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Calibracin

Prof. Dr. Moiss Knochen

Bibliografa sugerida

J. N. Miller, J. C. Miller, Estadstica y


Quimiometra para Qumica Analtica. 4
Edicin. Prentice Hall, Madrid, 2002
Captulo 5 Mtodos de calibracin en anlisis
instrumental: regresin y correlacin"

Terminologa Analtica
Tcnica
Mtodo

Proceso fundamental til para


proporcionar informacin analtica
Aplicacin especfica de una tcnica a la
resolucin de un problema

Procedimiento

Instrucciones escritas para aplicar un


mtodo

Protocolo

Descripcin especfica. Debe seguirse


sin modificaciones

J. K. Taylor, Anal. Chem., 1983, 55 (6), pp 600A608A

Terminologa Analtica
Analito
Seal

Transductor
Ruido

Especie qumica a detectar


determinar (en una matriz)
Forma en que se manifiesta la
informacin
Transforma un tipo de seal en otro (un
tipo de energa en otro)
Seal indeseada (aleatoria)
superpuesta a la informacin

Procesamiento
de seal

Amplificacin, atenuacin, filtrado,


integracin, derivacin
4

Por qu calibracin?

Tcnicas clsicas
Ej. gravimetras, volumetras
Se basan en relaciones
estequiomtricas
Ej. Titulacin volumtrica de HCl
con NaOH
La medida (p. ej. volumen de
reactivo) guarda una relacin
definida con la masa de analito
6

Tcnicas instrumentales
Se basan en la medida de una
propiedad fisicoqumica del sistema
No se basan en estequiometras
Son de tipo relativo o comparativo
La respuesta de un instrumento depende de varias
variables, no slo de la concentracin de analito
La relacin entre la respuesta y la concentracin del
analito no es estable en el tiempo
7

Instrumento
Concentracin
(o masa)

Cantidad de
sustancia

Puede variar con el


tiempo, depende de
diversas variables

Respuesta

Funcin de
respuesta

Nmero

No se puede hacer
una vez para
siempre
8

Cmo percibimos la medida por


medio de un instrumento?
Distintas interfases con el ser
humano
Vara con la tecnologa del
instrumento

Instrumento

Escalas analgicas

10

Registro analgico en papel

11

Lectura digital

12

Presentacin en pantalla

Combina
analgico y
digital

13

Impresin de datos digitales

14

Ejemplos de respuesta
Intensidad de radiacin luminosa
Absorbancia
Diferencia de potencial (voltaje)
pH
Llamamos respuesta a la indicacin que da
el instrumento.
15

Calibracin
Proceso de establecer la relacin funcional
entre la respuesta y la cantidad de
sustancia (concentracin o masa)

R = f (C )

Funcin de
calibracin

Se necesita disponer de patrones de


concentracin (o masa) de analito
perfectamente conocida
16

Definicin de IUPAC
Calibracin en Qumica Analtica es la operacin que
determina la relacin funcional entre valores medidos
(intensidades de seal y a ciertas posiciones de seal
zj) y cantidades analticas caracterizando tipos de
analitos qi y su cantidad (contenido, concentracin) x.
La calibracin incluye la seleccin del modelo (su forma
funcional) la estimacin de los parmetros del modelo
as como los errores, y su validacin.
IUPAC, Guideline for calibration in analytical chemistry. Part 1.
Fundamentals and single component calibration. K. Danzer, L. A. Currie,
Pure &Appl. Chem., 70(4), 993-1014 (1998).
17

Los instrumentos no son los nicos


responsables de la respuesta,
sta es consecuencia de todo el
proceso analtico

18

Proceso de calibracin
Obtener/preparar patrones del analito

Medir los patrones y registrar la respuesta

Averiguar la relacin funcional entre respuesta y


concentracin
19

Uso de la funcin de calibracin


Averiguar la concentracin de un analito
Se emplea la funcin inversa:
1

C = f ( R)

Funcin de
evaluacin

sta se emplea para averiguar la concentracin de


las muestras
20

Curva de calibracin

Concentracin (g/L)
21

Interpolacin
Si la funcin de evaluacin se usa dentro del rango
de concentraciones usado para la calibracin, se
denomina interpolacin
Si se la usa fuera de dicho rango se denomina
extrapolacin
Para fines analticos se emplea la interpolacin

22

La extrapolacin es muy
riesgosa porque se est
suponiendo que la funcin de
calibracin se sigue
cumpliendo an fuera de dicho
rango de concentraciones
23

