Emprego de substratos peptdeos sintticos fluorescentes ou de fluorescncia

apagada na deteco e caracterizao das prteses

Conceito dos substratos
Peptdeos fluorescentes

Figura 1
Na Fig 1 P3, P2 e P1 so os aminocidos do substrato sinttico e MCA (metil-cumarina
amida) um grupo fluorescente que muda seu espectro de emisso quando retirado
por ao de uma protease. Esta por sua vez est representada na Fig 1 os subsitios
S3, S2 e S1 da enzima proteoltica que reconhecem os aminocidos P 3, P2 e P1 do
substrato
Peptdeos de fluorescncia apagada

Figura 2
Na Fig 2 P3, P2, P1, P1, P2 e P3 so os aminocidos do substrato sinttico, Abz= cido
orto-aminobenzoico, que quando excitado a 320 nm emite fluorescncia a 420 nM e
EDDnp (etileno diamino-dinitrobenzeno) que absorve a luz de 420 nM. Assim quando o
peptdeo est inteiro ele no fluoresce. Os subsitios S3, S2, S1, S1, S2 e S3 da enzima
proteolica reconhecem os aminocidos P3, P2, P1, P1, P2 e P3 do substrato.
importante notar que os peptdeos de fluorescncia apagada tem maior numero de
interaes com o substrato e portanto estes acabam sendo mais especficos

NH2

Low
fluorescence

(peptide)
COO

NH(CH2)2NH

NO2
NO2

(Abz)
ex=320 nm
ortho-aminobenzoic acid =420 nm
em

(EDDnp)
ethylene-diamine-dinitrophenyl

365nm=17300 UA
1cm

NH2

High
fluorescence

COO

NH(CH2)2NH

cleavage

NO2
NO2

Figura 3 Resumo estrutural dos peptdeos de fluorescncia apagada

Em 2012 foi publicado pelo grupo do Dr Juliano o trabalho descrevendo a bibliotecas

de peptdeos de fluorescncia apagada tal como representada Fig 4

Figura 4.

A Fig 4 mostra o conceito de bibliotecas de peptdeos de fluorescncia apagada, onde

X= qualquer um dos 20 aminocidos naturais, exceto cisteina e Z= aminocido fixo.
Assim teremos 19 bibliotecas. Este tipo de biblioteca permite verificar as preferencias
dos stios de hidrolise das proteases. Uma alternativa a este tipo de biblioteca
constru-la de modo a ser toda randomizada isto , na forma Abz-G-X-X-X-X-X-QEDDnp. Uma biblioteca deste tipo indica se h protease na soluo a ser testada . Se
o ensaio for feito em trs pHs (4, 7 e 9) e na presena de inibidores poderemos ter

informaes da classe das enzimas. A grande vantagem desta metodologia que so

necessrios de 1 a 20 nmoles de enzima.