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FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

PROYECTO CURRICULAR INGENIERIA AMBIENTAL


INFORME N6: PRUEBA DE ABSORBANCIA
Andrs Oden 20132180893
RESUMEN

La determinacin cuantitativa de la concentracin de protenas es una de las pruebas ms


frecuentes en laboratorios de bioqumica. Primitivamente la medicin se evaluaba realizando una
estimacin de la cantidad total de nitrgeno proteico y teniendo en cuenta que este elemento
representa aproximadamente el 16% del peso de la protena. Estos mtodos eran muy extensos
por lo que en la actualidad se cuenta con mtodos calorimtricos y colorimetricos lo cual ha
permitido solventar estos inconvenientes. La espectrofotometra UV-visible es una tcnica
analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que
las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentracin. En el presente laboratorio se realizada la
determinacin de la concentracin de protenas presentes en una solucin por el mtodo de
Lawry con ayuda del espectofotometro.
Palabras clave: absorbancia, transmitancia, colorimetra, Lawry, Folin.
ABSTRACT

Quantitative determination of the protein concentration is one of the most common tests in
biochemistry laboratories. Originally measurement was evaluated by estimating the total amount
of protein nitrogen and considering that this element represents about 16% of the protein weight.
These methods were very extensive so that today it has calorimetric and colorimetric methods
which enabled overcome these drawbacks. UV-visible spectrophotometry is an analytical
technique for determining the concentration of a compound in solution. It is based on the
molecules absorb electromagnetic radiation and in turn the amount of light absorbed depends
linearly on the concentration. In this laboratory determining the concentration of proteins present
in a solution by the method of Lawry using the spectrophotometer is performed.
Keywords:
absorbance,
transmittance,
colorimetry,
Lawry,
Folin.
Keywords: absorbance, transmittance, colorimetry.
OBJETIVOS
Determinar la concentracin de albumina presente en una solucin por el mtodo de Lawry
Objetivos especficos
Conocer la incidencia del reactivo Folin en la reaccin qumica.
Familiarizar los conceptos de absorbancia y transmitancia.
Representar la relacin Absorbancia- concentracin en una curva de calibracin
MARCO TEORICO

Los mtodos espectroscpicos de anlisis


estn basados en la medida de la radiacin

electromagntica que es absorbida o


emitida por una sustancia. En funcin de
ello se clasifican fundamentalmente en:

Mtodos de absorcin: Se basan en la


disminucin de la potencia de un haz de
radiacin electromagntica al interaccionar
con una sustancia.
Mtodos de emisin: Se basan en la
radiacin que emite una sustancia cuando
es excitada previamente por medio de otro
tipo de energa (trmica, elctrica...).
Mtodos de fluorescencia: Se basan en la
radiacin que emite la sustancia cuando es
excitada previamente por un haz de
radiacin electromagntica.

Otras clasificaciones de los mtodos


espectroscpicos se establecen en funcin
de la regin del espectro electromagntico
que interviene en la tcnica. As, pueden
utilizarse regiones como rayos X,
ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas,
etc. En la Figura 1 pueden verse las
regiones del espectro electromagntico, en
funcin de los valores de la longitud de onda
() de cada radiacin:

Ilustracin 1: Espectro electromagntico. Tomado de practica 4, Qumica general UAM.

La regin UV se define como el rango de


longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es
una regin de energa muy alta. Provoca
dao al ojo humano as como quemadura
comn. Los compuestos con dobles enlaces
aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos,
sistemas aromticos, grupos carbonilos y
otros heterotomos tienen su mxima
absorbancia en la regin UV, por lo que sta
es muy importante para la determinacin
cualitativa y cuantitativa de compuestos
orgnicos. Diversos factores -como pH,
concentracin de sal y el disolvente- que
alteran la carga de las molculas, provocan
desplazamientos de los espectros UV. La
fuente de radiacin ultravioleta es una
lmpara de deuterio. En la regin visible
apreciamos el color visible de una solucin y
que corresponde a las longitudes de onda
de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del
color que transmite. Por tanto, para realizar

