................... 49
Figure 5-11 Montage exprimental utilis pour lexprience de caractrisation des souches.
Six blocs daluminium refroidis ou chauffs contenant chacun douze puits dans lesquels
lclairement a t ajust sparment. ....................................................................................... 53
Figure 5-12 Fluorimtre maison ayant permis de faire le suivi de la croissance pour
lexprience de caractrisation .................................................................................................. 54
Figure 5-13 Systme dclairage du bcher thermostat de 3 L................................................ 55
Figure 5-14 Rsultats des taux de croissance moyens de CPCC90 dans chacun des milieux aux
diffrentes tempratures ............................................................................................................ 56
Figure 5-15 Rsultats des taux de croissance moyens de MA2H6 dans des milieux
diffrentes tempratures ............................................................................................................ 57
vii

Figure 6-16 Croissance de CPCC90 dans un milieu BBM contenant diffrentes concentrations
de phnol ................................................................................................................................... 63
Figure 6-17 Comparaison de la croissance de CPCC90 dans diffrents milieux de culture ..... 63
Figure 6-18 Mesure de labsorbance dans diffrentes solutions de minraux avec phnol aprs
7 jours dincubation temprature pice ................................................................................... 66
Figure 6-19 Mesure de labsorbance sur des milieux de culture avec phnol et eau use ........ 66
Figure 7-20 Compilation des rsultats de croissance spcifique de CPCC90 dans des milieux
BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite ........................................................... 70
Figure 7-21 Compilation des rsultats de croissance spcifique de MA2H6 dans des milieux
BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite ........................................................... 70
Figure 7-22 Compilation des rsultats de croissance spcifique de PCH25 dans des milieux
BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite ........................................................... 70
Figure 7-23 valuation de leffet du pH sur la croissance de CPCC90 dans diffrents milieux
de culture ................................................................................................................................... 71
Figure7- 24 quilibre du CO2 /HCO3-/CO32- en fonction du pH [Becker, 1994]...................... 73
Figure A-25 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et la
concentration de chla pour les diffrentes souches dans un milieu BBM 5 % deau use
prleve le 22 mars 2013 ........................................................................................................... 77
Figure A-26 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et la
concentration de chla pour les diffrentes souches dans un milieu BBM 10 % deau use
prleve le 22 mars 2013 ........................................................................................................... 77
Figure A-27 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et la
concentration de chla dans une culture de Chlorella vulgaris CPCC90 dans un milieu BBM
30 % deau use prleve le 26 juin 2013 ................................................................................. 78
Figure A-28 Courbe dtalonnage du fluorimtre maison avec la mesure de la chla avec une
mthode dextraction ................................................................................................................. 79
Figure A-29 Suivi de lvolution de la concentration de cellules dun rplica de culture pour
chacune des souches en milieu BBM avec 5% (v/v) deau use prleve le 22 mars 2013...... 82
Figure A-30 Suivi de lvolution de la concentration de cellules dun rplica de culture pour
chacune des souches en milieu BBM avec 10% (v/v) deau use prleve le 22 mars 2013 ... 82

viii

Figure A-31 valuation de leffet du pH sur la croissance de MA2H6 dans diffrents milieux
de culture traits......................................................................................................................... 83

ix

LISTE DES TABLEAUX


Tableau 2-1 Bioaccumulation et transformation de pesticides slectionns par les algues
eucaryotes [Semple et al., 1999] ............................................................................................... 27
Tableau 3-2 Composition sommaire des eaux uses industrielles ............................................ 36
Tableau 3-3 nonc des objectifs secondaires de ltude ......................................................... 37
Tableau 4-4 Souches de microalgues utilises pour les exprimentations ................................ 42
Tableau 5-5 Comparaison des rsultats de croissance de CPCC90 dans le BBM 30 % deau
use obtenus dans diverses expriences .................................................................................... 58
Tableau 6-6 Spcifications de la mthode de mesure des phnols au HPLC. ........................... 62
Tableau 6-7 Rsultats des mesures de phnol obtenues au HPLC sur diffrentes solutions de
phnol ........................................................................................................................................ 65
Tableau A-8 Valeurs correspondant aux courbes de tendance linaires de la Figure A-25 et la
Figure A-26 ............................................................................................................................... 78
Tableau A-9 Donnes relatives la Figure A-27 ...................................................................... 78

LISTE DES ANNEXES

ANNEXE 1 DTAILS SUR LA MHODOLOGIE..............72


A1.1 Calcul des taux de croissance (Chapitre 4) .......72
A1.2 talonnage du fluorimtre maison (Chapitre 5)....74
A1.3 Mthodologie des traitements sur leau use (chapitre 7).....75
ANNEXE 2 DTAILS SUR LES RSULTATS.......76
A2.1 Concentration de cellules dans les cultures en eaux uses prleves le 22 mars 2013
(Chapitre
4).....76
A2.2 Optimisation de la concentration deau use (Chapitre 7)....77
ANNEXE 3 ANALYSES DES EAUX USES.....78
ANNEXE 4 RECETTE DU MILIEU BBM...85

LISTE DES ABRVIATIONS ET SYMBOLES

ATP

Adnosine triphosphate

BBM

Bold basal medium

CDM

Carbonate de dimthyle

Chla

Chlorophylle a

CO2

Dioxyde de carbone

COVs

Composs organiques volatils

DCO

Demande chimique en oxygne

Del

Diode lectroluminescente

DMSO

Dimthylsulfoxyde (solvant organique)

Fm

Fluorescence maximale

Fv

Fluorescence variable

Fv/Fm

Rendement quantique de photosynthse obtenu par fluorescence variable

GC-FID

Gas chromatography Flame ionization detector

HAPs

Hydrocarbures aromatiques polycycliques

HCl

Acide chlorhydrique

HPLC

High performance liquid chromatography

pH

Potentiel hydrogne

UVs

Ultra-violets

UV-VIS

Rayonnement ultra-violet et visible

xi

REMERCIEMENTS
Je tiens remercier sincrement Carina Poulin pour son importante contribution. Sans son
aide, je naurais sans doute pas pu terminer lintrieur de dlais aussi courts! Grce sa
grande patience et surtout au prcieux temps quelle ma accord au laboratoire, jai pu
dbuter ce projet avec des bases solides.
Je remercie galement Jennifer Vandenhecke, Mariette Lambert et Patrick Cliche pour leur
appui (technique et moral) tout au long de ce projet.
Finalement, je tiens remercier Yannick Huot et Jean-Michel Lavoie pour lopportunit et
pour le support essentiel la ralisation de ce projet.

xii

CHAPITRE 1 INTRODUCTION
Pour des raisons rglementaires, conomiques et environnementales, les entreprises sont de
plus en plus concernes par la diminution de lempreinte environnementale de leurs activits.
Cette tendance a entran lavancement de nombreuses recherches dans le domaine du
traitement des effluents industriels et plus particulirement des eaux de procds.
Les microalgues sont apparues comme une solution dans une optique de durabilit
environnementale. En effet, elles pourraient permettre de retirer efficacement les nutriments
en fortes concentrations dans les eaux uses, avec comme second avantage de produire une
biomasse pouvant tre utilise comme matire premire la production de biocarburants.
Dans un tel scnario, les eaux uses constitueraient une source peu coteuse de substrat de
culture. Ces biocarburants sont typiquement diviss en trois gnrations :
1) La premire gnration signifie gnralement la production de biodiesel et de
biothanol partir de biomasses agricoles, comme le canola ou le tournesol pour le
biodiesel et le mas et la canne pour le biothanol.
2) Les biocarburants de seconde gnration englobent plutt une production dhuiles ou
dthanol partir de biomasses lignocellulosiques.
3) Finalement, la dernire gnration de biocarburants est base sur lutilisation de CO2
comme source de carbone, permettant par exemple de produire une biomasse algale
valorisable par la suite en thanol ou en huile.
Cest dans ce contexte, la jonction des technologies environnementales et de celles des
biocarburants de 2e et de 3e gnration, que se base ce projet de matrise. Celui-ci sinsre dans
un projet dcologie industrielle de plus grande envergure, visant permettre la revalorisation
de rejets industriels de diffrentes industries lies au domaine des biocarburants. La Figure 1-1
ci-dessous schmatise lensemble du projet de valorisation des dchets industriels dans lequel
la prsente recherche sintgre. Les rejets de deux entreprises (entreprises A et B, encadr 1)
seraient utiliss comme substrat pour la croissance algale alors quune 3e (entreprise C,
encadr 2) fournirait la matire filtrante ncessaire pour sparer la biomasse du milieu aqueux.

13

Finalement (encadr 3), la biomasse et la matire filtrante pourraient tre valorises


conjointement sous forme de biocarburants.

Figure 1-1 Reprsentation schmatique du projet global dans lequel sinsre ce projet de
matrise

Le projet se divise donc en 3 parties distinctes : la culture dalgues et lutilisation des effluents
industriels comme milieu nutritif (1), la sparation de la biomasse du milieu liquide (2) et la
valorisation de la biomasse et de ses produits (3). Lactuel projet de matrise touche plus
spcifiquement la premire section et cible lvaluation de la faisabilit dutiliser leau use
industrielle comme substrat de culture pour la production de microalgues. Pour lentreprise,
cette tude devait permettre dobtenir une ide gnrale et rapide du potentiel dun tel procd
et de soulever les diffrents dfis entourant la culture de microalgues dans leurs eaux uses.
Dans cette optique, lapproche adopte a donc t de survoler plusieurs aspects de la culture de
microalgues dans les eaux uses industrielles. Dans un premier temps, il a t ncessaire de
slectionner une souche de microalgues vertes deau douce capable de survivre dans leau
use industrielle et didentifier ses caractristiques en conditions optimales de croissance.
Ensuite, son potentiel de retrait des contaminants viss, soient les composs phnoliques, est
valu et des solutions sont proposes pour optimiser le procd.
14

CHAPITRE 2 TAT DE LART ET CONCEPTS DE


BASE
2.1 Prsentation du modle Les microalgues deau douce
2.1.1 Dfinition, classification et cologie
Les microalgues sont des microorganismes photosynthtiques ubiquistes. Elles se retrouvent
prfrentiellement dans les habitats aquatiques, quils soient marins ou deau douce [Macedo
et al., 2009]. Bien quelles puissent tre fixes au fond (benthos), les plus pertinentes flottent
librement dans leau et font ainsi partie du phytoplancton [Andersen, 2005]. Les microalgues
sont dfinies comme des organismes eucaryotes unicellulaires ou pluricellulaires
indiffrencis.
Les microalgues utilises dans cette tude seront des microalgues unicellulaires vertes deau
douce, appartenant la division des Chlorophytes. Ces dernires ont dmontr des
caractristiques intressantes pour le traitement des eaux uses trs contamines. Le genre
Chlorella, en particulier, est cit dans de nombreuses tudes portant sur la remdiation deaux
uses, ce qui a tabli son intrt pour cette recherche [Agrawal et Manisha, 2007; Headley et
al., 2008; Li et al., 2013].

2.1.2 Structure et physiologie


Les microalgues peuvent mesurer de quelques microns plusieurs centaines de microns, selon
les espces. Elles ont la capacit de faire de la photosynthse oxygnique, soit de convertir de
manire biologique lnergie lumineuse en liens nergtiques chimiques, qui sont ensuite
accumuls sous forme de composs organiques [Falkowski et Raven, 2007]. Cette raction
photosynthtique forme galement de loxygne gazeux.
Les diffrents groupes de microalgues possdent gnralement plusieurs pigments
photosynthtiques. Toutes contiennent de la chlorophylle a (chla), qui peut tre complmente
selon les classes et les espces par des chlorophylles b, c, ou d et diverses carotnodes. Les
Chlorophytes ne contiennent que des chorophylles a et b ainsi que des carotnodes. On peut

15

distinguer deux types de pigments, les pigments photosynthtiques et les pigments nonphotosynthtiques.
Cest dans les chloroplastes, et plus prcisment dans les membranes thylacodes, que se
droule la raction doxydorduction qui permet de rduire le dioxyde de carbone partir de
lhydrogne de leau en sucres simples et en oxygne. La Figure 2-2 suivante prsente les
principales structures des cellules algales eucaryotes.

Figure 2-2 Structures cellulaires dune algue eucaryote [Prescott et al., 2002]

La membrane plasmique est une structure compose de polysaccharides et de protines plus


ou moins complexes et en proportions variables selon les espces [Van Den Hoek, 1995]. Elle
est charge ngativement, ce qui est attribuable la composition des groupes fonctionnels qui
y sont associs. Elle confre aux cellules une certaine rsistance aux ions mtalliques
potentiellement toxiques, ce qui motive leur utilisation pour le traitement des eaux [Monteiro
et al., 2012].

2.1.3 Composition interne


Sur une basse sche, les microalgues sont constitues majoritairement de carbone [Van Den
Hende et al., 2012]. La composition interne en mtabolites varie selon les espces, mais peut
aussi varier normment selon les conditions du milieu. Typiquement, les cellules contiennent
16

entre 30 % et 50 % (poids sec) de protines et le reste du carbone est principalement contenu


sous forme de glucides (5-40 %) et de lipides (3-20 %) [Falkowski et Raven, 2007]. Les
besoins nutritifs lmentaires en C:N:P dune cellule de microalgues est denviron 106:16:1
[Redfield, 1934]. Ces ratios peuvent toutefois varier dune espce lautre et selon les
conditions de croissance. Les microalgues qui contiennent de la chlorophylle b, par exemple,
prsentent gnralement des ratios N : P et C : P plus levs que celles qui contiennent de la
chlorophylle c [Falkowski et Raven, 2007].
Les microalgues ont dmontr une certaine capacit accumuler rapidement les lipides, ce qui
leur a permis de se profiler dans le domaine des biocarburants. Des concentrations internes de
lipides de plus de 30 % ont t obtenues en laboratoire en utilisant des eaux uses comme
milieu de culture [Pittman et al., 2011]. Par ailleurs, il a t dmontr quune limitation en
azote dans le milieu stimulerait la production de lipides dans la cellule [Chen et al., 2011].

2.1.4 Processus et cintique de transport et daccumulation des nutriments


2.1.4.1 Le carbone
Les microalgues peuvent assimiler une grande varit de formes de carbone inorganique ou
organique selon les espces. Le glucose, lactate, le glycrol, le fructose, le sucrose, le
lactose, le galactose et le mannose sont des exemples de formes de carbone organique qui
peuvent tre assimiles par certaines microalgues [Chen et al., 2011]. linverse, cest le CO2
(ou le HCO3-) qui est la source de carbone inorganique utilise. Selon les conditions dans
lesquelles elles se trouvent, les microalgues peuvent modifier le type de carbone quelles
utilisent et le moyen dont elles acquirent leur nergie. Il est alors question de variation dans
le mode trophique, dont trois types se distinguent.
Autotrophie : Les autotrophes utilisent la lumire comme source dnergie et le CO2 gazeux,
ou carbone inorganique, comme source de carbone. Il sagit du processus de photosynthse.
Htrotrophie : Les htrotrophes utilisent le carbone organique comme source de carbone et
comme source dnergie. Ils peuvent galement tre photohtrotrophes et utiliser la lumire
comme source dnergie.