Proceso de calibracin
C1

R1
C2

R2
R = f(C)

C3

C4

R3

R4
24

Proceso de calibracin
Preparacin de una tabla a dos columnas
Concentracin

Respuesta

C1

R1

C2

R2

C3

R3

Obtencin de la funcin de calibracin R = f(C)


Preparacin de una grfica llamada curva de
calibracin (opcional)
25

Anlisis de regresin
Cmo determinar la funcin de calibracin?
Modelado matemtico
Se emplea una herramienta estadstica
llamada Anlisis de Regresin

26

Anlisis de regresin
Ejemplo: y como funcin de x
Supongamos una relacin lineal:

y=a+b x
Los valores de los parmetros a y b se obtienen
mediante el mtodo de los mnimos cuadrados
Se dispone de ecuaciones para calcular los
parmetros para distintos modelos de ajuste
27

Anlisis de regresin: condiciones


La teora estadstica supone:
Que la variable x no tiene incertidumbre
Que para cada valor de xi los valores de yij
presentan una distribucin normal
Que para los distintos valores de x, las varianzas
de las y presentan varianzas s2i homogneas. Se
dice que los valores de y son homoscedsticos

En la realidad los datos experimentales slo


cumplen con lo anterior en forma aproximada
28

El mtodo de los mnimos cuadrados permite


hallar los valores de los parmetros que
hacen mnima la suma de los cuadrados de
las diferencias de las ordenadas estimadas
respecto a las experimentales
Minimiza la suma de los cuadrados de los
residuales

29

Ajuste de curva
16
14

Absorbancia
Fluorescencia

12
10
y = 2.2124x + 1.0395

8
6
4

Residuales o residuos
(traduccin del ingls
residuals)

2
0
0

Concentracin (mg/mL)

30

El problema de la incertidumbre en x
No es cero
x corresponde a concentraciones o masas de
patrones preparados con mucho cuidado:
balanzas de elevada precisin
material volumtrico de calidad
trabajo cuidadoso

Se supone incertidumbre suficientemente


baja para considerarla despreciable
31

Clculo de los parmetros


Caso: relacin lineal con ordenada en el origen
(y = a + bx)
i =m

b=

[( x x)( y
i =1

i=m

( x x)
i =1

y )]
2

a = y bx

ay b

son estimaciones de los verdaderos valores


de los parmetros

32

Clculo de los parmetros


Para este modelo lineal (y = a + b x) se pueden
estimar los parmetros a y b mediante las
ecuaciones:

mxy - x y
b=
2
2
m x -( x )

m = nmero de
niveles de x

y x - x xy
a =
m x 2 - ( x )2
(se ha omitido el smbolo ^ porque se sobreentiende
que son valores estimados)
33

Clculo de los parmetros


Similarmente se pueden deducir ecuaciones
para otros modelos:
xy
b=
x2

y=bx

y = bx +

cx2

x 2 x 2 y - x3 xy
c=
x4 x 2 - ( x3 )2
x4 xy - x3 x 2 y
b=
x4 x 2 - ( x3 )2
34

Clculo de los parmetros


y = a + b x + cx2
2
3
2 2
3
2
2
2
[

y
[m

xy
+
[m

x
]

y
)
)
x
x
x
x
x
x
c
a4 =
[ x2 x4 - ( x3 )2 ]m- [ x x4 - x2 x3 ] x+[ x x3 -( x2 )2 ] x2
2
3
4
2 2
4
2
3
2
[

y
[(

xy
+
[

y
)
x
x
x
x
x
x
x
x
b
b4 =
[ x2 x4 - ( x3 )2 ]m- [ x x4 - x2 x3 ] x+[ x x3 -( x2 )2 ] x2
2
4
3 2
4
2
3
3
2 2
2
[

y
[

xy
+
[

y
)
)
x
x
x
x
x
x
x
x
x
a=
c4
[ x2 x4 - ( x3 )2 ]m- [ x x4 - x2 x3 ] x+[ x x3 -( x2 )2 ] x2
35

Qu modelos emplear?
Para calibracin se suelen probar modelos
polinomiales
Grado de polinomio superior a 2 no
recomendable
Un polinomio de grado suficientemente alto
ajustar cualquier conjunto de puntos,
aunque la funcin no tenga ningn sentido
fsico.
36

