UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR

CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y MOLECULAR DE

LOS DEFECTOS CONGNITOS DE GLICOSILACIN.
TERAPIAS ESPECFICAS DE MUTACIN

ANA ISABEL VEGA PAJARES

TESIS DOCTORAL
Madrid, 2009

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR

CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y MOLECULAR DE

LOS DEFECTOS CONGNITOS DE GLICOSILACIN.
TERAPIAS ESPECFICAS DE MUTACIN

Tutora:
Prof. Magdalena Ugarte
Directora de tesis:

Directora de tesis:

Dra. Celia Prez-Cerd

Dra. Beln Prez

Memoria presentada por la Licenciada Ana Isabel Vega Pajares para

optar al grado de Doctor en Ciencias

Este trabajo ha sido realizado en el laboratorio

de la Prof. Magdalena Ugarte, Catedrtica del
Departamento de Biologa Molecular en el
Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa
de la Universidad Autnoma de Madrid, con la
ayuda de una beca concedida por el Ministerio
de Sanidad y Consumo-Instituto de Salud
Carlos III (2005-2007) y una beca concecida
por la Asociacin para el Estudio de las
Metabolopatas Congnitas (2008-2009).

AGRADECIMIENTOS

No s ni como he llegado a este momentoeste momento al que he temido

tanto, y que si no hubiera sido por el apoyo de la gente de este laboratorio,
principalmente de la Profesora Magdalena Ugarte que, desde un principio apost
porm,jamshubierallegadoal.
Quiero agradecer enormemente el apoyo incondicional de mis directoras de
tesis,CeliayBeln,porquesongeniales,porestarpendientesdem,porsuconfianza
y por la paciencia que han tenido conmigo. Gracias Celia por la cena de
fraternizacin y por tu sentido del humor, por tu forma de contar las cosas y por
creerenmdesdeelprincipio.GraciasBelnporacordartedemcadamomento,por
seguirme las bromas, por saber que mis malos das son sonados y por tener en
cuentasiempremiopinin.
Graciasporserlaprimerahbridadeestegrangrupo.
Atododiagnsticoporquehanvividomisinicios.ABegoporcadaensayode
carnitina, por ser tan meticulosa, por sus consejos y simpata. A Maris por su
familiaridadycalidez.APedroporsucuriosidad,aIsaacporsutipodehumorypor
los brownies de cada cumpleaos, a Celia la pequea porque aunque lleva poco
entre nosotros hemos compartido ya bastantes momentos buenos, a Paloma por su
efusividad y a Fernando por las fotos de sus viajes. A Marga por compartir sus
conocimientos conmigo y por cada caf de las maanas, por los peridicos diarios,
por los roscones de nata y sus tartas de queso. A M Jess por ser la primera en
conocerme,porsuamistad,porsucomplicidad,porcadaensayocompartidoypor
su sonrisa incondicional. Gracias a mis chicas, Gemi, Chari y Mary, por tantas
cosas, cuantas comidas y desayunos, por cada vez que me han ayudado sin
necesidad de habrselo pedido, por cada aperitivo, por cada broma, cada risa, por
animarmeenlosmalosmomentos,graciasporsercomosois.
Graciasalagentequeyanoestaendiagnsticoperosenmimente,aLorena
porsufranqueza,aYoliporsuoriginalidadysimpata,aJulioHFAporpensarque
lospecesbeben.
ACarmenporensearnosatrabajarcorrectamente,portantascharlasypenas
compartidasencultivos,graciasportratartanbienamipadre.
Graciasatodagenticaporaguantarmigenio.ALourdesyaPilarporsertan
amablesyporsusbuenosconsejos.AEvayAlexporsusencillez,porsupacienciay
por compartir su espacio. Gracias Ftima por mis primeros clonajes y PCRs, por
compartir poyata. A Rosa y Ascen por vuestra ayuda en todo momento y por
vuestros consejos. A mis compaeras de gentica. A M Angeles y Cristina que
aunqueyanoseencuentranenellaboratoriofsicamente,handejadosuesenciaentre
nosotros. Gracias M Angeles por tu amabilidad y ternura. Gracias Cristina por tu
formadereir,porelcongresoaBarcelona,porcadaintercambiodeconocimientoy
por tu intento de bailar. Al resto de becarias Patri, Ana Rincn, Ana Jorge, Roci,
Sandrayalamsreciente,Paula,porcadamomentoenellabo,cadacongreso,cada

desayuno,cadacomida,cadaespacioymolculadeoxgenocompartidoportantos
momentosvividos.GraciasPatriporsertancercana,porescucharsiempreyporser
tan divertida. Gracias Ana Jorge por compartir conmigo la soledad de la maana,
graciasporcadacafmatutinoyporcadaconciertolatino,graciasporsaberdiscutir
conmigo.
AAbelporquefuecortoperointenso,porcadarisacompartida,cadaensayo
deHRMyporseguirencontactoconmigo.
A Maja por compartir aficiones, por intentar entenderme y en especial, por
presentarmeaAlek.
A las secres, Ana, Juli, Eva e Isa, por su gran eficacia y estar siempre
dispuestasaayudar,porsusimpataysusbromas.
A los bioinfomticos, a Julio por tantos momentos buenos y por los bailes
compartidos.AtiGonzalo,aliasMonzolo,portucompaacampestre,graciaspor
ayudarmesiempre,porescucharmeyanimarme,porlosmalosentendidos.
GraciasAitorpor tucompaaenlasmaanas,portuconfianza,porsermi
amigo.
Gracias a Paz Briones y a su grupo, a Esther, por tratarme tan bien en
Barcelona,porelApoCIII.
Quiero agradecer especialmente a mi grupo de amigos su apoyo y por
animarme a no tirar nunca la toalla. A la familia Castrillo, especialmente a M
CarmenyJavi,porsermisegundafamilia,porayudarnossiempre.Amisamigasde
siempre,LoreySusi,queaunquenosveamosmenossquepuedocontarconellas
encualquiermomento.Amireducidoyespecialgruposalsero,InesyAlbertopor
sumpetuyjovialidad,Alekporsuintentofallidodemejorarmisidiomas,aInesilla
porestarsiempredispuesta.GraciasKaveh,porsertanbuenprofesor,porsaberque
puedocontarcontigosiempre,porcadamartesdereunin,portuscarcajadas,portu
carcterpeculiar,porserunamigoespecial.
Y a mi familia, a quien no le puedo agradecer lo suficiente todo lo que han
hecho por mi siempre. Gracias a mi hermana y a Jorge, por estar tan cerca, por
nuestrasexcursiones,nuestrastimbas,pornuestrosbuenosmomentoscompartidos,
por compartir los malos tambin. A mi Javito, por conocerme y entenderme mejor
quenadie,graciasporcuidarmetanto,portuapoyoincondicional,portuternuray
paciencia,graciasasuspadresAntoniayManoloporhacerlecomoes.Amispadres,
porelamorquemehandadosiempre,porsuapoyodurantetodosmisestudios,por
sus buenos y fuertemente marcados valores. A ti mam por tu fortaleza, por hacer
queno merindiera nunca,porseruna madreejemplar.A ti papporqueaunque
ya no puedas darte cuenta estaras orgulloso de m, gracias por ser un padre tan
especial,porestarsiempredebuenhumor,porsersiempremiejemploaseguir,por
sertancomprensivoybondadoso,porcadabroma,cadajuego,cadaacampada,por
ensearme a pescar, por compartir siempre tu tiempo con nosotras y en especial
conmigo,porsertupreferida,graciasporsertuhija,porsercomoT.
Endefinitiva,MUCHASGRACIASATODOS.

A mis padres,
Angel y Marta

Al otro lado de las nubes hay un cielo

Muhammad Al-Fayturi

SUMMARY

Congenitaldisorders of glycosylation (CDG) are a group of human genetic diseases

withabroadspectrumofclinicalmanifestationsaffectingmultipleorgansandtissueswhich
makes difficult the clinical diagnosis. The aim of this work has been the study of the
molecularbasesofthesedefectstofindnewdiagnostictoolsandnewtargetandtherapeutic
approachesbasedonthegenotype.

Using three serum biomarkers analyzed by isoelectric focusing (transferrin, 1

antitrypsin and ApoCIII) and subsequent enzymatic and/or genetics approaches we have
diagnosed19patients,14CDGIa,2CDGIb,2CDGIeand1CDGIjwithmutationsinthe
PMM2,MPI,DPM1andDPGAT1genes,respectively.
ThemutationalspectrumofthePMM2geneincluded13differentallelicvariants,5of
them are novel (T118S, P184T, D209G, IVS79T>G and IVS31G>C). The most frequent
mutations were R141H and T237M, both identified in 15% of the mutant chromosomes.
ThreemutationshavebeenidentifiedintheMPIgene,oneintheDPM1geneandtwonew
allelicvariants(R301CandL385R)intheDPGAT1gene.

The serum proteomic analysis by 2DE technology of two CDG Ia patients has
revealed the differential expression of proteins involved in the immune response,
inflammation, coagulation mechanism and tissue protection against oxidative stress,
indicatingthatthistechniquemightbeusefulforthediagnosisofthesedefectsandforthe
identificationofnewtherapeutictargets.
The functional analysis of PMM2 missense mutations in a prokaryotic expression
systemhasdemonstratedthatallarediseasecausingandtheresultsofPMM2activityhave
allowedtheclassificationofthesemutationsinnullmutations,intermediatemutationsand
mutations with high residual activity. Most of the patients are functional hemyzygous of a
null mutation anda mutation with intermediate residual activity usually associated with a
moderate form of the disease or with a mutation with higher residual activity, usually
associatedwithamilderclinicalphenotype.Inadditiontheproteinstabilityassaysallowed
theidentificationofatleastfivechanges(V44A,D65Y,F157S,P184TyF207S)withdecreased
amount of immunoreactive PMM 2 protein and decreased half life compared to wild type
openinguptherapeuticoptionsbypharmacologicalchaperonesinseveralpatients.
The function analysis by minigenes of three nucleotide changes, IVS79T>G and
IVS31G>C identified in the PMM2 gene and IVS715479C>T previously described, suggest
thatallarediseasecausingmutations.TheIVS31G>Cmutationcausesskippingofexons3
and4infibroblastcelllineandintheminigeneexpressionsystem.TheIVS79T>Gmutation
wasfoundtoberesponsiblefortheactivationofacrypticintronicsplicesiteinfibroblastcell
lineandinahybridminigenewhencotransfectedwithcertainSRproteins.Thedeepintronic
change IVS715479C>T was found to be responsible for the activation of a pseudoexon
sequence in intron 7. The use of morpholino oligonucleotides allowed the production of
correctlysplicedmRNAthatwas efficiently translated into functional and immunoreactive
PMM2protein.Theresultssuggestanovelmutationspecificapproachforthetreatmentof
thisgeneticdiseaseforwhichnoeffectivetreatmentisyetavailable,andopenuptherapeutic
possibilitiesforseveralgeneticdisordersinwhichdeepintronicchangesareidentified.

Abreviaturas
ABREVIATURAS

ADP:
AMO:

Adenosinadifosfato
Oligonucletido antisentido tipo morfolino (Antisense Morpholino
Oligonucleotide)
Asn:
Asparagina
1AT:
1antitripsina
ApoCIII:
ApolipoprotenaCIII
APS:
Persulfatoamnico
ATP:
Adenosinatrifosfato
BPS:
Secuenciaderamificacin(branchpointsequence)
BSA:
Albminadesuerobovino
CDG:
DefectosCongnitosdeGlicosilacin
cDNA:
DNAcomplementario
CDT:
Transferrinadeficienteencarbohidratos(carbohydratedeficienttransferrin)
CMP:
Citosinamonofosfato
Cp:
Puntodecorte(crossingpoint)
2DE:
Electroforesisbidimensional
DMSO:
Dimetilsulfxido
DNA:
cidodesoxirribonucleico
dNTP:
Desoxinucletidotrifosfato
DTT:
1,4ditioLtreitol
DolPP:
Dolicolpirofosfato
EDTA:
cidoetilenglicoltetraactico
EJC:
Complejodeuninaexonexon(exonjunctioncomplex)
EPOC:
Enfermedadpulmonarobstructivacrnica
ESE:
Secuenciaexnicaactivadoradesplicing(exonicsplicingenhancer)
FBS:
Suerofetalbovino
Gal:
Galactosa
GDP:
Guanidinadifosfato
GlcNAc:
Nacetilglusamina
gDNA:
DNAgenmico
GST:
Glutationsulfidrilotransferasa
HEPES:
cidoN2hibrixietilpiperazinaN2etanosulfnico
3Hmanosa:
Manosatritiada
hnRNPs:
Ribonucleoprotenasheterogneasnucleares
IEF:
Isoelectroenfoque
IgG:
InmunoglobulinaG
IPG:
GradientedepHinmobilizado
IPTG:
Isopropil1tioDgalactopiransido
IVS:
Intrn(interveningsequence)
Kb:
Kilobase
LB:
MedioLuriaBroth
LLO:
Oligosacridoestndar(lipidlinkedoligossacharide)
Man:
Manosa
MEM:
MediomnimoesencialdeEagle

Abreviaturas
mRNA:
NeuAC:
NMD:
OligodT:
OST:
Pb:
PBS:
PDB:
ProtenaSR:
PI:

Pm:
PMI:
PMM:
PTC:
qRTPCR:
RE:
RNA:
RQ:
rRNA18S:
RTPCR:
SDS:
SDSPAGE:
Ser:
Sia:
SNP:
snRNPs:
SURF:
TCEP:
Tf:

Thr:
Tris:
V1/2:
WT:

RNAmensajero
Nacetilneuramnico
SistemadevigilanciademRNA(nonsensemediateddecay)
Oligodedeoxitimidinas
Oligosacariltransferasa
Pardebases
Tampnfosfatosalino
Bancodedatosdeprotenas(ProteinDataBank)
Protenareguladoradesplicing(serinearginineprotein)
Puntoisoelctrico
Pesomolecular
Fosfomanoisomerasa
Fosfomanomutasa
Codondeparadaprematuro(prematureterminalcodon)
Retrotranscripcinyreaccinencadenadelapolimerasacuantitativa
RetculoEndoplmico
cidoribonucleico
Cuantificacinrelativa(relativequantity)
RNAribosmico18S
Retrotranscripcinyreaccinencadenadelapolimerasa
Dodecilsulfatosdico
ElectroforesisengelesdepoliacrilamidaenpresenciadeSDS
Serina
cidosilico
Polimorfismodeniconucletido(singlenucleotidepolymorphism)
Ribonucleoprotenaspequeasnucleares
Complejodesupervigilancia
Tris2carboxietilfosfina
Transferrina
Treonina
Tris(hidroximetil)aminometano
Vidamedia
Salvajeonormal(wildtype)

Algunos trminos ingleses, ampliamente utilizados en biologa molecular y sin clara

traduccinencastellano,semuestranencursiva.

NDICE

ndice
1. INTRODUCCIN....2
1.1. DefectosCongnitosdeGlicosilacin(CDG)...2
1.1.1.

Caracterizacinbioqumica.7

1.1.2.

BasesmolecularesdelosCDGIa...........................................................................9

1.2. Anlisisfuncionaldelasvariantesallicas.Nuevasaproximacionesteraputicasy
relacingenotipofenotipo.......................................................................10
1.2.1

Mutacionesdecambiodeaminocido.11

1.2.2

MutacionesqueafectanalcorrectoprocesamientodelmRNA...11

1.2.3

Relacingenotipofenotipo...15

2. OBJETIVOS.18

3. MATERIALYMTODOS.20
3.1. Materiales....20
3.1.1.

Reactivosyaparatos.......20

3.1.2.

Materialbiolgico.......21

3.1.2.1

Muestrasbiolgicas..21

3.1.2.2

Cepasbacterianas......22

3.1.2.3

Vectoresplasmdicos.........22

3.2. Mtodos.......................22
3.2.1.

Isoelectroenfoquedeglicoprotenassricas........................................................22

3.2.2.

MedidasenzimticasPMM2yPMI...................................................................23

3.2.3.

Cuantificacindeprotenas..........24

3.2.4.

Aislamientodecidosnucleicos...........24

3.2.5.

TcnicasdeamplificacindeDNA..24

3.2.5.1.

AmplificacindecDNA...........24

3.2.5.2.

AmplificacindeDNAgenmico..25

3.2.6.

PurificacindefragmentosdeDNA...27

3.2.7.

SecuenciacindeDNA......27

3.2.8.

Electroforesisbidimensional(2DE)deprotenassricas....28

ndice
3.2.9.

Mutagnesisdirigida.....28

3.2.10. ExpresindemutacionesmissenseenE.coli.......29
3.2.11. Electroforesis, transferencia e inmunodeteccin de la PMM 2 (Western
blot)...30
3.2.12. Estudiosdeestabilidaddeprotenasinvitro..31
3.2.13. Anlisis cuantitativo de la expresin del gen PMM2 mediante qRT
PCR.......31
3.2.14. ClonajeenelvectorpSPL3.Minigenes32
3.2.15. Transfeccindeclulasprimariasyestablecidas...........................33
3.2.16. Soporteinformtico....34

4. RESULTADOS.....36
4.1. Diagnstico bioqumico y enzimtico de los Defectos Congnitos de
Glicosilacin...36
4.1.1.

Isoelectroenfoque(IEF)deTransferrina(Tf).....................................................36

4.1.2.

Isoelectroenfoquede1Antitripsina...................................................................38

4.1.3.

IsoelectroenfoquedeApoliprotenaCIII.....39

4.1.4.

MedidadelasactividadesPMM2yPMI...39

4.2. Caracterizacinmoleculardelospacientes......41
4.2.1.

Estudio gentico de los pacientes con Defecto Congnito de Glicosilacin Ia:

anlisisdelgenPMM2...41

4.2.2.

EstudiogenticodelospacientesconDefectoCongnitodeGlicosilacinIb:
anlisisdelgenMPI.......46

4.2.3.

Estudio gentico de los pacientes con Defecto Congnito de Glicosilacin Ix:

anlisis de los genes ALG6 (CDG Ic), DPM1 (CDG Ie) y DPGAT1 (CDG
Ij)...47

4.3. AnlisisdelproteomasricodepacientesCDGIa....50

ndice
4.4. CaracterizacindelaslneasdefibroblastosdepacientesCDGIa....54
4.4.1

NivelesdeexpresindelaprotenaPMM2........54

4.4.2

Niveles de expresin del gen PMM2. 55

4.5 AnlisisfuncionaldelasvariantesallicasidentificadasenelgenPMM256
4.5.1

Anlisisfuncionaldemutacionesmissense...57

4.5.2

Anlisisfuncionaldemutacionesdesplicing...61

4.6 Estudiodeterapiasespecficasdemutacionesdesplicing....65
4.6.1

Efecto de la sobreexpresin de factores de splicing sobre mutaciones que

afectanalprocesamientodelmRNA.....65

4.6.2

Uso de terapia antisentido tipo morfolino (AMOs) en mutaciones

causantesdeexonizacindesecuenciasintrnicas.....67

5. DISCUSIN.....70
5.1

Diagnstico y caracterizacin de pacientes con Defectos Congnitos de

Glicosilacin..70

5.2

AnlisisfuncionaldelasvariantesallicasidentificadasenelgenPMM2.75

5.3

Correlacin genotipofenotipo y diseo de terapias especficas de

mutacin.............80

6. CONCLUSIONES..85

7. BIBLIOGRAFA..88

8. PUBLICACIONES....103

1.INTRODUCCIN

Introduccin

1.1DEFECTOSCONGNITOSDEGLICOSILACIN.

La glicosilacin es el proceso en el cual se adicionan enzimticamente glicanos a

protenas y lpidos. Estos glicanos se unen covalentemente al grupo amino de residuos de
asparagina, en la Nglicosilacin, o al grupo hidroxilo de residuos de serina, treonina o
hidroxilisina,enlaOglicosilacin(MarquardtandDenecke2003).

La ruta de Nglicosilacin (Fig. 1) tiene lugar en 3 compartimentos celulares

distintos: citosol, retculo endoplsmico (RE) y aparato de Golgi. La biosntesis del glicano
comienza en el citosol de la clula con la formacin de nucletidosazcar, a partir de
monosacridos obtenidos de la dieta o de rutas endgenas, y con la unin a un dolicol
fosfatodelamembranadelREde2Nacetilglucosaminasy5manosas,provenientesdeestos
azcares activados (UDPGlcNAc y GDPmanosa). Posteriormente, el glicano es traslocado
allumendelREporunaflipasa(Haeuptleetal.2008;Heleniusetal.2002)yallsecontinan
aadiendo4manosasy3glucosasprovenientesdeazcaresunidosadolicolP,formndose
el oligosacridoestndar o LLO (LipidlinkedOligosaccharide,Gl3Man9GlcNAc3PPDol). Este
LLO se transfiere a la protena naciente mediante el complejo enzimtico
Oligosacariltransferasa (OST, EC 2.4.1.119), unindose a la asparagina de la secuencia
consenso AsnXSer/Thr, siendo X cualquier aminocido excepto prolina. Finalmente, esta
protenaglicosiladaesprocesadaporvariasglicosidasasenelREyportransportevesicular
pasa a Golgi, formndose una estructura ms compleja por eliminacin de residuos de
glucosa y manosa y por la adicin de acetilgalactosamina, galactosa, fucosa y residuos de
cido silico (Freeze and Aebi 2005; Grunewald and Matthijs 2000; Marquardt and Freeze
2001;Sparks2006).
La Oglicosilacin difiere de la N en varios aspectos. La Nglicosilacin ocurre
simultneamentealatraduccindelaprotena,sebasaenunnicotipodeunindelglicano
alaprotenayposeeunaestructuracomnapartirdelcualsediferenciaranlosNglicanos.
Estosereflejaenunarutabiosintticarelativamentesencillaqueslodivergeenlosltimos
estadiosqueocurrenenelaparatodeGolgi.Sinembargo,laOglicosilacinocurredespus
delaoligomerizacindelaprotenayesunarutamuchomscomplejapuesnoposeeuna
estructura comn a partir del cual se diferencian los distintos glicanos ni una secuencia
consenso de unin a la protena, sino que hay distintos tipos de uniones segn sea N
acetilgalactosamina, xilosa, fucosa, manosa, glucosa, galactosa o Nacetilglucosamina el
primerazcarqueseuneaserina,treoninaohidroxilisinadelaprotena,loquegeneragran
cantidaddeOglicanosdiferentes.Poreso,laclasificacindelosOglicanosseharealizado
en base al primer zucar que se une a la protena, existiendo 7 grupos distintos, siendo el
ms comn en humanos el tipo mucina en el que el primer zucar es la N
acetilgalactosamina(MarquardtandDenecke2003;Wopereisetal.2006).