17

Mixotrophie : Il sagit de la capacit modifier sa source de carbone selon les besoins


(autotrophe ou htrotrophe). Certaines espces de microalgues sont mixotrophes, ou
galement appeles photoautotrophes facultatives, puisquelles sont en mesure dutiliser le
CO2 comme source de carbone et la lumire comme source dnergie. Cependant, elles
peuvent galement utiliser le carbone organique pour combler les besoins en carbone
ncessaires leur croissance [Falkowski et Raven, 2007].
Le carbone inorganique disponible pour les cellules se prsente principalement sous la forme
de CO2 ou de HCO3-. Le CO2 est la seule forme de carbone qui peut traverser librement la
membrane cellulaire ou lenveloppe du chloroplaste par diffusion. Le CO2 et le HCO3- peuvent
tre transfrs dans la cellule via un mcanisme de transport actif dans la membrane.
Les microalgues ont dmontr une capacit utiliser diffrentes formes de carbone, mme
celui prsent sous forme de composs aromatiques. Les systmes de dgradation proposs
dans la littrature sont prsents plus-bas dans la section 2.3.
2.1.4.2 Le phosphore
Lassimilation du phosphore est rgule par un processus ionique et chimique [Falkowski et
Raven, 2007]. Il entre dans la cellule par un transport actif travers la membrane cellulaire qui
est activ directement ou indirectement par lATP [Raven, 1984]. Le phosphore est
assimilable par les cellules lorsquil est sous forme de phosphate inorganique (H2PO4- ou
HPO42- en milieu marin) ou dans les molcules organiques solubles. Dans le dernier cas, les
molcules peuvent tre rendues assimilables par les espces autotrophes qui utilisent des
phosphatases pour hydrolyser les groupes phosphates [Falkowski et Raven, 2007].
Une fois incorpor dans la cellule, le phosphore entre dans la composition des glucides, des
lipides, dans le squelette carbon ou dans le processus nergtique par lentremise des
ractions utilisant ladnosine triphosphate (ATP). Il est le principal constituant de lADN et
des phospholipides, qui composent entre autres la membrane cellulaire.
Une limitation en phosphore peut nuire lactivit photosynthtique en rduisant la vitesse
laquelle les protines de lappareil photosynthtique sont fabriques [Falkowski et Raven,
2007]. Cette carence peut galement nuire la fixation du carbone et la reproduction
cellulaire. Le phosphore joue en effet un rle essentiel dans le cycle de Calvin. De plus, il
18

participe la voie des pentoses phosphate, voie qui sert la production du NADPH essentiel
la synthse des acides gras. Donc, la production de lipides pourrait ultimement tre aussi
affecte par une telle carence [Jacob et Lawlor, 1993] [Falkowski et Raven, 2007].
2.1.4.3 Lazote
Pour les microalgues autotrophes, les sources dazote inorganiques assimilables sont les
nitrates (NO3-), les nitrites (NO2-) et lammonium (NH4+) [Falkowski et Raven, 2007]. part
certaines cyanobactries, peu de microorganismes sont capables de fixer lazote gazeux
[Prescott et al., 2002]. La forme NH4+ est la plus facilement assimilable par les cellules qui
peuvent lutiliser sans rduction pralable [Prescott et al., 2002]. Cependant, la forme NO3- est
la plus frquemment rencontre dans les environnements aquatiques puisquelle est plus stable
[Falkowski et Raven, 2007].
Le transport des nitrates et de lammonium travers la membrane plasmique se fait par un
transport actif aliment par lATP. Le transport est activ par le flux secondaire de H+ et de
Na+ qui est amorc grce au gradient ionique cr par lATP. Une fois entrs dans le cytosol,
le NO3- et le NH4+ sont emmagasins dans les vacuoles [Falkowski et Raven, 2007].
Les mcanismes dassimilation de lazote inorganiques dpendent de la disponibilit des
substrats de carbone et de lATP rendue disponible par la photosynthse et la respiration. Une
limitation en azote peut nuire ces processus [Falkowski et Raven, 2007]. En effet, la capacit
photochimique du photosystme II est grandement diminue, ce qui rend les cellules plus
vulnrables la photoinhibition [Kolber et al., 1988]. La carence en azote ralentit la synthse
des protines et diminue donc la concentration interne protique lintrieur de la cellule. La
diminution du contenu protique est alors souvent relie une augmentation proportionnelle
du contenu en glucides ou en lipides [Falkowski et Raven, 2007].
2.1.4.4 Les mtaux
Certains mtaux sont essentiels la croissance et jouent des rles varis dans les diffrents
mcanismes cellulaires. Par exemple, le potassium (K+), le calcium (Ca2+), le magnsium
(Mg2+) et le fer (Fe2+ et Fe3+) sont tous prsents dans la cellule sous forme de cations et entrent
par exemple dans lactivit ou la synthse de plusieurs enzymes et dans la synthse des
cytochromes [Prescott et al., 2002]. Certains autres micronutriments, comme le manganse, le
19

zinc, le cobalt, le molybdate, le nickel et le cuivre sont ncessaires en faibles quantits pour les
cellules et servent gnralement de cofacteurs ou aident la catalyse des ractions et au
maintien des structures des protines [Prescott et al., 2002]. En gnral, les milieux naturels
assurent lapport en ces diffrents lments et ne sont pratiquement jamais limitants,
[Reynolds, 2006] puisque leur rapport stoichiometrique par rapport aux nutriments majeurs
(azote et phosphore) est suffisamment lev. Ils doivent cependant tre inclus dans les milieux
synthtiques afin dobtenir des concentrations de biomasses importantes. Les rares limitations
en micronutriments chez les algues ont t rapportes pour le fer et le molybdne, [Goldman,
1960] [Dumont, 1972] et ce, gnralement dans les milieux ocaniques loin des ctes. Le fer
est le mtal le plus important pour les algues. Il est impliqu dans plusieurs processus, dont
ceux de la photosynthse et de lassemblage des membranes des thylacodes [Reynolds, 2006].
Les cellules peuvent acqurir le fer grce une rduction des complexes ferriques ralise au
travers de la membrane plasmique des microalgues et catalyse par des enzymes spcifiques
[Merchant et al., 2006]. Lacquisition des mtaux solubles se fait principalement par diffusion
au travers de la membrane, soit par transport passif. Les transports actifs prennent ensuite le
relais lintrieur de la cellule pour intgrer les diffrents mtaux dans leurs rles respectifs
[Nies, 1999].

2.2 La phytoremdiation des eaux uses


2.2.1 Dfinition
Comme il a t soulev, les microalgues ont besoin dlments nutritifs prsents dans le milieu
pour leur croissance. Leurs capacits retirer ces composs les rendent intressantes et
potentiellement performantes pour la phytoremdiation, qui consiste en lutilisation de
vgtaux pour le retrait ou la bioconversion de polluants contenus dans un milieu contamin
dans le but de le traiter [Rawat et al., 2011] [Olgu n, 2003 .
Les microalgues htrotrophes sont intressantes pour la phytoremdiation, puisquelles
peuvent permettre de retirer des sources de carbone organique du milieu. Lhtrotrophie est
utilise pour le traitement des eaux, mais la mixotrophie est galement cible lorsque des
rejets gazeux de CO2 veulent tre valoriss.

20

2.2.2 Historique de lutilisation des microalgues dans le traitement des eaux


Ds le dbut des annes 70, lintention dutiliser les algues dans le traitement tertiaire deaux
municipales tait bien prsente. Le traitement avait t envisag pour rduire le potentiel
eutrophisant de ces eaux [Wang et al., 2010]. Il sest avr que ces algues prsentaient un
potentiel de traitement encore plus important que prvu et quelles pouvaient retirer de
nombreux nutriments des eaux, avec une efficacit suprieure aux boues actives. Il semblait
donc conomiquement plus intressant dutiliser ces microorganismes en traitement
secondaire plutt que tertiaire [Tam et Wong, 1989]. Les tangs ars ont t utiliss pour ces
applications. Les rsultats inattendus, quant leur efficacit de phytoremdiation et leur
rapidit de croissance, ont pouss plusieurs auteurs tester la croissance de diffrentes espces
dalgues dans des eaux uses spcifiques, afin de vrifier leur potentiel pour la production de
biocarburants prix plus comptitifs.
Plusieurs auteurs rapportent des rsultats concluants quant lefficacit des microalgues vertes
pour le traitement des eaux uses charges en nutriments. Par exemple, Wang et al. (2010) ont
vrifi en laboratoire la capacit de retrait des nutriments par Chlorella sp. en eaux uses
municipales. Les rsultats obtenus ont permis de conclure que ces microalgues peuvent
facilement crotre en utilisant les eaux uses comme substrat dans un volume de 100 mL. Elles
sont de plus en mesure de retirer des quantits non ngligeables de mtaux, de phosphore et de
nitrates et de diminuer la demande chimique en oxygne (DCO). Les meilleurs rsultats de
croissance et de retrait ont t obtenus avec le milieu le plus riche en nutriments (N et P
principalement) [Wang et al., 2010]. Dautres tudes lchelle laboratoire ont fourni des
conclusions semblables avec des espces de microalgues et des compositions deaux uses
diffrentes [Samor et al., 2013] [Cabanelas et al., 2012] [Cho et al., 2013].

2.2.3 Le cas des eaux uses industrielles


Davantage dtudes ont t ralises sur lutilisation des microalgues pour la phytoremdiation
des eaux uses municipales que pour les eaux uses industrielles. Le fait que les eaux
industrielles contiennent plus de composs possiblement toxiques pour les algues que les eaux
municipales pourrait expliquer la difficult dapplicabilit de ce traitement. De plus, la
composition des eaux uses industrielles peut tre variable dune production lautre, ce qui
rend difficile lutilisation dun procd standardis. Les quelques recherches ralises sur la
21

phytoremdiation deaux largement contamines en composs dangereux lont t le plus


souvent avec des bactries ou des plantes plutt quavec des microalgues. Cependant, lintrt
grandissant des microalgues pour la filire des biocarburants de 2e et de 3e gnration a
contribu augmenter le nombre dexprimentations avec ces microorganismes.

2.2.4 Les particularits des eaux uses de lindustrie gazire et ptrolire


Les eaux uses provenant de lindustrie gazire et ptrolire prsentent des compositions trs
variables selon la nature du procd. Celles-ci contiennent gnralement de grandes quantits
de :

Matires organiques dissoutes (benzne, tolune, thylbenzne, xylnes, phnols et


acides organiques)

Matires organiques en suspension (ex. : hydrocarbures, huiles et graisses);

Matires inorganiques dissoutes (ex. : mtaux lourds, sulfates, nitrites et nitrates);

Sels dissous (ex. : chlorures et bromures) [MDDEFP, 2012]

Les technologies qui sont le plus souvent rencontres pour le traitement de ces composs
lchelle industrielle sont des mthodes chimiques (oxydation), physiques (adsorption) ou des
mthodes biologiques (boues actives) [MDDEFP, 2012]. Les microalgues ont tout de mme
fait leurs preuves dans le traitement de composs dangereux, tels les phnols, les
hydrocarbures et les autres composs aromatiques retrouvs dans ce type deaux. Cependant,
leur efficacit na t dmontre jusqu'ici quen laboratoire.
2.2.4.1 La problmatique des phnols
Le compos phnolique le plus simple est le phnol. La molcule (C6H60) est compose dun
cycle aromatique benznique et dun groupement hydroxyle. Il se retrouve dans les rejets de
plusieurs industries puisquil sert la fabrication de nombreux produits. Il entre, entre autres,
dans la fabrication de rsines et de plastiques et il est le second plus important driv industriel
du benzne, aprs le styrne.
Le phnol est particulirement difficile retirer des eaux uses de faon biologique puisquil
peut tre particulirement toxique pour les bactries anarobies et arobies [Pinto et al., 2002].
Il serait plus toxique que le tolune et le benzne pour les algues [Agrawal et Gupta, 2009].
Les mthodes actuelles favorises pour retirer ce compos sont plutt de type chimique
22

comme lozonation, la chloration et lextraction par solvant ou des procds de floculation, de


coagulation ou dadsorption par charbon activ, cette dernire tant la plus commune
[Aravindhan et al., 2009]. Les transformations chimiques prsentent toutefois le risque de
crer des composs chimiques intermdiaires encore plus toxiques que le phnol lui-mme ou
les polyphnols [Chavan et Mukherji, 2010].
Malgr tout, certains traitements biologiques, particulirement avec des consortiums
bactriens et des champignons ont dj t utiliss en htrotrophie. Plusieurs souches
dalgues vertes non pr-acclimates aux composs phnoliques simples et qui se sont avres
tre rsistantes ces derniers ont dj t identifies en milieu synthtique en laboratoire
[Pinto et al., 2002]. Pour des souches de microalgues Chlorella non pr-acclimates, la
concentration toxique a t rpertorie plus de 400 mg/L [Olivier et al., 2003][Tiler et
Zagorc-Koncan, 1997]. Olivier (2003) a dtermin que Chlorella vulgaris peut galement
rsister certains composs phnoliques chlors lorsque les concentrations sont relativement
faibles, soient gnralement infrieures 20 mg/L.

2.3 Biodgradation, bioaccumulation et prcipitation des contaminants


2.3.1 Dfinitions
Le retrait de contaminants dun milieu peut gnralement se faire par lentremise de diffrents
mcanismes, dont la bioaccumulation, la biodgradation ou la prcipitation.
La bioaccumulation ne constitue pas un processus destructif. Il sagit plutt dun processus par
lequel il y a un transfert de pollution du milieu de culture vers la cellule. En fait, la cellule
possde des mcanismes lui permettant dabsorber ou dadsorber les contaminants et de les
accumuler, soit lintrieur ou la surface de la membrane cellulaire [Yang et al., 2005]. Ce
mcanisme ne permet pas aux cellules dutiliser les contaminants pour leur croissance, mais
mne tout de mme la phytoremdiation dune eau.
Le terme biodgradation ou la biotransformation est dfini de faon gnrale comme le
mcanisme permettant de transformer les contaminants en composs assimilables par la
cellule, contrairement la transformation chimique qui produit les deux isomres des
composs, dont un seul est ensuite assimilable par les cellules [Prescott et al., 2002]. La
biodgradation peut dcrire trois types de changements que peuvent induire les microalgues. Il
23

peut sagir dune minralisation des contaminants, soit dune transformation complte des
molcules organiques en composs inorganiques assimilables par les cellules. Le terme
englobe galement les modifications plus mineures sur les cycles aromatiques, comme le
remplacement dun groupe fonctionnel laissant la structure initiale intacte ou la fragmentation
complte. La biodgradation peut impliquer des enzymes intra- ou extracellulaires ou peut tre
rgit par des modes de transport actif, lorsque le contaminant en question peut tre directement
intgr dans les voies normales de bioconversion de la cellule [Prescott et al., 2002].
Finalement, la prcipitation rfre lhabilet des cellules transformer les mtaux solubles
en complexes insolubles par lentremise de produits oxydants disponibles sur la membrane
cellulaire [Wood et Wang, 1983].

2.3.2. Les composs phnoliques, les aromatiques divers et les hydrocarbures


Quelques espces seraient en mesure de crotre en htrotrophie en utilisant les sources de
carbone aromatique dans certaines conditions [Neilson et Lewin, 1974]. Toutefois, la voie
arobie serait gnralement prfre [Contreras et al., 2008]. Dailleurs, il a t dmontr que
la dgradation des phnols par Ochromonas danica (Chrysophyte) ne pouvait se faire quen
condition arobie [Semple et Cain, 1996]. Il a galement t prouv que des conditions de
mixotrophie favorisent la minralisation des composs phnoliques et diminuent leur toxicit
sur les microalgues [Tikoo et al., 1997]; [Megharaj et al., 1992]. Cependant, un excs de CO2
dans le milieu peut grandement nuire la croissance en mixotrophie et diminuer lefficacit de
retrait des substrats organiques [Sforza et al., 2012].
Dans le mme ordre dide, Melo (2005) observe de la croissance algale et de la dgradation
du phnol lorsque sa concentration dans le milieu est de 50 ppm [Melo et al., 2005]. Il suggre
galement quun manque doxygne pourrait tre limitant pour la dgradation du phnol,
puisquil a observ que dans un bcher de 5 L, en prsence dun consortium bactrien adapt
au phnol, de loxygne dissous nest uniquement mesur que lorsque le phnol a t
totalement dgrad. Ces observations confirment celles ralises par dautres auteurs qui
constataient que la biodgradation ncessitait la prsence doxygne molculaire pour initier le
bris du cycle aromatique [Semple et al., 1999; Semple et Cain, 1996]. La biodgradation du
phnol serait galement un processus photorgul [Papazi et Kotzabasis, 2007]. Dans son
tude, Papazi (2007) dmontre que le phnol peut servir de source de carbone pour la
24

croissance de Scenedesmus obliquus, comme il a t dmontr que le 2,4-dichlorophnol peut


galement permettre de soutenir une croissance algale de Tetraselmis marina plus longtemps
que pour un milieu synthtique standard [Petroutsos et al., 2008]. En conditions
dhtrotrophies, Ochromonas danica a galement dmontr une capacit utiliser le phnol
comme source de carbone [Semple et Cain, 1996]. Le rendement de croissance calcul en
prsence de phnol tait proportionnel la quantit de phnol utilise et lutilisation du phnol
tait comparable celle du glucose.
Dautres algues deau douce ont t reconnues pour tre en mesure de cataboliser le cycle
aromatique du phnol. Aprs une incubation de 48 h en prsence de phnol et de catchol
marqu au carbone-14, ce dernier a t retrouv dans les cellules de Chlorella pyrenoidosa,
Euglena gracilis bacillaris, Phormidium foveolarum, Chlamydomonas ulvaensis, prouvant
ainsi la capacit de dgradation des cycles aromatiques [Ellis, 1977]. Dans le cadre de cette
tude, il sest avr quune exposition prliminaire de chacune des souches 0,1 mM de
phnol avait un effet inhibiteur sur le catabolisme subsquent du phnol et dans certains cas,
elle causait une rduction visible de la croissance. Il a aussi t dmontr que des macroalgues
Sargassum muticum et des microalgues taient aussi en mesure de dgrader des composs
phnoliques plus complexes que le phnol [Petroutsos et al., 2007; Petroutsos et al., 2008;
Rubn et al., 2006].
Le pH est aussi un paramtre important dans la dynamique de retrait des composs
phnoliques. Aravindhan (2009) dterminait que le pH optimal pour labsorption du phnol
par des macroalgues tait autour de 6 et il observait des variations importantes dans la capacit
de biosorption des algues en pH acide ou basique [Aravindhan et al., 2009]. Annadurai (2002)
faisait le mme constat avec un mlange de bactries et de Pseudomonas putida (bactrie)
[Annadurai et al., 2002].
Les mcanismes biochimiques impliqus dans le catabolisme de ces polluants ne sont toujours
pas bien dfinis [Semple et al., 1999]. Diverses enzymes pourraient tre impliques dans les
processus doxydation des cycles aromatiques. Il semble quautant pour les cellules
procaryotes queucaryotes, les mcanismes de biodgradation ncessitent la prsence de
molcules doxygne pour initier lattaque enzymatique [Lika et Papadakis, 2009; Semple et
al., 1999; Semple et Cain, 1996]. Lhydroxylation du cycle benznique se fait par linsertion
25

dun oxygne, qui est influenc par la prsence denzymes hydroxylases et de cofacteurs
associs [Karegoudar et Kim, 2000]. Une voie typique pour la mtabolisation du phnol serait
lhydroxylation du cycle pour former du catchol et ensuite ouvrir le cycle via lortho- ou la
mta-oxydation [Ellis, 1977; Semple et al., 1999]. Des phnomnes de minralisation ont
galement t observs trs faible chelle chez les cellules eucaryotes pour le [cycle-14C]
phloroglucinol [Craigie et al., 1965].
La Figure 2-3 ci-dessous prsente le mcanisme oxydatif du phnol par Ochromonas danica,
tel que propos par Semple et Cain (1996).