37

Modelo: y = b x + a

38

Modelo: y = cx2 + b x + a

39

Modelo: y = g x6+ f x5 + e x4 + d x3 + c x2 + b x + a

40

Un modelo polinmico de alto grado puede ajustar cualquier


conjunto de datos aunque no tenga sentido fsico

El modelo de regresin adoptado debe ser el ms simple que


de resultados satisfactorios

Debe tenerse presente los fundamentos fsicoqumicos de la


tcnica analtica

No tiene sentido adoptar un modelo de regresin complejo


simplemente porque parece tener mejor ajuste
41

42

Seal

Curva de calibracin
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0

10
15
Concentracin
y = 7.0316x2 + 54.343x + 83.542
R = 0.9969

43

Significado de x e y
x, la variable independiente es generalmente la
concentracin del analito
y es la respuesta del mtodo, y depende del mismo
Por ejemplo: absorbancia, intensidad de emisin,
fluorescencia, diferencia de potencial
En algunas tcnicas x puede ser masa en lugar de
concentracin

44

Ajuste de curva
16
14

Absorbancia
Fluorescencia

12
10
y = 2.2124x + 1.0395

8
6
4

Residuales o residuos

2
0
0

Concentracin (mg/mL)

45

Preparacin de curvas de calibracin


Definir el rango de concentraciones de los patrones
Definir la cantidad de niveles de concentracin de
los patrones
Patrones uniformemente espaciados o no?
Preparar patrones (slidos, lquidos o gaseosos)
Calidad de los patrones

46

Rango de concentracin de los patrones


Condicionado por la respuesta del instrumento
Ejemplo: mtodos basados en medida de absorbancia

Condicionado por la concentracin esperada en las


muestras a analizar
Condicionado por la variabilidad de las muestras a
analizar
Ejemplo muestra ambiental vs producto industrial

47

Cantidad de niveles de concentracin


Ms niveles
Menos niveles

mejor modelado
menos trabajo

48

Pocos niveles de concentracin


8

Emisin

0
0

0.5

1.5

Concentracin (mg/L)

2.5

3.5

49

Ms niveles de concentracin
8

Emisin

y = -0.2x2 + 2.75x + 6E-14


2

0
0

0.5

1.5

Concentracin (mg/L)

2.5

3.5

50

Espaciamiento de los patrones


0.8

Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0

0.5

1.5

Concentracin (mg/L)

2.5

3.5

51

Espaciamiento de los patrones

52

Curvas de calibracin
en mtodos volumtricos
Tiene sentido?
Estequiometra definida
Curva de calibracin Volumen de
titulante consumido vs. masa de
analito Cmo sera?

53

Curvas de calibracin
en mtodos volumtricos
Vale la pena invertir tiempo en hacerla?
Caso excepcional: titulaciones volumtricas
con reacciones no estequiomtricas

54

Seleccin de la curva
de mejor ajuste

56

Seleccin de la curva de mejor ajuste


Mediante anlisis de regresin es posible obtener
los parmetros correspondientes a cualquier
modelo matemtico
(a) Para un dado modelo Cmo decidir si ajusta a
los puntos experimentales? bondad de ajuste
(b) Dados varios modelos Cul de ellos ser el ms
adecuado para representar los puntos
experimentales? seleccin de la curva de mejor
ajuste
57

Seleccin de la curva de mejor ajuste


Puede haber motivos para esperar o para
preferir un cierto modelo de curva de
calibracin?
Conocimiento de los fundamentos
fisicoqumicos del proceso analtico y de la
medicin
Simplicidad y conveniencia

modelo lineal

58

Seleccin de la curva
de mejor ajuste
Diversos criterios:
1. Inspeccin visual
2. Estudio de los residuales
3. Estudio de la varianza de regresin
4. Uso del coeficiente de correlacin (?)
5. Pruebas de hiptesis de base estadstica
59

1. Seleccin por inspeccin visual


El cerebro humano es una
poderosa herramienta de
reconocimiento de
patrones
Sin embargo no es
conveniente basarse en
esa nica herramienta
60

Seleccin por inspeccin visual


10

Emisin

0
0

Concentracin (mg/L)

61

Seleccin por inspeccin visual


10

6
Emisin

y = 1.55x + 1

Modelo lineal
con ordenada
en el origen

0
0

Concentracin (mg/L)

62

Seleccin por inspeccin visual


10

Emisin

6
y = 1.780x
4

Modelo lineal
sin ordenada
en el origen

0
0

Concentracin (mg/L)