Introduccin

Ib

Ii

Ia

Ij

Ik

If

Ie

IIb
In Id

IIf

IL

Ig

IL

Ic

Ih

IIc

IIa

IId

IIe,IIg,IIh

Figura1.RutadeNglicosilacinylocalizacindelosdistintosCDGsqueafectanaestaruta. Seindican
rojo los Defectos Congnitos de Glicosilacin que afectan a la etapa de sntesis del LLO o a la
en color
transferencia
de ste a la protena y en azul aquellos que afectan al procesamiento del glicano unido a la

protena.Losnombresdecadaenzimafiguranenlatabla1.

Los Defectos Congnitos de Glicosilacin (CDG) son un grupo de enfermedades

genticas, en su mayora con herencia autosmica recesiva, que afectan al proceso de N
glicosilaciny/oOglicosilacindeglicoprotenasyglicolpidos.Numerosostransportadores
y protenas de membrana, mediadores, receptores, enzimas y hormonas son
glicoconjugados,portanto,undefectoenlasntesisdesusglicanosprovocaunaalteracin
de su estructura y funcin. Esto explica que se trate de enfermedades multisistmicas y la
altaheterogeneidadclnicadelospacientes(Tabla1).

Jaekenycolaboradoresen1984hicieronlaprimeradescripcinclnicadeundefecto
enestemetabolismo(Jaekenetal.1984).Desdeentoncessehandescrito22defectosdistintos
enlarutadelaNglicosilacindeprotenas(FreezeandAebi2005)(Fig.1)(Tabla1),quese
agrupanendosgrandesgrupos.

CDGI:defectosqueafectanalaetapadesntesisytransferenciadeloligosacrido
estndaroLLOalaprotena.

CDGII:defectosqueafectanalprocesamientodelglicanounidoalaprotena.

Introduccin
ElCDGIaes,hastaelmomento,eldefectoenlaNglicosilacinmsfrecuenteyest
causado por la deficiencia del enzima fosfomanomutasa 2 (PMM 2, EC 5.4.2.8), enzima
citoslica que cataliza la conversin de manosa6P a manosa1P, sintetizndose a
continuacineldonadordemanosaGDPmanosa,esencialparalasntesisdelLLO.Existen2
isoformas de la fosfomanomutasa en humanos con distinta expresin especfica de tejido,
PMM 1 y PMM 2, pero tan slo mutaciones en el gen PMM2, localizado en el cromosoma
16p13,sonresponsablesdelosCDGIa(Cromphoutetal.2006;Matthijsetal.2000).
El fenotipo clnico de los CDG Ia se caracteriza por afectacin multiorgnica con
hipotona, retraso en el desarrollo, estrabismo, mamilas invertidas y acumulacin anmala
degrasa.Enpacientesmayoreslasintomatologaincluyeretinitispigmentosa,convulsiones,
atrofia cerebelar y malabsorcin. Aproximadamente el 20% de los pacientes mueren en el
primeraodevida,siendolasinfeccioneslacausamsfrecuente(Aronicaetal.2005;Blank
etal.2006;Dinopoulosetal.2007).

El CDG Ib est causado por un defecto del enzima fosfomanoisomerasa (PMI, EC

5.3.1.8),enzimacitoslicaquecatalizalaconversindefructosa6Pamanosa6P,queserel
sustrato para la fosfomanomutasa. Una alteracin en el funcionamiento de este enzima
provocaunasintomatologamuydistintaalospacientesconCDGIa.LospacientesconCDG
Ibnopresentanalteracinneurolgicasinoafectacinhepatointestinal,conenteropatacon
prdida proteica, coagulopata y fibrosis heptica. El gen responsable de este defecto es el
MPIlocalizadoenelcromosoma15q(Niehuesetal.1998;Schollenetal.2000a).
El CDG Ib es el nico defecto en la ruta de Nglicosilacin de protenas que en la
actualidad tiene tratamiento eficaz, esto es posible porque el enzima hexoquinasa
proporciona una va alternativa para la sntesis de manosa6P a partir de manosa. La
aportacin en la dieta de manosa es mnima y probablemente en estos pacientes es
insuficienteparaunacorrectaNglicosilacin,perosinembargo,unsuplementoconmanosa
enladietapromueveestavaalternativaypareceseruntratamientoeficaz(Hendrikszetal.
2001;Niehuesetal.1998).

El resto de CDG I tienen un fenotipo clsico caracterizado por presentar hipotona

muscular, anomalas del sistema nervioso, retraso en el crecimiento, problemas de
coagulacinyhepatopata,exceptoelCDGIhquepresentasintomatologasimilaralCDGIb,
esdecir,alteracioneshepatointestinales,coagulopata,enteropataconprdidaproteicaysin
alteraciones neurolgicas. Todos estos CDG estn representados por un bajo nmero de
pacientes,exceptoelCDGIc,queeselsegundomsfrecuenteconmsde30casosdescritos.
EstacausadoporladeficienciaenelenzimaglucosiltransferasaI(EC2.4.1.1.),localizadoen
elREycodificadoporelgenALG6,situadoenlaregincromosmica1p22.3.

Existen algunos defectos que afectan a ambas rutas de glicosilacin, son los
denominados Defectos Congnitos Combinados de la N y Oglicosilacin, aqu estaran
incluidoslosCDGIIc,IIe,IIgyIIh.LosCDGIIcpresentanunaalteracineneltransportador
defucosa(Lubkeetal.2001;Sturlaetal.2005).LosCDGIIe,IIgyIIhtienenafectacinenla
subunidad Cog7, Cog1 y Cog 8 (Foulquier et al. 2006; Kranz et al. 2007; Wu et al. 2004),
respectivamente,delcomplejoCog,complejooligomricodeGolgi.

Introduccin

Tabla1.ResumendelosdistintossubtiposdelosDefectosCongnitosdeGlicosilacin,enzima,genimplicadoencadadefectoysintomatologa
clnicaasoaciada.

CDG

ENZIMA/PROTENA

GEN

EntrezGene*

MIM**

CROMOSOMA

Ia

Fosfomanomutasa II

PMM2

5373

601785

16p13.3-p13.2

Ib

Fosfomanosa isomerasa

MPI

4351

154550

15q22-qter

Ic
Id

Glucosiltransferasa I
Manosiltransferasa VI

ALG6
ALG3

29929
10195

604566
608750

1p22.3
3q27

Ie

Dol-P-Man sintasa I

DPM1

8813

603503

20q13.13

If

Dolicol-P-manosa
utilizacin defecto1/Lec35

MPDU1

9526

604041

17p13.1-p12

Ig

Manosiltransferasa VIII

ALG12

79087

607144

22q13.33

Ih

Glucosiltransferasa II

ALG8

79053

608103

11pter-p15.5

Ii

Manosiltransferasa II

ALG2

85365

607905

9q22

Ij

GlcNAtransferasa I

DPAGT1

2875

191350

11q23.3

Ik

Manosiltransferasa I

ALG1

56052

605907

16p13.3

IL
Im

ALG9
DK1

79796
22845

606941
610768

11q23
9q34.11

RFT1

91869

612015

3p21.1

IIa

Manosiltransferasa VII
Dolicol quinasa
DolPP-GlcNA2Man5
flipasa
GlcNAtransferasa II

MGAT2

4247

212066

14q21

IIb

Glucosidasa I

GLS1

2744

606056

2p13-p12

SLC35C1/FUCT1

55343

266265

11p11.2

IId

Transportador GDPfucosa
Galactosiltransferasa

B4GALT1

2683

607091

9p13

IIe

Cog7

COG7

91949

608779

16p

IIf

Transportador CMPNeuAC

SLC35A1

10559

605634

IIg

Cog1

COG1

9382

606973

17

IIh

Cog8

COG8

84342

606979

16

In

IIc

SINTOMATOLOGA CLNICA
Retraso mental, hipotona, esotropa, lipodistrofia, hipoplasia cerebelar,
convulsiones
Fibrosis heptica, enteropata con perdida proteica, coagulopata,
hipoglucemia
Retraso mental, hipotona, epilepsia
Retraso mental severo, atrofia del nervio ptico
Retraso mental severo, epilepsia, hipotona, rasgos dismrficos,
coagulopata
Pequea estatura, ictiosis, retraso mental, retinopata
Hipotona, retraso mental, rasgos dismrficos, microcefalia,
infecciones frecuentes
Hepatomegalia, coagulopata, enteropata con prdida proteica, fallo
renal
Hepatomegalia, coagulopata, retraso mental, hipomielinizacin,
convulsiones no tratables
Retraso mental severo, hipotona, convulsiones, microcefalia
Retraso mental severo, hipotona, microcefalia, convulsiones no
tratables, coagulopata, sndrome nefrtico
Microcefalia severa, hepatomegalia, hipotona, convulsiones
Microcefalia, ictiosis, nistagmus, hipotona
Retraso en el desarrollo, hipotona, hepatomegalia, coagulopata,
convulsiones
Retraso mental, rasgos dismrficos, convulsiones
Dismorfia, hipotona, convulsiones, hepatomegalia, fibrosis heptica,
normal Tf
Infecciones recurrentes, neutrofilia, retraso mental, microcefalia,
hipotona, normal Tf
Hipotona, miopata, hemorragias espontneas
Dismorfia, hipotona, convulsiones no tratables, hepatomegalia,
ictericia, infecciones recurrentes, fallo cardaco
Trombocitopenia, glicoprotenas plaquetarias anormales, no sntomas
neurolgicos, normal Tf
Macrocefalia, rasgos dismrficos, hipotona, hipertrofia ventricular,
hepatoesplenomegalia, atrofia cerebelar
Retraso mental, hipotona, pseuso-ptosis, atrofia cerebelar

*16Hhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene**17Hhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

Introduccin

Debido al gran incremento de CDGs descritos hasta el momento, 40 tipos distintos

incluyendodefectosenlaglicosilacindeprotenasylpidos,ylasospechadequeelnmero
de genes implicados contine aumentando, la clasificacin de estos defectos es
extremadamente compleja. Como nueva nomenclatura se ha propuesto recientemente
(Jaekenetal.2008)queseuseelnombredelgenresponsable,pudindoseindicar,adems,el
nombredelaprotena,porltimo,quedacomoeleccinpersonalaadirentreparntesisla
antiguanomenclatura.Ejem:DeficienciadePMM2(CDGIa).

Existentambindefectosdeglicosilacinsecundariosaotrasenfermedadesgenticas.
Lagalactosemiaclsicacausadaporladeficienciadelenzimagalactosa1Puridiltransferasa
dalugaraNglicanostruncadosdeficientesengalactosa.Sepostulaquelaacumulacinde
galactosa1PinhibealagalactosiltransferasadelaNglicosilacinoquelasntesisdeUDP
galactosaseveafectada(Charlwoodetal.1998;Stibleretal.1997).

OtrodefectosecundariodelarutadeNglicosilacineslaintoleranciahereditariaala
fructosa, causada por la deficiencia del enzima fructosa1P aldolasa. Se debe a que el
metabolito acumulado en este defecto, la fructosa1P, es un potente inhibidor de la
fosfomanoisomerasa(AdamowiczandPronicka1996;Jaekenetal.1996).

Otras enfermedades que pueden producir hipoglicosilacin de protenas sricas

secundariamente son el alcoholismo (Bean et al. 1995; Helander et al. 2001), la afectacin
hepticasevera(Graveletal.1996;Murawakietal.1997),ydiferentessndromesinfecciosos,
comoporejemploelsndromehemolticourmicocausadoporStreptococcuspneumoniae(de
Loosetal.2002)ylameningitis(Quintanaetal.2007).
Adems se han visto alteraciones ms especficas en la Nglicosilacin en la artritis
reumatoideconhipoglicosilacindelasIgGsricas(Axfordetal.1992;Yagevetal.1993),en
distintos tipos de cncer como en el adenocarcinoma de pulmn, en el que se expresa una
glicoprotenadefuncindesconocida(Motteetal.1989)oenelcoriocarcinoma,dondehay
un incremento de oligosacridos unidos a asparagina (Kobata 1988), y por ltimo, en la
enfermedadpulmonarobstructivacrnica(EPOC),dondesehaobservadohipoglicosilacin
delatransferrina(Nihlenetal.2001).DelmismomodohayalteracionessecundariasdelaO
glicosilacin en la glomerulonefritis con hipoglicosilacin de la IgA1 (Allen et al. 1995), en
gran variedad de carcinomas que presentan glicosilacin incompleta de la estructura base
del oligosacarido tipo mucina (Meichenin et al. 2000) y en el sndrome de WiskottAldrich
(WAS)quepresentaaumentodeglicosilacinenlasuperficiedeloslinfocitos(Durandand
Seta2000;Greeretal.1989).

Tambin se conocen enfermedades en las que se describe un aumento de la

glicosilacinsinmediaractividadenzimtica,esdecir,resultadodelainteraccindealdosas
como la glucosa con grupos amino en polipptidos o lpidos. Este fenmeno se denomina
glicacin. Dentro de este grupo se encontrara la Diabetes mellitus (Singh et al. 2001), el
tabaquismo(NichollandBucala1998)ylaenfermedaddeAlzheimer(Munchetal.1997).

Introduccin

1.1.1CaracterizacinBioqumica

Debido a la gran heterogeneidad clnica de estos pacientes, el diagnstico de la

enfermedad no se basa en un patrn clnico caracterstico sino en una serie de pruebas
bioqumicasygenticas.

ParaladeteccindelospacientesconCDG,serealizaenprimerlugarelanlisisdela
transferrina srica mediante isoelectroenfoque (IEF). La transferrina es una glicoprotena
plasmticatransportadoradehierroquesesintetizaenhgado.Estformadaporunanica
cadena polipeptdica de 698 aminocidos con 2 sitios de unin a glicanos, cada uno de los
cualestienealfinaldesuestructura4posiblesunionesacidosilico(Fig.2.)

Sia

Sia

Sia

Gal
GlcNAc

Gal
GlcNAc
Man

Gal
GlcNAc
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn

Sia
Gal
GlcNAc

Sia
Gal
GlcNAc

Sia

Sia

Gal
GlcNAc
Man

Gal
GlcNAc
Man
Man
GlcNAc
GlcNAc
Asn

Sia
Gal
GlcNAc

Figura 2. Esquema de la estructura de la tranferrina. Los glicanos estn unidos a la transferrina

covalentemente por sus residuos de asparagina. La estructura del glicano est formada por N
acetilglucosamina(GlcNAc),manosa(Man),galactosa(Gal)ycidosilico(Sia).

Segn el nmero de grupos silicos unidos a la protena, existen 9 isoformas de la

transferrinaquesediferencian,porlotanto,ensucargaelctrica.Podemosencontrardesde
laformaoctosialiladadelaprotena(los8sitiosdeuninocupadosporac.silico)hastala
formaasialiladadelamisma.

ElIsoelectroenfoque(IEF)esunmtodoelectroforticoquepermitelaseparacinde
estas isoformas segn su punto isoelctrico en un gel con gradiente de pH y mediante la
aplicacindeunacargaelctrica.EstemtodopermiteidentificarpacientesconCDGI,que
muestran un patrn tipo 1, caracterizado por la disminucin de la tetrasialotransferrina,
isoformapredominanteenindividuossanos,msaumentodelasformasdiyasialiladasde
la transferrina; y pacientes con CDG II, que muestran un patrn tipo 2, con aumentos
variables de cualquiera de las formas hipoglicosiladas de la protena (tri, di, mono y
asialotransferrina).

Existen otras enfermedades, citadas anteriormente, que dan lugar a un defecto de

glicosilacindeformasecundariadetectableporelanlisisdelatransferrinasrica,comola
galactosemia y la intolerancia a la fructosa. En ambos casos los pacientes presentan un
patrn tipo 1 que se corrige tras el tratamiento. Tambin pueden alterar el patrn de la
transferrina enfermedades como el alcoholismo, afectacin heptica severa y diferentes
sndromes infecciosos, como por ejemplo el sndrome urmico causado por Streptococcus
pneumoniae.Enestecasonosloestalteradalatransferrina(patrntipo2)sinotambinla
apolipoprotena CIII debido a la excrecin de neuraminidasa, enzima que cataliza la
hidrlisisdecidossilicosdelasglicoprotenas(deLoosetal.2002).

Introduccin

El anlisis de otras Nglicoprotenas por IEF, como la 1antitripsina, es tambin

informativo. Se trata de otra protena srica de origen heptico que juega un papel
importanteenlacoagulacin,controldelainflamacinyreparacindedaotisular.Posee
una cadena polipptidica formada por 418 aminocidos con 3 puntos de unin a glicanos.
Cada glicano acaba endosotres cidos silicos,lo que genera la existencia de 8isoformas
diferentesquesonfcilmentedetectablesporIEFenfuncindesupuntoisoelctrico(Millset
al.2003).

El IEF de la apolipoprotena CIII de suero permite la deteccin de pacientes con

afectacinenlarutadelaOglicosilacintipomucina,esdecir,aquellaqueseiniciaconla
adicindeunaNacetilgalactosamina(Wopereisetal.2003).LaapolipoprotenaCIIIesuna
Oglicoprotena de origen heptico y su forma glicosilada se encuentra en plasma. En su
estructuraconstade99aminocidosyportaunnicoOglicanocondosposiblespuntosde
unin a cido silico, lo que leproporciona 3 posibles isoformas. Unpatrn normal deIEF
presenta de forma mayoritaria las formas di y monosialiladas de la protena en igual
proporcin. Mientras que un patrn anmalo se caracteriza por el aumento de la forma
mono o asialilada de la misma. Pacientes con patrones alterados de la Apo CIII y de la
transferrina(patrntipo2),probablementepresentarnundefectocombinadodelaNyO
glicosilacin(Wopereisetal.2005).

Aunqueelanlisisdelatransferrinapuededetectarunaalteracindelaglicosilacin,
no indica cual es el defecto primario. En ltima instancia el diagnstico de certeza lo
proporcionaelanlisisenzimticoy/omoleculardelosgenesquesesospecharesponsables
del defecto. De hecho, el ensamblaje de Nglicanos es un proceso muy conservado en
levaduras(Saccharomycescerevisae)yclulaseucariotas,loquehasidodegranutilidadpara
la identificacin de la mayora de los genes causantes de los CDG I (tabla 1). Las cepas de
levaduracondefectosdeglicosilacinindividualesomltiplesquetienenunefectoaveces
letal sobre la sntesis de las glicoprotenas son un sistema de complementacin ideal para
analizarelefectodemutacionespatolgicasenlosgeneshumanosortlogos.

Tambinlastcnicasprotemicaspuedenserunaherramientatilparaeldiagnstico
de pacientes con CDG. Desde que se describi por primera vez, en 1975, la electroforesis
bidimensional (2DE) por OFarrll and Klose (Ong and Pandey 2001), esta tcnica ha sido
utilizada en diversas aplicaciones. Con la 2DE las protenas se resuelven en la primera
dimensin en funcin de su punto isoelctrico en un gradiente de pH y en la segunda
dimensin segn el peso molecular. El anlisis protemico combina la 2DE con la
espectrometra de masas, tcnica que permite la identificacin de protenas a partir de la
digestin de spots obtenidos del gel 2D (Peng and Gygi 2001). La importancia de su
aplicacin reside en que puede resolver una mezcla de protenas compleja, pudiendo
identificar de forma rpida protenas desconocidas y sus formas modificadas post
traduccionalmente(OngandPandey2001).EstatcnicaaplicadaalosCDGpodraayudara
laidentificacindeldefectoenzimticomediantelabsquedademarcadoresespecficosde
cadadefecto,aconocerlagravedaddeldefectoyquealteracionesfisiolgicaspresentacada
paciente segn la expresin diferencial de las protenas y a conocer si existe diferencias
especficasdetejido(Butleretal.2003;Sturialeetal.2008).

Introduccin

1.1.2 BasesMolecularesdelosCDGIa

Hasta el momento slo se han descrito mutaciones causantes de CDG Ia en el gen

PMM2, localizado en el cromosoma 16, regin 16p13. Existe un gen localizado en 22q13 ,
PMM1, que codifica para una fosfomanomutasa que se expresa en pulmn y cerebro
(Silvaggi et al. 2006), acepta un mayor espectro de sustratos y tiene tambin actividad
fosfoglucomutasa in vitro (Pirard et al. 1999). Tambin se conoce la existencia de un
pseudogenprocesado,PMM2p,enelcromosoma18(Matthijsetal.2000).ElcDNAdelgen
PMM2(MIM601785)seclonen1997(Matthijsetal.1997).Tieneunafasedelecturade738
nucletidos codificante para una protena de 246 aminocidos. Es un gen altamente
conservado(57%deidentidadentrehumanoylevadura)yseexpresaentodoslostejidos.

Hasta la fecha se han descrito ms de 90 mutaciones diferentes en el gen PMM2,

siendo en el 95% de los casos mutaciones missense (http://www.euroglycanet.org/). La
mutacin ms comn descrita en pacientes CDG Ia es la R141H, la cual nunca se ha
encontrado en homocigosis (Kjaergaard et al. 2001; Schollen et al. 2000b). El anlisis de la
protena PMM 2 recombinante portadora de esta mutacin revela que este cambio de una
Arginina por Histidina en la posicin 141 provoca la inactivacin completa del enzima
(Kjaergaard et al. 1999; Le Bizec et al. 2005). La R141H est presente en ms del 37% de
pacientesCDGIadeorigencaucasiano,loquedaraunafrecuenciadehomocigotosdel13%
enestaseriedepacientes(Matthijsetal.2000),sinembargonosehanencontradopacientes
conelgenotipoR141H/R141H,loqueapoyalahiptesisdequeestegenotipoprobablemente
sealetal(Schollenetal.2000).

LospacientesCDGIasongeneralmentecompuestosheterocigotosdedosmutaciones
missenseenlosquealmenosunadelasprotenasmutadasconservaciertaactividadresidual,
pues lo contrario parece ser incompatible con la vida. Estudios con ratones knockout para
PMM2parecenindicarlaimportanciadeestaprotenaeneldesarrolloembrionario(Thielet
al. 2006), pues la ausencia de actividad es letal en los primeros das de vida intrauterina.
Ademsestosestudiosmuestranlainexistenciadeotraprotena,comopodraserlaPMM1,
cuyaactividadcompenseladeficienciadeactividadPMM2.Estudiosconratonesdeficientes
en PMM 1 revelan que la inactividad de esta enzima no parece ser esencial para un
desarrolloconfenotiponormal(Cromphoutetal.2006),loqueapoyaralahiptesisdeque
esletalsloladeficienciaenlaactividadPMM2.

La estructura tridimensional de la PMM 2 es un modelo molecular basado en la

estructura cristalizada de la PMM 1, pues ambas poseen un 65% de homologa en su
secuencia, y en las coordenadas incompletas de la PMM 2. Segn este modelo, la PMM 2
posee dos dominios: un core formado por 6 laminas y 5 helices, y un pequeo cap
insertadoentre5y7delcore,formadopor4laminasy3helices.Elsitioactivodela
protenaseencuentraenlainterfasedelcapconelcore(Silvaggietal.2006)(Fig.3).

