UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO

VILLARREEAL
FACULTAD DE INGENIERIA GEOGRAFICA, AMBIENTAL Y ECOTURISMO
ESCUELA INGENIERIA AMBIENTAL

PRCTICA N3: PRUEBA DE GENOTOXICIDAD

(ENSAYO DE MICRONUCLEOS)

TOXICOLOGIA
DOCENTE:
Blgo. F. Javier Alvarez A.
INTEGRANTES:
-

Alvarado lvarez, Xavier S.

Bustamante Chirre, Yoirenith.
Chacn Otazo, Gianpier A.
Lamilla Limancca, Gary R.
Pea Daga, Deysi Lilia.
Rodrguez Lira, Carol S.

LABORATORIO:
Segundo Turno - viernes.

2015

PRCTICA N3: PRUEBA DE GENOTOXICIDAD (ENSAYO DE MICRONUCLEOS)

2015

INDICE

Contenido
INDICE............................................................................................................................................ 2
INRTODUCCION ............................................................................................................................. 3
MARCO TEORICO ........................................................................................................................... 4
MATERIALES Y METODOS.............................................................................................................. 7
RESULTADOS ............................................................................................................................... 11
DISCUSIN Y CONCLUSION ......................................................................................................... 11
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................................... 13

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INRTODUCCION
En la toxicologa gentica se acepta que una sola prueba no puede detectar con
exactitud o predecir confiablemente los efectos genotxicos de una sustancia en el ser
humano; por esto es importante tener alternativas para evaluar genotxicos.

Durante la prctica realizada en el laboratorio con la supervisin del docente a cargo

se realiz la prueba de genotoxicidad en 3 peces Cebra. Dado que el Pez Cebra es uno
de los peces que se encuentran ms cercanos a la completa secuenciacin de su
genoma. Es nico para obtener y mantener miles de mutantes gracias a sus especiales
caractersticas; muchos de los fenotipos de los mutantes del Pez Cebra ya obtenidos se
parecen a algunas enfermedades genticas caracterizadas en el hombre, aportando un
poderoso instrumento para ahondar en las correspondientes patologas humanas; se
pueden buscar genes candidatos a enfermedades o anomalas en regiones
cromosmicas humanas definidas por mutaciones en el Pez Cebra. Las alteraciones
morfolgicas en el desarrollo embrionario del Pez Cebra se han utilizado desde hace
aos para estudiar los efectos de los contaminantes.
Esta prctica tuvo como objetivo determinar la capacidad txica del alcohol etlico, en
la formacin de microncleos en las clulas de tres peces Cebra adultos, sometidos a
una concentracin de 99.9% de alcohol etlico.
Encontrndose microncleos del tipo I, II, y III en las clulas de los peces del
experimento. Por lo que se concluye que el alcohol etlico, en concentraciones altas
tiene efectos txicos en las clulas, lo que se manifiesta en la formacin de
microncleos.

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MARCO TEORICO
LAS PRUEBAS DE GENOTOXICIDAD
Las pruebas para detectar agentes que daan al ADN son de gran importancia, pues los
compuestos genotxicos tienen la capacidad de alterar el material gentico en los
organismos, incluido el hombre, y adems pueden tener efectos teratognicos, causar
mutaciones en las clulas germinales, inducir enfermedades cardiacas, influir en los
procesos de envejecimiento y generar mutaciones en las clulas somticas que pueden
contribuir al desarrollo del cncer. Algunas de las pruebas utilizadas para detectar el
dao gentico son el cariotipo, el estudio del ndice mittico, el intercambio de
cromtides hermanas, el ensayo cometa, el estudio de la induccin de apoptosis, la
prueba de Ames y la prueba de microncleos.
Existen agentes qumicos presentes en el ambiente que se han identificado como
causantes de cncer o de defectos en el nacimiento. Los txicos pueden producir
efectos fisiolgicos o bioqumicos adversos en cualquiera de las etapas del desarrollo.
MTODO DE MEDIDA DE INESTABILIDAD GENTICA: ENSAYO DE MICRONCLEOS
Durante la divisin celular el material gentico (ADN) contenido en el ncleo celular se
replica y divide equitativamente dando lugar a dos clulas hijas idnticas; este proceso
puede producirse de manera errnea debido a errores durante la replicacin y
posterior divisin del ADN, a roturas cromosmicas y al efecto de la radiacin y de
sustancias genotxicas, producindose prdida cromosmica y haciendo que el
reparto del material gentico no sea equitativo. Cuando esto ocurre, el material
gentico que se desprende y que, por tanto, queda excluido y no se incorpora
correctamente al ncleo de la clula hija, origina un nuevo ncleo de menor tamao
que el primario denominado microncleo (MN), visible fcilmente al microscopio
ptico7. El material gentico desprendido puede derivar de cromosomas enteros o,
ms frecuentemente, de fragmentos cromosmicos acntricos que quedan excluidos
de los ncleos de las nuevas clulas durante anafase mittica.
El uso de la tcnica del recuento de MN como medida de dao cromosmico sobre
cultivos de linfocitos humanos fue propuesto por primera vez por Countryman y
Heddle en 1976, cuyo nico requisito era la eleccin de tipos celulares con gran
actividad mittica. Ms tarde, en 1985, el ensayo de genotoxicidad fue mejorado por
Fenech y Morley, consiguiendo frenar el proceso de divisin celular cuando la clula
slo hubiese sufrido una divisin mittica, para ello desarrollaron la tcnica del
bloqueo de la citocinesis (CBMN: cytokinesis-block micronucleus) cuyo fundamento es
la utilizacin de un agente qumico denominado citocalasina-B cuya funcin es impedir
la citocinesis celular.