mediciones de absorcin es necesario


utilizar la longitud de onda en la que
absorbe luz la solucin coloreada. La fuente
de radiacin visible suele ser una lmpara
de tungsteno y no proporciona suficiente
energa por debajo de 320 nm.
Transmitancia y Absorbancia
Cuando un rayo de luz de una determinada
longitud de onda de intensidad Io incide
perpendicularmente sobre una disolucin de
un compuesto qumico que absorbe luz o
cromforo, el compuesto absorber una
parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar
pasar el resto (It), de forma que se cumple:
Io= Ia+ It
La transmitancia (T) de una sustancia en
solucin es la relacin entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez
que ha atravesado la muestra, I t, y la
cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y

se representa normalmente en tanto por


ciento: % T=It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida fsica
de la relacin de intensidad incidente y
transmitida al pasar por la muestra. La
relacin entre %T y la concentracin no es
lineal, pero asume una relacin logartmica
inversa. La absorbancia (A) es un concepto
ms relacionado con la muestra puesto que
nos indica la cantidad de luz absorbida por
la misma, y se define como el logaritmo de
1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io
Cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales (Io = It), la transmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a
una determinada longitud de onda, y
entonces A vale log 1 = 0.
Instrumentacin para la medicin de
absorbancias de la luz visible y
ultravioleta:
espectrofotmetro UVvisible
La medicin de absorbancia de la luz por las
molculas se realiza en unos aparatos
llamados espectrofotmetros. Aunque
pueden variar en diseo, en especial con la
incorporacin de ordenadores para el
anlisis
de
datos,
todos
los
espectrofotmetros constan, segn se
indica en la figura, de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara
de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de
radiaciones de una determinada longitud de
onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un
recipiente transparente (cubetas o tubos)
que contenga la muestra Pueden ser de
vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para
medir en UV se deben usar las de cuarzo o
slice fundido, porque el vidrio no transmite
la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador
convertidor de las seales luminosas en
seales elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de
datos.

Ilustracin 2: Espectrofotmetro. Tomada


de Departamento de Bioqumica UCO.

Desde el punto de vista operativo, el primer


paso es seleccionar la fuente de luz y
longitud de onda a la que se va a realizar la
medida. Hay espectrofotmetros de un solo
haz (con una sola celdilla para alojar la
cubeta con la muestra) y de doble haz (con
dos celdillas para dos cubetas); en nuestro
caso se trabajar con los de un solo haz. Se
mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste
del mando, de forma que la intensidad
incidente y transmitida sean iguales (Io=It),
y por tanto la absorbancia es cero. A
continuacin se pone en la celdilla la cubeta
con la muestra y se lee la absorbancia de
sta.
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relacin entre
absorbancia de luz monocromtica (de
longitud de onda fija) y concentracin de un
cromforo en solucin:
A = log I/Io = cl
La absorbancia de una solucin es
directamente
proporcional
a
su
concentracin a mayor nmero de
molculas mayor interaccin de la luz con
ellas-; tambin depende de la distancia que
recorre la luz por la solucin a igual

concentracin, cuanto mayor distancia


recorre la luz por la muestra ms molculas
se encontrar-; y por ltimo, depende de ,
una constante de proporcionalidad
-denominada coeficiente de extincin- que
es especfica de cada cromforo. Como A
es adimensional, las dimensiones de
dependen de las de c y l. La segunda
magnitud (l) se expresa siempre en cm
mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que
las dimensiones de resultan ser M-1cm-1.
Este coeficiente as expresado, en trminos
de unidades de concentracin molar (o un
submltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extincin molar (M). Cuando,
por desconocerse el peso molecular del
soluto, la concentracin de la disolucin se
expresa en otras unidades distintas de M,
por ejemplo gL-1, las dimensiones de
resultan ser distintas, por ejemplo g-1Lcm1, y al coeficiente as expresado se
denomina
coeficiente
de
extincin
especfico (s).
La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; para valores de c altos,
vara con la concentracin, debido a
fenmenos de dispersin de la luz,
agregacin de molculas, cambios del
medio, etc.
CURVA DE CALIBRACIN
Denominamos espectro de una sustancia a
la representacin de absorbancia (A) en
funcin de longitud de onda (), este grfico
presenta ondulaciones con mximos y
mnimos.
Para
hacer
las
determinaciones
cuantitativas se elige, en general, la longitud
de onda correspondiente a un mximo, pues
el error de medicin es mnimo y la
sensibilidad mxima.
Para verificar el cumplimiento de la ley de
Beer, se debe realizar la curva de