Introduccin

CORE

CAP

Figura 3. Estructura tridimensional en dominios de un monmero de la PMM 2. Basado en las

coordenadasdepositadasenelProteinDataBankdelCentrodeGenmicaEstructuraldeEucariotas(cdigo
deacceso2AMY).Enazuleldominiocoreyenverdeeldominiocap.

Ensolucin,laPMM2estenformadehomodmerointeraccionandoexclusivamente
por los dominios cap, presentando una conformacin abierta debido a las fuerza de
repulsinentreelcapyelcore.Launindelsutrato(manosa1P)provocaladesaparicinde
esascargasyporlotanto,laconformacincerradadelaprotena,hacindolafuncionalmente
activa(Silvaggietal.2006).

1.2 ANLISIS FUNCIONAL DE VARIANTES ALLICAS. NUEVAS

APROXIMACIONES
TERAPUTICAS
Y
RELACIN
GENOTIPOFENOTIPO.

Laposibilidaddeestablecernuevasaproximacionesteraputicasapartirdelgenotipo
delpaciente, eselmotor que impulsa loscada vez ms numerosos anlisis funcionales de
mutaciones en las enfermedades genticas. Estos anlisis funcionales proporcionan
informacinmuyrelevantesobreelefectoquecadamutacinproduce,nosloenreferenciaa
sugravedadsinotambinentrminosdesumecanismodeaccin.Ademssonimportantes
debido a la existencia de cambios nucleotdicos que aunque hayan sido clasificados
previamentecomopolimorfismospordetectarseenlapoblacinnormal,puedentenercierto
efectofuncional.SonlosdenominadosSNPsfuncionales(MangoniandJackson2002).

10

Introduccin

1.2.1Mutacionesdecambiodeaminocido

Aproximadamente, un 85% de los cambios puntuales que causan enfermedades

genticassonmutacionesporcambiodeaminocidoomissense,mantenindoseestafrecuencia
en los pacientes con CDG (Wang et al. 2005). Las variantes causantes de enfermedad no se
detectan en los cromosomas normales mientras que los polimorfismos o SNPs (Single
NucleotidePolymorphism)estnpresentesenlapoblacingeneralconunafrecuenciaigualo
superior al 0.01%. Sinembargo,aunqueestaevidenciapuedeservlidaparalasmutaciones
poco frecuentes no es suficiente para concluir que cualquier mutacin es causante de
enfermedad, especialmente en el caso de enfermedades raras. Por lo tanto, conocidos los
cambiosnucleotdicosdeunpaciente,hayquedistinguirsidichoscambiossoncausantesde
enfermedadoSNPsmedianteelestudiofuncionaldelasdiferentesvariantesallicas.

Existendiferentessistemasdeexpresindemutacionesmissense,todosellosbasados
en la expresin de los correspondientes cDNAs clonados en vectores adecuados.
Frecuentemente, para la expresin y caracterizacin de las protenas mutantes se han
empleado sistemas procariotas, fundamentalmente Eschericchia coli, y eucariotas, tanto
clulasdemamferosencultivocomosistemaslibresdeclulas.Estosestudioshanrevelado
que son dos los mecanismos ms frecuentes a travs de los cuales las mutaciones missense
ejercen sus efectos patognicos sobre la protena: los defectos en la estabilidad (mutaciones
estructurales) (Bross et al. 1999; Pey et al.2003) oen las propiedades catalticas (mutaciones
funcionales), aunque existen mutaciones que ejercen un efecto mixto estructural y funcional
(Cohen and Kelly 2003; Gregersen et al. 2000; Pey et al. 2003). Una vez confirmada la
patogenicidaddelcambio,losanlisisfuncionalestambinnospermitenidentificarelefecto
producidoporlamutacinyestablecerposiblesdianasteraputicas,comoenelcasodelas
mutaciones missense que afectan al plegamiento y/o estructura de la protena cuyo efecto
puede ser modulado mediante el uso de chaperonas farmacolgicas (Chaudhuri and Paul
2006;MuchowskiandWacker2005;Peyetal.2008)

1.2.2MutacionesqueafectanalcorrectoprocesamientodelmRNA

Aproximadamente un 15% de las mutaciones puntuales asociadas a enfermedades

genticas humanas afectan al procesamiento del mRNA (splicing) (Cooper et al. 2006;
Krawczak et al. 1992; Wang et al. 2005). Estas mutaciones pueden afectar a secuencias
conservadasimplicadasenelsplicing(sitiodonador5desplicing,sitioaceptor3desplicing,
la secuencia de ramificacin (BPS) y el tracto polipirimidnico) querepresentanel 60%de
estas mutaciones, o bien afectar a secuencias reguladoras (Fig. 4). Estas secuencias
reguladoras,queseencuentranlocalizadastantoenexonescomoenintrones,puedenactuar
o bien estimulando la eliminacin intrnica (potenciadores de splicing o enhancers) o bien
impidindola(silenciadoresdesplicing).Lassecuenciasconservadassonreconocidasporlas
partculas ribonucleoproteicas (snRNPs) (U1, U2, U4, U5 y U6) que forman el spliceosoma
junto con ms de 50 protenas, y los elementos reguladores de splicing ejercen su accin a
travs de factores proteicos. En concreto, las secuencias silenciadoras parecen interaccionar
con una serie de reguladores negativos, frecuentemente pertenecientes a la familia de las

11

Introduccin
ribonucleoprotenas heterogneas nucleares (hnRNPs). Los enhancers exnicos de splicing
(ESEs) son sitios de unin de factores proteicos ricos en serina y arginina, conocidos como
protenasSR,atravsdeloscualesrealizansufuncinactivadora(PozzoliandSironi2005).
LasprotenasSRestnimplicadasenelreconocimientodelossitios5y3desplicingyenla
comunicacinentreambos,enelreclutamientoyconstitucindelspliceosomafuncionalyen
el reconocimiento de enhancers. Asimismo, pueden ejercer su accin positiva en el
reconocimiento de un exon a travs de su unin al RNA mensajero, al impedir que
reguladores negativos se unan a un silenciador prximo (competicin e impedimento
estrico)(PozzoliandSironi2005).

5 Sitio Donador
de Splicing

Sitio de
ramificacin

3 Sitio Aceptor
Tracto
polipirimidnico de Splicing

Figura4.Representacinesquemticadelosdistintosfactoresimplicadosenelprocesodemaduracin
del mRNA y las distintas zonas de reconocimiento de los mismos. Figura adaptada de (Cartegni et al.
2002).

La identificacin de las secuencias consenso de unin para factores reguladores de

splicing (protenas SR) (Liu et al. 2000) ha permitido la generacin de diferentes programas
informticos como el ESEfinder (http://exon.cshl.edu/ESE/), SELEX, RESCUEESE y PESE
(Wangetal.2005)medianteloscualessepuedenpredecirlosposiblesESEsdeunasecuencia
nucleotdica a estudiar (Cartegni et al. 2003; Pozzoli and Sironi 2005). Estos programas
facilitan la identificacin de posibles ESEs basndose en su reconocimiento por cuatro
protenasSR:SF2/ASF,SC35,SRp40ySRp55,cuyosmotivosconsensodeuninsemuestran
enlafigura5.

SF2/ASF

SC35

SRp40

SRp55

Figura5.MotivosdeuninparalasprotenasSRSF2/ASF,SC35,SRp40ySRp55.Laalturadecadaletraindica
lafrecuenciadecadanucletidoenesaposicin.Encadaposicin,losnucletidossemuestrandearribaaabajo
en orden decreciente de frecuencia. Las letras en color naranja indican frecuencias por encima del fondo.
http://exon.cshl.edu/ESE/

12

Introduccin
Enlosltimosaossehadescubiertounmayornmerodemutacionesqueafectana
secuenciasreguladorasdesplicingcomoenlafibrosisqustica,distrofiamiotnica,esclerosis
mltiple y otras (Pozzoli and Sironi 2005), incluso se han definido ciertas mutaciones
puntualesqueafectanasecuenciasreguladorasdesplicingyenconcretoaESEs(exonicsplicing
enhancers), y que fueron incorrectamente clasificadas como mutaciones de cambio de
aminocido,mutacionesnonsenseoinclusopolimorfismossilenciososdebidoalaausenciade
anlisis a nivel de cDNA (RTPCR) y a la utilizacin de sistemas de expresin inadecuados
(Nielsenetal.2007).

Las dos consecuencias ms comunes de las mutaciones de splicing son el skipping

exnico, eliminacin de un exon que no se incluye en el mRNA maduro, y la activacin de
sitioscrpticoscuyaconsecuenciaeslainclusindesecuenciasaberrantesolaeliminacinde
secuencias codificantes. Adems, en los intrones existen de manera muy abundante
secuencias que portan todos los elementos necesarios para el reconocimiento de la
maquinariadesplicingperonoseincluyencomoexonesenelmRNA.Estoesdebido,aquea
pesar de que estas secuencias poseen buenos valores de splicing presentan otros defectos
importantes en las regiones potenciadoras del splicing adems de un enriquecimiento de
regiones silenciadoras que impiden su reconocimiento como exones verdaderos. Estas
secuenciassondenominaspseudoexones.Enlosultimosaossehancaracterizadodiversas
enfermedadesgenticascausadasporlainclusindeestassecuencias,generalmentedebido
a mutaciones que provocan la creacin de novo de un sitio donador o aceptor fuerte de
splicingseguidodeunaseleccindeunaceptorodonadoroportunista.Otromotivoporel
que estas secuencias pueden ser incluidas como exones es debido a la existencia de
mutacionesquecausanlacreacinodelecindesecuenciasreguladorasdesplicing(enhancer
osecuenciassilenciadorastantoexnicascomointrnicas)(Blencowe2000;Burattietal.2006;
FaustinoandCooper2003).

ParavalidarelefectoqueejercenlasmutacionessobreelprocesamientodelmRNAse
hace necesario utilizar otras aproximaciones experimentales que impliquen la expresin de
regionesdiscretasdelDNAgenmico,comosonlossistemascelularesmodelodesplicingque
utilizan vectores apropiadosparagenerarlos llamadosminigenes(Cooper 2005;Pagani and
Baralle2004;Rinconetal.2007).Losminigenespuedenserutilizadoscomoherramientapara
distintos estudios como son la determinacin del grado de reconocimiento de los sitios de
splicing,laidentificacindeelementosexnicosointrnicosqueactivanoreprimenalsplicing,
la identificacin de variante allicas que tienen un efecto en la eficiencia del splicing y la
identificacindeelementosrequeridosparalaregulacinporfactoresespecficos.

Lamayoradelasmutacionesdesplicingproducenuncambioenelmarcodelectura
dando lugar a una secuencia madura de mRNA con un codn prematuro de terminacin
(PTC) lejano al sitio original. A priori, todas ellas son clasificadas como mutaciones nulas
(actividad indetectable), ya que generalmente dan lugar a la disminucin de los
correspondientes mRNAs evitndose la produccin de protenas truncadas potencialmente
txicas (Maquat 2004) . Este mecanismo celular de degradacin de mRNAs anmalos
conocido como NMD (Nonsensemediated decay) (Fig. 6) elimina los transcritos que
produciranprotenasconunapotencialdominancianegativa(Holbrooketal.2004)yseha
conservadoatravsdelaevolucinnosloporquedegradatranscritosaberrantesgenerados

13

Introduccin
deformarutinariaenlaexpresingnicasinoporque,adems,esutilizadoparaconseguir
nivelesapropiadosdedichaexpresin.

Figura6.EsquemadelmecanismodeactuacindelsistemaNMD.SeindicaunPTClocalizadoantesde5055nt

corriente
arriba de una unin exonexon, que provocara la activacin del sistema NMD y otro localizado
posteriormentequesetraduciranormalmente.Laeliminacindelosintronesporelsplicingdacomoresultadoel

posicionamiento a 2025 nt corriente arriba de la unin exonexon del complejo ECJ. SURF: complejo de

supervigilancia que se forma cuando se detiene el ribosoma al encontrar un PTC. Cuando SURFinteraccionacon

EJCsedisparaelsistemaNMD.Figuraadaptadade(KuzmiakandMaquat2006).

ElNMDenmamferosgeneralmentedegradamRNAsqueterminanlatraduccin50
55 nucletidos corriente arriba de una unin exonexon generada por splicing. A 2024
nucletidos corriente arriba de esta unin se une un complejo proteico, EJC (exon junction
complex) el cual est formado por 12 protenas donde estn incluidos algunos factores del
sistema NMD. Cuando el ribosoma comienza la traduccin y encuentra un PTC (codon de
paradaprematuro)sedetiene.EstopermitelaformacindelcomplejoSURF,elcualcuando
colisiona con el EJC provoca la activacin del sistema NMD y con ello, la degradacin del
mRNA.Sehavistoquemutacionesnonsenseenelltimoexondelgencodificanteparala
globinahumananosufrenNMDporquenohayuninexonexonposterior(Thein2004).El
sistema NMD no es 100% eficiente, sino que aproximademante un 525% de mRNA que
contienePTCescapaaestesistemadevigilanciayestraducidoaunaprotenatruncadaque
generalmenteesinestablesiendodegradada(KuzmiakandMaquat2006).Sinembargo,enla
actualidad se han observado transcritos portadores de PTC que no son degradados y
generan protenas truncadas con posible actividad (Kerr et al. 2001). En base a esto se han
creadonuevasterapiasbasadasenlainhibicindelsistemaNMDqueconsiguenrecuperarel
fenotiponormalinvitroenenfermedadescomolaenfermedaddeUllrich(Usuki2006;Usuki
etal.2004).

14

Introduccin
Elconocimientodelasconsecuenciasquecadamutacinproduceentrminosdesu
mecanismo de accin a nivel de DNA y mRNA ha abierto nuevas y prometedoras vas
teraputicasgenticasenestasalteracionesdelsplicing.Lamodulacindelsplicingpermitira
modificar el porcentaje de transcritos incorrectamente procesados y por lo tanto, alterar la
expresinfenotpicadelamutacin.Estosepodrallevaracabomediante:

Sobreexpresin de factores especficos de splicing (NissimRafinia et al. 2004) o

activacindelatranscripcindeestosfactoresconelusodedrogascomofenilbutirato
(Andreassietal.2004),butiratosdico(Changetal.2001),kinetina(Slaugenhauptetal.
2004), cido valproico (Brichta et al. 2003; Gottlicher 2004), aclarubicina (Andreassi et
al.2001),cafena(Shietal.2008),entreotros,queactuancomodiacetilasasoactivando
determinadospromotores.

Uso de oligonucletidos antisentido tipo morfolino (AMO). Se trata de pequeas

cadenas de anlogos de deoxirribonucletidos que hibridan con el mRNA
complementarioporapareamientodebasesformandolosheterodplexAMOsmRNA.
Los mecanismos mediante los cuales los AMOs llevan a cabo la regulacin de la
expresin gnica incluyen induccin de la actividad RNasa H endonucleasa que
degrada el mRNA, interferencia de la traduccin por impedimento estrico de la
actividad ribosomal e interferencia de la maduracin del mRNA por inhibicin del
splicing(AartsmaRusandvan Ommen2007;Kurreck2003).En los ltimos aos los
oligonucletidos antisentido tipo morfolino (AMOs), capaces de bloquear
alostricamente estos sitios de splicing, han sido utilizados para restaurar el splicing
normalenvariasenfermedadescomosonlatalasemias(Suwanmaneeetal.2002),
fibrosisqustica(Friedmanetal.1999),enfermedaddeMenkes(Madsenetal.2008),
albinismooculartipoI(Vetrinietal.2006),afibrinogenia(Davisetal.2008),distrofia
muscular de Duchenne (AartsmaRus and van Ommen 2007), ataxia telangiectasia
(Duetal.2007)yacidemiasorgnicas(Rinconetal.2007).

1.2.3Relacingenotipofenotipo
Con el conocimiento del espectro mutacional de los genes implicados y teniendo en
cuentalainformacinobtenidaenlosdiferentesestudiosdeexpresindelasmutacionesylos
datos clnicos/bioqumicos de los pacientes, se ha intentado correlacionar el fenotipo con el
genotipo en numerosas enfermedades genticas. De esta manera, se intentara predecir el
pronstico de la enfermedad y adecuar una terapia de forma ms individualizada y, en
algunoscasos,dirigidaalmecanismomolecularresponsabledelapatognesisdecadavariante
allica.

La relacin genotipofenotipo es ms evidente cuando los pacientes son homocigotos

para una mutacin o funcionalmente hemicigotos (portadores de una mutacin nula). En
pacientesheterocigotosparadosmutacionesdecambiodeaminocido,quesuponenel80%de
lospacientes,estarelacinesmscomplejayaqueesnecesariovalorarlacontribucindecada
varianteallicaenlaproduccinfinaldeprotenafuncional.Deestaforma,sepuededefinirun

15

Introduccin
sencillo algoritmo en el cual dos mutaciones severas (con actividad residual nula in vitro) se
asocianalasformasmsgravesdelaenfermedad,mientrasquelapresenciadeunamutacin
levequeretieneactividadresidualyunasevera(hemicigotofuncional),seasociaafenotipos
ms leves. Las discrepancias en la relacin genotipofenotipo encontradas se han descrito
fundamentalmentecuandoseproduce unamenorcantidad deprotena inmunorreactiva por
ser defectos que afectan al plegamiento de la protena, con mayor tendencia a la
agregacin/degradacin y por lo tanto, menor actividad cuando son expresadas in vitro
(Waters et al. 1998). Las enfermedades donde se han descrito este tipo de mutaciones son
denominadas enfermedades conformacionales. As, estas discrepancias podran ser
explicadas por las posibles diferencias interindividuales en la eficacia del sistema de
degradacin/plegamiento de protenas (protein quality control) que mantiene diferentes
nivelesdeactividadresidual(Desviatetal.1999;Gregersenetal.2001a;Gregersenetal.2004).

16

2.OBJETIVOS

Objetivos

Elobjetivoprincipaldeestetrabajohasidoelestudiodelasbasesmolecularesdelos
Defectos Congnitos de Glicosilacin para encontrar nuevas herramientas diagnsticas y
poder investigar en nuevas dianas y aproximaciones teraputicas basadas en el genotipo.
Paraello,sehanseguidolossiguientesobjetivosconcretos:

1. Aplicacin y desarrollo de tcnicas diagnsticas: IEF de glicoprotenas sricas,

estudiosenzimticosyanlisisgenticodelosgenesresponsablesdelapatologa.

2. EstudiosdelproteomasricodepacientesconCDGIa.

3. Caracterizacin de lneas celulares de pacientes con Defecto Congnito de

GlicosilacinIa(CDGIa).AnlisisdelaexpresingnicaydelaprotenaPMM2.

4. Anlisisfuncionaldelasmutacionesmissenseensistemasdeexpresinprocariota.
EfectodelasmutacionessobrelaactividadyestabilidaddelaprotenaPMM2.

5. Anlisis funcional de mutaciones que afectan al correcto procesamiento del

mRNA mediante modelos celulares con minigenes. Anlisis del perfil
transcripcionalenlneascelularesportadorasdedichasmutaciones.

6. Estudio de nuevas aproximaciones teraputicas especficas de mutaciones de

splicing: sobreexpresin de factores de splicing y aplicacin de oligonucletidos
antisentidotipomorfolinos.

18

3.MATERIALESYMTODOS

Material y mtodos

3.1MATERIALES
3.1.1Reactivosyaparatos

El clculo del porcentaje de transferrina deficiente en carbohidratos (%CDT) se ha

realizadoutilizandoelkit%CDTTIAMicrotiterplateversindeBIORAD.

El isoelectroenfoque se ha realizado en una unidad de electroforesis Multiphor de

Amersham, con anfolinas de pH 46 y 3.55 de Pharmacia y 58 de GE Healthcare,
anticuerposdeconejoantitransferrinaoanti1antitripsinahumanadeDAKOyantiapoCIII
deconejodeAcris,antiIgGdeconejomarcadoconfosfatasaalcalinadeSigma.Ademsde
utilizNBT/BCIP,neuraminidasadeRocheyGelesCleanGelIEFdeAmershamBiosciences.

ParalamedidadelasactividadesenzimticasPMM2yPMIsehanutilizadoenzimas
auxiliares proporcionadas por las casas comerciales Sigma y Roche, NADP de Roche y los
sustratos,Dmanosa6PyDmanosa1PdeSigma.Paralalecturadelaabsorbanciaa340
nmsehautilizadounlectordeplacasMicroplateReader680XRdeBiorad.

Enelcultivocelularseemplearonlossiguientesreactivos:mediomnimoesencialde
Eagle (MEM), glutamina de la firma comercial GibcoBRL y suero fetal bovino (FBS) de
SIGMA.LosantibiticosfueronsuministradosporAntibiticosS.A.Latripsinaylosmedios
de comprobacin se obtuvieron de Difco Laboratorios. Invitrogen, GibcoBRL y Gene Tools
suministraronlosreactivosparalastransfeccionesdeclulasprimariasyestablecidas.

Amershans Biosciences y GE Helathcare proporcionaron los reactivos para la

realizacindelaelectroforesisbidimensionaldeprotenas.

La agarosa y la agarosa NuSieveGTG son de las casas comerciales Pronadisa y

Cambrex,ylaacrilamidaybisacrilamidadeBioRad.

Invitrogen proporcion los productos necesarios para la purificacin de RNA total.

LapurificacindeproductosdePCRydeDNAplasmdicosellevacaboconlosproductos
de las casas comerciales Promega, Quiagen y Mbiotech. Las firmas comerciales GENTRA
Systems,PromegaeInvitrogenproporcionaronlosproductosnecesariosparalaextraccinde
DNAgenmico.

LosreactivosyenzimasempleadosenlasreaccionesdePCR,RTPCRymutagnesis
dirigida fueron obtenidos de las firmas comerciales Invitrogen, Roche y Stratagene y se
realizaronenuntermocicladorVeritydeAppliedBiosystem.

Las reacciones de secuenciacin cclica directa se llevaron a cabo con productos de

Applied Biosystems en un secuenciador ABI Prism 3730 de Applied Biosystems. Los
oligonucletidos sintticos proceden de la firma comercial Isogen y los oligonucletidos
antisentidotipomorfolinosfueronsuministradosporlacasacomercialGeneTools.

20

Material y mtodos
Invitrogen, Life Technologies y Rzpd proporcionaron los vectores necesarios para
llevaracabolosclonajes.

LasenzimasderestriccinfueronproporcionadasporRocheDiagnosticsyPromega.

LosreactivosyaparatosempleadosenlasreaccionesRTPCRtiemporeal(qRTPCR)
fueronobtenidosdelasfirmascomercialesAppliedBiosystem.

Los reactivos utilizados para Western Blot son de las casas comerciales Amersham
Pharmacia Biotech, Millipore y Roche. Los anticuerpos utilizados fueron anticuerpo
policlonal comercial antiPMM2 (Abnova) y anticuerpo secundario anti IgG de ratn
conjugadoaperoxidasa(SantaCruz).ElWesternblotsellevoacaboenunMiniproteande
Biorad y se densitmetr en un densitmetro BioRad GS710 Calibrated Imaging
Densitometer.