Figure 2-3 tapes confirmes dans le mcanisme de meta-clivage du phnol par des
cultures axniques de O. danica [Semple et Cain, 1996]

26

Il a aussi t dtermin que certaines souches peuvent bioaccumuler des composs


aromatiques et ainsi rduire la toxicit de leffluent, comme il est indiqu dans le Tableau 2-1
suivant.

Tableau 2-1 Bioaccumulation et transformation de pesticides slectionns par les algues


eucaryotes [Semple et al., 1999]

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont dautres composs qui sont
toxiques pour la plupart des organismes vivants. Leur faible solubilit dans leau peut
expliquer leur persistance dans lenvironnement [Ghasemi et al., 2011]. Les algues
russiraient les dgrader en attaquant les cycles aromatiques grce la production doxygne
et ensuite grce dautres voies mtaboliques compltant le clivage [Lika et Papadakis, 2009]
[Juhasz et Naidu, 2000]. De plus, loxydation partielle des HAPs par les microalgues
favoriserait leur dgradation dans les milieux aqueux en augmentant leur biodisponibilit et
leur biodgradabilit [Meulenberg et al., 1997].
Mme si certaines souches algales sont en mesure de dgrader les composs aromatiques, les
mcanismes sont ralentis et peuvent mme tre arrts lorsque les concentrations deviennent
toxiques pour les cellules [Semple et al., 1999].

2.3.3 Les mtaux


Tel que rapport prcdemment, certains mtaux sont ncessaires la croissance des
microalgues et peuvent tre utiliss comme oligonutriments. Ils peuvent donc en principe tre
retirs plus facilement du milieu. Toutefois, la majorit des mtaux peuvent avoir des effets
inhibiteurs plus ou moins forts sur les cellules lorsque leurs concentrations deviennent trop
importantes [Prescott et al., 2002]. Toutefois, leffet toxique des mtaux essentiels la
27

croissance sobserve gnralement des concentrations beaucoup plus leves que pour les
mtaux non essentiels [Wood et Wang, 1983].
Prescott et al. (2002) propose trois groupes de mtaux selon leurs interactions avec les
microorganismes : les mtaux nobles, les mtaux formant des liaisons carbone-mtal stables
(ou mtaux lourds) et les autres mtaux. Dans le cas des mtaux nobles, comme largent, lor
ou le platine par exemple, les microorganismes rduisent des formes ioniques de ces mtaux
en formes lmentaires. Les mtaux lourds, comme le mercure, larsenic ou le plomb, peuvent,
quant eux, tre transforms par les microorganismes de leurs formes organiques et
inorganiques en formes mthyles, dont certaines formes peuvent tre encore plus toxiques
que les structures originales [Prescott et al., 2002]. Les mtaux de ce groupe sont en fait
transforms en produits plus mobiles appels organomtaux. Les mtaux lourds peuvent
galement tre retenus par des processus de squestration. Les microalgues utilisent des
processus similaires ceux utiliss par les autres microorganismes, soit par adsorption la
surface des cellules ou par des mcanismes dabsorption utilisant par exemple les
phytochlatines [Wilde et Benemann, 1993]. Il est alors question principalement du
mcanisme de bioaccumulation par les cellules. Le processus de formation de ces complexes a
t tudi en partie [Triki, 1997], mais reste encore peu connu. Les microorganismes
photosynthtiques peuvent galement relcher des mtabolites permettant la chlation des ions
mtalliques lextrieur des cellules [Muoz et Guieysse, 2006]. Finalement, les mtaux
comme le cuivre, le cobalt, le zinc ou le fer, qui font partie des lments essentiels aux cellules
et qui sont inclus dans le groupe des autres mtaux, peuvent devenir toxiques lorsquils sont
prsents sous formes ionises en trop grande concentration. Lefficacit de retrait des mtaux
est donc difficile grer, puisque leur prsence peut avoir ou non des effets inhibiteurs sur la
croissance algale [Zerhouni et al., 2004]. Il reste toutefois possible dutiliser les algues pour
retirer les mtaux des effluents en les utilisant pour des applications dans les limites de leur
tolrance [Zerhouni et al., 2004] ou en utilisant des algues modifies gntiquement pour
rsister des concentrations leves de mtaux [Perales-Vela et al., 2006].
Les microalgues peuvent utiliser de nombreux mcanismes pour retenir les mtaux et ceux-ci
peuvent varier en fonction des conditions de culture. Par exemple, le pH change non
seulement la chimie des mtaux, mais modifie galement le positionnement et la disponibilit
28

des groupes fonctionnels la surface des membranes cellulaires [Sheng et al., 2004]. Les
microalgues peuvent donc autant accumuler les mtaux lintrieur de leur cellule en crant
des poches temporaires pour emprisonner les mtaux et prvenir leur toxicit que forcer leur
prcipitation grce des composs se trouvant la surface des membranes cellulaires [Wood
et Wang, 1983]. La prcipitation la surface rsulterait de la biosynthse dagents oxydants ou
de linteraction avec la sulfate rductase membranaire des cellules qui induit la formation de
complexes mtalliques insolubles.
Les cellules eucaryotes ont un avantage sur les cellules procaryotes pour la rsistance aux
mtaux puisque les membranes des diffrentes structures internes assurent une protection
supplmentaire et augmentent le nombre de mcanismes pouvant dgrader ou incorporer les
diffrentes formes mtalliques [Wood et Wang, 1983]. Cependant, il est important de
considrer que la capacit de fixation des diffrents mtaux varie dune souche lautre et en
fonction de lge de la culture et de lensemble des conditions externes [Wilde et Benemann,
1993].

2.4 La production de biocarburants de 3e gnration


Les biocarburants de 3e gnration sont ceux qui sont entre autres obtenus partir de biomasse
algale. Ils sont tudis dans le but de complmenter les biocarburants de 2e gnration produits
partir de biomasses lignocellulosiques. Il semble que ce 3e type de biocarburant soit un des
plus prometteurs pour le remplacement des carburants diesel actuels [Chisti, 2007].
Lengouement pour la production de biocarburants algaux est trs prsent et lintrt
technologique est vident lorsquon constate laugmentation rapide du nombre de publications
rserves cette tude dans la dernire dcennie (voir Figure 2-4 suivante).

29

Figure 2-4 Nombres darticles publis dans les 20 dernires annes sur le sujet des
biocarburants de 3e gnration (obtenu dune recherche dans Web of Science pour le
sujet : algal and biofuels or algae and biofuels ).

Il savre que les microalgues possdent plusieurs avantages intressants pour cette
application. En effet, les microalgues ont lavantage davoir une grande capacit de production
par superficie, si on compare avec les diffrentes biomasses ligncellulosique par exemple.
Dans les bonnes conditions, les cellules peuvent accumuler des triglycrides, qui peuvent tre
utiliss pour produire du biodiesel via la transestrification [Cadoret et Bernard, 2008]. De
plus, il est possible doptimiser le contenu lipidique intracellulaire, soit par le contrle des
conditions de croisance ou via des modifications gntiques.
Il reste toutefois plusieurs dfis relever pour cette production. Les performances sont trs
variables en fonction des conditions de culture et des quipements utiliss. Les concentrations
de cellules atteintes doivent tre maximises. Par exemple, en systme semi-intensifs, des
masses sches se situant seulement autour de 0,2 g/L ont t observes [De la Noue et Proulx,
1986]. De plus, il est parfois difficile de maintenir une production en continue d au risque de
contaminations qui peuvent survenir par des rotifres par exemple [Fulks et Main, 1991]. Les
rendements et les cots de production dpendent beaucoup du mode trophique utilis. Lorsque
les effluents gazeux de CO2 sont utiliss comme substrat, les besoins nergtiques peuvent se
reflter sur lclairage ncessaire. Avec une production en htrotrophie, il est possible de
rduire ces cots, mais faut-il encore avoir un substrat de carbone efficace et peu dispendieux.
30

Ltape de sparation de la biomasse pose galement un problme. moins que les algues
soient relativement grosses ou quelles floculent naturellement, cette tape est laborieuse,
considrant les grands volumes de liquide sparer. Les techniques de floculation semblent
tre le meilleur traitement [De la Noue et Proulx, 1986]. Il reste donc beaucoup faire pour
densifier les cultures afin de faciliter, par le fait mme, ltape de sparation.

2.4.1 Principales voies de valorisation nergtique de la biomasse


La biomasse produite peut tre valorise par dautres faons que par la production de
biodiesel. Selon la composition du contenu intracellulaire, les voies de valorisation peuvent
tre la mthanisation, la fermentation alcoolique, la combustion ou la gazification. Si la
biomasse est riche en glucides, elle peut tre utilise comme substrat la fermentation
alcoolique afin de produire de lthanol, par exemple. La biomasse riche en carbone peut
galement tre transforme en mthane. Ces deux voies ont lavantage de diminuer les cots
de sparation et dliminer le besoin de schage de la biomasse. La combustion et la
gazification sont des processus difficilement applicables cause du contenu en eau important
et ils ne permettent pas de mettre en valeur les divers sous-produits potentiels de la biomasse.
Finalement, si la biomasse est plutt riche en lipides, leur extraction reste possible pour en
faire la valorisation en biodiesel.

2.5 Culture en photobioracteur


Il existe principalement deux grandes catgories de photobioracteurs savoir le type ouvert,
dans lequel la biomasse est laisse lair libre et le type ferm, dans lequel tous les paramtres
de culture peuvent tre contrls. Lavantage conomique des systmes ouverts sexplique
entre autres par le fait quil ny a pas de contrle des paramtres, tels lclairage et la
temprature qui ncessitent un apport nergtique important, contrairement aux systmes
ferms.
Une tude ralise avec deux photoracteurs de 6 L, soient un de type tang ouvert et lautre
de type tubulaire ferm, a soulign entre autres que la production de biomasse, sa composition
et lefficacit photosynthtique dans les deux modles de photobioracteurs ont donn des
rsultats similaires [Gonzlez-Fernndez et al., 2010]. Or, mme sil est plus dispendieux et
quil prsente des rsultats comparables dans certains cas, le choix du modle ferm prsente
plusieurs avantages. Il permet par exemple doffrir des environnements contrls plus
31

favorables la croissance de certaines espces et qui rduisent les risques de contamination


[Borowitzka, 1999]. Pour les tudes en laboratoire, ces conditions sont gnralement
prfres, car elles permettent un meilleur contrle des conditions de la culture. De plus, les
photobioracteurs ferms pourraient tre plus intressants pour le traitement deffluents
puisquils augmenteraient lefficacit dutilisation de la matire organique [GonzlezFernndez et al., 2010].

2.5.1 Particularits de la culture batch et semi-continue


Dans un mode de culture batch, la biomasse et les nutriments sont incorpors au dbut et
aucun ajout nest effectu par la suite. Dans un tel cas, la croissance de la biomasse est donc
ralentie lorsquun des lments essentiels pour la division cellulaire nest plus prsent en
quantit suffisante pour soutenir le mtabolisme. Cette mthode de culture est particulirement
utile pour ltude des conditions limitantes pour la croissance cellulaire. En effet, lorsquil ny
a aucun ajout de nutriments, lvolution thorique de la croissance se fait selon cinq phases
reprsentes par la courbe de la Figure 2-5. Il sagit des phases de latence (1), dacclration
(2), de croissance exponentielle (3), stationnaire (4) et de dcroissance (5). Ces phases se
succdent mesure que les nutriments du milieu sont consomms.
Phase de latence (1) : Les cellules ont besoin dun certain temps dacclimatation au nouvel
environnement.
Phase dacclration (2) : Les cellules ont russi accumuler suffisamment de composs
intracellulaires pour dbuter la croissance par reproduction vgtative [Andersen, 2005].
Phase de croissance exponentielle (3): La croissance est exponentielle et est maintenue
constante jusqu ce que la composition du milieu ne soit plus optimale [Andersen, 2005].
Phase stationnaire (4) : Un des lments du milieu devient limitant. Les quantits de cellules
qui se divisent et qui meurent sont gales, ce qui produit un plateau de croissance. Les lipides
et les glucides peuvent continuer saccumuler dans cette phase [Andersen, 2005].
Phase de dcroissance (5) : La plupart des cellules ont puis leurs rserves intracellulaires
de composants et elles nont plus suffisamment dnergie leur disposition pour poursuivre la
maintenance cellulaire et meurent [Richmond, 2004].
32

Figure 2-5 Courbe de croissance thorique de microalgues [Richmond, 2004]

En culture semi-continue ou continue, malgr lapport constant en nutriments, une limitation


en certains nutriments peut tout de mme survenir. Pour viter ce phnomne, il faut contrler
la concentration de cellules dans le bioracteur. Cest lopration en turbidostat qui permet
lobtention dune culture non-limite et qui assure une division constante des cellules. Le
volume de culture est galement maintenu constant en prvoyant une sortie de milieu, par
exemple, par surverse ou par pompage. La culture doit ncessairement tre amorce en mode
batch, jusqu ce que la concentration de cellules souhaite soit atteinte.
2.5.1.1 Turbidostat
Le turbidostat est un mode dopration en continu qui consiste maintenir la turbidit du
milieu constante. Celui-ci est intressant puisquil permet doprer la concentration de
biomasse choisie et de maintenir la population dans ltat souhait [Falkowski et Raven,
2007], gnralement dans la phase exponentielle. La concentration optimale varie dune
espce lautre et est base sur leur profil de croissance en fonction de lclairement.

2.5.2 Limportance des conditions de culture


2.5.2.1 Source de lumire
La source de lumire utilise pour clairer le photobioracteur peut tre interne ou externe. La
distance entre les cellules et la source de lumire influence grandement lefficacit
dclairement. En effet, une distance plus petite est thoriquement prfrable puisquelle
assure une utilisation maximale de la lumire par les algues et limite les effets dombrage
entre les cellules. Une luminosit bien rpartie permet donc datteindre des densits de
33

biomasse plus importantes, puisque mme les cellules se trouvant au centre peuvent avoir
accs la source de lumire. Toutefois, selon le type dclairage slectionn, un clairage
interne peut tre impossible d la production importante de chaleur par certaines sources de
lumire conventionnelles [Chen et al., 2011]. Les diodes lectroluminescentes (del)
deviennent populaires pour ce genre dapplications puisquelles ont lavantage de produire peu
de chaleur, de consommer peu dnergie et peuvent avoir de petits diamtres qui permettent de
les inclure lintrieur des photobioracteurs troits [Chen et al., 2011].
La lumire, bien quessentielle pour la croissance des algues en photoautotrophie et
photohtrotrophie, ne doit pas tre utilise en excs. Dans la plupart des cas, les algues ont
une cintique de croissance en fonction de lclairement qui ressemble celle prsente la
Figure 2-6. Une augmentation linaire de la croissance est observe initialement avec
laugmentation de lclairement jusqu un niveau de saturation qui est spcifique chaque
espce. Dans le cas de Porphyridium purpureum par exemple, la saturation survient autour de
100 E/(m2 s) [Posten, 2009]. La valeur de saturation lumineuse de lespce cible est donc
importante connatre puisquelle permet de rduire les pertes dnergie qui pourraient
rsulter dun clairage excessif. De plus, des phnomnes de photoinhibition peuvent survenir
des niveaux dclairage beaucoup trop importants.