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Formacin de microncleos

Heddle (1973) y Schmid (1975) fueron los primeros investigadores que de manera
independiente propusieron que: un ensayo alternativo y simple para determinar el dao
cromosmico in vivo era el conteo de microncleos (MN) en poblaciones celulares en divisin.
Los MN son expresados en clulas en divisin que contienen rupturas de cromosomas por
prdida de los centrmeros (fragmentos acntricos) y / o prdida de cromosomas completos,
en ambos casos son incapaces de viajar con el resto de los cromosomas a travs del huso
mittico, a los polos del ncleo celular durante la anafase de la divisin celular. En la telofase
las estructuras cromosmicas son envueltas por la membrana nuclear y, tanto los cromosomas
completos, como los fragmentos de cromosomas retardados, asumen gradualmente la
morfologa de un ncleo en interfase con la excepcin de que son ms pequeos que el ncleo
principal de la clula, de aqu el trmino de MN. En ocasiones son observados, adems,
puentes nucleoplsmicos entre los ncleos de las clulas binucleadas. Estos se originan de
cromosomas dicntricos y proveen una medida complementaria del reordenamieno
cromosmico. Teniendo en cuenta que los MN solo pueden ser expresados en clulas
eucariotas en divisin; que el ensayo no puede ser usado cuantitativamente en poblaciones
celulares que no se estn dividiendo o en aquellas donde la cintica de divisin no sea bien
conocida y que las clulas se dividen a diferentes tasas in vivo e in vitro dependiendo de
diferentes condiciones fisiolgicas, genticas y de micronutrientes.
Los MN son contados solo en las clulas binucleadas, lo cual permite realizar comparaciones
confiables de dao cromosmico entre poblaciones celulares que difieren en la cintica de
divisin nuclear. El mtodo fue inicialmente desarrollado para linfocitos humanos en cultivo,
pero ms tarde fue adaptado a otros tipos de cultivos celulares como son los de tumores
slidos y los de mdula sea. Recientemente ha sido propuesto que el ensayo de MN sea
usado en lugar del anlisis de metafases para el ensayo de genotoxicidad de nuevos agentes
qumicos. Esta propuesta est basada en el grupo de ventajas que tiene el ensayo de MN sobre
el anlisis de metafases. Dentro de ellas se distinguen las siguientes: los microncleos en las
clulas en interfase pueden ser contados mucho ms objetivamente que las aberraciones

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cromosmicas en clulas en interfase; no hay un requerimiento riguroso para el

entrenamiento detallado del personal competente para este ensayo; esto permite mayor
rapidez en el conteo de las preparaciones, adems, como se pueden contar miles de clulas
por tratamiento eso le imparte mayor poder estadstico al ensayo. Por otra parte como los
microncleos pueden contener cromosomas completos, se pueden detectar agentes
inductores de aneuploida, los cuales son muy difciles de estudiar en el ensayo de
aberraciones cromosmicas convencionales.
Los MN pueden ser fcilmente detectados en microscopios pticos o de fluorescencia. Para
ello, el ADN es teido con sustancias que permiten diferenciar el material gentico del resto de
las estructuras celulares. La ventaja de esta tcnica es que provee ndices cuantificables de
dao gentico, de manera rpida y relativamente sencilla.
El ensayo de MN aplicado al biomonitoreo de contaminantes resulta ser una herramienta de
gran practicidad en los estudios de mutagnesis ambiental. En innumerables casos, los txicos,
no pueden ser detectados en las diferentes matrices (suelo, agua, sedimentos), sin embargo
sus efectos pueden medirse en los organismos.

Tipos de microncleos

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MATERIALES Y METODOS
Equipos, reactivos y materiales
Cubeta de tincin vertical o Cubeta tincin Hellendahl

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Reactivos

Giemsa 10%

Metanol

Aceite de inmersin

Agua destilada

Materiales

Laminas portaobjetos y cubreobjetos.

Cmara para laminas portaobjetos.

Cuchilla o bistur.
Pipetas Pasteur.

Cubeta de tincin vertical o Cubeta tincin Hellendahl.

Muestra Biolgica

Peces cebra adultos de aprox. 5 cm.