3.1.2 Materialbiolgico

3.1.2.1Muestrasbiolgicas

Seseleccionaronlossuerosdepacientesquepresentaronun%CDT>3parael
anlisisporisoelectroenfoquedelatransferrina, 1antitripsinayapolipoprotenaCIII.Para
losestudiosdeprotemicaseutilizaronsuerosde2pacientesCDGIayde3controles.

Paraelanlisisenzimticoy/ogenticoseutilizaronfibroblastosobtenidosdebiopsia
de piel de 24 pacientes y 17 controles cultivados en botellas de 75 25 cm2 o en placas
estandarizadas de 6 pocillos (P6) a 37C en una atmsfera de humedad relativa del 95% y
CO25%.SeutilizcomomediodecultivoMEMsuplementadoal10%consuerofetalbovino
(FBS),glutamina2mM,100U/mLdepenicilinay100g/mLdeestreptomicina.Serealizaron
controles de contaminacin de reactivos, medios de cultivo y cultivos celulares de forma
sistemtica durante todo el estudio. Las clulas fueron recogidas con una solucin de
tripsinaEDTAysedimentadasmediantecentrifugacin.

En aquellos casos en los quenose dispona defibroblastos depiel se utiliz sangre

totalconanticoagulanteoimpregnadaenpapelSS903paraelestudiogentico

LalneacelulardehepatomahumanoHep3Butilizadaenesteestudiofuecedidapor
elDr.S.R.deCrdoba.

Los fibroblastos de piel de la lnea celular 25232 utilizada en este estudio fueron
cedidosporelDr.G.MatthijsdelCentrodeGenticaHumana,Leuven(Blgica).

Todo el material gentico (biopsias de piel y sangres) de pacientes y controles se

obtuvieron con consentimiento informado autorizado por padres y por el hospital que

21

Material y mtodos
remitilasmuestras.Todalainvestigacinllevadaacaboconestematerialestautorizado
porelComitdeticadelaInvestigacindelaUniversidadAutnomadeMadrid,respeta
los principios fundamentales de la declaracin de Helsinki, del Convenio del consejo de
EuroparelativoalosderechoshumanosylabiomedicinaydeladeclaracinUniversaldela
UNESCOsobreelgenomaHumanoylosderechoshumanos.

3.1.2.2Cepasbacterianas

Las estirpes de E.coli utilizadas en este estudio han sido XL1Blue de Stratagene y
BL21(DE3)pLysSdePromega.

3.1.2.3 Vectoresplasmdicos

pSPL3deLifeTechnologies

pDEST15deRzpd

Losplsmidosportadoresdelasecuenciacodificanteparalosdistintosfactoresde
splicingyprotenasSRfueroncedidosporDr.B.Andresen,Dr.A.KraineryDr.J.
Valcarcel.

TOPOTACloningPCR2.1TopoVectordeInvitrogen.

3.2MTODOS

3.2.1 Isoelectroenfoque(IEF)deglicoprotenassricas

Para el anlisis de la transferrina se utilizaron sueros de pacientes con sospecha de

enfermedadmetablicapreviamenteseleccionadosportener%CDT>3.Unvolumende20l
desuerosesaturconcitrato frrico10 mMen NaHCO3 0.5 My posteriormentesediluy
1/50conaguadestilada.

Para el anlisis de 1antitripsina se utilizaron sueros de pacientes que presentaron

alguna alteracin en el IEF de la transferrina. Se incub 20 l de suero con DTT 25 mM
Tween2012.5ml/Lysediluy1/100conaguadestilada.

Ambos anlisis se realizaron a 10C en una unidad de electroforesis Multiphor de

Amersham,engeldeagarosaal1.2%conteniendoun10%deglicerinay15%desorbitol,con
ungradientedepH=48(Pharmalyte46y58deGEHealthcare)yaplicandounacorriente
de1250V,150mA,20Wa1500V/h.Posteriormenteserealizelinmunoblotatemperatura

22

Material y mtodos
ambientetransfirindoselasprotenasaunfiltrodenitrocelulosadurante1530minutos.A
continuacinseincubtodalanochea4Cconanticuerposdeconejoantitransferrinaoanti
1antitripsina humana, segn el caso, diluidos 1/250 en una solucin de NaCl 0.9%
conteniendoun0.2%delechedesnatada.ComoanticuerposecundarioseutilizantiIgGde
conejomarcadoconfosfatasaalcalina(Sigma)diluido1/2500enlamismasolucindeNaCl
0.9%con0.2%delechedescremadaysedejincubando1horaatemperaturaambiente.El
reveladoserealizconNBT/BCIP(Roche)diluido1/10enunasolucinal5%deTrisHCl1
MpH=9.7.
Para la identificacin de variantes o subtipos de transferrina se llev a cabo un
tratamiento con neuraminidasa; a 20 l de suero se aadi neuraminidasa 10 U/ml
simultneamentealasaturacinconcitratofrrico10mMysedejincubara37C24horas.
Posteriormente,sediluylamuestra1/100conaguadestilada.Estetratamientoproporciona
latransferrinaenestadoasialilado,esdecir,libredegrupossilicos.

En todos los casos se aplic al gel 3 l de las muestras para el anlisis de la

transferrina,y4l paraeldela1antitripsina.

Para el anlisis mediante IEF de la Apo CIII se utilizaron sueros de pacientes que
presentaron patrn tipo 2 de la transferrina y se aplic directamente 4 l de la muestra de
suerosinningntratamientoprevio.

El anlisis se llev a cabo a 16C en una unidad de electroforesis Multiphor de

Amersham, en gel de poliacrilamida (Geles CleanGel IEF de Amersham Biosciences)
rehidratadoshoraymediaatemperaturaambienteconunasolucinquecontieneurea8.5M
y Pharmalyte 3.55 63 mL/L (Pharmacia). Se aplic una corriente de 2000 V, 14 mA, 14 W
durante90minyposteriormenteserealizelinmunoblottransfiriendoanitrocelulosaa65C
durante 1 hora e incubando toda la noche a 4C con anticuerpos antiapoCIII de conejo
(Acris)diluidos1/100ensolucindeNaCl0.9%quecontieneun0.2%delechedescremada.
Como anticuerpo secundario se utiliz antiIgG de conejo marcado con fosfatasa alcalina
(Sigma) diluido 1/1000 con la misma solucin y se dej incubar 1 hora a temperatura
ambiente. Se revel con NBT/BCIP (Roche) 1/10 en una solucin al 5% de TrisHCl 1M
pH=9.7.

3.2.2 MedidadelasactividadesPMM2yPMI

ElmtodoespectrofotomtricoutilizadoestbasadoenlamedidadeNADPHa340
nmproducidoporlareduccindelNADPporlaactividaddelaglucosa6Pdeshidrogenasa
(deKoningetal.1998;VanSchaftingenandJaeken1995).

Cada pellet, obtenido de fibroblastos de piel cultivados en una botella de 75 cm2 a

confluencia, se resuspendi en un medio HEPES 20 mM con KCl 25 mM, DTT 1 mM y
Pefabloc 0,2 mM. La rotura y eliminacin de las estructuras celulares se realiz mediante
doblecongelacinennitrgenolquidoyposteriorcentrifugadodelamuestraa13.000rpm
durante5minutos.

23

Material y mtodos
Lamedidadelasactividadesserealizdurante45minutosa37Cyenagitacin,en
unamezclaquecontieneHEPES50mMpH7.1,MgCl25mMyNADP0.6mMdeSigma.Para
laactividadPMM2ademsseaadifosfoglucoisomerasa10g/mldeRocheyglucosa6P
deshidrogenasa1.4U/m,fosfomanoisomerasa3.5g/ml,glucosa1,6diP100Mymanosa1
P 0.4 mM de Sigma. En el caso de la actividad PMI se aadi glucosa6P deshidrogenasa
0.28 U/ml, fosfoglucoisomerasa 10 g/ml citadas anteriormente y manosa6P 0.5 mM de
Sigma. Se para la reaccin con tampn NaHCO3 / Na2CO3 0.5 M pH 10.7. La lectura de la
actividadsehizomedianteMicroplateReader680XRdeBioRada340nm.

AmbasactividadesseexpresaenmU/mgdeprotena,siendounamUlosnmolesde
NADPHobtenidoporminuto.

3.2.3 Cuantificacindeprotenas

La concentracin de protenas totales a partir de fibroblastos de piel de pacientes,

paraladeterminacindelasactividadesenzimticasPMM2/PMIsedeterminsiguiendoel
mtododeLowry(Lowryetal.1951).Laconcentracindeprotenastotalesdelosextractos
obtenidos a partir de la expresin de la protena de fusin GSTPMM 2 en bacterias se
determinsiguiendoelmtododeBradford(Bradford1976).

3.2.4 Aislamientodecidosnucleicos

Para la extraccin de RNA total a partir de fibroblastos de piel, se utiliz TriPure

IsolationReagentdeInvitrogen.

La extraccin del DNA genmico a partir de fibroblastos de piel o hepatoma y de

sangretotaldelosdistintospacientesserealizmediantefenolizaciones(Johnetal.1991),sin
embargo de la sangre impregnada en papel se llev a cabo con el kit Generation DNA
PurificationSystemsdeGentraSystems.

ParalaextraccinypurificacindeDNAplasmdicoseempleelsistemacomercial
de extraccin de DNA plasmdico WizardPlus SV Minipreps DNA Purification system de
Promega.

3.2.5 TcnicasdeamplificacindeDNA

3.2.5.1 AmplificacindecDNA

ElprocesodeRTPCRsellevacaboapartirde1gdeRNAtotalextradoapartir
de fibroblastos de piel o hepatoma. Los reactivos empleados en la retrotranscripcin y
posterior amplificacin fueron suministrados por Invitrogen (SuperScriptIII FirstStrand

24

Material y mtodos
Synthesis System for RTPCR), utilizando oligodT y siguiendo las instrucciones de la casa
comercial.

Para los distintos estudios moleculares en cDNA se disearon primers especficos

para cada gen a partir de la Base de Datos Pblica Ensembl
http://www.ensembl.org/index.html(Tabla2).

Tabla2.OligonucletidosdiseadosparalaamplificacindeloscDNAsdelosdistintosgenesestudiados.
FRAGMENTO
NOMBRE
SECUENCIA
TAMAO RTGEN
Tm(C)
cDNA
OLIGO
5 3
PCR (pb)

PMM2

PMM2

MPI

MPI
ALG6.1

ALG6
ALG6.2
DPM1.1
DPM1
DPM1.2
DPGAT1.1
DPGAT1
DPGAT1.2

PMM2-F
PMM2-R
MPI-F-1S
MPI-R
ALG6-A
ALG6-R(E8)
ALG6-F(E7)
ALG6-R
DPM1-F
DPM1-R2
DPM1-F2
DPM1-R-9AS
DPGAT1-F
DGPAT1-1R
DPGAT1-2F
DPGAT1-R

GTTCCTCGTGCCAACGTGTC
GGAAGTCCAGACGGCACATG
CTGCCGGGAAAGGCATACGT
GGTGAGGTTGGCTGGAATTTA
ATGCGCTTCCTGGGACCC
CCCTTTCCTTTGAGGCCTTTT
ATGCATCTTGCTGTATCCAGG
TCCTGTGGTTCCATGGTTCTC
TTTCTAATTGAACCACGCATT
GAGACAATATCAAAATTACCC
CTACATCATTATTATGGATGC
ATGCATGAAATTTACCTTACC
GCTCAAGTCAGAGTTGCTG
GAGCAATCCCAAAGTGGTG
GAGTTGGAAGGTGATTGTCG
GTCTCCATTGAGAGCATGTG

61.4
61.4
61.4
57.9
61.0
57.9
59.8
59.8
52.0
52.0
52.0
52.0
56.7
56.7
57.3
57.3

937
1377
945
1103
578
571
870
1059

Oligonucletidos diseados utilizando las secuencias NM_000303.1 para el gen PMM2, NM_002435.1para el gen MPI,
NM_013339.2 para el gen ALG6, NM_003859.1 para el gen DPM1 y NM_001382 para el gen DPGAT1, depositadas en las
bases de datos pblicas.

Paraelestudiodelperfiltranscripcionaldelospacientesportadoresdelamutacin
IVS79T>G se dise, adems, un oligonucletido especfico (PMM2E8) cuya secuencia es
5ATGGTCATTGCCACCCTGGAA3quehibridaconelfinaldelintrn7yelprincipiodel
exon8delgenPMM2.ParalaRTPCRseutilizesteprimerjuntoconeloligoPMM2F.

Los oligonucletidos utilizados en la amplificacin y secuenciacin de las

construccionesplasmdicasenpSPL3(LifeTechnologies)semuestranenlatabla3.

Tabla3.Oligonucletidossintticosempleadosenlasecuenciacindeconstruccionesplasmdicas.

VECTOR
PSPL3

NOMBRE
OLIGO
SD6
SA2

SECUENCIA
5 3
TCTGAGTCACCTGGACAACC
ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC

Tm(C)
54.0
52.0

3.2.5.2 AmplificacindeDNAgenmico

Losexonesdecadagenjuntoconsussecuenciasintrnicasflanqueantes,incluyendo
las secuencias aceptoras y donadoras se amplificaron mediante el diseo de primers
especficosysellevoacaboenuntermocicladorVeritideAppliedBiosystem.

25

Material y mtodos
Tabla4.OligonucletidosdiseadosparalaamplificacindelosdistintosexonesdelgenPMM2

GEN

EXON
1
2
3
4

PMM2
5
6
7
8

NOMBRE
OLIGO
PMM2-1S
PMM2-1AS
PMM2-2S
PMM2-2AS
PMM2-3S
PMM2-3AS
PMM2-4S
PMM2-4AS
PMM2-5S
PMM2-5AS
PMM2-6S
PMM2-6AS
PMM2-7S
PMM2-7AS
PMM2-8S
PMM2-8AS

SECUENCIA
5 3
GTTCCTCGTGCCAACGTGTC
AGCCCCAACTGGGAACAGCA
GGTCTCCTGATTATTGTGTGG
TAGGGCAGCCTATGATACTTG
TTCCTAGAGGCATTCATTGTG
GTTTTGATTCTTTGCATTCTAAG
CTGGGTTTGCTATGAAGCTG
CCATGTGACACTACGCTATG
AGGCTGTTTATCTATGTTGCC
CACCAGGCCATATCTTATTT
GCCAGTAGTTAAAACTGTGCT
CCACAACAAACTCTGGGAAAT
TCAGTGACATATCATTAGCCC
CCCCATCAAGCGCAAATGC
TCCAGGGTCACATCAGCAAT
GAGCACGTGTGGGAGGAC

Tm(C)
61.4
61.4
57.9
57.9
55.9
53.5
57.3
57.3
55.9
53.2
55.9
55.9
55.9
58.8
57.3
57.3

TAMAO
PCR (pb)
178
251
205
219
235
206
235
260

OligonucletidosdiseadosapartirdelasecuenciaENST00000268261,depositadaenlasbasesdedatospblicas.

Adems, para la amplificacin del pseudoexn localizado en el interior del intrn 7

del gen PMM2 se disearon dos primers especficos, PSEUF de secuencia
5GTGGCTGAGTTCCCAACTA3yPSEURdesecuencia5GGAGAATCAATTCCATCCAG3.

Tabla5.OligonucletidosdiseadosparalaamplificacindelosdistintosexonesdelgenMPI

GEN

EXON
1
2
3
4

MPI
5
6
7
8

NOMBRE
OLIGO
MPI-F-1S
MPI-1AS
MPI-2S
MPI-2AS
MPI-3S
MPI 3AS
MPI-4S
MPI-4AS
MPI-5S
MPI-5AS
MPI-6S
MPI-6AS
MPI-7S
MPI-7AS
MPI-8S
MPI-8AS

SECUENCIA
5 3
CTGCCGGGAAAGGCATACGT
ACGCGCTCCACGAACACACT
TGAGGAGTGGAGTGGCAGCT
TTTCTCCTGACCTGCGGGTAA
TGGCAGGTTTCTTCCCCCTT
ATAAGCCCTTCTGTACCCTGA
TAATGGCTGTACCCTCACCAT
TATCCCTGGCCCAGTACGCA
CTTACCATTCCTGATATGGGC
AGAGCATTGCACCCAACCAG
AGCACTGAGTATCCCCCTAAG
AGTGGGGCTACATGCTGAAAT
GGCATACTTCATCAGCTTAGC
GATTTTCATGGCACACGAAGG
ATGAGAGCAGAGTCTGAGCT
TTTAGGAACAGGTACCCCAAA

Tm(C)
61.4
61.4
61.4
59.8
59.4
57.9
57.9
61.4
57.9
59.4
59.8
59.8
57.9
57.9
57.3
55.9

TAMAO
PCR (pb)
108
218
296
236
264
253
297
322

OligonucletidosdiseadosapartirdelasecuenciaENST00000352410,depositadaenlasbasesdedatospblicas.

Tabla6.Oligonucletidosdiseadosparalaamplificacindelexon9delgenDPM1

GEN

EXON

DPM1

NOMBRE
OLIGO
DPM1-9S
DPM1-R-9AS

SECUENCIA
5 3
ATCCTATTTCTGTTGTGTTGG
ATGCATGAAATTTACCTTACC

Tm(C)

TAMAO
PCR (pb)

54.0
52.0

327

Oligonucletidos diseados utilizando la secuencia ENST00000371588, depositadas en las bases de datos

pblicas.

26

Material y mtodos
Tabla7.Oligonucletidosdiseadosparalaamplificacindelosexones6y8delgenDPGAT1

GEN

EXON
6

DPGAT1
8

NOMBRE
OLIGO
DPGAT1-6S
DPGAT1-6AS
DPGAT1-8S
DPGAT1-8AS

SECUENCIA
5 3
GGCCCCAGGAATAGATGAAT
CCCTTTGCACAGCAAATGTA
CAGATCCAAGGGGAACTTGA
AGAAAGGGAGACACGGAGGT

Tm(C)
57.3
55.3
57.3
59.4

TAMAO
PCR (pb)
450
291

Oligonucletidos diseados utilizando la secuencia ENST00000354202, depositadas en las bases de datos

pblicas.

Lasreaccionesde amplificacin por PCRsellevaron a cabo en un volumen final de

25l, con una concentracin de MgCl2 de 2 mM, dNTPs 200 M, 1 mol de cada
oligonucletido, 1 U FastStart Taq de Roche Applied Science y entre 0,51,5 g de DNA
genmico.Latemperaturadehibridacinoscilentre5060Csegnfueralatemperaturade
fusinomeltingdelpardeoligonucletidosempleadosencadacaso(Tabla4,5,6y7).
Para el estudio y amplificacin de inserciones mediante separacin allica de un
mismogenseutilizelkitTOPOTACloningPCR2.1TopoVectordeInvitrogen.

3.2.6PurificacindefragmentosdeDNA

LapurificacindefragmentosdeDNAinferioresa1Kb,obtenidostrasamplificacin
por PCR o resultantes de digestin enzimtica, se realiz con los productos SpinClean PCR
Purification Kit de MBiotech, siguiendo instrucciones de los proveedores. En el caso de
fragmentos de mayor tamao, la purificacin se llev a cabo empleando QIAEX II Gel
Extractionkit(Qiagen).

3.2.7SecuenciacindeDNA

La secuenciacin cclica directa se realiz empleando el mtodo enzimtico de

terminacindecadenadeDNAporincorporacindedideoxinucletidostrifosfato(ddNTPs)
descritopor(Sangeretal.1977).Lasreaccionessellevaronacabojuntoconoligonucletidos
sintticos no fluorescentes y utilizando el kit BigDe Terminator v3.1 Cycle Sequencing de
Applied Biosystems,siguiendoelprotocolosuministradopor el proveedor y losproductos
obtenidos fueron resueltos en un secuenciador automtico ABI Prism 3730 de Applied
Biosystems.

EnlasreaccionesdesecuenciacindeproductosamplificadosporPCRseemplearon
300 ng de DNA y para la secuenciacin de construcciones plasmdicas se emple una
cantidadde300500ngdeDNA.

La secuenciacin de productos amplificados por PCR se llev a cabo con

oligonucletidosdeigualsecuenciaalosempleadosenlasreaccionesdeamplificacin.

27

Material y mtodos

3.2.8Electroforesisbidimensional(2DE)deprotenassricas

Sediluyeronlossuerosdepacientesdirectamenteenunbufferdelsisquecontiene
urea8.4M,tiourea2.4M,CHAPS5%yTCEPHCl2mM.Paraincrementarlaresolucine
intensificarlasprotenasdebajaexpresin,lossuerosfueronpreviamentetratadosconunkit
queeliminalaalbminaylasinmunoglobulinasIgG(deAmershansBiosciences)yelpellet
obtenidofueresuspendidoigualmenteenelbufferdelsis.

EntodosloscasossemidilaconcentracindeprotenaporBradfordysecarg90
100 g de protena total. La primera dimensin se llev a cabo como fue descrita por
(Richardetal.2006).LaseparacindeprotenasserealizconunatiraIPGde18cmyrango
depH31047deGEHealthcareenunaunidaddeelectroforesisEttanIPGphorIsoelectric
focusingdeGEHealthcare,ajustndosealasrecomendacionesdelacasacomercial.

LaseparacindelasegundadimensinserealizengelesdeSDSpoliacrilamidaal
10%,corriendocadagela6mAdurante15horasa4Cyposteriortincinconplata.

Se recogieron manualmente spots de 3 mm3 que fueron colocados en placas de 96

pocillos y automticamente procesados utilizando un InvestigatorTM ProGest digestion
station donde lasmuestras son reducidas en gel, alquiladas con iodoacetamida ydigeridas
contripsina(Shevchenkoetal.1996).PosteriormenteseanalizaronporMALDITOF.

3.2.9Mutagnesisdirigida

Las variantes allicas D65Y, V44A, L32R, F207S, F157S, D209G, R141H, T237M,
P184T,T118S,P113L,R123QR238H,C241SyE197AdelgenPMM2fueronintroducidasen
elvectordeexpresinprocariotapDEST15deRzpdqueportalasecuenciadelcDNAPMM2.

LamutagnesisdirigidamedianteelprocesodePCRserealizconelkitQuikChange
SiteDirectedMutagenesisdeStratageneutilizandolosprimersespecficosqueseindicanenla
tabla8.

Todoslosclonesmutantesfueroncomprobadosyseleccionadoscomoportadoresde
la mutacin correspondiente mediante secuenciacin cclica directa del DNA plasmdico
resultante.

28

Material y mtodos
Tabla8.Oligonucletidossintticosempleadosenlamutagnesisdirigida.

MUT.