Figure 2-6 Cintique de croissance de Synecoccus sp. : Taux de croissance spcifique de


la culture en fonction de lclairement [MacIntyre et al., 2002].

34

2.5.2.2 La temprature
Une variation importante de la temprature peut affecter les diverses ractions biochimiques
lintrieur de la cellule. Ces effets peuvent affecter les vitesses et les capacits dacquisition
des nutriments. Par exemple, Demon et al. (1989) a entre autres observ une augmentation de
la capacit de retrait de larsenic, du cadmium, du zinc et du cuivre avec laugmentation de la
temprature chez Scenedesmus [Demon et al., 1989]. De la mme faon, la temprature peut
modifier la composition chimique intracellulaire en modifiant la nature des composs prsents
dans le milieu. La temprature affecte galement la croissance algale. Le taux de croissance
augmente avec la temprature, jusqu latteinte de la temprature optimum de croissance. Par
la suite, leffet sinverse et la croissance peut alors tre ralentie par une temprature trop
leve. Il a t dmontr avec Chlorella que le mtabolisme cellulaire est ralenti de faibles
tempratures, mais que la quantit de lumire reue est la mme. La cellule reoit donc plus
dnergie quelle ne peut en transformer [Huner et al., 1998]. Les modifications du
mtabolisme sont alors semblables celles utilises pour contrer la photoinhibition.
2.5.2.3 Le pH
Comme pour la temprature, chacune des espces a son propre pH idal. Le pH joue un rle
important sur la forme des composs carbons et des minraux disponibles dans le milieu
[Becker, 1994]. Il influence aussi la capacit de diffusion du CO2 vers lintrieur de la cellule
[Balkos et Colman, 2007] et permet de rguler lactivit enzymatique intra- et extracellulaire
[Beardall et al., 1998] [Bartual et Glvez, 2002].

35

CHAPITRE 3 OBJECTIFS, HYPOTHSES ET


LIMITES DE LTUDE
3.1 Cadre thorique global
Comme il a t prsent, de nombreuses recherches ont t faites sur le traitement de leau par
les microalgues, mais peu impliquaient le retrait de composs tel que le phnol. De plus, la
plupart se sont concentres sur les eaux uses municipales, en raison de leurs fortes
concentrations en phosphore et en azote. Les rsultats prsents sur certaines eaux uses
industrielles trs contamines sont limits la composition exacte de cette eau et ne peuvent
donc pas tre gnraliss cette tude. Lindustrie des biocarburants a des problmatiques
chimiques spcifiques et complexes. On retrouve trs souvent dans leurs rejets des composants
chimiques de type phnolique. Lintrt des microalgues est donc de trouver un traitement
deau efficace avec une valeur ajoute pour lindustrie.
Leau use industrielle utilise dans ce projet avait une composition complexe. Afin de mieux
la comprendre, elle a t analyse par un laboratoire externe spcialis. Les rsultats reus sont
rsums dans le Tableau 3-2 suivant. La composition prsente dans ce tableau correspond
celle de leau prleve le 26 juin 2013. Les analyses compltes sont prsentes dans lannexe
3. lexception de quelques rsultats prliminaires, la prsente tude se limite lvaluation
de leffet de leau prleve ce jour-l, sur les souches de microalgues testes, afin de permettre
une comparaison des rsultats entre eux.
Tableau 3-2 Composition sommaire des eaux uses industrielles
Composs
Phnol
Phnols-chlors
(o-, m-, p-) crsol
COVs
HAPs
Azote
Ammoniacal
Kjeldahl
Phosphore
Mtaux : Arsenic
Nickel
Cd, Cr, Cu, Mo, Pb, Zn
36

Concentration (ppm)
60,4
1,5
32
0,8
1,3
774
787
0
46
0,23
0

Par ces rsultats danalyses, il tait possible de constater que plusieurs composs possiblement
toxiques pour les algues taient prsents et dans certains cas, en trs fortes concentrations. Les
contaminants prsents en plus grandes concentrations sont les produits phnoliques (phnols,
phnols chlors, (o-, m-, p-) crsol), dont le phnol qui en compose environ 60 %.
Le but global de ce projet tait donc dvaluer la possibilit dutiliser leau use en question
comme substrat de culture pour des microalgues afin, si possible, dobtenir une biomasse
valorisable en biocarburants. Malheureusement, d des contraintes techniques, il na pas t
possible de valider la composition interne de la biomasse et ainsi de valider son potentiel pour
une valorisation en biocarburant. Malgr tout, le projet a t divis en quatre objectifs
secondaires qui devaient permettre datteindre la majeure partie de lobjectif principal. Ceuxci sont prsents dans le Tableau 3-3 suivant.

Tableau 3-3 nonc des objectifs secondaires de ltude


Objectifs secondaires
#1 Slection de souches et
estimation de la croissance des
cultures en eaux uses
(Chapitre 4)
#2 Optimisation de la croissance
et mise lchelle
(Chapitre 5)
#3 Analyse de leffet de la
prsence du phnol
(Chapitre 6)
#4 Optimisation de la
concentration deau use
(Chapitre 7)

Dtail
1) Choix de la souche la plus rsistante
2) Identification de la concentration maximale
deaux uses pouvant tre ajoute
3) valuation de la ncessit de lajout de
nutriments
1) Caractrisation de la souche
2) Essais en photobioracteur de 3L
1) valuation de leffet du phnol sur la
croissance des microalgues
2) Identification de la concentration limite en
phnol que peuvent tolrer les microalgues
3) Dtermination de la capacit de retrait du
phnol par les microalgues
1) valuation de leffet dun traitement
pralable des eaux uses sur la croissance
des microalgues

Afin de pouvoir fournir lindustrie une rponse rapide sur la faisabilit de cultiver des
microalgues dans les eaux use industrielles, il a t choisi de tester plusieurs aspects de la
croissance. Ce choix a impliqu plusieurs expriences et a donc rduit le nombre de rplicas
37

quil tait logistiquement possible de faire pour chaque culture. Ceci a galement rendu
impossible une analyse statistique pousse sur les rsultats et a limit les conclusions pouvant
tre tires. Cependant, les rsultats obtenus peuvent permettre didentifier les aspects qui
devront tre considrs plus en dtails pour la suite et valids par des expriences qui pourront
tre plus labores.
Il est noter que, pour faciliter la comprhension de chacune des expriences ralises, le
prsent chapitre et les subsquents ont t diviss en fonction des quatre objectifs secondaires
mentionns. Les mthodologies et les rsultats sont donc discuts sparment pour chacun de
ces objectifs.

3.2 Objectif #1 : Croissance des microalgues dans les eaux uses


industrielles
Puisquaucun traitement biologique sur leau use nest en place lusine, il ntait pas
possible dutiliser des microorganismes dj pr-acclimats cette eau. Cest donc huit
souches de microalgues vertes deau douce qui ont t retenues pour dbuter ce projet. Le
premier objectif tait donc de slectionner la souche la plus rsistante ces eaux uses et de
dterminer la concentration maximale deau use quil tait possible dajouter dans le milieu
tout en maintenant une croissance cellulaire intressante, savoir une croissance comparable
ce qui se retrouve dans la littrature pour lespce, dans les conditions dclairement.
Puisque les souches de microalgues ntaient pas pr-acclimates leau use industrielle de
ltude, la premire hypothse tait quil serait probablement impossible de travailler avec
100 % deau use. Pour ce qui tait de la slection, il tait difficile de prvoir quelles souches
performeraient le mieux. En effet, les souches taient toutes soient de lespce Chlorella ou
Scenedesmus, deux espces qui apparaissent rgulirement dans la littrature concernant le
traitement deaux uses.
Il est important de mentionner que ltude a t limite lessai de ces souches, mme sil ne
sagissait pas de souches pr-acclimates ou modifies gntiquement. De plus, leau use
utilise avait une composition unique correspondant la production du 26 juin 2013, cette
composition tant variable selon ltape de fonctionnement de lusine et des intrants utiliss
pour la production. Les rsultats de survie ne seront donc pas ncessairement valables pour
38

une autre composition deau use. Ils devraient cependant tre indicatifs et permettre dtablir
un aperu des limites attendues pour les eaux provenant de cette usine.

3.3 Objectif #2 : Optimisation de la croissance et mise lchelle


Le 2e objectif devait permettre de dterminer quelles sont les conditions de culture idales
pour la souche retenue et didentifier les paramtres (temprature et clairement) pouvant
permettre damliorer sa croissance. Le but de cet objectif tait dobtenir les courbes de
croissance de chacune des souches en fonction de lclairement et de dterminer leur
temprature optimale de culture.
Les algues prsentent gnralement un profil de croissance exponentielle asymptotique (taux
de croissance en fonction de lclairement fourni) (voir Figure 2-6). La valeur dclairement
correspondant latteinte du plateau dpend de la souche de microalgues. Il tait donc attendu
dobserver ce mme profil exponentiel pour chacune des souches, aux diffrentes tempratures
et pour chacun des milieux tests. En principe, lajout deau use, si elle nest pas toxique,
dans un des milieux devrait favoriser la croissance par lajout de carbone organique qui peut
permettre la croissance en mixotrophie. Cependant, lhypothse est que la couleur plus fonce
de cette eau puisse diminuer la quantit de lumire disponible.
Des essais dans un volume plus grand, soit en photobioracteur de 3 L, ont t raliss par la
suite dans les conditions idales afin de valider les courbes de croissance obtenues.

3.4 Objectif #3 : Analyse de leffet de la prsence de phnol


Puisque le phnol est le contaminant prsent en plus grande concentration dans les eaux uses
reues, il tait intressant disoler leffet de ce contaminant sur les algues. Cest pourquoi des
milieux synthtiques avec ajout de solution de phnol ont t tests dans diffrentes
conditions. Le but de ce sous-objectif tait de vrifier leffet du phnol sur la croissance des
microalgues et de dterminer leur capacit retirer ce compos. Ces diffrentes variables ont
t tudies sparment dans des expriences indpendantes, comme il le sera dtaill dans le
Chapitre 6.
La littrature est plutt limite en ce qui a trait la capacit de dgradation ou dassimilation
du phnol par les microalgues. Par contre, comme il a t prsent dans la revue
39

bibliographique, il semble raliste de croire que le phnol puisse agir comme source de
carbone pour les microalgues, tant quil est prsent des concentrations non toxiques pour
celles-ci. Il pourrait permettre daccrotre la performance de croissance par rapport au milieu
initial pauvre en carbone. Par le fait mme, le phnol risque donc dtre retir entirement du
milieu. De plus, la littrature semble indiquer que les microalgues pourront rsister des
concentrations importantes de phnol pouvant aller jusqu 400 ppm [Olivier et al.,
2003][Tiler et Zagorc-Koncan, 1997].

3.5 Objectif #4 : Optimisation de la concentration deau use


Cette srie dexpriences avait comme objectif de diminuer la toxicit de leau use sur les
microalgues, afin de pouvoir augmenter sa concentration dans les milieux de culture. Le
traitement tait donc ralis uniquement sur leau use, avant mme quelle soit utilise dans
le milieu de culture (donc, en absence dalgues).
Le choix des traitements a t bas sur laspect de la complexit et du cot. En effet, puisque
lentreprise souhaite minimiser ses cots de traitement deaux uses, il fallait tenter de trouver
des mthodes simples qui pourraient sinsrer facilement en amont dun bioracteur de
culture. Puisquil est connu que les traitements doxydation chimique sont ceux les plus
rgulirement utiliss pour le retrait des phnols et des autres composs aromatiques, les
traitements tests ont t les suivants : lclairage aux ultraviolets, lozonation, laration et le
bullage au CO2. Dans un premier temps, il savrait intressant de tester un simple bullage
lair afin de vrifier si la volatilisation de certains composs pouvait diminuer la toxicit. Dans
le mme but, un bullage avec du CO2 a t test. Le CO2 a galement lavantage de faire
baisser le pH du milieu, ce qui a comme effet de diminuer la solubilit du phnol et
possiblement den rduire sa toxicit. Dautres traitements doxydation ont t ajouts, soient
le traitement aux ultraviolets et celui lozone, afin de vrifier leurs effets sur la toxicit de
leau use Le choix de ces derniers a t fait en fonction des disponibilits des quipements.
Il est attendu que ces traitements puissent avoir un effet positif sur la croissance des
microalgues. Toutefois, certaines rserves persistaient quant lutilisation des traitements
doxydation, puisque de tels traitements pouvaient mener la formation de composs
intermdiaires possiblement plus toxiques pour les microalgues. Il est noter que lobjectif
tait davoir un portrait rapide du potentiel de ces diffrents traitements et que ceux-ci nont
40

pas t optimiss. Cest pourquoi, il est possible que ces intermdiaires toxiques puissent tre
vits dans le cas o les temps de contact ou les dbits seraient modifis.

41

CHAPITRE 4 CROISSANCE DANS LES EAUX USES


INDUSTRIELLES
4.1 Mthodologie
4.1.1 Conditions de culture
Les huit souches de microalgues testes initialement dans les eaux uses sont prsentes dans
le Tableau 4-4 suivant.

Tableau 4-4 Souches de microalgues utilises pour les exprimentations

1
2

Nom attribu
JN15
JN17
JN36
LB1H10
MA2H6
PCH25
CPCC90
CPCC157

Genre
Scenedesmus
Scenedesmus
Chlorella
Chlorella
Chlorella
Chlorella
Chlorella
Scenedesmus

Espce
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
vulgaris
obliquus

Provenance/priode
Rivire Ottawa/t
Rivire Ottawa/t
Rivire Ottawa/t
Lac Croche/t
Fleuve St-Laurent/t
Rivire Ottawa/t
-

Fournisseur
UdeM1
UdeM1
UdeM1
UdeM1
UdeM1
UdeM1
CPCC2
CPCC2

Universit de Montral, isole par lquipe du Pr. Patrick Hallenbeck


Canadian Phycological Culture Centre

Il sagit dans tous les cas dalgues vertes deau douce de diamtre se situant entre 5 et 10 m.
Les souches ont t reues dans le milieu Bold basal medium (BBM) (voir annexe 4), sans
ajout de source de carbone complmentaire [Andersen, 2005]. Il a donc t choisi de conserver
ce milieu de culture pour tout le projet. De plus, ce milieu est pauvre en carbone, ce qui allait
permettre de mieux percevoir leffet de leau use sur la croissance.
Pour la survie des souches dans les eaux uses, il fallait remplacer une certaine proportion du
volume deau milli-Q ncessaire pour la fabrication du milieu BBM par de leau use. Le
pourcentage deau use dans le milieu correspond au volume deau use par rapport au volume
total du milieu, en incluant les solutions de minraux (% v/v). Indpendamment de la
proportion deau use, la concentration finale en nutriments correspond celle du milieu BBM
42

(i.e. que les nutriments nont pas t dilus). De cette faon, il a t possible de suivre leffet
inhibiteur de leau use sur les algues, en sassurant de ne pas avoir de carence en lments
essentiels. Avant son ajout dans le milieu de culture, leau use tait filtre sur un filtre
0,2 m.
Pour lexprience qui a permis de dterminer limportance de certains minraux sur la
croissance, le milieu tait prpar avec 30 % (v/v) deau use. Pour chaque culture teste,
seuls les minraux choisis taient ajouts dans les mmes proportions que pour le milieu BBM
complet. Aucun des autres minraux ntaient ajouts.
Les microalgues ont t cultives en batch, cest--dire quelles taient cultives jusqu ce
que la concentration atteigne un plateau ou que la dcroissance commence. Afin de rduire le
temps de latence et davoir une croissance reprsentative, les cultures taient inocules partir
de microalgues pr-acclimates la condition dclairement et la concentration deau use.
Les microalgues taient repiques deux reprises lorsquelles taient en phase exponentielle et
cest la croissance aprs le 3e repiquage qui a t utilise pour dterminer le taux de
croissance.
Les cultures de 200 mL ont t maintenues 22 1 C dans des bouteilles de culture en
plastique de 250 mL. Le montage a permis dclairer les deux cts des bouteilles et de fournir
un clairement denviron 300-350 mol photons m-2 s-1 en continu. Lclairement a t
mesur avec la sonde PAR scalaire US-SQS/L (Waltz, Allemagne) branche la console Light
meter LI-250A (LI-COR, USA). Lagitation a t assure par un petit barreau magntique
tournant faible vitesse. Aucune aration na t injecte en cours de culture. Chaque
condition de culture a t teste en duplicata. Les cultures taient inocules environ
50 g chla L-1.