63

Seleccin por inspeccin visual


10

Emisin

y = -0.2x + 2.75x - 7E-15

Modelo
cuadrtico con
ordenada en el
origen

0
0

Concentracin (mg/L)

64

Seleccin por inspeccin visual


10

Emisin

6
y = 22.75x
y = -0.2x
+ 2.75x
4

Modelo
cuadrtico sin
ordenada en el
origen

0
0

Concentracin (mg/L)

65

2. Estudio de los residuales


Puede efectuarse grfica o estadsticamente
En un buen ajuste el signo de los residuales
debera distribuirse aleatoriamente
Estadsticamente mediante una prueba de
signos

66

Estudio de rachas
de signos

+
+
+
+
+
+
-

67

Grfico de residuales

68

3. Estudio de la varianza de regresin


No indica si el ajuste es bueno o no, pero entre
varios modelos permite elegir el mejor
s2R

n
=
f

2
(
y

y
)
i i ,R
i =1

Residuo

f, grados de libertad = nmero de niveles de


concentracin nmero de parmetros del modelo
Entre varios modelos, el de mejor ajuste presenta el
menor s2R (menores residuales)
69

4. Uso del coeficiente de correlacin


Coeficiente de correlacin para una recta:

-1 r +1 es una medida de la bondad de ajuste


r = +1 -1 ajuste lineal perfecto (correlacin
positiva o negativa). r = 0 no hay correlacin lineal
Indicador muy riesgoso de usar sin otros elementos
de juicio
70

Uso incorrecto del coeficiente


de correlacin

Para usar el coeficiente de correlacin se recomienda


acompaarlo de un segundo criterio (p. ej. inspeccin
visual)
71

Seleccin de la curva
de mejor ajuste
Diversos criterios:
1. Inspeccin visual
2. Estudio de los residuales
3. Estudio de la varianza de regresin
4. Uso del coeficiente de correlacin (?)
5. Pruebas de hiptesis de base estadstica
72

5. Pruebas estadsticas
Prueba de falta de ajuste (prueba de lack-offit o prueba de LOF)
Es una prueba de hiptesis
Para un dado modelo de regresin, permite
aceptarlo o rechazarlo sobre una base
estadstica

73

Pruebas estadsticas
Como toda prueba de hiptesis, el usuario
debe elegir un valor de probabilidad llamado
nivel de confianza
En Qumica Analtica suele elegirse un nivel
de confianza de 95% (= 0.05)

74

Prueba de LOF
Se dispone de mediciones de los valores de y para
varios niveles de x (en este caso para varios niveles
de concentracin)
Para cada valor de x, xi, se dispone de varios valores
2
s
de y, yij, cuyo promedio ser y i con varianza i
Es condicin necesaria que estas varianzas sean
homogneas (condicin de homoscedasticidad)
Esta condicin debe verificarse previamente
mediante otra prueba de hiptesis (p. ej. prueba de
Bartlett)
75

76

77

Prueba de LOF
A partir de estas varianzas se calcula la varianza de
repetibilidad:
m

2
(
y

y
)
ij i

2
rep

i =1 j =1

m(n 1)

La varianza de repetibilidad es una estimacin de la


dispersin de las ordenadas al medir repetidamente un
mismo punto
Presenta m(n-1) grados de libertad (suponiendo n constante)
Si n variable, f = ni - m
78

Prueba de LOF
Se calcula adems la varianza respecto a la
regresin, ya vista anteriormente:

n
=
f

( y
i =1

yi , R )

f, grados de libertad = nmero de niveles de


concentracin nmero de parmetros del modelo
Como vimos, sta mide la distancia entre la lnea de
regresin y los puntos experimentales
79

Prueba de LOF
La prueba de LOF compara la varianza de
repetibilidad con la varianza respecto a la regresin
Se intenta determinar, si el apartamiento de los
puntos experimentales respecto a la curva de
regresin puede explicarse nicamente a partir de la
dispersin aleatoria de los valores
H0: s2R = s2rep
HA: no H0
80

Prueba de LOF
Se emplea el estadstico

s R2
F= 2
s rep
el cual cumple con la distribucin F para el nivel de
confianza seleccionado, con (m-p, ni m) grados
de libertad
m= nmero de niveles de concentracin, ni = n de
repeticiones en cada nivel, p = nmero de
parmetros del modelo
81