SECUENCIA
5 3

SECUENCIA
3 5

cDNA PMM2

D65Y

GTGGTTGAAAAATACTATTATGTGTTTCCAG

CTGGAAACACATAATAGTATTTTTCAACCAC

178-208

L32R

GAAATGGATGACTTCCGCCAAAAATTGAGG

CCTCAATTTTTGGCGGAAGTCATCCATTTC

79-108

R141H

CCAAGAAGAACACATTGAGTTCTACGAAC

GTTCGTAGAACTCAATGTGTTCTTCTTGG

411-439

T237M

GCCTGAGGACATGCGCAGGATCTG

CAGATCCTGCGCATGTCCTCAGGC

699-722

P113L

CGAAAATTAAACTCCTGAAGAAGAGGGG

CCCCTCTTCTTCAGGAGTTTAATTTTCG

322-350

D209G

TTATTTCTTTGGAGGCAAAACTATGCCAG

CTGGCATAGTTTTGCCTCCAAAGAAATAA

612-640

F207S

CCATTTATTTCTCTGGAGACAAAACTATGC

GCATAGTTTTGTCTCCAGAGAAATAAATGG

608-637

F157S

GACAAAAGTCTGTAGCAGATCTACGGAAAG

CTTTCCGTAGATCTGCTACAGACTTTTGTG

461-590

P184T

CTTTGATGTCTTTACTGATGGATGGGAC

GTCCCATCCATCAGTAAAGACATCAAAG

537-564

V44A

CAAAATCGGAGTGGCAGGCGGATCG

CGATCCGCCTGCCACTCCGATTTTG

117-141

T118S

GAAGAGGGGTAGTTTCATTGAATTCCG

CGGAATTCAATGAAACTACCCCTCTTC

342-368

R123Q

CATTGAATTCCAAAATGGGATGTTAAACG

CGTTTAACATCCCATTTTGGAATTCAATG

357-385

R238H

GAGGACACGCACAGGATCTGTGAAC

GTTCACAGATCCTGTGCGTGTCCTC

703-726

C241S

CGCAGGATCTCTGAACTGCTGTTCTC

GAGAACAGCAGTTCAGAGATCCTGCG

712-737

E197A

CGACATGTGGCAAATGACGGTTATAAG

CTTATAACCGTCATTTGCCACATGTCG

580-606

NM_000303.1

Labasequeintroducelamutacinenlareaccindemutagnesisdirigidasemuestraenrojo.
SemuestralalocalizacindecadaoligonucletidoenlasecuenciadelcDNAPMM2(Ensembl,cdigodeacceso
NM_000303.1),siendoelnucletido+1laadenosinadelATGiniciadordelatraduccin.

3.2.10ExpresindemutacionesmissenseenE.coli

Para la expresin de mutaciones se utiliz el vector plasmdico pDEST15 de Rzpd,

portadordelcDNAde PMM2enfase delecturacon la protena GST (Fig. 7) y alque sele
hanintroducidolasdistintasvariantesallicaspormutagnesisdirigida.

SetransformaronlasclulasXL1BluedeStratageneconelvectorconteniendoelgen
PMM2 salvaje y con las mutaciones en estudio incorporadas. La seleccin de los clones
positivosserealizporresistenciaaampicilinayseconfirmporsecuenciacin.

29

Material y mtodos

Figura7.EsquemadelvectorpDEST15.

Decadaclonsepreparunprecultivode18h,apartirdelcualsecrecia2637C
un cultivo hasta una densidad ptica de 0.61 a 600 nm, al cual se le aadi IPTG 1 mM
dejandoactuaralmenos5horas.Secentrifug5minutosa5000rpmyelpelletobtenidose
resuspendien1mldeunmedioquecontieneHEPES20mMconKCl25mM,DTT1mMe
inhibidordeproteasaComplete,Mini,EDTAFreedeRoche.Laroturacelularsellevacabo
por sonicacin durante 5 segundos 3 veces con descansos de otros 5 segundos y para la
eliminacin de las estructuras celulares se centrifug 5 minutos a 13000 rpm. Con el
sobrenadanteserealizladeterminacinenzimtica.

LamedidadelaactividadPMM2sellevoacaboa37Ccon500ngdeprotenatotal,
medida por Bradford (Bradford 1976), en una mezcla que contiene HEPES 50 mM pH 7.1,
MgCl2 10 mM y NADP 1.2 mM. Adems se aadi glucosa6P deshidrogenasa 2.8 U/ml,
fosfoglucoisomerasa 20 g/ml, fosfomanoisomerasa 8 g/ml, glucosa 1,6 diP 200 M y
manosa1P0.8mM.Separalareaccinalos30minutoscontampnNaHCO3/Na2CO30.5
M pH 10.7.La lectura de la actividad se hizo a340 nmenunMicroplateReader 680XRde
BioRad.

3.2.11 Electroforesis, transferencia e inmunodeteccin de la PMM 2

(Westernblot)

Para el anlisis de protena PMM 2 mediante Western Blot, los pellets obtenidos de
fibroblastosdepieldepacientesCDGIa,hepatomaodebacteriasseresuspendieronenuna
solucinHEPES20mMconKCl25mM,DTT1mMyPefabloc0,2mMysesometieronatres
ciclos sucesivosde congelacin/descongelacin en N2 lquido y posterior centrifugacin. La

30

Material y mtodos
determinacindelaconcentracindeprotenassellevacabomediantecuantificacinporel
mtododeBradford(Bradford1976)empleandoelreactivoBioRadProteinAssay(BioRad).
Lamismacantidaddeextractoproteico(10genelcasodedefibroblastosdepacientesyde
la protena expresada en hepatoma, 150 g en el caso de fibroblastos transfectados con
AMOsy1genelcasodelaprotenaexpresadaenbacterias.)fuesometidaaelectroforesis
engeldepoliacrilamidaal10%.LaelectroforesissellevoacaboenelaparatoMiniProtean
(BioRad),empleandounasolucinTris25mM,250mMglicina,0,1%(p/v)SDS.

La protenas separadas por SDSPAGE, fueron transferidas a membrana de

nitrocelulosa(Millipore)ydetectadasmediantetincinconRojoPonceau(HarlowandLane
1988).LainmunodeteccindelaprotenaPMM2serealizutilizandoanticuerpopoliclonal
comercial antiPMM 2 de ratn a una dilucin 1/1000 (Abnova) y como anticuerpo
secundario,anticuerpodecabraantiIgGderatnconjugadoaperoxidasa(SantaCruz)auna
dilucin1/10000(V/V).Lavisualizacindeloscomplejosformadossellevacabomediante
el desarrollo de una reaccin quimioluminiscente en presencia del reactivo ECL
(Amersham Pharmacia Biotech) durante 1 minuto y posterior impresin de una pelcula
fotogrfica durante 15 y 30 minutos. La cuantificacin de los niveles de protena
inmunorreactivaserealizmediantedensitometralser,utilizandoeldensitmetroBioRad
GS710CalibratedImagingDensitometer(BioRad).

3.2.12Estudiosdeestabilidaddeprotenasinvitro.

Se realiz el anlisis de estabilidad de las protenas de fusin PMM 2 normal y

mutantesexpresadasenE.coliincubandoa37Celextractoproteicoobtenidodecadaclon
bacteriano por sonicacin y cuya concentracin de protenas totales se ha medido por el
mtododeBradford.
Decadaextractoserecolectaronalcuotasdeigualvolumencada2horas,teniendoen
cuenta que la alcuota inicial, es decir a tiempo 0 siempre contiene 1 g de protena total.
Medianteunarepresentacingrficadelasmedidasdensitomtricasobtenidasapartirdela
protenainmunorreactivadetectadaencadaalcuotaporWesterblot,secalcullavidamedia
tantodelaprotenasalvajecomodelasprotenasmutantes.

3.2.13 Anlisis cuantitativo de la expresin del gen PMM2 mediante qRTPCR

Los niveles de expresin del gen PMM2 se analizaron mediante cuantificacin del
cDNAporPCRatiemporeal(qRTPCR).

Se extrajo el RNA total de fibroblastos de piel de las distintas lneas celulares

mediante TriPure de Ambion, se analiz la calidad del mismo mediante el Bioanalizador
Agilent2100quepermiterealizarensayoselectroforticosdelRNApudiendovisualizarseen
formatogeloenunperfildepicos(electroferograma).

31

Material y mtodos
Para la qRTPCR del mRNA del gen PMM2 se utilizaron sondas Universal Probe
(S48) de Roche y oligonucletidos especficos 5GGACTTTGAGAAAGTGCAGGA3 y
5AAGCCATTTTCTGGAAACACAT3 diseadas usando el probeFinder Software
(Universal Probe Library) de Roche Applied Science. La retrotranscripcin se llev a cabo
con el Archive kit de Applied Biosystems utilizando 1g de RNA total y siguiendo las
recomendacionesdelproveedor.ParalaPCRseutilizlaTaqMan2XUniversalPCRMaster
MixNoAmpereseONG(AppliedBiosystems).

LaamplificacinyanlisisserealizenunaparatoABIPRISM7900HTutilizandoel
programa qBase suministrado por la casa con el mismo nombre. La eficiencia de la
amplificacinfueestandarizadamediantelaretrotranscripcinyposterioramplificacinen
paralelodelmRNAdelgenconstitutivorRNA18s.

Parallevaracabolacuantificacin,unavezobtenidoslosdatosdecrossingpoint(Cp)
o cycle threshold (Ct) de la PCR a tiempo real tanto para el gen de inters como para los
constitutivossellevacaboeltratamientomatemticoparaobtenerfinalmenteelparmetro
(RQ) relative quantity que nos permite calcular y comparar la cantidad de mRNA en los
distintosextractoscelulares,siendocalculadosegnlasiguientefrmula:
RQ=2Ct;Ct=(CtdeunamuestraCtlamuestradereferencia)

Ct=(CtdelgendeestudioCtdelgenconstitutivo[rRNA18s])

3.2.14ClonajeenelvectorpSPL3.Minigenes.

La construccin de los distintos minigenes se realiz en el vector de splicing pSPL3

(ExonTrappingSystem,LifeTechnologies)(Figura8)

SAg
EcoRI

SDg
Exon

EcoRI

SDv

pSPL3
ori

SAv

6031 bp

Ampr

Figura8.EsquemadelvectorpSPL3.SDv:Sitiodonadordesplicingdelvector.SAv:Sitioaceptordesplicingdel
vector. Ampr: Gen de resistencia a ampicilina. SDg: Sitio donador de splicing del exon introducido. SAg: Sitio
aceptordesplicingdelexonintroducido.

32

Material y mtodos
Para evaluar el mecanismo de splicing de las mutaciones IVS31G>C e IVS7
15479C>T, los fragmentos gnicos correspondientes a los exones 3 y 4 o el pseudoexon,
respectivamente, del gen PMM2 junto con sus regiones intrnicas adyacentes, se
amplificaronporPCRapartirdeDNAgenmicodecontrolesydelospacientesportadores
de los cambios nucleotdicos a estudiar. Los fragmentos resultantes de la amplificacin
fueron clonados en el vector TOPO TA Cloning PCR 2.1Topo Vector (Invitrogen), siguiendo
las instrucciones del proveedor. El fragmento introducido en cada caso fue escindido del
vectorconelenzimaderestriccinEcoRIyclonadoenelvectorplasmdicopSPL3digerido
previamenteconelmismoenzimaydesfosforiladoparaevitarlarecircularizacin.

Para el estudio del efecto producido en el mecanismo de splicing por la mutacin

IVS79T>G se requiri la construccin de un exon artificial formado por el exon 8 con su
3aceptordesplicingfusionadoalexon2delmismogenqueleaportaraelsitio5donadorde
splicing.Paraello,seamplificlasecuenciaenteradelexon8conlosprimersPMM2ANotIy
PMM2B y se amplific la secuencia entera del exon 2 con los primers PMM2A y PMM2B
BamHI.Posteriormente,elexon8fuedigeridoconlasenzimasderestriccinNotIyAlwI,y
el exon 2 con AlwI y BamHI. Los fragmentos fueron clonados en el vector TOPO y
escindidosusandoBamHIyNotI.LaconstruccinobtenidaseintrodujoenelvectorpSPL3y
latranscripcindelminigenseanalizporRTPCR.

Lasdiferentes construcciones normalesy mutantes en laorientacin correctafueron

seleccionadasporanlisisderestriccinysecuenciacincclicadirecta.

3.2.15Transfeccindelneascelularesprimariasyestablecidas

Paraverelefectoproducidoporlosoligonucletidosantisentido(AMOs)enelperfil
transcripcional,expresinyactividaddelaprotenaPMM2,6x105fibroblastosdepieldel
pacienteconCDGIafueroncultivadosenbotellasde25cm2paralaRTPCRylamedidade
actividad,y18x105fibroblastosenbotellasdede75cm2paraelWesternblot.Seaadieron
losAMOs24horasdespusdelasiembraaunaconcentracinfinalde10M20M.Para
la transfeccin se utiliz EndoPorter (Gene Tools) a una concentracin final de 68 M. El
tiempo de cultivo tras la adicin del EndoPorter y los AMOs fue de 4872 horas.
Posteriormente,serecogieronlasclulasyseguardelprecipitadocelulara70C(hastasu
utilizacin).

La secuencia de los oligonucletidos tipo morfolinos (Tabla 9) utilizados en la

modulacindesplicingfuerondiseados,sintetizadosypurificadosporGeneTools.

Tabla9.OligonucletidostipomorfolinosdiseadosparalamodulacindelsplicingenelgenPMM2.

Oligo

Secuencia53

Gendiana

AMOA
AMOB

TAGCTGCAAAGCAAGTGAAGCGGAC
ATCACAAACACAACCTACCTCAGGC

PMM2ENST00000268261

33

Material y mtodos

Los experimentos de expresin de minigenes se llevaron a cabo cultivando 4 x 105

clulas Hep3B de hepatoma humano en placas estandarizadas P6. Las transfecciones se
llevaron a cabo en medio MEM completo, utilizando 6 l de Jetpei (Lipofectin Reagent,
Invitrogen)y1.5gdelaconstruccinplasmdicapSPL3normalomutante.

Enlosexperimentosparaverelefectodelasobreexpresindefactoresdesplicingse
cotransfectHep3Bconelminigenadecuadoyhasta4gdevectoresportadoresdedistintos
factoresdesplicing:SRp40,SRp55,SC35,SF2/ASF,U2AF35yU2AF65utilizando8ldeJetpei
(LipofectinReagent,Invitrogen).

Las clulas fueron recogidas a las 4872 horas de la transfeccin por tripsinizacin,
lavadasconPBSycongeladasa70Chastasuutilizacin.

3.2.16Soporteinformtico
Las secuencias tanto de los cDNAs como de los DNAs genmicos de los genes
PMM2,MPI,ALG6,DPM1yDPGAT1fueronobtenidasmediantebsquedainformticaen
labasededatospblicaEnsembl(http://www.ensembl.org/index.html).

Eltratamientodeimgenesdigitalesydensitometradelasmismasserealizmediante
los programas Kodak Digital Science 1D 2.0.3. (Kodak Scientific Image Systems) y Quantity
One4.3.1(BioRad).

ElprocesamientoyanlisisdesecuenciasdeDNAsellevacaboconlosprogramas
Chromas 1.45 (Griffith University, Australia) y Prophet 5.0 (BNN Systems and
Technologies).

La identificacin de los posibles sitios aceptores y donadores de splicing en una

determinadasecuenciaserealizconelprogramainformticoSpliceSitePredictiondeBDGP
(http://www.fruitfly.org/seq_tools/other.html).

La visualizacin de la estructura tridimensional de la PMM 2 se realiz mediante la

bsqueda
en
la
base
de
datos
3d
Domains
del
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=domains) y la localizacin de los aminocidos
mutados en las distintas variantes allicas se realiz con el soporte informtico DS
ViewerPro5.0deAccelrysInc.

La bsquedadesecuenciashomlogas sellevo acabo en la bases dedatospblicas

Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html)). Para el alineamiento interespecfico de las
secuencias homlogas obtenidas se emple el programa CLUSTALW de EMBL
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

LasestimacionesestadsticassellevaronacaboconlapruebaPruebaTrealizadaen
MicrosoftOfficeExcel2003.

34

4.RESULTADOS

Resultados

4.1 DIAGNSTICO BIOQUMICO Y ENZIMTICO DE LOS

DEFECTOSCONGNITOSDEGLICOSILACIN.

Durante el transcurso de este trabajo se ha medido el porcentaje de transferrina

deficiente en carbohidratos (%CDT) en ms de 4000 sueros/plasmas de nios con sospecha
deenfermedadmetablicarecibidosenellaboratorio.Seconsideratransferrinadeficienteen
carbohidratosalconjuntoformadoporlasisoformasdi,monoyasialiladasdelaprotena.
Deestamanera,seseleccionaron45pacientescuyosueropresentabaun%CDT>3,valorde
referencia en la poblacin peditrica, a los cuales se les realiz el estudio de 3 protenas
sricas glicosiladas (transferrina, 1antitripsina y apolipoprotena CIII) para poder
clasificarlosenpacientesconCDGI,IIopacientesconDefectosCombinadosenlaNyO
glicosilacin.

4.1.1 Isoelectroenfoque(IEF)deTransferrina(Tf)

CuandoserealizelanlisisdelatransferrinamedianteIEFenindividuoscontrolse
observ un patrn tpico caracterizado por predominio de la isoforma tetrasialilada de la
protena(Fig.9,carrilCyD)mientrasquelos45suerosseleccionadospresentabanpatrones
anmalos:32conunpatrntipo1caracterizadoporaumentodelasformasdiyasialiladas
de la transferrina(Fig.9,carril A) y13 con distintos patronestipo 2, caracterizadosporun
aumentovariabledecualquieradelasisoformashipoglicosiladasdelaprotena(Fig.9,carril
B).

A
5
4
3
2
1
0

D
Figura9.Isoelectroenfoquedetransferrinasrica.
Alaizquierdadelafiguraseindicaelnmerodecidossilicosque
tieneunidacadaisoformadelatransferrina.Apatrntipo1tpico
deCDGI.Bpatrntipo2tpicodepacientesCDGII.CyDpatrones
deindividuoscontrol.

Tipificadas las muestras en patrones tipo 1 y 2, faltaba descartar que esos patrones
anmalos fueran debidos a que los pacientes presentaran una variante aminoacdica o
subtipodelaTfdebidoaunaalteracindelaglicosilacindeformasecundaria.

ParadescartarunavarianteallicadelaTf,serealizeltratamientodelasmuestras
conneuraminidasaysevolvieronaanalizarporIEF.Comolaneuraminidasaproporcionala
transferrina libre degrupossilicos, dejandotodala protenaen estado asialilado, aquellas
muestras que presentaron dos bandas presentaran, en principio, un polimorfismo
aminoacdicoparalamisma(Fig.10).

36

Resultados

A B C D E F

Figura10.Isoelectroenfoquedetransferrinasricatras
el tratamiento con neuraminidasa. A la izquierda de la
figurasesealalabandaquecorrespondealaformaasialilada
delaprotena.A,B,CyDsonmuestrasconlavarianteallica
mscomndelaTf.SinembargoEyFpresentanademsotra
varianteallicaosubtipodelaTf,indicadaconunaflecha.

De los 32 pacientes que presentaron patrn tipo 1 slo uno present una variante
allicadelatransferrina,sinembargodelos13pacientesconpatrntipo2,7presentaronun
polimorfismodelaprotena.

Posteriormente de los 31 pacientes restantes con patrn tipo 1, 3 fueron

diagnosticadoscomodefectossecundariosdeglicosilacin:2Galactosemiasy1Intolerancia
alaFructosa.EnlaTabla10seresumenlosresultadosobtenidosenelIEFdelaTf.

Tabla10.Clasificacindepacientesmedianteelanlisisdetransferrinaporisoelectroenfoque.

PATRN
Tipo 1

Tipo 2

CLASIFICACIN

N de Pacientes

CDG I
POLIMORFISMO AMINOACDICO
GALACTOSEMIA
INTOLERANCIA A LA FRUCTOSA
CDG II
POLIMORFISMO AMINOACDICO

28
1
2
1
6
7

Otra de las aplicaciones del estudio de las isoformas de la Tf srica ha sido el

seguimiento teraputico de un paciente CDG Ib. De esta forma, se analiz el efecto que
producelaadministracinoraldemanosaenelpatrndeglicosilacindeestebiomarcador
(Fig.11).

Fig.11.IsoelectroenfoquedelatransferrinasricadeunpacienteCDG
A B C D

Ib tras recibir tratamiento. A la izquierda se indica el grado de

glicosilacindelasdiferentesisoformasdelatransferrina.A:control.B:
paciente al diagnstico (6 m) con un %CDT en suero de 42%,
4
desnutricin, hepatomegalia (5cm) y anemia microctica. C: paciente (7

m) en tratamiento con manosa a dosis de 150 mg/kg x 4 dosis , en este

2
momento el %CDT srico era 24% y mejora de la curva de peso. D:

paciente6mesesdespusdesubirladosisdemanosaa200mg/kgx4,el
0
%CDT baj al 6%, curva de peso ascendente y estudio de coagulacin
normal.

Los resultados nos muestran que con la administracin oral de manosa no slo
mejoralasintomatologaclnicadelpacientesinotambinlosparmetrosbioqumicos,pues
ademsdeunabajadaenel%CDTpodemosvercomoelpatrndeglicosilacindelaTfse
normaliza.

37

Resultados

4.1.2 IEFde1antitripsina(1AT)
Con el objetivo de analizar de forma complementaria otra glicoprotena srica de
origenheptico,seanalizla1ATsricade30individuoscontrol(Fig.12),de17pacientes
conpatrontipo1enlatransferrinaclasificadoscomoCDGI,de6pacientesconpatrntipo2
enlatransferrinaclasificadoscomoCDGII(Fig.13)ylos8individuosquepresentabanun
polimorfismoaminoacdicoparalatransferrina(Fig.14).

Elresultadoobtenidoenlossueroscontrolmuestraunpatrndeglicosilacindela
1ATmscomplejoqueeldelaTf,conlaaparicindehasta7isoformassialiladas(Fig.12).

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Figura 12. Isoelectroenfoque de 1antitripsina de 30 individuos controles. El patrn tpico presenta de 4 a 7

isoformas.

EntodoslossuerosdelospacientescatalogadoscomoCDGIobservamoslaaparicin
deunaovariasbandascorrespondientesaisoformashipoglicosiladasquenoestnpresentes
enloscontroles.Sinembargo,sloen3delos6suerosdepacientescatalogadoscomoCDG
IIseobservaunadelasisoformashipoglicosiladascaracterstica(Fig.13).

CDG I

CDG II

Figura13.Isoelectroenfoquede1antitripsinadepacientesconunposibleCDGclasificadospreviamentecon
elIEFdelatransferrina.Enlafiguraseindicanconflechaslasbandasdehipoglicosilacinpresentesenlos
pacientesyquenoestnpresentesenloscontroles(C).