calibracin; absorbancia (A) en funcin de


concentracin (c), para lo cual se preparan
soluciones de la sustancia

Ilustracin 3: Curva de calibracin.


Tomada de Departamento de
Qumica analtica UBA.

Preparan soluciones de la sustancia de


concentraciones conocidas y se mide la
absorbancia a la longitud de onda elegida
Si es vlida la ley de Beer, para esa
sustancia a esas concentraciones, la
relacin debe ser una recta, que pase por el
origen de los ejes cartesianos; a menudo se
observan desviaciones debidas a diversos
factores.
Albmina
Es una protena que se encuentra en gran
abundancia en el plasma sanguneo, siendo
la principal protena de la sangre. Es
sintetizada en el hgado. Son el 75% de las
protenas del suero y el 11% de las
protenas totales, solubles en presencia de
SO4Na2 al 20%. Hay 3 tipos: lactoglobulina,
lactoalbmina y seroalbminas.
Funciones de la albmina
-Mantenimiento de la presin onctica.
-Transporte de hormonas tiroideas.
-Transporte de hormonas liposolubles.
-Transporte de cidos grasos libres. (Esto
es, no esterificados)
-Transporte de bilirrubina no conjugada.
-Transporte de muchos frmacos y drogas.
-Unin competitiva con iones de calcio.
-Control del pH.
-Funciona como un transportador de la
sangre y lo contiene el plasma

Mtodos de valoracin de protenas


Los mtodos utilizados para medir las
MATERIALES
protenas totales pueden clasificarse en 6
categoras:
Espectrofotmetro.
1. Procedimientos turbidimtricos:
Baln Aforado.
a) cido sulfosaliclico ms sulfato sdico
Pipeta graduada de 10ml.
b) cido tricloroactico (TCA)
Beacker de 50 ml.
2. Espectrofotometra ultravioleta a 210 mn
Agitador de vidrio.
despus de:
Balones aforados (5)
a) Cromatografa en columna.
Albumina
b) Ultrafiltracin
Reactivo de Folin
3. Mtodos de Lowry utilizando el reactivo
Pasta
de
Folin- Muest Absorba Mas Volum %P/
Ciocalteau:
ra
ncia
a
en
V
a) Con blanco
(ml)
RESULTADOS
b) Sin blanco
Blanco
0
25
0
4.
M1
0,229
30
25 120 En el presente laboratorio
Procedimientos
M2
0,345
60
25 240 se ha utilizado el mtodo
modificados del
de Lowry usando reactivo
M3
0,624 120
25 480
biuret
con
de
Folin-Ciocalteau
medicin a 300 nm
usando un blanco de agua destilada. Los
5. Mtodos inmunolgicos.
valores obtenidos para absorbancia del blanco y
En el presente laboratorio se har uso del
mtodo de Lowry con el reactivo de FolinCiocalteau es ampliamente utilizado para
este tipo de valoraciones. En este mtodo
se observa una reaccin en dos etapas: a)
una reaccin inicial de la protena y el cobre,
relacionada con la reaccin del biuret; b)
una segunda reduccin de los cidos
fosfotungstico y fosfohemolibdico con el
complejo de cobre-protena as como con
tiosina y triptfano. El mtodo de Lawry solo
precisa 100 a 200 l de LCR. Sin embargo
es ms prolongado y ms difcil que los
mtodos turbimetricos y est sujeto a
interferencias variables derivadas de los
fenoles
y
frmacos
producidos
endgenamente
(salicilatos,
cloropromacina, tetraciclina y sulfamidas).