Prueba de LOF: datos con baja dispersin


12

10

0
0
-2

82

Prueba de LOF: datos con baja dispersin


12

10

0
0
-2

83

Prueba de LOF
12

10

0
0
-2

84

Prueba de LOF: datos con alta dispersin


12

10

0
0
-2

85

Prueba de LOF: datos con alta dispersin


12

10

0
0
-2

86

Prueba de LOF: datos con alta dispersin


12

10

0
0
-2

87

La prueba de LOF es muy exigente


Fracasa o es de difcil interpretacin cuando
las determinaciones son muy precisas (baja
dispersin) ningn modelo sencillo es
aceptado

88

El cuarteto de Anscombe
http://en.wikipedia.org/wiki/Anscombes_quartet

89

Incertidumbre en la regresin
Los parmetros estimados tienen una incertidumbre
asociada. Para la regresin lineal simple:

90

Incertidumbre en la regresin
Como consecuencia la curva de regresin tiene
tambin una incertidumbre

91

Incertidumbre en la regresin
Esta incertidumbre se expresa en los corredores de
confianza:
Y por ende los valores
de x (concentracin)
obtenidos por
interpolacin tendrn
una incertidumbre
asociada

92

Interferencias
Decimos que en una determinacin analtica existen
interferencias cuando los resultados son inexactos como
consecuencia de algn fenmeno fsico o qumico cuya
influencia no fue prevista

Se produce un error sistemtico que genera un sesgo


(diferencia entre el valor obtenido y el valor verdadero)

93

Clasificacin de interferencias
Desde el punto de vista del efecto neto
que producen:
Interferencias aditivas
Interferencias multiplicativas

94

Interferencias aditivas
Producen el efecto de sumar una constante al
valor medido

R = k1 + bC

(k1 0)

95

Interferencias aditivas
Ejemplo: si medimos la absorbancia de una sustancia
pero la muestra contiene adems otra sustancia que
absorbe a esa longitud de onda, mediremos, sin
saberlo, la suma de dos absorbancias.

El resultado estar afectado de un error

96

Interferencias multiplicativas
Ocurre cuando la matriz de la muestra afecta la respuesta del
analito
Producen el efecto de multiplicar la respuesta por un factor
distinto de 1
R = k2bC (k2 1)
A igual concentracin de analito la respuesta ser diferente para
los estndares y para la muestra
97

Tipos de calibracin analtica

Calibracin externa o directa:


Se interpola en una curva de calibracin

Mtodo de adiciones estndar:


Calibracin en la misma muestra, en la misma matriz
Se emplea cuando se sospecha la presencia de interferencias
multiplicativas
98

Calibracin externa o directa

99

Mtodo de adiciones estndar (Standard


additions method, SAM)
Hacer la calibracin dentro de la propia muestra

As la matriz es idntica para patrones y muestra y


k2 = 1
Permite detectar la presencia de interferencias
multiplicativas y, si las hubiera, obtener un resultado
libre de interferencia
100

Mtodo de adiciones estndar


Se toman varias alcuotas iguales de la muestra

A cada una se adiciona una cantidad diferente


pero conocida de analito (estndar o patrn)
Se llevan todas a igual volumen
101

Muestra
(ya procesada)

Vm

Vm

Vm

Vm

102

Patrn

V1

C1

V2

C2

V4

V3

C3

C4

103

Se miden las respuestas instrumentales

Se relacionan stas con las adiciones C

Se extrapola la recta al corte con el eje de abscisas


El valor del punto de corte es el valor de concentracin
con signo cambiado (-C0)
104

105

Deteccin de interferencias: Si la pendiente de la curva de


adiciones estndar difiere significativamente de la pendiente de la
curva de calibracin directa
existe interferencia multiplicativa.

Si existieran interferencias aditivas la curva de SAM simplemente


se desplazara verticalmente

Determinacin cuantitativa: se calcula C0 y


se hacen los clculos correspondientes

106

18

16

14

Adiciones
estndar

12

10

Calibracin
directa o externa

0
0

10

107

Condiciones para usar el SAM


La respuesta debe ser
lineal en todo el
intervalo de
concentraciones usado

La interferencia
multiplicativa debe ser
constante en todo el
rango de
concentraciones

No deben existir
interferencias aditivas

Si existieran debern
ser corregidas
separadamente
108

El mtodo de adiciones
estndar puede ser ms
exacto pero es ms
impreciso (mayor
dispersin)

Esto se debe a ser un


mtodo basado en una
extrapolacin

Es ms trabajoso

No se recomienda su uso
si no es imprescindible

109

-C0

-C0
110