4.1.2 Suivi de culture


Le suivi de la croissance sest fait par la mesure de la concentration de chla avec un Trilogy
Laboratory Fluorometer (Mthode CHL A NA, Turner Designs, USA) aprs une extraction
avec un mlange actone 90 % (v/v) : DMSO dans des proportions 3 : 2 (v/v) [Andersen,
2005]. Des chantillons de 1 mL taient prlevs quotidiennement et lextraction de la chla
tait ralise sur 200 L dchantillon.
43

Lefficacit photosynthtique a galement t suivie avec la mthode de fluorescence, afin de


faire un suivi de ltat physiologique des microalgues. Lutilisation du fluorimtre AquaPen
100 (Photon Systems Instruments, Rpublique Tchque) a permis de mesurer le rendement
quantique de sparation de charge du photosystme II (Fv/Fm) [Butler, 1978]. Avec cette
mthode, les cellules rcoltes sont places 30 minutes dans le noir puis exposes un flash
lumineux 630 nm.
La concentration de cellules a aussi t mesure pour quelques cultures avec le Coulter
Counter (Beckman) avec un tube dune ouverture de 50 m. Pour le comptage, une solution
saline de 0,9 % NaCl dans de leau milli-Q a t utilise pour diluer les chantillons.

4.1.3 Calcul du taux de croissance


Le taux de croissance a t calcul partir des donnes de chla recueillies. Le taux de
croissance optimal a t calcul en trouvant la pente de la droite maximale observe sur un
graphique du logarithme naturel de [chla] en fonction du temps, ce qui correspond au moment
o la croissance tait en phase exponentielle. La mthode est explique par la Figure 4-7 ci-

5000

10,00

4000

8,00

ln [Chl a]

[Chl a] ug/L

dessous.

3000
2000

6,00
4,00
2,00

1000

0,00

0
0

Temps jr

10

12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Temps jr

Figure 4-7 Mthode graphique permettant de calculer le taux de croissance de la souche


en priode de division exponentielle en culture batch

44

Le calcul du taux de croissance se fait selon lquation 4-1 suivante :


quation 4-1
N0 : quantit de cellules initiale; N : quantit de cellules aprs t; : taux de croissance; t : intervalle
de temps slectionn.

Pour toutes les expriences, la croissance est dfinie en fonction de la concentration de chla,
mais les rsultats peuvent facilement tre convertis en quantit de cellules. En effet, des
relations linaires ont t observes entre la concentration de cellules et la concentration de
chla en phase exponentielle de croissance, ce qui permet daffirmer que la fluorescence a t
un moyen efficace de faire le suivi. Les graphiques et calculs permettant daffirmer ce fait sont
prsents en annexe de ce document (annexe 1). Ceci est logique puisque lorsque toutes les
composantes de la cellule varient au mme taux (balanced growth) la mesure du taux de
croissance est indpendante de la composante mesure. Ceci est vrai pour la croissance
constante et moins lorsque la croissance diminue, mais ceci tait suffisant pour le suivi voulu.
Dans ce document, les taux de croissance prsents dans les graphiques sont gnralement une
moyenne calcule partir des taux obtenus pour une mme souche, dans une condition de
culture donne, pour chaque rplica de culture.

4.2 Prsentation et analyse des rsultats


4.2.1 Exprience en eaux uses prleves le 22 mars 2013 Essais prliminaires
la suite des premires observations faites avec de leau use rcolte le 22 mars 2013, qui
avait un plus fort contenu en matire dissoute que celle utilise par la suite, il a t possible de
constater que les souches ne pouvaient pas rsister des concentrations deau use suprieures
ou gales 15 %. En effet, les premiers essais effectus avec 15 % et 50 % deau use ont tous
deux prsents une mort rapide de toutes les souches de microalgues. Des flocs blancs taient
visibles dans les cultures ds le 2e jour. Les mesures de chla et une valuation du Fv/Fm ont
confirms la mort cellulaire.
Des essais supplmentaires 5 % et 10 % deau use ont t faits afin de prslectionner les
meilleures souches (voir Figure 4-8). Les souches CPCC90, MA2H6 et PCH25 ont dmontr
45

des taux de croissance spcifiques parmi les plus levs aux deux concentrations testes,
soient respectivement de 1,18, 1,56 et 1,15 jr-1 5 % deau use et 0,55, 0,71 et 0,65 jr-1
10 %. 5 % deau use, les souches JN15 et JN17 ont prsentes des taux de croissance
comparables aux taux des trois souches prcdentes, soient de de 1,33 et de 1,32 jr-1, alors que
CPCC157, JN36 et LB1H10 avaient des taux beaucoup plus faibles se situant entre 0,49 et
0,79 jr-1. 10% deau use, les taux de croissance ont significativement diminus pour toutes
les souches. Les taux de croissance de CPCC157 et LB1H10 ont t beaucoup plus faibles que
les autres, soient respectivement de 0,17 et 0,20 jr-1, alors que CPCC90, JN15, JN17 et JN36
ont prsent des taux de croissance plus levs de respectivement 0,55, 0,46, 0,48 et 0,40 jr-1.
MA2H6 et PCH25 ont encore prsents les meilleurs rsultats.
En comparant les concentrations de cellules atteintes par chacune des souches, il est possible
de constater qu 10 % deau use, ce sont les souches CPCC90, PCH25 et MA2H6 (dans une
moindre mesure) qui atteignent les densits de cellules les plus leves (annexe 2).

Figure 4-8 Comparaison des taux de croissance spcifiques de chacune des souches en
milieu BBM avec 5% (v/v) et 10% (v/v) d'eau use prleve le 22 mars 2013

Ces rsultats prliminaires suggrent donc que les souches PCH25 et MA2H6 seraient les
meilleures candidates pour survivre des concentrations plus leves des types de
contaminants prsents dans ces eaux uses. Il sest avr que cette eau use avait un effet
46

inhibiteur important sur la croissance des microalgues, ce qui a limit les essais. Elle a
toutefois permis didentifier certaines souches plus prometteuses permettant de sen tenir
celles-ci pour la suite. Les souches CPCC90, MA2H6 et PCH25 ont t retenues pour leur
performance respective. CPCC90 a t retenue dans le but davoir une base comparative avec
une souche connue et pralablement tudie.

4.2.2 Exprience en eaux uses prleves le 26 juin 2013 Essais principaux


De nouveaux essais de survie ont par la suite t raliss avec leau use rcolte le 26 juin
2013, qui avait une composition connue (Tableau 3-2 et annexe 3). Cest cette eau qui est
utilise pour le reste des exprimentations. Cette nouvelle eau use a donn des rsultats un
peu diffrents, en confirmant la possibilit daugmenter la concentration deau use dans le
milieu jusqu 30 %, sans nuire lefficacit de croissance des espces. Sur la Figure 4-9, il
est possible de remarquer que les taux de croissance des trois souches sont plus levs avec
laugmentation de la concentration deau use dans le milieu, dans les conditions donnes,
jusqu environ 20 % deau use. La tendance sinverse lorsque la concentration deau use
dans le milieu dpasse 30 %, part pour PCH25 qui semble tre rduite ds 20 %. 40 %
deau use, pour PCH25, le taux de croissance obtenu est comparable celui obtenu dans un
milieu BBM standard. Pour CPCC90 et MA2H6, ce fait sobserve plutt 50 % deau use,
o les souches atteignent respectivement 0,41 et 0,26 jr-1.
PCH25 a offert des meilleurs taux de croissance que les deux autres souches, soit de plus de
1,5 jr-1, jusqu latteinte de 20 % deau use dans le milieu. CPCC90 arrive en deuxime et
MA2H6 a prsent les taux les plus faibles. Aprs 20 % deau use, les performances des trois
souches sinterchangent. CPCC90 prsente de meilleures performances des concentrations
gales ou suprieures 30 %, suivi par MA2H6 et PCH25. Il semble donc que PCH25 ait une
moins bonne rsistance aux contaminants prsents.

47

Taux de croissance jr-1

2,00
CPCC90

1,50

MA2H6
1,00

PCH25

0,50
0,00
0%
-0,50

10%

15%

20%

30%

40%

50%

Concentration d'eau use dans le milieu %v/v

Figure 4-9 Comparaison des taux de croissance spcifiques des souches de Chlorella dans
un milieu BBM diffrentes concentrations (v/v) deau use prleve le 26 juin 2013

De faon gnrale, il est possible de constater que lajout deau use dans le milieu a un effet
bnfique sur la croissance des algues et que cet effet sinverse partir de 20 % deau use
dans le milieu. La diminution du taux de croissance entre 20 % et 30 % deau use pouvait
aller denviron 10 % pour CPCC90 et MA2H6 29 % pour PCH25. Lcart est encore plus
marqu lorsque la concentration deau use atteint 40 %. Entre 20 % et 40 % deau use les
taux de croissance pour CPCC90, MA2H6 et PCH25 diminuent respectivement de 46 %, 50 %
et 53 %. linverse, entre le milieu sans eau use et le milieu avec 20 % deau use, il est
possible de constater une augmentation denviron 60 % pour chacune des souches.

4.2.3 Importance de certains minraux


Finalement, il fallait dterminer si leau use pouvait, sans ajout de minraux quelconque,
soutenir la croissance des microalgues. Les essais ont t raliss uniquement avec CPCC90
qui prsentait la meilleure rsistance. Sans surprise, les cultures maintenues en eaux uses
seulement nont pas pu crotre, puisquaprs un 3e repiquage dans la phase exponentielle, la
croissance mesure tait pratiquement nulle. Les rsultats de croissance aprs le 3e repiquage
pour chacun des milieux sont prsents dans la Figure 4-10.

48

Taux de croissance jr-1

1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
-0,20

1,04
0,61
0,41

0,43

Eau use seule


KH2PO4 + K2HPO4
KH2PO4 + K2HPO4 + NaCl

0,00
Eau use KH2PO4 + KH2PO4 + KH2PO4 + KH2PO4 +
seule
K2HPO4 K2HPO4 + K2HPO4 + K2HPO4 +
NaCl
MgSO4
NaNO3

KH2PO4 + K2HPO4 + MgSO4


KH2PO4 + K2HPO4 + NaNO3

Figure 4-10 Croissance de Chlorella vulgaris (CPCC90) avec 30% (v/v) deau use et
ajout de minraux slectionns uniquement.

Lajout de certains minraux est donc ncessaire pour soutenir une croissance dans les eaux
uses. Lajout dune source de phosphore est essentiel et lajout dazote complmentaire
permet dobtenir de meilleurs rendements de croissance. Avec lajout de ces deux sources, il
est possible datteindre une croissance comparable celle obtenu dans un milieu BBM
complet avec la mme proportion deaux uses et significativement diffrente de celle obtenu
avec ajout des autres nutriments seulement. Lajout de NaCl seul na pas fourni damlioration
significative de la croissance par rapport lajout de phosphore, tandis que le MgSO4 a permis
une faible augmentation du taux de croissance, sans toutefois atteindre le rendement obtenu
par lajout dazote.

4.3 Discussion et conclusions intermdiaires


Les trois souches retenues sont des Chlorella, ce qui confirme le potentiel de ce genre de
microalgues dans des milieux fort potentiel toxique pour les microorganismes. Les rsultats
de croissance faibles obtenus dans le milieu BBM sans eau use ni autre source de carbone ne
sont pas tonnants et sont consistants avec ce qui a dj t observ dans la littrature. En
effet, Castellanos (2013), a obtenu avec Chlorella vulgaris, dans le mme milieu BBM pauvre
en carbone, un taux de croissance de 0,13 jr-1 [Castellanos, 2013]. Les taux de croissance sont
beaucoup plus levs lorsque du carbone est ajout sous forme de carbonate par exemple
(Na2CO3). Il semble donc possible de croire que le carbone prsent dans les eaux uses peut
tre utilis par les algues pour leur croissance. Toutefois, en augmentant la concentration
deau use, la concentration de contaminants toxiques augmente galement, avec un leffet
49

inhibiteur associ. La souche CPCC90 a fourni les meilleurs rsultats aux concentrations les
plus leves en eau use prleve le 26 juin 2013. Il faut rappeler quil ne peut videmment
pas sagir dune carence en nutriments cause par laugmentation de la proportion deau use
puisqu cette tape, dans tous les cas, tous les minraux ncessaires taient ajouts dans les
mmes proportions.
Pour ce qui est de limportance de lajout de tous les minraux du milieu BBM pour la
croissance, il semble qu court terme, cest--dire aprs trois repiquages en phase
exponentielle, ils ne soient pas tous essentiels. En effet, la croissance avec lajout de
phosphore et dazote (sous forme nitrate) suffit pour atteindre une croissance quivalente
celle obtenue avec tous les minraux. Cependant, il serait possible que des carences en
minraux ncessaires en plus petites doses surviennent plus long terme. Il a t possible de
remarquer par exemple que lajout de MgSO4 permet damliorer lgrement la croissance par
rapport lajout du phosphore seulement. Ce compos est quant lui utile pour la part de
magnsium quil apporte, car ce dernier participe, entre autres, la stabilisation de la
membrane cellulaire [Prescott et al., 2002].
Dans un autre ordre dides, il est possible de penser que certains composs limitent le
potentiel dutilisation de souches pures non pr-acclimates dans ces eaux uses. Les tudes
disponibles suggrent rgulirement lutilisation de microorganismes pr-acclimats, ce qui
aurait en effet pu permettre daugmenter la proportion deau use dans le milieu de culture. En
effet, si des microorganismes dj acclimats avaient pu tre utiliss, ceci aurait possiblement
permis doprer dans 100 % deau use, puisquils auraient t rsistants aux fortes
concentrations de contaminants prsents. Il semblait intressant de tenter de dterminer quels
contaminants prsents dans ces eaux ont fait en sortes quil tait impossible dutiliser des
concentrations deau use suprieures 50 %. En cherchant dans la littrature, il a t possible
de soulever quelques hypothses pouvant expliquer le phnomne de toxicit.
Phnol
Le phnol est le contaminant retrouv plus forte concentration dans leau use. Sa
concentration est de plus de 60 mg/L. Tisler (1996), dterminait que le phnol est moins
toxique pour la microalgue Scenedesmus quadricauda que le formaldhyde et que la
50

concentration laquelle la croissance diminue de 50 % tait plus de 400 mg/L [Tiler et