las 3 muestras evaluadas se presentan a


continuacin:

A partir de estos datos se ha construido la curva


de calibracin la cual permitir encontrar la
concentracin de las muestras analizadas en
este laboratorio.
Adicional, se realiz la coccin de pasta de la
cual se obtuvo un suero de 40 ml el cual fue
aforado en un matraz adicionando 100 ml
adicionales de agua destilada. Se aplic el
reactivo de cobre y posteriormente FolinCiocalteau. Una vez hecho esto las muestras
manejadas tomaron una coloracin azul
verdosa.

Curva de calibracin
0.8
0.6
Absorbancia

f(x) = 0x + 0.04
R = 0.98

0.4
0.2
0

100

200

300

400

500

600

Concentracion (P/V)
Absorbancia

Linear (Absorbancia)

Igualmente se ha hecho el anlisis de dos


muestras de pastas las cuales fueron hervidas y
se les aplico el mtodo de Lawry para
determinacin de concentracin de protena
presente en la solucin. Para el clculo ha sido
utilizada la ecuacin de la recta encontrada en
el tem anterior. Para la estimacin de la
concentracin real se ha empleado el factor de
dilucin obteniendo la siguiente tabla:
C.
Masa Absorba Dilui C.
Muestra (g)
ncia
da
Real
10,25
126,8 317,
Tornillos
0
0,165
87
22
10,04
438,4 1096
Fideos
0
0,570
26
,1
Conchita 10,12
249,1 622,
s
0
0,324
95
99
Macarro
10,40
146,8 367,
nes
0
0,191
87
22

Analisis de resultados

Como se puede apreciar se ha conformado


una lnea recta con los valores obtenidos
mostrando que conservan una estrecha
relacin lineal confirmando un error mnimo
y una sensibilidad mxima que nos permite
verificar el cumplimiento de la ley de
Lambert-Beer en la dilucin analizada
durante esta prctica y as se logra
corroborar la relacin existente entre la
concentracin de la muestra y la
absorbancia obtenida.
Con los datos obtenidos en el
espectrofotmetro, se puede deducir que la

absorbancia aumenta con la concentracin


de las soluciones y la distancia que recorre
el rayo de luz, debido a que hay mayor
cantidad de analito ( mayor cantidad de
molculas que adsorben energa para
excitarse). Las cuales toman esta energa
del rayo de luz, disminuyendo la intensidad
de la radiacin, por lo que la transmitancia
disminuye al aumentar la concentracin.
Fernndez (2011).
CONCLUSION

La presente practica ha permitido afianzar


conocimientos en el manejo del
espectrofotmetro y la relacin entre el nivel
de absorbancia de luz por parte de
soluciones frente a su nivel de
concentracin. Se ha logrado establecer de
una manera prctica que la concentracin
presente en la muestra con el complejo
Cu(NH3)4 fue directamente proporcional a el
nivel
de
absorbancia
presentado
observndose un coeficiente de correlacin
lineal R2 de 0.996 indicndonos una muy
alta relacin entre los datos que fueron
objeto de anlisis. Igualmente se pudo
evidenciar como a mayor absorbancia
mayor concentracin en las muestras.
BIBLIOGRAFIA
Fernndez, C. (2011). Quimiometra.
Valencia. Espaa: Universidad de Valencia.
FIUBA (2006). Catedra
Analtica:
segundo

de Qumica
cuatrimestre.

Departamento de Qumica. Universidad de


Buenos Aires.
Facultad de Ciencias (2010). Mapas
conceptuales de las asignaturas de 1 y 2
curso del grado de Qumica. Universidad
Autnoma de Madrid.
Abril, A., Barcena A., et al. (2011).
Espectrofotometra: espectros de absorcin
y
cuantificacin
colorimtrica
de
biomoleculas. Departamento de Bioqumica.
Universidad de Crdoba. Espaa.