Por ultimo, se analizaron los sueros de los 8 individuos que presentan alguna
varianteaminoacdicadelaTf,quecomoeraesperabletodospresentaronunpatrnnormal
para la 1AT (Fig. 14), excepto uno que present una banda de hipoglicosilacin (Fig. 14,
carrilE).Esteresultadopermitisospecharque elpacientepodratenerunCDGyadems
presentarunavarianteallicadelatransferrina.

38

Resultados

A B C D E

Figura14.Isoelectroenfoquede1antitripsinadepacientes
quepresentandistintasvariantesallicasdelatransferrina.
Acontrol.BD,FIpacientesquepresentanpatrnnormal.E
paciente que presenta banda de hipoglicosilacin (indicada
conunaflecha).

F G H I

4.1.3 IEFdeApolipoportenaCIII(ApoCIII)

Se conoce la existencia de defectos combinados de N y Oglicosilacin debido a

deficiencias en algn enzima del aparato de Golgi comn en ambas rutas. Para poder
detectar este tipo de defectos se analiz mediante IEF el patrn de glicosilacin de una O
glicoprotenatipomucina,laapolipoprotenaCIII,enaquellasmuestrasquepresentabanun
patrn tipo 2 de la transferrina ya que los pacientes con defectos en la Nglicosilacin con
deficienciasenenzimaslocalizadasenelaparatodeGolgimuestranalteracionesenelpatrn
deestaglicoprotena.

Analizando 20 sueros de individuos control se determin un patrn tpico normal

caracterizado por la presencia de dos bandas de igual intensidad correspondientes a las
formasdiymonosialiladasdelaprotena.Ademssedetectabaunatercerabandadebaja
intensidadcorrespondientealaformaasialiladadelaApoCIII(Fig.15,carrilA).

Posteriormente, se analizaron un total de 6 sueros de pacientes catalogados como

CDGII,enbuscadeposiblesDefectosCongnitosCombinadosdelaNyOglicosilacin.El
resultado obtenido fue que en todos los casos encontramos un patrn normal, es decir,
ninguno de nuestros pacientes pareca presentar una alteracin de la Oglicosilacin tipo
mucina(Fig.15).

A
2
1
0

G
Figura 15. Isoelectroenfoque de Apo CIII. A
control.BGpacientesclasificadosconCDGIIa
partir del IEF de la Tf. A la izquierda de la
figura se indica el nmero de grupos silicos
unidosalaprotena.

4.1.4 DeterminacindelasactividadesPMM2yPMI

Una vez clasificadoslos pacientes en CDG I y II nuestro propsito fue identificarel

defecto gentico responsable de la patologa en cada uno de ellos. Se procedi primero al
anlisis enzimtico de los pacientes clasificados como CDG I para identificar dos de las
formas ms frecuentes de estos defectos; CDG Ia causado por un defecto en la protena

39

Resultados
fosfomanomutasa 2 (PMM 2) y CDG Ib causado por un defecto en la protena
fosfomanoisomerasa(PMI).

Se realiz la medida de las actividades enzimticas PMM 2 y PMI a partir de

fibroblastos de piel cultivados, segn un mtodo espectrofotomtrico basado en la medida
deNADPHa340nmproducidoporlareduccindelNADPporlaactividaddelaglucosa
6Pdeshidrogenasa(deKoningetal.1998;VanSchaftingenandJaeken1995).

Seanalizaronlasactividadesenzimticasde20delos28pacientescatalogadoscomo
CDG I, del resto de los pacientes no se dispona de fibroblastos de piel en el laboratorio.
Ademsseincluyeronenelestudiofibroblastosde17individuoscontrol.Lasfiguras16y17
muestranlosresultadosobtenidos.
VALORES PMM

Figura. 16. Representacin grfica de la medida de la

actividadPMM2.CadaromboindicalaactividadPMM
2 de los individuos control, los cuadrados la actividad
PMM 2 de los individuos que presentan valores
deficientesyloscrculoslaactividadPMM2delrestode
los pacientes CDG I. Las lneas horizontales sealan los
valores PMM 2 medio de los resultados obtenidos. ***
indicaelgradodesignificacinestadsticaconp<0.001.

20,0

18,0

16,0

PMM (mU/mg)

14,0

12,0

10,0

9.3 + 3.9
8.6 + 4.6

8,0

6,0

***

4,0

1.6 + 0.7

2,0

0,0

VALORES PMI
35,0

30,0

PMM (mU/mg)

25,0

20,0

16.2 + 5.6

15,0

14,7 + 6.3

10,0

***
5,0

3.8 + 1.6
0,0

Figura. 17. Representacin grfica de la medida de la

actividad PMI. Cada rombo indica la actividad PMI de
losindividuoscontrol,loscuadradoslaactividadPMIde
los individuos con valores deficientes y los crculos la
actividadPMIdelrestodelospacientesCDGI.Laslneas
horizontalessealanelvalorPMImediodelosresultados
obtenidos.***indicaelgradodesignificacinestadstica
conp<0.001.

EnloscontrolesseobtuvounvalormediodeactividadPMM2de9.35+3.9mU/mg
deprotenaydeactividadPMI16.2+5.6mU/mgdeprotenayunratioPMI/PMM2de1.9+
0.5.

De la medida de nuestros pacientes con CDG I se obtuvo que 8 presentaban una

actividad PMM 2 significativamente deficiente (p<0.001) entre 0.72.8 mU/mg de protena
total(deun7%aun31%delamediadecontroles)yunratioPMI/PMM2patolgicoentre
3.721, siendo diagnosticados como CDG Ia (Tabla 11). Adems 2 pacientes mostraban
actividadPMIsignificativamentedeficiente(p<0.001),2.64.9mU/mgdeprotenatotal(deun
16%aun30%delamediadecontroles),siendodiagnosticadoscomoCDGIb(Tabla11).El
restodelospacientesconactividadesPMM2,PMIyratioPMI/PMM2dentrodelosvalores
controlfueronclasificadoscomoCDGIx.

40

Resultados
Tabla11.MedidadelasactividadesPMM2yPMIdepacientesCDGI.
PACIENTE

ACTIVIDAD PMM 2
(mU/mg)

PMI
(mU/mg)

PMI / PMM 2

17568

2.8

10.3

3.7

18440

2.0

9.2

4.6

18818

2.0

13.7

6.9

19042

2.2

20.3

9.2

20484

0.9

7.4

8.6

20682

1.5

15.1

10.1

22692

0.7

14.7

21.0

22988

1.3

19.2

14.7

19484

6.2

2.6

0.42

25058

8.5

4.9

0.57

C (n=17)

9.3 + 3.9

16.2 + 5.6

1.9 + 0.5

DIAGNSTICO

CDG Ia

CDG Ib

C corresponde a los media de controles. Las actividades se expresan en mU/mg protena, siendo una mU los
nmolesdeNADPHproducidosporminuto.

4.2 CARACTERIZACINMOLECULARDELOSPACIENTESCON
CDG.

Se realiz la caracterizacin molecular de los pacientes mediante bsqueda de

mutaciones causantes de enfermedad en los genes implicados en cada defecto. En aquellos
pacientes que presentaron una deficiencia en el enzima PMM 2, se realiz el anlisis
mutacional en el gen PMM2. Del mismo modo, en aquellos pacientes que presentaron
actividadPMIdeficiente,porlotanto,diagnosticadoscomoCDGIbserealizunabsqueda
de mutaciones en el gen MPI. En el resto de pacientes catalogados como CDG Ix, y con el
objetivodefinalizareldiagnsticosellevacabounscreeningmutacionalendiversosgenes
de la ruta, en funcin de la sintomatologa, frecuencia del defecto o procedencia de los
pacientes.

4.2.1 Estudio gentico de los pacientes con Defecto Congnito de

GlicosilacinIa:anlisisdelgenPMM2.

Se llev a cabo el estudio gentico del gen PMM2 en un total de 14 muestras. Se

analizaron fibroblastos de piel de los 8 pacientes con deficiencia en la actividad PMM 2
(CDG Ia), sangre en papel de un paciente hermano de uno de los anteriormente citados y
sangre total de 5 pacientes remitidos a nuestro laboratorio nicamente para realizar el
estudiogentico.

Los distintos cambios allicos en el gen PMM2 fueron detectados por secuenciacin
cclicadirectadelcDNAy/oenlosexonescorrespondientesdelgen.Inicialmenteelestudio
molecular se llev a cabo a nivel de mRNA mediante retrotranscripcin y posterior
amplificacin por PCR a partir de RNA total y con oligonucletidos diseados para que
hibridenenlaszonas5UTRy3UTR.Unavezfuerondetectadosloscambiosnucleotdicos

41

Resultados
en el cDNA, el anlisis molecular del gen PMM2 a nivel del DNA genmico permiti
identificar y confirmar la presencia de dichos cambios en los exones correspondientes, as
como determinar el carcter homocigoto o heterocigoto del paciente para cada mutacin.
Paraello,seanalizaronlosexonesylassecuenciasadyacentes,loquenospermitidetectar
el100%delasdistintasvariantesallicaspresentesennuestrospacientes.

Se pudo determinar los genotipos causantes de enfermedad de 14 pacientes

pertenecientesa13familiasnorelacionadas,identificndose18variantesallicasdistintas.Se
encontrunaaltafrecuenciadeheterocigotos,del92%,yaquetanslohayunpacienteque
presentalamutacinT237Menhomocigosis(Tabla12).

Mediante el estudio en DNA de los padres se confirm en trans la presencia de

ambasmutacionesyenelpacientehomocigoto,seconfirmlaausenciadeunadelecinque
comprendieradichamutacin.

Elespectromutacionalencontrado(Fig.18)incluye13cambiospuntualesdeprobable
cambioaminoacdicotodosellosdescritospreviamente(L32R,V44A,D65Y,P113L,R123Q,
R141H,F157S,R162W,F183S,E197A,T237MyT226S(Matthijsetal.2000)yF207Sdescrita
comoF206S(http://www.euroglycanet.org/)).Losnuevoscambiosnucleotdicosencontrados
incluyen 3 mutaciones de probable cambio aminoacdico (D209G, P184T y T118S) y 2 que
afectaran al correcto procesamiento del mRNA (IVS79T>G y IVS31G>C). Se realiz la
bsqueda en 100 alelos normales de los cambios nucleotdicos P184T y T118S por
encontrarseencis,deE197ApuesyasesospechabaqueeraunSNPs,ydeIVS79T>Gpor
su localizacin en el tracto polipirimidnico.La patogenicidad de los 5 cambios nuevos
identificadossecomprob,posteriormente,medianteestudiosfuncionales(seccin4.5).

GEN PMM2
(16p13.2)

NM_000303.1

F157S F183S
R162W P184T
T118S
E197A
L32R
P113L
V44A
F207S
R123Q
D209G
R141H
D65Y

IVS3nt-1 G>C

Mutaciones nuevas
T226S
T237M

IVS7nt-9 T>G

Figura18.RepresentacinesquemticadelaestructuragenmicadelgenPMM2
.Lafiguramuestratodaslas

variantes allicas identificadas en los pacientes CDG Ia analizados en el laboratorio y su localizacin. La

representacin de la estructura del gen se realiz en base a la informacin de la secuencia genmica

ENST00000268261
disponible en las bases de datos pblicas. Las mutaciones nuevas identificadas en este

estudiosedenotanenrojo.

Segn estos resultados encontramos que en los exones 5 y 8 se encuentran las

mutacionesmsfrecuentes(15%)ennuestraseriedepacientesconCDGIa(R141H,T237M)
(Tabla13)yenelexon7encontramoselmayornmerodemutacionesdiferentes.

42

Resultados

Tabla12.Resumendedatosclnicos,bioqumicosygenticosdelos14pacientesconCDGIa

Sexo
Consanguinidad
Edad al diagnstico
Edad actual
(Dic 2008)
Retraso psicomotor
Ataxia
hipotona
Estrabismo
Epilepsia
Microcefalia
Retinitis pigment.
Hiporeflexia
Otros

17568

187591

18440

18818

19042

20484

20682

mujer
no
10a

varn
no
3a3m

varn
no
3a 11m

varn
no
4a 5m

mujer

mujer

14m

mujer
no
10.5m

17a

8a

9a

10a

7a

5a

5a

Leve
IQ71
+
-

Leve-Moderado
IQ75
+
+
+
-

Leve
IQ70
-

Moderado-severo

leve

Moderado

Leve-moderado

+
+
+
+

+
+
+
+

Temblor

temblor

+
+
+
+
+
+
Escoliosis
Infecciones

anorexia

leucocitosis

Anomalas cerebrales

Hipoplasia
cerebelosa y de
vermis

Dismorfias
Mamilas invertidas
Lipodistrofia
Retraso crecimiento
Hepatopata

+ (dcha)
-

Gran cisterna
magna
Hipoplasia
cerebelosa
-

Anomalas cardiacas

Factores coagulacin
Actividad PMM 2
(mU/mg protena)

protena C

protena C

2.8 (31%)*
p.R141H (0%) B
p.R162W (19%)A

Genotipo

10m

+
+
-

Hipoplasia
cerebelosa

Hipoplasia
cerebelosa

Hipoplasia
cerebelosa

Hipoplasia
cerebelosa

GPT

transaminasas

transaminasas
Leve derrame
pericrdico
Antitrombina III

+
+
transaminasas

Normal

+
+
+
transaminasas
Derrame
pericrdico
coagulopata

ND

2.0(22%)*

2.0 (22%)*

2..2 (24%)*

0.9 (9.8%)*

1.5 (16%)*

p.R141H (0%) B
p.R162W (19%)A

p.T237M (48%) B
p.T237M (48%) B

p.D65Y (20%) B
p.R141H (0%) B

p.L32R (51%) B
IVS3-1G>C (0%)

p.T237M (48%) B
IVS7-9T>G (0%)

p.D209G (0%) B
p.P113L (43%) B

1. Hermano del paciente 17568. - Ausente. + Presente. ND. No determinado PMM 2: Fosfomano mutasa 2. * Actividad PMM 2, medida en fibroblastos de piel, respecto a los valores control: 9.3 3.9 (4.5-15.4)
mU/mg protena. A actividad PMM 2 descrita en la literatura (Pirard et al. 1999). B actividad PMM 2 expresada in vitro en el apartado 4.5.1

Resultados

Cont.tabla12.Resumendedatosclnicos,bioqumicosygenticosdelos14pacientesconCDGIa

Sexo
Consanguinidad
Edad al dx
Edad actual
(Dic 2008)
Retraso psicomotor
Ataxia
hipotona
Estrabismo
Epilepsia
Microcefalia
Retinitis pigment.
Hiporeflexia

22692

22988

22514

22764

24086

24728

26032

mujer
no
6.5m

varn
no
5a

mujer

mujer

mujer

mujer

10m

12m

12a

mujer
no
7m

20m/ 5a

3a

7a

4a

4a

15a

2a

6a

Moderado-severo
+
+
+

Leve-moderado
+
+
+
+
+

+
+

+
+

Leve-moderado

Severo
+
+

+
-

+
+
+

Otros

Infecciones

Anomalas cerebrales

Hipoplasia
cerebelosa

Dismorfias
Mamilas invertidas
Lipodistrofia
Retraso crecimiento
Hepatopata
Anomalas cardiacas
Factores coagulacin
Actividad PMM 2
(mU/mg protena)
Genotipo

+
+
+
+
transaminasas

Temblor
polineuropata
Hipoplasia
cerebelosa
y de vermis
+

Trastorno
Oculo
motricidad
Atrofia cerebral
y cerebelosa

Polineuropatia
Sordera
Nistagmus
Atrofia cerebral
+
-

Anemia microctica

Atrofia
cerebelosa
+

+
+
+
+
transaminasas

Normal

Normal

0.13 (6.2%)**

0.8 (39%)**

GPT GOT

Antitrombina III
protena C

Hiper
coagulabilidad

0.7 (7.7%)*

1.3 (14%)*

p.D65Y (20%) B
IVS7-9T>G (0%)

Normal
0.73(35%)**

p.R141H (0%) B p.V44A (16%)B p.F157S (1%) B p.R123Q (0%) B p.T118S+p.P184T (0%) B
p.F183S
p.T237M (48%) B p.F207S (0%) B p.R162W (19%) B
p.P113L (43%) B

0.4 (19%)**
p.R141H (0%) B
p.T226S (23%)C

Ausente. + Presente. ND. No determinado PMM 2: Fosfomano mutasa 2. * Actividad PMM 2, medida en fibroblastos de piel, respecto a los valores control: 9.3 3.9 (4.5-15.4) mU/mg protena. ** Actividad
PMM 2, medida en fibroblastos de piel, respecto a los valores control: 2.07 mU/mg protena (Dra. Chabs). C actividad PMM 2 decrita en la literatura (Vuillaumier-Barrot et al. 2000). B actividad PMM 2
expresada in vitro en el apartado 4.5.1

Resultados

Tabla13.MutacionesidentificadasenlospacientesCDGIayfrecuenciaallica.
EFECTO EN LA
N ALELOS
MUTACIONES*
PROTENA
(frecuencia allica)
c.95TA>GC
L32R
1 (4%)
c.131T>C
V44A
1 (4%)
c.193G>T
D65Y
2 (8%)
c.338C>T
P113L
2 (8%)
[c.353C>G / c.550C>A]
[T118S / P184T]
1 (4%)
c.368G>A
R123Q
1 (4%)
c.422G>A
R141H
4 (15%)
c.470T>C
F157S
1 (4%)
c.484C>T
R162W
2 (8%)
c.548T>C
F183S
1 (4%)
c.620T>C
F207S
1 (4%)
c.626A>G
D209G
1 (4%)
c.677C>G
T226S
1 (4%)
c.710C>T
T237M
4 (15%)
c.640-9T>G (IVS7-9T>G)
p.P213_G214ins22
2 (8%)
c-256-1G>C (IVS3-1G>C)
p.V60Gfs11X
1 (4%)
*Nomenclatura segn nmero de acceso de GenBank: NM_000303 siguiendo las
recomendacionesdeHumanGenomeVariationSociety(http://www.hgvs.org/mutnomen).

SellevacaboelanlisisapartirdeRNAyDNAgenmicoextradosdefibroblastos
depielcultivadosdelasdoslneascelulares,20484y22692.Conelanlisismutacionalenel
cDNAdelgenPMM2seidentificarondosmutacionesmissense,T237Menlalnea20484yla
D65Yenlalnea22692,enamboscasosenhomocigosis(Fig.19A),sinembargoenelDNA
genmico se encontr que dichas mutaciones estaban en heterocigosis. Tras el anlisis de
todoslosexonesysecuenciasintrnicasadyacentesseidentificenambospacientesadems
unamutacin,tambinenheterocigosis,enlaposicion9delintrn7(Fig.19B).

A)
A

B)
B

-9

D65Y
1

T237M

EX3

D65Y

EX8

RT-PCR

IVS7-9T>G

-9

EX8

T237M

EX8

IVS7-9T>G

Figura19.PatrndeRTPCRysecuenciasdelgDNAdedospacientesCDGIa.A)Carril Atranscritoquese
obtiene en controles. Carril B transcrito obtenido en el paciente 22692 portador de la mutacin D65Y en
homocigosis.CarrilCtranscritoobtenidoenelpaciente20484portadordelamutacinT237Menhomocigosis.
B)Secuenciasdelosexonesportadoresdelasmutaciones(indicadasconflechas).

SellevacaboelanlisisapartirdeRNAyDNAgenmicoextradosdefibroblastos
depielcultivadosdelalneacelular19042.CuandoserealizlaRTPCRconelRNAtotaldel
pacienteseencontrlaaparicindedostranscritos,unocontenaunamutacinporcambio
de aminocido (L32R), ya descrita previamente en la literatura (VuillaumierBarrot et al.

45

Resultados
2000), y el otro presentaba la delecin o skipping del exon 3 y exon 4 (Fig. 20, A). Con el
estudio mutacional enDNA genmico se confirm la mutacin missense y se identific un
segundo cambio nucleotdico nuevo en la posicin 1 del intrn 3 del gen PMM2, que
posiblemente afectara al correcto procesamiento del mRNA, IVS31G>C (Fig. 20, B). No se
encontrningunamutacinenelintrn2queexplicaraelskippingdelexon3.

A)
B)

C 19042

EXON 2

L32R

L32R

EXON 4

IVS3-1G>C

2 3 4 5 6 7 8
1
ex4

5 6 7
1
2
8

RTPCR

Figura20.PatrndelaRTPCRysecuenciasdelgDNAdelpaciente19042.A)transcritosqueseobtienen

en el control
(C) y en el paciente 19042. A la derecha se representa los transcritos obtenidos y la mutacin
L32R encontrado
en uno de ellos. B) Secuencias de los exones y secuencias adyacentes portadores de las

mutacionesL32RyIVS31G>C(indicadasconunaflecha).

4.2.2 Estudio gentico de los pacientes con Defecto Congnito de

GlicosilacinIb:anlisisdelgenMPI.

SellevacaboelestudiogenticoenfibroblastosdepieldelospacientesconCDGIb
caracterizadosmedianteladeterminacindelaactividadPMI.

Los distintos cambios allicos en el gen MPI fueron detectados por secuenciacin
cclica directa del correspondiente cDNA y/o gDNA, segn el procedimiento del apartado
anterior.Seidentificaron3variantesallicasyadescritas,2decambiodeaminocido,R219Q
yM51T,yunainsercindeunabase,c.166167insC(Schollenetal.2000a)(Fig.21,Tabla15).

GEN MPI (15q22)

NM_002435.1
M51T (c.152T>C)

166fs ( c.166-167insC)
R56-G57insC

R219Q (c.656G>A)

Figura21.RepresentacinesquemticadelaestructuragenmicadelgenPMI.Lafiguramuestralasvariantes

allicasidentificadasenlospacientesysulocalizacinenlosdiferentesexones.Larepresentacindelaestructura

delgenserealizenbasealainformacindelasecuenciagenmicaENST00000352410disponibleenlasbasesde
datospblicas.

En el estudio mutacional del cDNA del paciente 19484 se identific en el exon 5 la

mutacinmissense,R219Q,enhomocigosisperolacomprobacinenelDNAgenmiconos
mostr que dicha mutacin se encontraba en heterocigosis y identificndose una segunda

46

Resultados
mutacin, una posible insercin de una citosina en el exon 3. La caracterizacin de la
insercin 166167 ins C se realiz mediante la amplificacin por clonaje del exon 3 lo que
permitiestudiarlosalelosporseparado(Fig.22)

B)
A)

Separacin
allica por
clonaje

Exon 3

Figura22.Anlisisdelamutacin166167insCmediante
separacinallicadelexon3delpaciente19484.
A)Secuenciadelexon3amplificadoysecuenciado.B)Secuenciasdeunclonportadordeunacitosinaextra
(indicadaconunaflecharoja)ydeunclonconlasecuencianormal.
Lainsercindeunacitosinaenlaposicin166167delexon3provocalaaparicinde
uncodonstopprematuroqueposiblementeconducealadegradacindedichotranscritopor
elsistemadevigilanciadelaclula(NMD),loqueexplicaquelamutacinR219Qaparezca
enhomocigosisenelcDNA.