Zagorc-Koncan, 1997]. Avec Chlorella vulgaris, Olivier (2003), a obtenu une diminution
significative de 50 % de la croissance galement une concentration de phnol de 400 mg/L
[Olivier et al., 2003]. Il est donc peu probable que la toxicit de leau soit due ce compos,
comme il a pu tre valid subsquemment (chapitre 6).
Arsenic
Aprs lazote et le phnol, larsenic est le compos prsent en plus grande concentration dans
les eaux uses. La concentration dans leau entire est de 46 mg/L, ce qui est trs lev pour
un tel contaminant. Levy (2008) a test le potentiel toxique des diffrentes formes darsenic,
soient As (III) et As (V), sur la toxicit de Chlorella sp. et Monoraphidium arcuatum. Pour la
microalgue Chlorella, considre comme la plus rsistante, la concentration laquelle sa
croissance diminue de 50% a t denviron 25 mg/L pour les deux formes. Il est galement
connu que la forme As (III) est plus toxique que As (V) et que la toxicit augmente lorsque le
milieu est plus riche en phosphore [Levy et al., 2005] [Karadjova et al., 2008]. Tout ceci
permet de mettre en vidence la complexit de larsenic et de son potentiel de toxicit. Les
rsultats prsents dans ces tudes permettent de croire que ce contaminant pourrait
effectivement tre celui qui limite en partie lutilisation dune plus grande quantit deau use
dans le milieu, puisqu 50 % deau use, la concentration darsenic est prs de 25 mg/L, soit
de 23 mg/L.
Composs aromatiques divers
En plus de sa concentration dans le milieu, les proprits physico-chimiques dun compos
peuvent galement avoir un effet sur le potentiel toxique. Selon Hutchinson (2005), la pression
de vapeur et la solubilit dun hydrocarbure pourrait donner une bonne ide de sa toxicit
molaire. Les composs avec des pressions de vapeur et des solubilits plus faibles seraient
plus toxiques pour les algues que ceux avec des pressions de vapeur et des solubilits plus
leves [Hutchinson et al., 2005]. Selon cette base, il a t possible de mettre dans un ordre les
diffrents contaminants en fonction de leur risque de toxicit. En observant la solubilit et la
pression

de

vapeur

de

chacun

de

ces

composs,

le

benzo (a) pyrne,

le

benzo (b, j) fluoranthne, le dibenzo (a, h) anthracne et le fluorne seraient parmi les plus
51

toxiques. En considrant galement la concentration du compos dans leau use, il est


possible dajouter le pentachlorophnol dans les composs qui contribuent probablement la
forte toxicit de leau use.
Selon la littrature, le benzo (a) pyrne serait possiblement non toxique jusqu des
concentrations de plus de 1200 g/L, concentrations qui ont t identifies pour la microalgue
Selenastrum capricornutum [Warshawsky et al., 1995]. La concentration dans le milieu
50 % deau use nest que de 8,75 g/L. Or, il est peu probablement que ce contaminant soit
limitant. Pour le fluoranthne, la concentration toxique rapport pour Phaeodactylum
tricornutum (diatome) commencerait 0,08 g/ml [Wang et Zheng, 2008]. Le milieu 50 %
deau uses en contient jusqu 13,2 g/L, mais mme dans un milieu 30 % deau use, les
cultures sont dj exposes une concentration de prs de 8 g/L, ce qui est aussi trs leve.
Le compos pourrait toutefois contribuer la toxicit, mais ne peut expliquer lui seul le
rsultat. Finalement, le dibenzo (a, h) anthracne serait toxique autour de 575 g/L pour
Nannochloropsis sp., Picochlorum sp., Alexandrium catenella et Chaetoceros muelleri
[Othman et al., 2012], alors quil ny en a que 1 g/L dans une milieu 50 %.
Pour ce qui est du pentachlorophnol, des effets inhibiteurs significatifs ont t observs chez
Pseudokirchneriella subcapitata, une microalgue verte unicellulaire, partir de concentrations
infrieures 1 mg/L, soit autour de 0,11 et 0,52 mg/L [Radix et al., 2000]. 50 % deau use,
le milieu en contient 0,139 mg/L, ce qui est dans lcart possible de toxicit leve pour les
microalgues.
En conclusion, il semble que larsenic, le pentachlrophnol, le fluoranthne et possiblement le
benzo (b, j) fluoranthne seraient les contaminants avec le plus grand potentiel de toxicit sur
les microalgues et qui limiteraient donc lutilisation de leau use dans le milieu de culture. Un
traitement pralable sur leau use pourrait donc possiblement permettre daugmenter sa
proportion dans le milieu de culture. Le chapitre 7 de ce document traitera de solutions
doptimisation.

52

CHAPITRE 5 OPTIMISATION DE LA CROISSANCE


5.1 Mthodologie
5.1.1 Conditions de culture
Deux souches ont t testes, soient CPCC90 et MA2H6, dans un milieu BBM standard avec
ajout de solution de vitamines S3 Vitamins Solution [Andersen, 2005] et dans un milieu BBM
avec 30 % (v/v) deau use. Les clairements ont t ajusts par lajout de filtre Lee noirs
selon les besoins et mesures avec la sonde PAR scalaire US-SQS/L (Waltz, Allemagne)
branche la console Light meter LI-250A (LI-COR, USA). Les clairements slectionns ont
t 10, 25, 50, 100, 200 et 500 mol photons m-2 s-1. Les trois tempratures choisies (10,
20 et 30 C) ont t contrles par des systmes de chauffage et de refroidissement
indpendants. Un seul rplica a t utilis par souche pour une mme temprature et un mme
clairage. Aucune agitation ni aration na t utilise dans cette exprience. La Figure 5-11
prsente le montage exprimental utilis.

Figure 5-11 Montage exprimental utilis pour lexprience de caractrisation des


souches. Six blocs daluminium refroidis ou chauffs contenant chacun douze puits dans
lesquels lclairement a t ajust sparment.

Les cultures de 7,5 mL ont t maintenues dans des cuvettes rondes en verre de 8 mL avec un
bouchon de plastique laiss entre-ouvert. Toutes les cultures ont t inocules pour avoir
environ 50 g/L de Chla. La concentration de cellules dans les cuvettes a t maintenue
environ entre 50-300 g/L de Chla, afin de conserver les cellules dans leur phase
53

exponentielle constante. Les cellules ont t suivies pendant 20 jours afin davoir plusieurs
mesures de croissance.

5.1.2 Mesure de la fluorescence


La mesure de fluorescence a t prise quotidiennement pour chaque culture, afin de dterminer
si une dilution tait ncessaire pour maintenir la culture dans les densits souhaites. La
culture tait ensuite dilue dans une nouvelle cuvette propre et remise dans le montage. La
lecture de la fluorescence tait toujours faite immdiatement aprs que la culture soit sortie du
montage, afin que les cellules soient toujours dans le mme tat physiologique.
Lappareil utilis pour mesurer la fluorescence a t un fluorimtre maison fabriqu laide
dun multimtre et de capteurs optiques. La Figure 5-12 suivante prsente lappareil en
question.

Figure 5-12 Fluorimtre maison ayant permis de faire le suivi de la croissance pour
lexprience de caractrisation

Le fluorimtre maison conu est bas sur le principe de la fluorescence. Les algues absorbent
les longueurs dondes correspondant au bleu (470 nm) mis par la del et mettent dans le
rouge (680 nm). Cest lmission dans le rouge qui est mesure et convertit en mesure de
tension.
Afin de valider les rsultats de lappareil maison, les mesures de courant lues sur le multimtre
ont t corrles avec des mesures de chla obtenues avec une autre mthode. Les rsultats de
cette calibration se sont avrs concluants et sont prsents en annexe 1.
54

5.1.3 Calcul du taux de croissance


Afin dannuler lerreur sur le multimtre observe lorsque le capteur optique tait plus ou
moins chaud, la valeur correspondant au bruit de fond tait note avant chacune des mesures.
La valeur de tension conserve pour les calculs tait donc la diffrence entre la mesure sur
lchantillon et la valeur du bruit de fond. Lorsquune dilution tait ralise, la nouvelle
concentration tait dduite partir de la valeur initiale de tension et du taux de dilution utilis.
Les taux de croissance ont finalement t calculs pour chaque jour n selon lquation 5-1:

quation 5-1

Ensuite, la moyenne des taux de croissance obtenus en plusieurs rplicas pour une mme
culture et lcart-type entre eux ont t utiliss pour produire les graphiques (Figure 5-14 et
Figure 5-15).

5.1.4 Culture dans le photobioracteur de 3 L


La souche CPCC90 a t utilise pour faire des essais plus grande chelle dans un
photobioracteur de 3 L thermostat. Lagitation a t maintenue constante avec un barreau
magntique. Aucune aration na t injecte en cours de culture. La culture a t maintenue
20 C avec un clairage externe compos de trois petits nons fournissant environ
500 mol photons m-2 s-1. Le systme dclairage est prsent la Figure 5-13. Le milieu
de culture utilis tait le milieu BBM avec 30 % deau use.

Figure 5-13 Systme dclairage du bcher thermostat de 3 L


55

Le suivi de la croissance sest fait avec un comptage cellulaire quotidien avec le Coulter
counter (Beckman), selon la mthode prsente dans la section 4.1.2 de ce document. Les taux
de croissance ont t calculs selon la mthode graphique dtaille dans la section 4.1.3.

5.2 Prsentation et analyse des rsultats


Les meilleurs taux de croissance pour CPCC90 ont t obtenus 20 C. Dans les deux milieux
(Figure 5-14) les meilleures performances de croissance sont effectivement mesures cette
temprature, et ce, partir de 50 mol photons m-2 s-1. Les moins bonnes performances de
croissance ont t mesures 30 C, o aucune croissance na pu tre mesure aucun niveau
dclairement dans le milieu BBM. Dans le milieu avec leau use, une croissance a t
dtecte partir de 100 mol photons m-2 s-1 uniquement. 10 C, une croissance a t
possible tous les clairements et pour les deux milieux. Cependant, la croissance cette
temprature est infrieure celle mesure 20 C, particulirement aux clairements plus
levs. Latteinte des plateaux de croissance semble se situer autour de 100 mol photons m2

s-1 une temprature de 10 C et 200 mol photons m-2 s-1, ou possiblement plus,

20 C.

10C_BBM
20C_BBM
30C_BBM
10C_BBM 30% e.u
20C_BBM 30% e.u
30C_BBM 30% e.u

Taux de croissance jr-1

1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2 0
-0,4

100

200

300

400

500

600

clairement mol photons m-2 s-1

Figure 5-14 Rsultats des taux de croissance moyens de CPCC90 dans chacun des
milieux aux diffrentes tempratures

56

Pour les clairements infrieurs 200mol photons m-2 s-1, il est difficile disoler leffet
de la temprature puisque les cart-types se chevauchent, ce qui donne des valeurs de
croissance similaires pour une mme temprature. Le seul effet positif du milieu BBM 30 %
est observable 30 C, o la croissance a t possible dans celui-ci et non dans le milieu BBM
et un fort clairement 20 C.
Pour MA2H6 (Figure 5-15), il ny avait pas de diffrence entre les taux de croissance 20 C
et 30 C, et ce, pour tous les clairements et dans les deux milieux. 10 C, les taux de
croissance sont lgrement infrieurs, principalement des clairements suprieurs ou gaux
100 mol photons m-2 s-1.

Les

plateaux

de

croissance

sont

atteints

autour

de

100 mol photons m-2 s-1 10 C et de 200 mol photons m-2 s-1 20 C. 30 C,
aucune stabilisation nest observe avant 500 mol photons m-2 s-1.

10C_BBM

1,2

20C_BBM

Taux de croissance jr-1

1,0

30C_BBM

0,8

10C_BBM 30% e.u


20C_BBM 30% e.u

0,6

30C_BBM 30% e.u

0,4
0,2
0,0
0
-0,2

100
200
300
400
clairement mol photons m-2 s-1

500

600

Figure 5-15 Rsultats des taux de croissance moyens de MA2H6 dans des milieux
diffrentes tempratures

Les cart-types pour MA2H6 sont plus grands que pour CPCC90, ce qui rend donc les
conclusions moins claires pour MA2H6. Il est plus difficile disoler leffet de la temprature
sur le taux de croissance obtenu, particulirement pour les clairements plus faibles 20C et
30C. Toutefois, il est possible dobserver que la croissance est plus difficile 10 C pour les
deux milieux et que le milieu avec BBM 10 C montre des taux de croissance trs faibles.

57

Dans le volume de 3 L avec CPCC90 et aux conditions idales identifies avec les essais
prcdents, soit 20 C avec un clairement de 500 mol photons m-2 s-1, la croissance
moyenne obtenue a t de 1,12 0,11 jr-1. En comparant avec la courbe de croissance 20 C
en milieu BBM 30 % deau use prsente dans la Figure 5-14, il est possible de remarquer
que le taux de croissance calcul dans le plus grand volume 500 mol photons m-2 s-1
sinsre quelque part entre les valeurs de 200 et 500 mol photons m-2 s-1. Ce qui permet
de valider les rsultats obtenus dans la phase de caractrisation en petit volume. Cette valeur
porte galement croire que le plateau de croissance dans le milieu 30 % deau use pour
cette souche satteindrait autour de 300 mol photons m-2 s-1.

5.3 Discussion et conclusions intermdiaires


Pour chacune des souches testes, il a t possible dobtenir des profils peu prs
exponentiels, comme il tait attendu, sauf 30 C o CPCC90 avec 30 % deau use na pu
crotre. Dailleurs, cette absence de croissance a t valide laide de trois essais diffrents
de culture, durant lesquels aucune croissance na t observe chaque fois.
Pour la souche CPCC90, il est possible de comparer les rsultats de croissance obtenus pour la
caractrisation avec ceux des algues produites dans le bioracteur de 3 L et ceux prsents
dans le chapitre 4 30 % deau use temprature ambiante (22 C). La comparaison est
prsente dans le Tableau 5-5.

Tableau 5-5 Comparaison des rsultats de croissance de CPCC90 dans le BBM 30 %


deau use obtenus dans diverses expriences
Exprience
Exp. Chapitre 5
3L
Exp. Chapitre 4

Temprature
(C)
20
20
20
22 1

clairement
(mol photons m-2 s-1)
200
500
500
350-400

Taux de
croissance (jr-1)
0,89 0,09
1,35 0,16
1,12 0,11
1,31 0,07

On peut remarquer que les rsultats des diffrentes expriences sont comparables, ce qui
permet de croire que les rsultats obtenus dans les petits volumes de 8 mL sont valides. Les
diffrences observes entre les rsultats de cette exprience et ceux de lexprience prcdente
58

pour le milieu BBM sans eau use sexplique par la diffrence dans la composition du milieu.
Lajout des vitamines a eu un effet positif sur la croissance dans le milieu BBM. On peut
galement confirmer, comme il avait t soulign prcdemment, que le plateau de croissance
se situerait autour de 300-400 mol photons m-2 s-1. Pour cette souche, la temprature
idale de croissance, parmi les tempratures testes, se situerait entre 20-25 C, selon les
expriences qui ont t ralises dans cette tude. Pour la souche MA2H6, la temprature
idale pourrait plutt se situer autour de 25-30 C, encore une fois, selon les expriences
menes.
En thorie, le dbut de la saturation augmente avec la temprature. Plus la temprature est
leve, plus lclairement correspondant la saturation ou au plateau de croissance augmente
[Huner et al., 1998]. Cest ce qui est observ sur les courbes des deux souches. Le plateau est
effectivement atteint plus rapidement 10 C qu 30 C, ce qui correspond ce qui tait
thoriquement attendu.
Lorsquon compare les croissances en fonction des milieux de culture utiliss, il est difficile
de conclure une diffrence significative. Il semble que la temprature ait une plus grande
influence sur la croissance que le milieu de culture temprature idale. Leffet du milieu est
plus clair lorsque les conditions de tempratures sont moins bonnes, par exemple 30C dans
le cas de CPCC90.
Il faut noter que la comparaison entre les deux milieux nest pas tout fait exacte, considrant
les diffrences dclairement relles auxquelles les microalgues taient soumises dans les deux
milieux. La couleur fonce de leau use a diminu la valeur relle dclairement, ce qui porte
croire que les taux de croissance dans le milieu avec leau use pourraient tre plus levs
que ceux identifis pour chacun des clairements. En effet, les clairements considrs pour
les graphiques taient ceux fournis par les fluorescents et non ceux mesurs dans les milieux.
Il est donc fort probable que la souche CPCC90 puisse bnficier de la prsence de leau use.
Il est connu que les processus photosynthtiques sont affects lorsque la temprature nest pas
idale, alors il est possible de croire quaux tempratures non-idales pour la photosynthse,
CPCC90 peut utiliser un autre processus biochimique pour puiser sa source de carbone. Le
milieu avec leau use est riche en carbone, ce qui pourrait permettre CPCC90 de soutenir

59

une croissance dans le cas o la photosynthse est plus difficile. Chlorella vulgaris est connue
comme tant une espce capable de crotre en htrotrophie [Liang et al., 2009].
Les conclusions sont moins convaincantes pour MA2H6 pour ce qui est lajout deau use.
Ces rsultats ne sont toutefois par surprenants, puisquils refltent ce qui avait t rapport au
Chapitre 4, savoir que la souche MA2H6 supporte moins bien lajout deau use.

60

CHAPITRE 6 EFFET DE LA PRSENCE DE PHNOL


6.1 Mthodologie
Les essais sur le phnol ont t diviss en deux sections, savoir lanalyse de leffet du phnol
sur la croissance et la concentration maximale pouvant tre tolre, suivi de la dtermination
de la capacit de retrait du phnol par les microalgues. La premire exprience allait permettre
de dterminer le niveau de toxicit de ce compos sur les microalgues, alors que la seconde
allait permettre dvaluer le potentiel dutilisation des microalgues pour le traitement de leau
use.

6.1.1 Conditions de culture


Les cultures de 200 mL ont t maintenues une temprature de 22 1 C et exposes un
clairement de 300-350 mol photons m-2 s-1. Des bouteilles de culture en verre de
250 mL ont t utilises dans ce cas-ci, afin que les analyses du phnol ne soient pas biaises
par ladsorption possible du phnol sur les parois dun contenant en plastique. Aucune
agitation ni aration na t utilise pour lexprience. Le milieu BBM tait fabriqu en
remplaant un volume appropri deau milli-Q par une solution mre de phnol (C6H6O)
2000 ppm, afin dobtenir les concentrations souhaites. Les concentrations testes, soient entre
20 ppm et 500 ppm, correspondent aux concentrations retrouves dans un milieu 30 % deau
use (20 ppm) et une concentration lgrement suprieure la concentration thorique
laquelle le phnol devient toxique pour les algues (500 ppm).