Mtodo
1. Se seleccionan los peces y se sacrifican realizando un corte en la parte anterior del
mismo, entre el oprculo y las aletas pectorales, con la finalidad de obtener la sangre
perifrica.

2. Se colecta la sangre perifrica colocando una gota de sangre en un extremo de la

lmina porta objeto e inmediatamente se realiza el frotis.

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3. Se deja secar a temperatura ambiente por 15 minutos.

4. Se sumergen las muestras en Etanol Absoluto frio por 15 minutos. Luego se procede a
retirarlas y dejarlas secar por 15 minutos a temperatura ambiente.

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5. Las lminas se colorean con GIEMSA al 10% por 8 minutos.

6. Se lava con agua destilada para retirar el exceso de colorante y dejar seca por 1 hora a
temperatura ambiente.

7. Finalmente se procede a la observacin microscpica para el conteo final. Se utiliza 400X y

1000X (usamos aceite de inmersin).

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RESULTADOS
Luego de la evaluacin genotpica en peces cebras se observaron en el microscopio clulas
con microncleos de tipo MN 1 y MN2 principalmente (con desprendimiento de una parte del
nucleo), aunque tambin se observan del tipo MN4 (sin membrana nuclear)
Tipos de microncleos producidos por dao genotxico sobre los glbulos rojos en el pez Cebra (Danio
rerio)

DISCUSIN Y CONCLUSION
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
En LA PRUEBA DE MICRONUCLEOS desarrollado por Guillermo M. Zuiga Gonzales y Belinda C.
Gmez Meda nos dice que La prueba de microncleos fue desarrollada por W. Schmid en
1975, quien originalmente la propuso para practicarse en la medula sea del ratn;
posteriormente, la tcnica se ha instrumentado en una gran variedad de tejidos y especies, y
en la actualidad se le utiliza ampliamente.
Los microncleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que
espontneamente o por causa de agentes que rompen cromosomas, como las radiaciones
(agentes que se denominan clastgenos) o que daan el huso mittico, como la vincristina
(aneuploidgenos), quedan fuera del ncleo durante la mitosis. Los microncleos son
conocidos en el campo de la hematologa como cuerpos de Howell-Jolly y su forma es
generalmente redonda o almendrada, con un dimetro que vara desde 0.4 a 1.6 micras.
Su formacin se basa en que en la anafase cualquier fragmento cromosmico que no posea
centrmero no podr integrarse a un ncleo por carecer del elemento indispensable para
orientarse en el huso acromtico. Despus de la telofase, los cromosomas normales, as como
los fragmentos que posean centrmeros, dan origen a los ncleos de las clulas hijas; sin
embargo, los elementos rezagados (que pueden ser fragmentos o cromosomas completos)
quedan incluidos en el citoplasma de las clulas hijas, y una proporcin de ellos se transforma

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en uno o varios ncleos secundarios. Tales ncleos son mucho ms pequeos que el ncleo
principal, y de ah su nombre de microncleos. Entonces, si el compuesto estudiado es un
clastgeno, se formarn microncleos pequeos, pero si es un aneuploidgeno, lo que
observaremos ser la formacin de microncleos grandes.
Para la realizacin de esta prueba es indispensable utilizar un tejido en constante divisin, pero
debe considerarse que en las clulas con poco citoplasma los microncleos no son fcilmente
distinguibles de los lbulos o proyecciones del ncleo normal.
Existen 5 tipos de micronucleos:

M.N.I
M.N.II
M.N.III
M.N.IV
M.N.V

Los resultados concuerdan con lo establecida por Guillermo M. Zuiga Gonzales y Belinda C.
Gmez Meda en su PRUEBA DE MICRONUCLEOS, teniendo como resultado en nuestro trabajo
los micronucleos 1, 2 y 4
Por tanto se concluye que:

El ensayo de MICRONUCLEOS es una alternativa en el que se analizan las

alteraciones presentes en metafases mitticas y permite detectar
aberraciones cromosmicas que responden a alteraciones de tipo estructural
(efecto clastognico) o alteraciones numricas (efecto aneugnico) del
agente en estudio.
Este ensayo de MICRONUCLEOS es por tanto un ensayo practico, que nos
sirve para evaluar la inestabilidad gentica inducida por agentes
genotxicos.
La concentracin a la que es sometidas la muestras dara lugar a la
formacin de micronucleos de los diferentes tipos.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Daniel Francisco Arencibia Arrebola, Luis Alfredo Rosario Fernndez. 2003.
ACTUALIZACIN SOBRE EL ENSAYO COMETA Y DE MICRONCLEOS IN VITRO. Retel
(revista de tecnologa en lnea).
Disponible en: http://www.sertox.com.ar/img/item_full/20003.pdf
Juan Manuel Gutirrez. MICRONCLEOS EN PECES COMO INDICADORES DE CALIDAD
AMBIENTAL EN ESTUARIOS DE LA COSTA URUGUAYA. 2013. Montevideo, Uruguay.

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