MedianteelestudioenDNAdelospadresdecadapacienteseconfirmlapresencia
de ambas mutaciones en posicin trans y en el caso del paciente homocigoto se descart
unadelecinquecomprendieradichamutacin.

4.2.3 Estudios genticos de los pacientes con Defectos Cognitos de

Glicosilacin Ix: anlisis de los genes ALG6 (CDG Ic), DPM1
(CDGIe)yDPGAT1(CDGIj)

Se utilizaron fibroblastos de 10 pacientes que no presentaron deficiencia en la

actividadPMM2niPMIyporlotanto,estabanclasificadoscomoCDGIx.

La secuenciacin del cDNA del gen ALG6 no permiti identificar ningn cambio
causantedeenfermedadenningunodenuestrospacientesenestudio.

Por el contrario, mediante la secuenciacin del cDNA y DNA genmico del gen
DPM1 se identific en homocigosis una mutacin por cambio de aminocido, S248P
(c.742T>C), ya descrita en la literatura (GarciaSilva et al. 2004) en 2 de nuestros pacientes
(Tabla14),siendodiagnosgticadoscomoCDGIe.

47

Resultados

Tabla14.Resumendedatosclnicos,bioqumicosygenticos delospacientes CDGIb,IeyIj.

Sexo
Consanguinidad
Edad al diagnstico
Edad actual
(Dic 2008)
Retraso crecimiento
Retraso psicomotor

19484 (CDG Ib)

25058 (CDG Ib)

21705 (CDG Ie)

23734 (CDG Ie)

22701 (CDG Ij)

Varn
No
7m

Mujer
no

Mujer
si
11a

Mujer
no
2m

Varon
no
15d

5a

17m

16a

2a

Exitus 1.5m

+
severo
PCI, convulsiones,
sordera bilateral
+
Displasia cortical,
Paquigiria.
polimicrogiria
Nistagmo

+
+
+

+
Hiporeflexia, alteracin
coclear bilateral
+ con hipocinesia

Atrofia cerebral

Atrofia ptica

Atrofia papilar

+
-

Alteraciones neurolgicas

Hipotona

Anomalas cerebrales

Alteraciones oculares

Diarrea, atrofia
vellositaria yeyunal

Altaraciones gastrointestinales
Hepatopata

hepatomegalia

Dismorfias

Otros

Factores coagulacin
Alteraciones bioqumicas
Mutaciones identificadas
Ausente.+Presente.

Antitrombina III,
protenas C y S, factor
XI
Transaminasas,
Hipoalbuminemia
R219Q / R56-G57insC

Microcefalia, paladar
gtico, malposicin
dental
Infecciones, luxacin de
caderas

M51T/ M51T

Sordera bilateral

Lipodistrofia general
displejia facial, telecantus
campodactilia,
Deformidades
esquelticas

Hipoalbuminemia

S248P / S248P

S248P / S248P

R301C / L385R

Resultados
PorsecuenciacindelcDNAyDNAgenmicodelgenDPGAT1enelpaciente22701
seidentificaron2mutacionesmissenseidentificadasnuevasenesteestudio,R301C(c.901C>T)
yL385R(c.1054T>G),siendo,porlotanto,diagnosticadocomoCDGIj(Tabla14).

Con el fin de analizar si estos cambios podran estar afectando a la funcin de la

protenaserealizunalineamientomltipleconsecuenciasdeprotenasortlogas,dondese
pudo observar que el cambio aminocidico R301C afectaba a un residuo altamente
conservados y que el cambio L385R aunque afectaba a un residuo menos conservado
ningunadelasespeciespresentabaunaargininaenesaposicin(Fig.23).

R301C

Canis
Equus
H.sapiens
Bos
Gallus
Xenopus
Danio

PRHRIPRLNTKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGNFILKVAASLQLVTVHQSENEDGAFTECN
PRHRIPRLNTKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGTFILKVAESLQLVTVRQSENEDGAFTECN
PRHRIPRLNIKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGTFILKVAESLQLVTVHQSETEDGEFTECN
PRHRMPRLNTKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGTFILKVAENLGLLTVRHSEDEDGAFTECN
PRHRLPRLNPTTGKLEMSYSKFKTKSLSTLGTYILKVVKILHIVDVRSGMDEDGEYSECN
PRHRLPRLDPTNGKLGMSYSKFKSKELSKLGDLIIKVGEVLYVLDVKRAQGEDGQYVEVN
PRHRLPRLQSDTGKLGMSYSKFKQKDLGKLGQLILKVAEKLWVLDVRRGQEGDDEFIECN
****:***: .*** ******* *.*. ** *:**
* :: *: .
*. : * *

359
359
359
359
360
359
357

L385R
Canis
Equus
H.sapiens
Bos
Gallus
Xenopus
Danio

NMTLLNLLLKVLGPMHERNLTLLLLLLQILGSAVTFSIRYQLVRLFYDV
NMTLINLLLKVFGPMHERNLTLFLLLLQILGSAVTFSIRYQLVRLFYDV
NMTLINLLLKVLGPIHERNLTLLLLLLQILGSAITFSIRYQLVRLFYDV
NMTLINLLLKVFGPMHERNLTLLLLLLQVVGSAVTFSIRYQLVRLFYDV
NMTLINFVIKLIGPIHERNLTLLLLLIQVLGSMIAFSIRYQLVRLFYDV
NMTLINFVLKLTGPMHERNLTVLLLFIQVLGSCAAFLVRYQLVRLFYDV
NMTLINLVLKILGPTHERTLTAIMLLMQVLGSAVAFGIRYHLVRLFYDV
****:*:::*: ** ***.** ::*::*::** :* :**:********

408
408
408
408
409
408
406

Figura 23. Fragmento del alineamiento mltiple de diferentes protenas ortlogas a la protena N
acetilglucosaminiltransferasa I humana realizado con el programa informtico ClustalW2 de EBI
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html.LosresiduosafectadosporlasdosvariantesallicasDPGAT1
seencuentransealadosconunaflecha.(*)=Residuosidnticos(:)=sustitucionesconservadas(.)=sustituciones
semiconservadas

Secontinaelestudioenlos7pacientesconCDGIx,delosquetodavasedesconoce
eldefectogentico.

Podemosresumirlosanlisisbioqumicos,enzimticosygenticosutilizadosparael
disgnsticodelosDefectosCongnitosdeGlicosilacinenelsiguientealgoritmo(Fig.24)

49

Resultados

PATRN1

IEFDETRANSFERRINA

PATRN2

IEFDEAPOCIII
MEDIDADELASACTIVIDADES
ENZIMTICASPMM2/PMI

ALTERADO
NORMAL

PMM2
PMI
PMM2YPMI
DEFICIENTE
DEFICIENTE
ANLISIS
NORMALES
(CDGIb)
GENTICODE
(CDGIa)
(CDGIx)
ESTUDIODEL
GENESCOG
RESTODEGENES

RESPONSABLESDE
ANLISIS
ANLISIS
ANLISIS
CDGII
GENTICODELOS
GENTICODE
GENTICODE
GENESALG6,DPM1
PMM2
MPI
YDPGAT1.

Figura 24. Algoritmo diagnstico. El esquema resume los pasos utilizados en el diagnstico de pacientes
conDefectosCongnitosdeGlicosilacin.

4.3ANLISISDELPROTEOMASRICODEPACIENTESCDGIa

Se ha analizado el proteoma srico por electroforesis bidimensional (2DE) de 3

controles y de dos pacientes CDG Ia (20484 y 22692), compuestos heterocigotos de una
mutacinmissense(T237MyD65Y,respectivamente)yunamutacindesplicingIVS79T>G.
En primer lugar, se realiz el anlisis diferencial del proteoma srico mediante 2DE del
paciente 20484, donde observamos la expresin diferenciada de varias isoformas
hipoglicosiladasdeciertasprotenascomotransferrina,1antitripsinay2macroglobulina
respectoauncontrol(Fig.25,Tabla15).

A
B

Figura25. Anlisis protemico de un suero control (A) y suero del paciente 20484 (B). El nmero indica la
protenapicada,tripsinizadayanalizadaporMALDITOF,ycuyaidentificacinseencuentraenlaTabla15.Se
analizaron 100 g de protena total utilizando una tira IPG de 18 cm y pH=310 no lineal en la primera
dimensinygel2Dal10%paralasegundadimensin.Posteriormente,losgelesfueronteidosconplata.

50

Resultados
Tabla15.Protenasidentificadasensuerodelpaciente20484ydeuncontrolpor2DE/MS

N
spot a

N
accesob

Nombre de la protena

Mr / pIc

N masas
buscadas

N masas
correspondidas

% de
cobertura de la
secuencia

MASCOT
score

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

gi|62897069
gi|62897069
gi|62897069
gi|37747855
gi|78101272
gi|1942629
gi|1942629
gi|224224
gi|224224
gi|1942629
gi|1942629
gi|1942629
gi|177827
gi|177831
gi|455970
gi|455970
gi|224053
gi|1620909
gi|1620909
gi|23307793
gi|60810141
gi|224053
gi|224053
gi|224053
gi|224053
gi|1942629
gi|179161
gi|386789
gi|78101268
gi|62113341

Transferrina
Transferrina
Transferrina
Transferrina
Cadena D, Componente C3c complemento
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
1-Antitripsina
Vitamina D-unido a protena
Vitamina D-unido a protena
2-Macroglobulina
Ceruloplasmina
Ceruloplasmina
Albumina
Albumina
2-Macroglobulina
2-Macroglobulina
2-Macroglobulina
2-Macroglobulina
1-Antitripsina
Antitrombina III
Precursor de Hemopexina
Cadena B, Componente C3 del Complemento
Albumin

77049 / 6.61
77049 / 6.61
77049 / 6.61
77049 / 6.97
71190 / 6.82
44250 / 5.37
44250 / 5.37
46731 / 5.35
46731 / 5.35
44250 / 5.37
44250 / 5.37
44250 / 5.37
46645 / 5.42
46645 / 5.43
52950 / 5.34
52950 / 5.34
160805 / 5.95
115471 / 5.43
115471 / 5.43
69401 / 6.13
69484 / 5.92
160805 / 5.95
160805 / 5.95
160805 / 5.95
160805 / 5.95
44280 / 5.37
52618 / 6.32
51545 / 6.57
112940 / 5.55
69087 / 5.85

49
31
40
35
24
23
22
25
13
21
19
13
18
18
14
12
15
12
17
8
10
23
23
13
18
11
19
12
26
15

38
40
30
22
18
9
15
14
8
14
12
7
7
7
11
10
10
10
12
6
7
19
18
11
11
7
13
8
22
8

51
35
42
33
32
20
27
24
18
36
28
14
17
16
25
27
9
9
9
12
14
14
16
9
9
23
27
20
24
13

460
242
307
216
208
87
153
123
89
183
161
89
75
74
137
176
108
112
120
72
82
106
148
154
89
94
140
108
207
79

Nmerodelspotcorrespondientedelafigura25.bNmerodeaccesoalNCBI.cValoresdelpesomolecularypIcalculadosconSWISSPROTdatabase.

Resultados
Tabla16.Protenasidentificadasensuerodelpaciente22692ydeuncontrolpor2DE/MS

N
spot a

N
accesob

Nombre de la protena

Mr / pIc

N masas
buscadas

N masas
correspondidas

% de
cobertura de
la secuencia

MASCOT
score

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

gi|178775
gi|178775
gi|178775
gi|178775
gi|223170
gi|223170
gi|182439
gi|223170
gi|223170
gi|182439
gi|223170
gi|1942629
gi|1942629
gi|82408097
gi|22219267
gi|223170
gi|223170
gi|223002
gi|223002
gi|223002
gi|6990
gi|6990
gi|2347133
gi|2347133
gi|1620909
gi|224053
gi|182424
gi|182424
gi|182424
gi|182424

Proapolipoproteina
Proapolipoproteina
Proapolipoproteina
Proapolipoproteina
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
1-Antitripsina
1-Antitripsina
Antitrombin III
Cadena A, actin+vit. D
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrina
-Fibrina
-Fibrina
1-B-glicoproteina
1-B-glicoproteina
factor B del Complemento
factor B del Complemento
Ceruloplasmina
2-Macroglobulina
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno

28078 / 5.27
28078 / 5.27
28078 / 5.27
28078 / 5.27
46281 / 5.54
46281 / 5.54
49481 / 5.61
46281 / 5.54
46281 / 5.54
50481 / 5.61
46281 / 5.54
44250 / 5.37
44250 / 5.37
49029 / 5.95
51216 / 5.17
46281 / 5.54
46281 / 5.54
50762 / 7.95
50762 / 7.95
50762 / 7.95
51940 / 5.65
51940 / 5.65
85504 / 6.55
85504 / 6.55
115471 / 5.43
160805 / 5.95
69809 / 8.26
69809 / 8.26
69809 / 8.26
69809 / 8.26

33
13
23
18
29
35
28
28
25
23
27
27
28
17
20
19
19
33
25
29
15
14
10
22
23
15
21
28
26
25

20
11
18
13
18
19
15
14
18
16
16
16
16
14
9
13
13
23
18
18
7
8
5
14
17
10
12
14
14
13

56
34
58
37
49
53
48
39
60
56
50
38
36
34
23
44
44
54
50
51
17
19
8
20
17
9
21
25
24
22

235
158
257
174
219
218
181
164
256
226
205
205
184
177
100
181
181
276
233
205
101
123
69
142
177
120
129
138
144
132

Nmerodelspotcorrespondientedelafigura25.bNmerodeaccesoalNCBI.cValoresdelpesomolecularypIcalculadosconSWISSPROTdatabase.

Resultados
Cont.tabla16.Protenasidentificadasensuerodelpaciente22692ydeuncontrolpor2DE/MS

32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46

gi|182424
gi|182424
gi|182424
gi|182424
gi|182424
gi|62897069
gi|15021381
gi|15021381
gi|37747855
gi|47124562
gi|47124562
gi|47124562
gi|47124562
gi|47124562
gi|47124562

47

gi|55669576

48

gi|34785163

49
50
51
52
53
54
55
56

gi|109731812
gi|78101268
gi|80478039
gi|4096840
gi|40737343
gi|78101268
gi|4389275
gi|230284

-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
-Fibrinogeno
Transferrina
Transferrina
Transferrina
Transferrina
Haptoglobina
Haptoglobina
Haptoglobina
Haptoglobina
Haptoglobina
Haptoglobina
Cadena B, A Dimero covalente of
Transtiretina
Componente 1, s subcomponente del
Complemento
Componente 5 Complemento
Cadena B, Componente C3 Complemento
Afamina
Inhibidor de Inter--tripsina
Componente C4B3 del Complemento
Cadena B, Componente C3 Complemento
Albumina
Retinol unido a protena

69809 / 8.26
69809 / 8.26
69809 / 8.26
69809 / 8.26
69809 / 8.26
77079 / 6.68
77049 / 6.81
77049 / 6.81
77079 / 6.97
31381 / 8.48
31381 / 8.48
31381 / 8.48
31381 / 8.48
31381 / 8.48
31381 / 8.48

28
28
24
16
19
42
40
28
22
10
15
11
11
15
15

15
15
15
9
11
29
28
19
12
6
6
6
6
6
11

25
26
26
16
19
41
42
27
17
15
17
17
17
18
31

150
150
164
98
117
330
320
212
119
85
74
83
83
72
120

12843 / 5.33

13

80

130

76684 / 4.86

20

12

19

127

188319 / 6.11
112940 / 5.55
69069 / 5.64
103372 / 6.64
47454 / 5.37
112940 / 5.55
66035 / 5.69
20958 / 5.27

24
22
15
26
22
17
24
11

13
16
12
15
8
16
13
7

8
19
18
14
19
17
21
34

76
162
149
103
78
183
139
91

Nmerodelspotcorrespondientedelafigura26.bNmerodeaccesoalNCBI.cValoresdelpesomolecularypIcalculadosconSWISSPROTdatabase.

Resultados
Posteriormente, se realiz el anlisis del paciente 22692. Para mejorar la resolucin
delanlisis,lossuerostantodelpacientecomodelcontrolfuerontratadospreviamentecon
un kit para eliminar la albumina y la IgG. Los resultados obtenidos nos muestran una
disminucin en la expresin de 5 protenas sricas: antitrombina III, dos componentes del
complemento: cadena B del C3c y C4B3, afamina y retinol. Adems aparece expresin de
distintas isoformas adicionales con hipoglicosilacin en distintas protenas, siendo ms
evidenteenprotenasinvolucradasenlarespuestainmune(fibringeno,haptoglobina,2
macroglobulinayC3delcomplemento),enlosmecanismodecoagulacin(antitrombinaIII
y fibringeno) y de protenas encargadas de la proteccin contra el estrs oxidativo de
tejidos(haptoglobina,2macroglobulina)(Fig.26,Tabla16).

Si atendemos a la protenas que usualmente se analizan por IEF, 1antitripsina y

transferrina,observamosquelastcnicasprotemicaspuedenaportarinformacinadicional
puesenelsuerocontrolseidentificaron8isoformasdiferentessegneltamaoyPI,yenel
paciente 22692 se observaron 2 isoformas hipoglicosiladas adicionales, como ya se haba
descritopreviamente(Henryetal.1997;Millsetal.2001;Millsetal.2003).

Figura26.Anlisisprotemicodeunsuerocontrol(A)ysuerodelpaciente22692(B).Elnmeroindicala
protenapicada,tripsinizadayanalizadaporMALDITOF,ycuyaidentificacinseencuentraenlaTabla16.
Se analizaron 90 g de protena total utilizando una tira IPG de 18 cm y pH=310 no lineal en la primera
dimensinygel2Dal10%paralasegundadimensin.Posteriormente,losgelessetieronconplata.

4.4 CARACTERIZACIN DE LAS LNEAS DE FIBROBLASTOS DE

PACIENTESCDGIa

4.4.1 NivelesdeexpresindelaprotenaPMM2

Se emplearon pellets de fibroblastos de 8 pacientes CDG Ia resuspendidos en un

medioHEPES20mMconKCl25mM,DTT1mMyPefabloc0,2mM.Serealizlaroturay

54

Resultados
eliminacindelasestructurascelularesyserealizWesternblotcargando150gdeprotenas
totales(Fig.27).

C17568188181904220484

39%7%35%12%

***

***

**

C 20682 226922298818440

74%0%19%47%

**

***

**

***

Figura27.NivelesdeexpresindelaprotenaPMM2enfibroblastoscontrolesydepacientesCDGIa.Abajo
se indica el porcentaje de protena inmunorreactiva en cada caso respecto al control cuantificada mediante
densitometralser.***y**indicanelgradodesignificacinestadsticaconp<0.001yp<0.01,respectivamente,
obtenidaanalizandolosresultadosde3ensayosdiferentes.

Segn estos resultados, todas las lneas celulares excepto la 20682, presentan
disminucinsignificativadelosnivelesdeexpresindelaprotenaPMM2,quepodraser
debido o bien a una disminucin en los niveles de expresin del gen PMM2 (inestabilidad
del mRNA) o porque estas mutaciones causen inestabilidad en la protena. Para ello, se
procediaanalizarlaestabilidaddelmRNAmedianteqRTPCR.

4.4.2 NivelesdeexpresindelgenPMM2.

Seestudielefectoquetenanlasdistintasmutacionesdetectadassobrelosnivelesde
expresin del gen PMM2. Para ello, se analiz el mRNA extrado de fibroblastos de piel
cultivados de 8 pacientes con CDG Ia, siempre comparndolo con el mRNA extrado de
fibroblastoscontrol.

En primer lugar, se confirm el buen estado del RNA extrado mediante un

bioanalizador, y a continuacin se realiz la cuantificacin de los niveles del mRNA
mediante la conversin de 1 g del RNA total extrado de cada lnea celular a cDNA y
posterioranlisismediantePCRatiemporeal,utilizandosondasespecficasUniversalProbe.

cantidad relativa mRNA

1,40
1,20

RQ

1,00

0,80
0,60

0,40
0,20

le
s

co
nt
ro

22
69
2
22
98
8

20
68
2
20
48
4

18
84
0
19
04
2

17
56
8
18
81
8

0,00

Figura 28. Cuantificacin de los niveles de mRNA del gen PMM2 mediante qRTPCR. En el eje X se
representalaslneascelularesanalizadasyenelejeYserepresentaelRQdecadalneacelular,siendoRQ=
2CT.CTescalculadocomoladiferenciaentreelCTdelamuestrayelCTdelcontrolinterno,siendoen
este caso del gen de rRNA18S. CT es la variacin existente dentro de la misma lnea en 3 experimentos
distintos..*indicaelgradodesignificacinestadsticaconp<0.05.

55

Resultados
Finalizado el anlisis, el resultado obtenido fue que casi todas las lneas celulares
presentaban niveles cercanos a la normalidad (RQ= 0.691.2), lo que indica que las
mutacionesdetectadasnoparecenafectaralaestabilidaddelmRNA.Slolaslneas20484y
22692 (portadoras de la mutacin IVS79T>G) parecen presentar una pequea disminucin
significativa (p<0.05), RQ=0.640.47 y RQ=0.50.31 respectivamente, en los niveles de
expresin del gen PMM2 (Fig. 28, Tabla 17). Sin embargo, la lnea 19042 portadora de la
mutacinIVS31G>C,causantedelskippingdelosexones3y4quedalugarauncambioen
elmarcodelectura,nopresentdisminucinsignificativaenlaexpresindelgenPMM2.

Tabla 17. Niveles de expresin de la protena PMM 2 y niveles de mRNA del gen PMM2 en las lneas de
fibrobastosdepacientesCDGIa
% ACTIVIDAD
% PROTENA
% EXPRESIN
PACIENTE
GENOTIPO
PMM 2
INMUNORREACTIVA*
GEN PMM2*
20682

p.D209G / p. P113L

16

74

131

17568

p.R141H / p.R162W

30

39

74

18818

p.R141H / p.D65Y

22

63

22988

p.R141H / p.T237M

14

19

97

18440

p.T237M / p.T237M

22

47

73

20484

IVS7-9T>G / p.T237M

10

12

56

22692

IVS7-9T<G / p.D65Y

41

19042

IVS3-1G>C / p.L32R

24

35

70

* % calculado tomando como 100% los niveles obtenidos en controles.

4.5 ANLISIS FUNCIONAL DE LAS VARIANTES ALLICAS

IDENTIFICADASENELGENPMM2.

