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DNA
I. Enzimas de restriccin
Anlisis
No acepta elongacin de la
cadena de nucleotidos por
la DNA polimerasa
dsDNA molde (secuencia?)
4 desoxiribonucletidos (dNTPs)
cebador de DNA
DNA polimerasa
3 5
5 3
dCTP[P32]
Hibridacin y reconocimiento
de secuencias con alta homologa
65oC
50oC
1. Aislamiento de RNA
2. Desnaturalizar el RNA
3. Separar por electroforesis desnaturalizante
4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon
5. Hibridar con sonda especfica
6. Revelar con placa de Rayos X pantalla de
fosforimager
Expresin de genes
Bromuro
de etidio
Sonda P32
Southern Blot
Northern Blot
28S
18S
Niveles de expresin
Isoformas
Modificaciones postraduccionales
Tiempo de vida media y degradacin
Localizacin subcelular
cebador reverso
cebador directo
Desnaturalizar
Alineamiento
Polimerizacin
94-95C
55-65C
72C
La amplificacin es exponencial
2
4
Exones +
intrones
RNA: RT-PCR
1. Transcripcin
reversa
(obtencin de
cDNA)
2. Amplificacin
por PCR
Solo
exones
DNA A
ligasa
DNA AB
DNA B
Mutagnesis
sitio dirigida
La mutacin se incluye en
uno de los cebadores para
el PCR
Mutagnesis dirigida
Vectores de clonacin
1. Plsmidos
2. Fagos
3. Csmidos
4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maz)
1. Plsmidos
DNA doble cadena,
circular, origen propio
de replicacin
Se pueden clonar
fragmentos entre 1,000 y
10,000 nucletidos
Marcadores de resistencia a
antibiticos
Permiten la seleccin de bacterias
transformadas con el plsmido o
con el DNA recombinante
Sitios de clonacin
mltiples:
varias enzimas de
restriccin que solo cortan
una vez en el plsmido
Plsmidos de expresin
Caracteristicas adicionales:
- Promotor regulable
- Terminador de la transcripcion
- Sitio de reconocimiento por el ribosoma