6.1.2 Suivi de la croissance


Des chantillons de 1 mL taient prlevs quotidiennement et lextraction de la chla tait
ralise sur 200 L dchantillon, selon la mthode prsente au Chapitre 4 (Mthode
CHL A NA, Turner Designs, USA). Les taux de croissance ont t calculs avec la mthode
graphique prsente au chaptire 4.

6.1.3 Mesure du phnol


Deux mthodes ont t utilises pour quantifier le phnol dans le milieu, savoir la mthode
colorimtrique propose par la compagnie HACH (Method 8047, phenols, HACH, USA) et

61

une mthode au HPLC (Waters, USA) sur colonne Eclipse Plus C18 (Agilent Technologies,
USA).
La mthode colorimtrique ncessitait une dilution des chantillons pour entrer dans
lintervalle de dtection de la mthode, ce qui assurait par le fait mme que la couleur fonce
de leau naffecte pas les lectures. Cette mthode tait utilise principalement titre indicatif,
afin didentifier les grands carts de concentration, mme si une calibration prliminaire avait
permis de valider la pertinence de cette mthode.
La mthode au HPLC est une mthode dveloppe pour la mesure de monomres de lignine.
Les spcifications exactes de la colonne sont prsentes dans le Tableau 6-6.

Tableau 6-6 Spcifications de la mthode de mesure des phnols au HPLC.


Colonne:
HPLC:
Dtecteur:
T colonne:
Taux dcoulement:
Vol. dinjection
Solvants:
Temps:
Longueurs dondes
Nom de la mthode:

Spcifications
Agilent Eclipse Plus C18 (3,5 m, 4,6 x 100 mm)
(PN 959961-902, SN USUXR07609, LN 811299)
Waters 2695 separation module
Waters 996 Photodiode array detector (UV)
30 C
0,5 mL/min
0,5 L/injection
Eau + Acetonitrile (gradient)
84 mins
221,5 nm
2014 C18 mon T7 6

6.2 Prsentation et analyse des rsultats


Lajout de phnol dans un milieu de culture pauvre en carbone comme le BBM semble avoir
un Figure 6-16 quune amlioration est dj visible 20 ppm par rapport au milieu BBM.
partir de 40 ppm de phnol, la croissance des microalgues est grandement augmente. Des
taux croissances de plus de 1 jr-1 sont obtenus comparativement une croissance de 0,23 dans
le milieu BBM standard (sans carbone ajout). partir de 400 ppm, la croissance diminue de
prs de 50 % par rapport aux meilleures performances, tandis qu 500 ppm, la croissance est

62

difficile. La concentration limite en phnol se situerait donc quelque part entre 400 et

1,56

1,38

1,33
0,97

0,50

1,12
0,68

0,52

CPCC90

500 ppm

400 ppm

300 ppm

100 ppm

80 ppm

60 ppm

40 ppm

0,20
30 ppm

1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00

20 ppm

Taux de croissance (jr-1)_

500 ppm.

Concentration de phnol

Figure 6-16 Croissance de CPCC90 dans un milieu BBM contenant diffrentes


concentrations de phnol

Dans une autre exprience (voir Figure 6-17), divers milieux BBM ont t compars. Les
milieux avec 20 ppm de phnol et ceux avec de leau use ont prsent des taux de croissance
maximaux plus levs que le milieu BBM standard. Il est donc possible de penser que dans
ces concentrations, les ajouts de carbone au milieu BBM permettent damliorer

Taux de croissance jr-1

significativement la croissance.

1,5
0,99

1
0,5

1,19

0,87

0,60
0,21

0,34

CPCC90
MA2H6

0
BBM

BBM 20ppm
phnol
Milieu de culture

BBM 30%
eau use

Figure 6-17 Comparaison de la croissance de CPCC90 dans diffrents milieux de culture

63

Pour les mesures de retrait du phnol, des rsultats tonnants ont t obtenus. En effet, avec
les deux mthodes de mesures utilises, un retrait du phnol a t observ mme dans les
milieux blancs sans microalgues. Dans une premire exprience ralise sur sept jours, les
pourcentages massiques de retrait du phnol dans les blancs, mesurs avec la mthode
colorimtrique, ont t de 99,91 % et 69,78 % pour les milieux BBM phnol et BBM 30 %
deau use respectivement. Avec les algues, il a t possible datteindre des pourcentages de
retrait pour ces mmes milieux de 100 %.
Pour les blancs BBM avec 30 % deau use, le taux de disparition moyen se situe autour de
65 %, ce qui correspond la proportion de phnol qui se retrouve dans leau use. Puisque les
microalgues ont prsent des pourcentages de disparition plus levs que 65 %, ce fait pourrait
laisser croire que le phnol disparat possiblement sans ncessiter la prsence des algues et que
les composs plus gros, comme les phnols chlors, pourraient avoir t retirs par les algues.
Des mesures ont par la suite t ralises au HPLC afin de vrifier si le milieu BBM tait la
source du retrait ou si le milieu interfrait avec la mthode colorimtrique d la prsence
dions de chlore (effet interfrant reconnu dans la mthode). Un milieu BBM avec phnol a t
compar avec une eau milli-Q complmente avec la mme concentration de phnol. Les
mesures ralises sur sept jours ont permis de dmontrer que le phnol disparaissait
compltement du milieu BBM et que la concentration restait intacte dans leau milli-Q. La
concentration de phnol mesure dans le milieu BBM tait nulle au 5e jour. Il a galement t
conclu que la raction qui se produit dans le BBM nest pas photorgule, puisque mme dans
le noir, le phnol disparaissait au mme rythme qu la lumire dans le milieu BBM et restait
intact dans leau milli-Q la noirceur.
Il a donc t impossible dtablir de faon exacte la contribution des microalgues sur la
disparition des composs phnoliques, puisquil tait difficile de lisoler par rapport leffet
des minraux du milieu de culture.
Afin de tenter dexpliquer lorigine de la disparition du phnol dans le milieu BBM, des
solutions de phnol ont t prpares et certains minraux (ceux normalement ajouts dans le
milieu BBM) ont t retirs tour de rle. De cette faon, il semblait possible didentifier
quels minraux pouvaient avoir un impact sur le retrait du phnol. Les rsultats sont prsents
64

dans le Tableau 6-7. En regardant ces rsultats, il est possible de constater que le EDTA, le
H3BO3, le NaCl et le NaNO3, mme lorsquils sont retirs du milieu, nempchent pas le
phnomne de dgradation. Le MgSO4, le CaCl2, le PO4 et le FeSO4 ont un impact lorsquils
sont retirs individuellement, puisque les pourcentages de retrait dans ces cas-ci ont diminu.
La seule solution dont labsence a compltement empcher le retrait du phnol du milieu de
culture est la solution de mtaux. Il est donc possible de penser quil y a un effet combin de
plusieurs minraux sur le retrait du phnol ou quun des mtaux (ZnSO4, CuSO4, MnCl2,
MoO3, Co(NO3)2) soit responsable du phnomne et que labsence de certains autres
substances (MgSO4, CaCl2, PO4 o FeSO4) rduise lefficacit de retrait de celui-ci.

Tableau 6-7 Rsultats des mesures de phnol obtenues au HPLC sur diffrentes solutions
de phnol
Solution

BBM - NaNO31
BBM - MgSO4
BBM - NaCl
BBM - CaCl2
BBM - PO4
BBM - FeSO4
BBM - H3BO3
BBM - EDTA
BBM Mtaux
BBM complet

[Initiale]
(mg/L)
51
51
51
51
49
51
44
44
42
43

[aprs 9 jours]
Diffrence % restant
(mg/L)
0
51
0%
41
10
80%
0
51
0%
35
16
69%
41
8
84%
44
7
86%
0
44
0%
0
44
0%
42
0
100%
0
43
0%

BBM-NaNO3 signifie que le milieu BBM complet a t prpar mais sans le NaNO3

Afin de valider la prsence de complexes mtaux-phnol pour expliquer la disparition du


phnol, des solutions prpares avec de leau milli-Q, une solution mre de phnol et divers
mtaux du milieu BBM ont t passes au spectrophotomtre UV-VIS (Ultrospec 3000,
Biochrom, Royaume-Unis) dans le spectre des UVs (entre 200 et 400 nm). Le phnol a t mis
en contact de faon indpendante avec chacun des mtaux et mis dans un milieu BBM
standard afin dobserver les effets. Un milieu BBM avec de leau use a galement t
analys. Les rsultats sont prsents dans la Figure 6-18 et la Figure 6-19.

65

CuSO4 + Phnol
FeSO4 + Phnol
ZnSO4 + Phnol
MgSO4 + Phnol
MnCl2 + Phnol
Co(NO3)2 + Phnol
Solution phnol 100ppm (Blanc)

Absorbance

2,5
2
1,5
1
0,5
0
200

250

300
350
Longueur d'onde nm

400

450

Absorbance

Figure 6-18 Mesure de labsorbance dans diffrentes solutions de minraux avec phnol
aprs 7 jours dincubation temprature pice

3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0

BBM 30% e.u


Eau use dilue
BBM 100 ppm phnol 0 jrs
BBM 100 ppm phnol 3 jrs
BBM 100 ppm phnol 10 jrs

200

250

300
Longueur d'onde nm

350

400

Figure 6-19 Mesure de labsorbance sur des milieux de culture avec phnol et eau use

Le pic observ 270 nm correspond au pic dabsorption de la molcule de phnol. Dans la


Figure 6-18, aucune modification notable de la courbe nest visible pour aucun des minraux
tests indpendamment en comparaison avec la solution de phnol seule (blanc). Par contre,
sur la Figure 6-19 il est possible de remarquer que le pic visible 270 nm disparait dans les
milieux BBM ds le 3e jour dincubation. Ceci porte donc croire quil ny a pas deffet
unique pour un mtal en particulier, mais quil pourrait sagir dune synergie entre plusieurs
(complexes mixtes). Toutefois, les rsultats ne permettent pas dassumer quils sont totalement
absents.

66

6.3 Discussion et conclusions intermdiaires


Dans un premier temps, la concentration limite de phnol que peut tolrer Chlorella vulgaris a
t identifie dans cette tude environ 400 ppm. Cette valeur est tout fait cohrente avec
celle qui est retrouve dans la littrature, comme il a t mentionn prcdemment [Olivier et
al., 2003]. Son effet bnfique sur la croissance dans un milieu pauvre en carbone organique
nest pas non plus surprenant [Semple et Cain, 1996]. Malgr quil y ait une certaine
croissance observe 400 ppm, ds que lajout de phnol atteint 100 ppm et 200 ppm, les
rsultats de croissance obtenus chutent de prs de 40 et 30%, ce qui permet de stipuler que le
phnol aurait dj un potentiel toxique partir de ces concentrations. Afin de tirer des
conclusions plus sres par rapport la concentration maximale, il serait conseill de refaire
quelques essais avec plus de rplicas.
La comparaison entre les diffrents milieux de culture BBM avec les ajouts de phnol et de
30 % deau use dmontre leffet bnfique de ces sources de carbone sur la croissance des
microalgues.
Pour la disparition du phnol dans le milieu BBM, la premire hypothse souleve pour
expliquer sa disparition est leffet doxydation catalytique sur les cycles phnoliques de ces
mtaux bivalents [Gianfreda et al., 2006][Mohammed A. A., 2013]. Avec les rsultats
prsents prcdemment dans le Tableau 6-7, il semble que loxydation puisse expliquer ce
phnomne. Les mtaux bivalents ajouts dans le milieu pourraient donc jouer leur rle
doxydation et possiblement rendre disponible le carbone du cycle phnolique. Il restera donc
dans le futur tenter dexpliquer plus en dtails ce phnomne afin de lier le rle de ces
minraux lutilisation du phnol comme source de carbone par les microalgues.
Lautre hypothse mise tait que des complexes pouvaient se former entre le phnol et les
mtaux prsents dans le milieu de culture. En effet, il a t dmontr, par exemple, dans la
littrature, que les ions bivalents, entre autres Fe(II), Cu(II) et Zn(II), peuvent former des
complexes avec des composs phnoliques [Karama, 2009] [Ambrosi et al., 2008]. Ces ions
sont prsents dans le milieu BBM. Toutefois, aux longueurs dondes testes, qui ont t
limites par la capacit de lappareil utilis, il semble peu probable quil y ait formation de tels
complexes dans ce cas-ci.

67

Des tests bactriens de base sur ptris ont t raliss afin de vrifier la possible prsence de
bactries pouvant expliquer la disparition du phnol. Les rsultats obtenus sur milieu agar
simple nont pas permis den dtecter.

68

CHAPITRE 7 OPTIMISATION DE LA
CONCENTRATION DEAU USE
7.1 Mthodologie
Afin de tenter daugmenter la concentration deau use dans le milieu, quelques traitements
pralables sur leau use filtre ont t tests. Pour chacun des traitements, le volume deau
traite tait toujours de 1000 mL. Comme mentionn prcdemment, les types de traitements
tests ont t le bullage lair, le bullage au CO2, le bullage lozone et lexposition aux
ultraviolets. Chacun des traitements a t ralis sur leau use entire, avant que les milieux
de cultures ne soient prpars. Les volumes deau traite ncessaires pour fabriquer les
milieux de culture taient prlevs aprs traitement et les minraux manquants taient alors
ajouts pour complter le milieu BBM. Le dtail des mthodes et des appareils utiliss pour
chacun des traitements est prsent en annexe 1.
Les cultures de 200 mL ont t maintenues 22 1 C dans des bouteilles de verre de
250 mL. Aucune agitation ni aration complmentaire nont t utilises durant toute la dure
de la culture. Un clairage de 300-350 mol photons m-2 s-1 tait fourni. Les cultures ont
t faites en dupliqua pour une mme souche, avec une mme eau traite. Le suivi de la
croissance des cultures a t fait par la mesure de la concentration de chla selon la mthode
prsente dans le chapitre 4. Les cultures ont t inocules environ 50 g chla/L et ont t
arrtes latteinte dune dcroissance.

7.2 Prsentation et analyse rsultats


Les traitements ont eu chacun des effets distincts sur la croissance des microalgues, tel que le
dmontrent les figures 7-20, 7-21 et 7-22.

69

Non traite
Are
CO2
Ozone
UV

Taux de croissance jr-1

2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
30%

-0,50

40%

50%

60%

70%

Concentration v/v d'eau use

Taux de croissance jr-1

Figure 7-20 Compilation des rsultats de croissance spcifique de CPCC90 dans des
milieux BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite

1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
-0,20
-0,40

Non traite
Are
CO2
Ozone
UV

30%

40%

50%

60%

70%

Concentration v/v d'eau use

Figure 7-21 Compilation des rsultats de croissance spcifique de MA2H6 dans des
milieux BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite

Taux de croissance jr-1

1,00

Non traite
Are
CO2
Ozone
UV

0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
-0,20
-0,40

30%

40%

50%

60%

70%

Concentration v/v d'eau use

Figure 7-22 Compilation des rsultats de croissance spcifique de PCH25 dans des
milieux BBM avec diffrentes concentrations d'eau use traite

70

Les rsultats sont semblables pour toutes les souches. Lozone et lUV ont eu un effet ngatif
notable sur la croissance des trois souches comparativement tous les autres traitements.
Linjection dair na pas eu deffet positif observable pour la majorit des souches des
concentrations deau use infrieure 40 %. La croissance ntait pas diffrente de celle
obtenue dans les milieux sans traitement. Il semble mme que lair, dans certain cas, des
concentrations deau use plus leves, ait un effet ngatif. Le seul traitement qui a permis
daugmenter les performances de croissance pour deux souches (CPCC90 et MA2H6) est le
traitement au CO2. Leffet bnfique du CO2 est plus marqu des concentrations suprieures
ou galement 40%. Cependant, mme si la croissance est plus leve, il est possible
dobserver la mme tendance que dans leau non trait, savoir que la concentration
maximale utilisable dans le milieu est toujours 50 %.
La mesure des pH aprs le traitement indiquait que le CO2, sans surprise, acidifiait le milieu de
culture. Leau use traite au CO2 atteignait 6,70 alors que leau use non traite avait plutt
un pH de 8,53, pH qui tait identique celui de leau are et de leau traite aux UVs. Afin
de vrifier si le pH avait pu lui seul influer sur les performances de croissance, des essais
avec CPCC90 et MA2H6 ont t raliss, afin de comparer des milieux traits au CO2 avec
des milieux acidifis au HCl 10 %. Les milieux traits au HCl ont t ajust au mme pH que
le milieu trait au CO2, afin de pouvoir bien isoler leffet du pH. Les rsultats obtenus pour

Taux de croissance jr-1

CPCC90 sont prsents dans la Figure 7-23.

BBM
BBM 20ppm phnol
BBM 30% e.u

2
1,5
1
0,5
0
Non trait

CO 2

HCl

Figure 7-23 valuation de leffet du pH sur la croissance de CPCC90 dans diffrents


milieux de culture

71

De la mme faon, le pH initial seul ne semble pas affecter la croissance, mais le traitement au
CO2 affecte positivement la croissance pour chacun des milieux. Dailleurs, le CO2 a une
influence positive encore plus importante sur les milieux BBM et BBM 20 ppm phnol que
sur le milieu BBM 30 % eau use. Les rsultats obtenus pour MA2H6 ne sont pas prsents ici
puisque les conclusions pouvant tre tires taient similaires ceux de CPCC90 (voir
annexe 2).

7.3 Discussion et conclusions intermdiaires


Dans le cas de lozone, il est tonnant que celui-ci nait pas diminu la toxicit, puisquil est
un oxydant puissant et reconnu pour le traitement des composs aromatiques, des COVs et
galement pour le retrait de nombreux mtaux. Il est entre autre trs utilis en rhabilitation
des sols contamins [Schwartz, 2002]. Il est peu probable que lozone rsiduel soit
responsable de leffet toxique, puisque lozone est trs instable. De plus, leau use a t are
lO2 aprs le traitement afin de retirer lexcdent. Son temps de demi-vie est denviron
30 minutes lorsquil ny a pas daration ni prsence de compos oxyder (Lenntech, Paysbas). En considrant la grande quantit de composs aromatiques divers dans leau use, il est
donc probable que la formation de composs intermdiaires plus toxiques ait affect la
croissance. Lutilisation dun tel procd demande un grand contrle, comme il a t prouv
dans cet essai. Avec ces conclusions, le traitement lozone ne serait pas un traitement
conseill pour le type deau use, dautant plus quil sagit dun procd trs nergivore.
Les UVs, quant eux, nont pas eu deffet sur la croissance des algues. Il semble possible que
la lampe utilise nait pas t assez forte pour fournir des radiations en quantit suffisante pour
dgrader certains des composs. galement, la couleur trs fonce de leau limite lefficacit
dun tel traitement.
Lutilisation du CO2 comme traitement de leau semblait permettre damliorer les
performances de croissance des diffrentes souches, et ce, jusqu une concentration deau
use de 50 %. Le traitement na donc pas pu rendre leau use moins toxique pour les algues,
ce qui invalide lhypothse que la diminution de la solubilit des composs phnols en pH
plus acide puisse tre associe la diminution de la toxicit sur les microorganismes. Les
traitements au CO2 et lair ont tout de mme permis de conclure que les composs
responsables de la toxicit ne sont pas facilement volatilisables.
72

Lamlioration de la croissance par le CO2 pourrait plutt sexpliquer par lajout de carbone
complmentaire dans le milieu apport sous forme gazeuse. Mme si linjection se fait avant
mme que les microalgues soient ajoutes dans le milieu, il est fort probable quune partie du
carbone reste dans le milieu sous forme de carbonate, dautant plus que le pH du milieu est
autour de 7. Le pH joue un grand rle sur la forme que prend le CO2 gazeux inject en milieu
aqueux, comme le suggre la Figure 7-24 suivante.

Figure7- 24 quilibre du CO2 /HCO3-/CO32- en fonction du pH [Becker, 1994]

Le CO2 dans leau apparat sous les formes prsentes dans lquation 7-1

quation 7-1

La raction prsente par lquation 7-2 se fait de faon presque instantane, alors que la
raction inverse prsente par lquation 7-3 se fait beaucoup plus lentement.

quation 7-2
quation 7-3

Ces quations pourraient expliquer le fait que le carbone puisse rester encore disponible dans
le milieu pour les microalgues, mme quelques heures aprs le traitement. Ces observations
73

pourraient donc proposer une nouvelle faon dutiliser les rejets industriels de CO2. En effet, il
serait donc possible dinjecter 100 % de CO2 dans un milieu avant dy ajouter les microalgues,
ce qui permettrait den faire une utilisation maximale et dviter leffet toxique de celui-ci sur
les microalgues lorsquil est ajout en trop forte concentration. Il reste toutefois faire les
bilans de masse requis afin dvaluer la quantit relle de CO2 qui est incorpore dans le
milieu aqueux et de valider la pertinence dune telle utilisation.
Finalement, afin de rduire la toxicit de leau, il serait probablement ncessaire de conserver
un traitement chimique ou un traitement dabsorption en amont de la culture. Par exemple, des
procds chimiques de floculation ou une filtration au charbon activ, malgr leur cot,
pourraient permettre daugmenter la concentration deau use utilisable comme substrat. Par
contre, dans un tel cas, il faudrait rvaluer leffet de ceux-ci sur la disponibilit en carbone
organique avec de nouveaux tests de croissance et trouver une source de phosphore
complmentaire afin de permettre une croissance.

74

CHAPITRE 8 CONCLUSIONS
Lobjectif de cette tude tait de valider la faisabilit dutiliser leau use industrielle
disponible comme substrat de culture pour la croissance de microalgues, et ce, dans une
optique de production de biocarburants. Le projet a permis de conclure que le carbone contenu
dans cette eau, principalement des composs aromatiques divers, peut soutenir
convenablement la croissance algale. Le phnol, en particulier, semble tre un compos
carbon potentiellement utilisable, puisquil peut tre prsent dans le milieu jusqu des
concentrations de 400 ppm avant daffecter ngativement la croissance. Toutefois, il sest
avr que leau use seule ne pouvait soutenir la croissance sans lajout de complments en
phosphore et en azote. Des rserves ont t souleves par rapport leffet des mtaux
bivalents sur lutilisation relle mesure des composs phnoliques par les microalgues. Des
exprimentations complmentaires devraient tre ralises afin de pouvoir lier ces deux
phnomnes. Les rsultats permettent tout de mme daffirmer que leau use pourrait tre
utilise comme source de carbone complmentaire peu coteuse pour la production de
biomasse algale, mais quelle ne constitue pas un milieu de culture complet. Comme
mentionn dans le document, il na pas t possible de vrifier le potentiel de valorisation de
la biomasse pour la production de biocarburants.
Les souches de microalgues identifies comme les plus rsistantes aux contaminants prsents
ont t principalement des souches de Chlorella. Elles ont permis dobtenir des rendements de
croissance et une concentration de biomasse, dans le cas de Chlorella vulgaris, de 0,84 g/L, ce
qui se compare ce qui est rapport dans la littrature. Ces rsultats pourront toutefois tre
optimiss en ajustant les paramtres de croissance, principalement lclairement, la
temprature et lamlioration de la composition du milieu.
Finalement, les essais de traitement ont permis de soulever lintrt de lajout de CO2 gazeux,
mme en amont de la culture, qui sest avr une bonne faon daugmenter les performances
de croissance. Des expriences subsquentes plus labores pourraient permettre de valider
avec certitude de quel faon le CO2 a pu influer sur la croissance cellulaire. Dans tous les cas,
les conditions de culture idales identifies dans cette tude pour Chlorella vulgaris permettre
de croire quil pourrait sagir tout de mme dune candidate intressante, puisquelle peut trs
75

bien crotre des tempratures rencontres notre latitude, soient entre 10 C et 30 C, tant
les tempratures testes dans cette tude. La disponibilit de chaleur rsiduelle pourrait alors
combler les carts lors des tempratures hivernales plus basses.
Dans tous les cas, les rsultats prsents dans cette tude permettent dorienter vers des voies
suivre et sur les futurs essais, mais ne constituent pas un fondement officiel pour des calculs
de rendements. Le nombre danalyses requis a limit le nombre de replicas ralisables et ne
permet pas de confirmer les rsultats sur une base statistique. Ltude a t limite
lutilisation de microalgues deau douce vertes non pr-acclimates leau use teste. Il
semblerait donc pertinent pour de futures tudes de se procurer des souches pr-acclimates
aux types de contaminants rencontrs, afin daugmenter les rendements de production et de
traitement. Dans le cas contraire, il serait pertinent dvaluer laspect technico-conomique de
lajout dun traitement deau en amont de la production de microalgues et qui pourrait
permettre dutiliser entirement leau use industrielle comme substrat de culture. Il serait
aussi pertinent de rechercher des sources dazote et de phosphore bons prix afin de
complmenter leau use disponible, cette dernire ne pouvant pas rpondre la demande pour
ces nutriments.

76

ANNEXE 1 DTAILS SUR LA MHODOLOGIE


A1.1 Calcul des taux de croissance (Chapitre 4)
Comme expliqu dans la mthodologie du chapitre 4, il a t possible de corrler la
concentration de chla mesure avec la concentration de cellules pour les souches en phase
exponentielle dans un milieu donn. Les rsultats ont t recueillis lors de dilutions
successives afin de maintenir les cellules dans le mme tat. Pour leau use prleve le 22
mars 2014, les rsultats pour les concentrations de 5 % et 10 % sont prsents dans la

Concentration de cellules
cells/L

Figure A-25, la Figure A-26 et le Tableau A-8.


1E+10
1E+10
1E+10
8E+09
6E+09
4E+09
2E+09
0E+00

CPCC90
CPCC157
JN15
JN17
JN36
LB1H10
0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

[Chl a] g/L

MA2H6
PCH25

Figure A-25 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et


la concentration de chla pour les diffrentes souches dans un milieu BBM 5 % deau
use prleve le 22 mars 2013

Concentration de cellules
cells/L

1E+10
CPCC90

1E+10

CPCC157

8E+09

JN15

6E+09
4E+09

JN17

2E+09

JN36
MA2H6

0E+00
0

2 000

4 000
[Chla] ug/L

6 000

8 000

PCH25

Figure A-26 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et


la concentration de chla pour les diffrentes souches dans un milieu BBM 10 % deau
use prleve le 22 mars 2013
77

Tableau A-8 Valeurs correspondant aux courbes de tendance linaires de la Figure A-25
et la Figure A-26

Souche
CPCC90
CPCC157
JN15
JN17
JN36
LB1H10
MA2H6
PCH25

5% d'eau use
quation courbe
de tendance
y=3E+06x+5E+07
y=4E+06x+1E+08
y=900459x+1E+08
y=2E+06x-3E+08
y=3E+06x+8E+07
y=7E+06x-2E+08
y=4E+06x-9E+08
y=1E+06x+6E+08

R2
0,9393
0,9719
0,9269
0,9626
0,9365
0,9149
0,9672
0,9485

10% d'eau use


quation courbe
de tendance
y=7E+06x-2E+09
y=2E+07x-2E+09
y=3E+06x+5E+07
y=3E+07x-5E+08
y=4E+06x+3E+07
E
y=3 +06x-2E+08
y=1E+06x+2E+08

R2
0,9001
0,7597
0,9756
0,7614
9260
0,9333
0,9902

Les rsultats pour les cultures de CPCC90, MA2H6 et PCH25 dans le milieu BBM avec 30 %

Concentration de cellules
cells/L

deau use prleve le 26 juin 2013 sont prsents dans la Figure A-27 et le Tableau A-9
3E+09
2,5E+09
2E+09
MA2H6

1,5E+09

PCH25

1E+09

CPCC90

500000000
0
0

1000

2000 3000 4000


[Chla] mg/L

5000

6000

Figure A-27 Graphique illustrant la relation linaire entre la concentration de cellules et


la concentration de chla dans une culture de Chlorella vulgaris CPCC90 dans un milieu
BBM 30 % deau use prleve le 26 juin 2013

Tableau A-9 Donnes relatives la Figure A-27


Souches
CPCC90
MA2H6
PCH25

78

quation courbe de
tendance
y=850153x+6E+07
y=809174x+1E+07
y=596201x+3E+08

R2
0,9429
0,9877
0,9464

A1.2 talonnage du fluorimtre maison (Chapitre 5)


Afin de relier la mesure du courant une concentration de chla, des mesures de chla ont t
faites en parallle avec le Trilogy Laboratory Fluorometer (Mthode CHL A NA, Turner
Designs, USA). De cette faon, il a t possible de vrifier si la concentration de chla en
fonction de la mesure de courant donnait une relation directement proportionnelle. La relation
cest avre correcte, mais il semblait y avoir une lgre dviation aprs 0,800 mV et les
rsultats semblaient moins constants des concentrations de cellules plus leves. Il tait donc
prfrable de rester dans des concentrations infrieures 0,800 mV, ce qui correspondait une
concentration de chla de 280 g chla/ L. La Figure A-28 prsente lobservation.

700,00

[Chlorophylle a] ug/L

600,00
500,00
400,00
300,00
200,00

y = 326,59x + 21,303
R = 0,9841

100,00
0,00
0

0,5

1
1,5
Mesure de courant mV

2,5

Figure A-28 Courbe dtalonnage du fluorimtre maison avec la mesure de la chla avec
une mthode dextraction

79

A1.3 Mthodologie des traitements sur leau use (chapitre 7)


Aration avec lair et avec le CO2 pur
-

Dbit dair/CO2 100 % : 0,15 L/min

Dure du traitement : 2 h

Volume dair utilis : 18 L

Manipulations : Le traitement a t fait dans un erlenmeyer de 1 L (systme ouvert)


avec une agitation constante au barreau magntique, temprature ambiante
(20 1C) et sous la hotte. Lair/CO2 inject dans la solution tait pralablement filtr
avec un filtre Whatman HEPA-VENT et le dbit tait contrl via une pompe
daquarium Whisper 100 5 W (Tetra, Allemagne). Aprs larrt du traitement, leau
tait laisse 5-10 minutes au repos avant dtre utilise pour fabriquer les milieux de
culture.

Bullage avec ozone


-

Modle dozonateur : OZO-2VTTL (Ozomax, Canada), 0,1 KW

Dbit dozone : 0,025 L/min

Dure du traitement : 1 h30

Volume thorique dozone utilis : En considrant 4 % dozone thoriquement produit


=> 90 mL dozone inject, soit 1 mL/min.

Manipulations : Le traitement a t fait avec une agitation constante au barreau


magntique, temprature ambiante (20 1C) et sous la hotte. Lozone tait inject
dans le milieu via un diffuseur improvis avec une pipette pasteur. Aprs larrt de
lozonation, de loxygne pur a t bull pendant 15 minutes dans leau pour retirer
lozone rsiduel. Ensuite, le contenant a t laiss ouvert 5 minutes puis ferm jusqu
son utilisation quelques heures plus tard pour fabriquer le milieu de culture.

clairage aux UVs

80

Modle de lampe : Handheld UV lamp UVG-54 (Science company, USA)

Intensit dclairage : 6 W, 254 nm

Dure du traitement : 70 h

Manipulations : Le traitement a t fait avec une agitation constante au barreau


magntique, temprature ambiante (20 1 C) et sous la hotte.

81

ANNEXE 2 DTAILS SUR LES RSULTATS


A2.1 Concentration de cellules dans les cultures en eaux uses prleves le
22 mars 2013 (Chapitre 4)

Concentration de cellules
cells/L

1E+10

CPCC90

1E+10

CPCC157

1E+10

JN15

8E+09

JN17

6E+09

JN36

4E+09
2E+09

LB1H10

0E+00

MA2H6
0

6
7
Temps jr

10

11

12

PCH25

Concentration de cellules cells/L

Figure A-29 Suivi de lvolution de la concentration de cellules dun rplica de culture


pour chacune des souches en milieu BBM avec 5% (v/v) deau use prleve le 22 mars
2013

1E+10
CPCC90

1E+10

CPCC157

8E+09

JN15

6E+09

JN17

4E+09

JN36
LB1H10

2E+09

MA2H6

0E+00
0

6 7 8
Temps jr

10 11 12 13

PCH25

Figure A-30 Suivi de lvolution de la concentration de cellules dun rplica de culture


pour chacune des souches en milieu BBM avec 10% (v/v) deau use prleve le 22 mars
2013

82

A2.2 Optimisation de la concentration deau use (Chapitre 7)


Voici les rsultats de croissance pour MA2H6 qui nont pas t prsents dans la section 7.2

Taux de croissance jr-1

de ce document.
1,4

BBM

1,2

BBM phnol
BBM 30% e.u

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Non trait

CO2

HCl

Figure A-31 valuation de leffet du pH sur la croissance de MA2H6 dans diffrents


milieux de culture traits

83

ANNEXE 3 ANALYSES DES EAUX USES

84

85

86

87

88

ANNEXE 4 RECETTE DU MILIEU BBM

89

RFRENCES
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