Es necesario profundizar en el anlisis de los distintos cambios nucleotdicos

mediante su expresin en sistemas celulares y la aplicacin de diversas aproximaciones
experimentales para comprender el mecanismo molecular responsable de su patognesis e
intentarestablecerlarelacingenotipofenotipo.Enelcasodevariantesallicasqueoriginan
un cambio de aminocido, deleciones en fase, codones de parada de traduccin cerca del
original, as como cambios puntuales que afectan a splicing, su efecto es difcilmente
predecible. Por lo que, estos estudios son importantes para diferenciar entre aqullas que
estnasociadasaenfermedadylasquesonpolimorfismos.

La metodologa empleada para este estudio incluye la expresin de mutaciones

missenseenunsistemaprocariotayelanlisisfuncionaldemutacionesdesplicingmediante
minigenes,asicomoelperfiltranscripcionaldelosfibroblastosportadoresdelasmutaciones
desplicing.

56

Resultados

4.5.1Anlisisfuncionaldemutacionesmissense.

Seescogieronparaelestudiolassiguientesvariantesallicas:D209G,P184T,T118S
son variantes nuevas identificadas en este estudio; P113L, F207S, F157S, V44A y T237M
(Matthijsetal.2000)porque,aunquesetratademutacionesyadescritasenlaliteratura,nose
han realizado estudios de expresin que analicen su efecto , R123Q y R141H por estar
descritasconactividad<10%onula(controlnegativo)(Kjaergaardetal.1999;LeBizecetal.
2005;Pirardetal.1999;VuillaumierBarrotetal.2000;Westphaletal.2001);E197A(LeBizec
et al. 2005) para confirmar que es SNP y por ltimo, D65Y y L32R (Pirard et al. 1999;
VuillaumierBarrot et al. 2000; Westphal et al. 2001) que aunque estn descritas en la
literatura comparten genotipo con las mutaciones de splicing nuevas identificadas en este
estudioyerainteresanteconocersilamutacinD65Yafectabaalplegamientodelaprotena,
ya que los fibroblastos portadores de dicha mutacin (22692 y 18818) presentaron niveles
inferioresdel6%deprotenaPMM2conrespectoalcontrol.

Con el fin de analizar el efecto y comprobar la patogenicidad de las distintas

variantes allicas de cambio de aminocido identificadas en el gen PMM2, se realiz en
primer lugar un alineamiento mltiple con secuencias de protenas ortlogas (Fig. 29). Se
observ que todos los cambios aminocidicos encontrados afectaban a residuos altamente
conservados,exceptoel197enelqueapareceuncambiodeglutaminaporalaninaenGallus
gallus,loqueindicaqueesunresiduomenosconservado.

Homo
Canis
Eqqus
Bos
Gallus
Xenopus
Danio
Saccharomyces

L32R

V44A

----MAAPG-----PALCLFDVDGTLTAPRQKITKEMDDFLQKLRQKIKIGVVGGSDFEK
----MAASG-----SALCLFDVDGTLTAPRQKITEEMDGFLQNLRQRIKIGVVGGSDFEK
----MAAPG-----PALCLFDVDGTLTPPRQKITKEMDDFLQKLRQKIKIGVVGGSDFEK
---VMAAPG-----PALCLFDVDGTLTAPRQKITKDMDCFLQKLRQKIKIGVVGGSDFEK
LPAAMAPPER----AVLCLFDVDGTLTAPRQKITAEMAEFLQRLRQKVKVGVVGGSDFEK
----MAQCD------VLCLFDVDGTLTAARQKVTKDMAEFLEELRKRVKVGVVGGSDFEK
--MSGSTVDS----TTLCLFDVDGTLTAARQKATADMHEFLSKLKQRVKVGVVGGSDLDK
--MSIAEFAYKEKPETLVLFDVDGTLTPARLTVSEEVRKTLAKLRNKCCIGFVGGSDLSK
:
.* *********..* . : ::
* .*::: :*.*****:.*

51
51
51
52
56
50
54
58

D65Y
Homo
Canis
Eqqus
Bos
Gallus
Xenopus
Danio
Saccharomyces

VQEQLGNDVVEKYDYVFPENGLVAYKDGKLLCRQNIQSHLGEALIQDLINYCLSYIAKIK
VQEQLGNDVVKKYDYVFPENGLVAYKDGKLLCKQNIQGHLGEALIQDLINYCLSYIAKIK
VQEQLGNDVVEKYDYVFPENGLVAYKDGKLVCKQSIQGHLGEALIQDLINYCLSYISKIK
VQEQLGDDVIKKYDYVFPENGLVAYRDGKLLCKQNIQGHLGEALIQDLINYCLSYIAKIK
IKEQLGDDVVEKFDYVFPENGLVAYKDGKFFSKQNIQSHLGEDVLQDLINYCLSYIAKIK
IKEQLGDDVVEKFDYVFAENGLVAYKDGKFLCKQSIHAHLGEDLLQDIINYCLSYIAKLK
IKEQLGDDVIDRVDYVFAENGLVAYRFGKLHSVQNIQAYLGEDILQEFINFCLNYLSKIK
QLEQLGPNVLDEFDYSFSENGLTAYRLGKELASQSFINWLGEEKYNKLAVFILRYLSEID
**** :*:.. ** *.****.**: ** . *.:
***
:.: : * *::::.
P113L T118S R123Q

Homo
Canis
Eqqus
Bos
Gallus
Xenopus
Danio
Saccharomyces

R141H

111
111
111
112
116
110
114
118

F157S

LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQEERIEFYELDKKENIRQKFVADLRKEFAGKGLT
LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQEERIEFHELDKKENIRQKFVADLRKEFAGKGVT
LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQEERIEFHELDKKENIRQKFVADLQKEFAGKGLT
LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQEERIEFYELDQKENIRQKFVEDLRKEFAGKGLT
LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQEERIEFYELDKKEHIREKFVADLRREFAGKGLT
LPKKRGTFVEFRNGMLNVSPIGRNCTQEERIEFYELDKKEQFRDKFVAELQREFSGRGLT
LPKKRGTFIEFRNGMLNVSPIGRSCSQQERIEFFELDKKEKIRETFVSVLKEEFAGKGLA
LPKRRGTFLEFRNGMINVSPIGRNASTEERNEFERYDKEHQIRAKFVEALKKEFPDYGLT
***:****:******:*******..: :** ** . *::.::* .** *:.**.. *::

171
171
171
172
176
170
174
178

57

Resultados
P184T
Homo
Canis
Eqqus
Bos
Gallus
Xenopus
Danio
Saccharomyces

E197A

F207S D209G

FSIGGQISFDVFPDGWDKRYCLRHVENDGYKTIYFFGDKTMPGGNDHEIFTDPRTMGYSV
FSIGGQISIDVFPDGWDKRYCLRHVENDGYKTIYFFGDKTMPGGNDHEIFTDPRTVGYTV
FSIGGQISFDVFPEGWDKRYCLQHVEKDGYKTIYFFGDKTMPGGNDHEIFTDPRTVGYTV
FSIGGQISFDVFPDGWDKRYCLGHVEKDGYKTIYFFGDKTMPGGNDHEIFTDPRTVGYTV
FSIGGQISFDVFPDGWDKRYCLGIIAEDGYKTIYFFGDKTMPGGNDYEIFTDSRTEGHSV
FSIGGQISFDVFPTGWDKTFCLGILENEGFSKIYFFGDKTMPGGNDYEIYTDSRTIGHSV
FSIGGQISFDVFPEGWDKRYCLGIVEKDSYQHIHFFGDKTMPGGNDYEIFVDPRTIGHEV
FSIGGQISFDVFPAGWDKTYCLQHVEKDGFKEIHFFGDKTMVGGNDYEIFVDERTIGHSV
********:**** **** :** : ::.:. *:******* ****:**:.* ** *:

231
231
231
232
236
230
234
238

T237M
Homo
Canis
Eqqus
Bos
Gallus
Xenopus
Danio
Saccharomyces

TAPEDTRRICELLFSTAPEDTRRICEELFSTAPEDTRRICEELF-AAPEDTRRICEELFCTSPQDTRRICEELFFTSPGETRTICTELFFQ
KSPEDTQRICRELFFS
QSPDDTVKILTELFNL
:* :* *
**

246
246
245
247
251
246
250
254

Figura29.AlineamientomltipledediferentesprotenasortlogasalaprotenaPMM2humanarealizadocon
el programa informtico ClustalW2 de EBI http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Los residuos
afectados por las distintas variantes allicas PMM2 se encuentran sealados con una flecha. (*)= Residuos
idnticos(:)=sustitucionesconservadas(.)=sustitucionessemiconservadas

Posteriormente,serealizaronexperimentosdeexpresininvitrodelaprotenaPMM
2enunsistemaprocariota(E.coli)utilizandoelvectorpDEST15quecontieneensuinteriorel
cDNAdelgenPMM2enfasedelecturaconlaprotenaGST.Mediantemutagnesisdirigida
seobtuvieronclonesquecontienenelgenconlasvariantesallicasenestudioincorporadas.
Previamentealamedidaenzimticaseoptimizelsistema,determinndosequesemediran
500ngdeprotenatotalylasconcentracionesadecuadasdelosreactivosinvolucradosenel
ensayo.Elresultadoobtenidoencadacasosemuestraenlafigura30.

D2
09
G

R1
41
H

R1
23
Q

F2
07
S

P1
84
T

F1
57
S

V4
4A

D6
5Y

P1
13
L

T2
37
M

L3
2R

T1
18
S

E1
97
A

W
T

14000
12000
10000
**

8000
*** ***
***
6000
4000
** ***
2000
*** *** *** *** *** ***
0

Figura 30. Actividades especficas de las enzimas PMM 2 recombinantes salvaje (wt) y mutantes. La

actividad
se expresa en mU/mg de protena, siendo una mU los nmoles de NADPH producidos por
minuto.
***, ** y * indican el grado de significacin estadstica con p<0.001, p <0.01 y p<0.05
respectivamente.

Segn estos resultados, se encontr que el cambio allico E197A presentaba una
actividad PMM 2 cercana a la normalidad (91%), las mutaciones T118S, L32R, T237M y
P113Lpresentabanunaactividadintermediaconunintervalode5444%respectoalvalorde
laprotenasalvaje,lasmutacionesD65YyV44ApresentabanactividadPMM2baja(2116%)

58

Resultados
yporultimo,lasmutacionesF157S,P184T,F207S,R123Q,R141HyD209G,tenanactividad
residualnula(10%).

Para el estudio de la estabilidad de la PMM 2, se analiz por Western blot 1 g de

protenatotalapartirdelmismoextractoobtenidoparalamedidadelaactividad,recogiday
congeladainmediatamente(Fig.31).

90% 113% 103% 21% 45%

T237M

T118S

P113L

R141H

L32R

V44A

E197A

R123Q

**

**
P184T

95%

***
D209G

F157S

WT

***

0% 108% 100% 67% 89%

D65Y

0% 95%

F207S

Figura 31. Estudio de la estabilidad a 37C de las protenas PMM 2 salvaje (wt) y mutantes analizado

mediante Western blot. Arriba se indica la cuantificacin relativa de protena inmunorreactiva

densitometrada
por lser, y abajo la correspondiente mutacin. *** y ** indican el grado de significacin

estadsticaconp<0.001yp<0.01respectivamente,obtenidosmedianteelanlisisdelosresultadosobtenidos

de2ensayos.

En estas condiciones, se pueden distinguir 2 tipos de mutaciones, aquellas que no

producen variacin en los niveles de protena inmunorreactiva (D209G, R132Q, , L32R,
R141H, P113L, T118S y T237M), posiblemente porque sean mutaciones que afecten a la
funcincatalticadelaprotena,yaquellasquesdanlugaraunadisminucinenlosniveles
deprotena(F157S,F207S,V44A,D65YyP184T)quepodranestarafectandoalaestructura
o plegamiento de la PMM 2 causando la prdida de actividad. Como era esperable la
protena portadora del cambio E197A presenta los mismos niveles de protena
inmunorreactivaquelasalvaje(Tabla18).

Tabla18.EfectodelasmutacionessobrelaactividadPMM2yprotenainmunorreactiva.

MUTACION
WT
T118S
L32R
T237M
P113L
R123Q
R141H
D209G
V44A
P184T
D65Y
F157S
F207S

% ACTIVIDAD
RESIDUAL
100
54
51
48
43
0
0
0
16
1
20
1
0

% PROTENA
INMUNORREACTIVA
100
113
89
103
90
108
95
95
67
45
21
0
0

WT indica
la protena salvaje. En azul se indican aquellas mutaciones que parecen afectar a la funcin
cataltica de la PMM 2 y en rojo aquellas que podran estar afectando al plegamiento y/o estructura de la
protena.

59

Resultados
Se realiz una aproximacin experimental mediante la expresin de las protenas
nomalymutantesa26C,paraintentarconseguirunamejoraenlaeficaciadeplegamiento
delaprotena,ysuvisualizacinmediante Western blot. Se estudiaron aquellas mutaciones
que podan estar afectando al plegamiento de la protena (V44A, P184T, D65Y, F157S y
F207S). Se obtuvo un aumento del 4570% de protena inmunorreactiva en las mutaciones
F207S,F157SyP184T(Fig.32).

75%

D65Y

F207S

27%

120

V44A

70%

P184T

WT

91%

F157S

54%

100
80
37C

60

26C

40
20
0
wt

V44A

P184T F157S F207S D65Y

Figura32.EstudiodeestabilidaddelaprotenaPMM 2 a26C. A)WesternblotdelasenzimasPMM2

recombinantes salvaje (WT) y mutantes. Arriba se indica el porcentaje de protena inmunorreactiva
densitometradaporlser.B)Representacingrficadelporcentajedeprotenainmunoreativadetectadaa37
y26CenlasprotenasPMM2portadorasdelasmutacionesenestudio.

Por ltimo, se estudi la estabilidad de las protenas mutantes F157S y F207S

analizndose los perfiles de degradacin a 37C, recogiendo alicuotas del extracto a
intervalos de tiempo de 2 horas hasta un mximo de 24h de incubacin. A partir de la
representacingrficadelosperfilesdedegradacinalolargodeltiemposecalcullavida
mediadecadaunadeestasprotenas,(Fig.33).

V1/2 F157S = 2.1 h

V1/2 F207S = 2.1 h

B)

120
100
% p ro ten a in m u n o reactiva

V1/2 WT = 8.6 h

A)

y = 100e-0,0807x
R2 = 0,9768

80
F157S

60
y = 100e-0,3399x
R2 = 0,9888

40
20

WT

y = 95,941e-0,3274x
R2 = 0,9964

F207S

0
0

10

tiempo (horas)

Figura33.AnlisisdelaestabilidaddelasprotenasPMM 2normalymutantestrassuexpresininvitro
enunsistemaprocariota.A)AnlisismedianteSDSPAGEyposteriorautorradiografadelaestabilidadde
lasprotenassalvaje(WT)ymutantesF157SyF207S.Arribaseindicalavidamedia(V1/2)calculadaencada
caso.B)Representacingrficadelosperfilesdedegracindecadaprotena,conelfindecalculareltiempo
devidamedia,obtenidosapartirdelacuantificacindelosnivelesdeprotenainmunorreactivamediante
densitometralser.

60

Resultados
Los resultados muestran que las protenas mutantes F157S y F207S muestran una
vida media menor que la salvaje revelando una degradacin ms rpida por parte de la
maquinara proteoltica del sistema. Como ha sido descrito previamente, tiempos de vida
mediadisminuidosenprotenaspodranserindicativosdedefectosdeplegamiento(Gamez
etal.2000).

4.5.2 Anlisisfuncionaldelasmutacionesdesplicing.

Enlaposicin9delltimointrndelgenPMM2seencontrlatransversinc.640
9T>G (IVS79T>G), cambio que podra afectar al correcto procesamiento del mRNA por
encontrarse en el tracto polipirimidnico del ltimo intrn del gen. Se analiz el perfil
transcripcionalenfibroblastosdepieldelospacientes(20484y22692)diseandounprimer
especfico(PMM2B)quehibridaraconelfinaldelintrn7yelprincipiodelexon8yqueno
modificara el cambio nucleotdico en la posicin 9, con el propsito de rescatar algn
posibletranscritoproductodeunprocesodemaduracindelmRNAalterado(Fig.34).
T

Exon 7

ag

gt

TAA

ttcgtgGctttccag GGTGGCAATGACCATGAGAT
Exon 8

PMM2B

IVS7-9T>G (c. 640-9T>G; r.639_640ins66 ; g. 49881T>G)

Figura34. Representacin esquemtica de la mutacion IVS79T>G. Se indican los exones en cajas y la
posicin
del primer PMM2B utilizado para el rescate de transcritos aberrantes. Se indica el cambio
nucleotdicoenunrecuadro.

Elresultadoobtenido,medianteRTPCR,fuequeenambospacientesserescatabaun
transcritoqueestausenteenindividuoscontrol,loqueindicabaquenoerapartedelfondo
desplicing(Fig.35).Estetranscritocontenaunainsercinde66pbdebidaalaactivacinde
unsitiocrpticodesplicingenlaposicin67delintrn7delgenPMM2yportabaelcambio
T>G en la posicin9 del intrn 7, demostrndose, as, quees productode la transcripcin
del alelo mutante. A nivel de protena, esta activacin provocara una insercin de 22
aminocidos.

A)

B)

66pb del INTRN 7

E7

E8

--Anlisis RT-PCR

SecuenciacinRTPCR

Figura35.AnlisisdelperfiltranscripcionaldelaslneascelularesportadorasdelcambioT>Genlaposicin9
delintrn7delgenPMM2(20484y22692).A)Carriles1,3y5correspondenalosproductosobtenidosconlos
primers PMM2F y PMM2R de la lnea 20484, 22692 e individuo control, respectivamente. Carriles 2, 4 y 6
sealadosconcrculosrojos,correspondenalosproductosobtenidosapartirdelRNAdelaslneas20484,22692e
individuo control con el primer PMM2E8, respectivamente. Se observ ausencia de amplificacin a partir del
mRNAcontrol.B)SecuenciadelostranscritosobtenidosenpacientesmediantelosprimersPMM2FyPMM2E8.

61

Resultados
Serealizunaestimacininslicodeloquepodraestarocurriendoenelprocesoyse
observqueelaceptordesplicingsalvajeprcticamentenopierdeefectividadbajando,elscore
deun0.98aun0.92enelmutante,mientrasqueelaceptorcrpticodesplicingpresentaun
scoredel81(Fig.36).

Exon 7 0.97
Exon 8
0.92
0.81
GGT....TAA

....CCA gt.... ccag gg

..........g.. ag
P213
G214

Exon 7
Exon 8

...CCA
Ins 66 bp
GGT....TAA

Figura 36. Representacin esquemtica del posible efecto producido por la mutacin IVS79T>G. Se
indican los exones en cajas, as como algunos codones y los aminocidos que codifican. El cambio

nucleotdicoapareceenunrecuadro(mutantenormal).Elefectoenlasecuenciacodificantesemuestraen
la parte
inferior de la figura. En rojo se indica la probabilidad de splicing de cada sitio donador y aceptor
estimadainformticamente(18Hhttp://www.fruitfly.org/seq_tools/other.html).

B)

IVS79G

IVS79T

Paracomprobarquelatransversinc.6409T>G(IVS79T>G)localizadaeneltracto
polipirimidnico del ltimo intrn del gen PMM2 no es un SNP, si no que es la causa del
procesamientoaberrantedelmRNA,yporlotanto,escausantedeenfermedad,serealizel
estudiomedianteminigenes.DebidoaqueelexonenestudioeselltimodelgenPMM2,se
requiri realizar una construccin del exon 8 unido a otro exon del mismo gen que nos
aportaraeldonador5desplicing(Abuhatziraetal.2005).Estaconstruccinseintrodujoenel
vectorpSPL3ysetransfectaronclulashumanasHep3B.

Conlacaracterizacindelamutacinmedianteminigenesseobservqueelcambio
IVS79T>G provoca una alteracin total del procesamiento del mRNA, pues no aparece
ningun transcrito resultado del alelo mutante con la inclusin del exon hbrido 8/2. Sin
embargo,esteresultadonoseajustaaloencontradoenlospacientespuesnoseactivaelsitio
crpticoyporlotanto,noseinsertanlas66pb(Fig.37).

T
SA2
A) SD6

G
V
AG Ex8 Ex2 GT
V

Ex8-EX2

Figura 37. Anlisis funcional de la mutacin IVS79T>G por minigenes. A) Esquema de la construccin
introducidaenelvectorpSPL3.B)LafiguramuestraelpatrndeRTPCRylasecuenciadelosfragmentos
obtenidosresultadodelosminigenesnormalymutante.ParalaRTPCRseutilizaronprimersespecficosdel
vector(SD6ySA2).V=secuenciaexnicadelvector.

62

Resultados
Enelintrn3delgenPMM2seidentificlamutacinc.2561G>C(IVS31G>C),que
consisteenlainversin G>Cenlaposicin1,nucletidoinvariabledentrodelasecuencia
consensodelsitio3aceptordesplicing.Elanlisisdelperfiltranscripcionaldelalneacelular
delpacienteaniveldeRNAmensajero,muestraelskippingdellosexones3y4provocando
un cambio en la fase de lectura de la traduccin, que da lugar a una posible protena
truncadadebidoalaaparicindeuncodonstopprematuro(Fig.38).

Cuandoserealizunestudioinsilicodeloquepodraestarocurriendoenelproceso,
se observ que debido a la mutacin el aceptor de splicing salvaje del intrn 3 pierde
efectividadbajandoelscoredeun65%aun0%enelmutante,yqueelaceptordesplicingdel
intrn2tieneunscoredeun18%loquepodraexplicarelskippingdelosexones3y4(Fig.
38).

0 g
0.96
0.83
0.94 Exon 5
Exon 4
Exon 3
..............
..GAT G gt .......... .... ag TGG....CAG gt
ac AAT....GAG gt.... ag G GGT..
D59
G117 T
Exon 2 Exon 5
Cambio del marco de
.GAT G GG GTA..
lectura
D59
G117

Exon 2 0.86

0.18

IVS3-1G>C (c.256-1G>C; r.179_347del; g.7007G>C)

Figura38.RepresentacinesquemticadelposibleefectoproducidoporlamutacionIVS31G>C.Seindicaen
cada caso los exones delecionados y los exones adyacentes, as como algunos codones y los aminocidos que

codifican.Elcambionucleotdicoapareceenunrecuadro.Elposibleefectoenlasecuenciacodificantesemuestra
inferior de la figura. En rojo se indica la probabilidad de splicing de cada sitio donador y aceptor
en la parte

estimadainformticamente(19Hhttp://www.fruitfly.org/seq_tools/other.html).

Para estudiar si el cambio nucleotdico en la posicin 1 del intrn provoca una

alteracinenelprocesamientodelmRNAsiendocausantedeenfermedad,seconstruyun
minigenquecontenaelexon3consuaceptor3correspondiente,elintrn3yelexon4con
sudonador5(Fig39,A).SeobservqueelcambioIVS31G>Cprovocaunaalteracintotal
delprocesamientodelmRNA,puesnoapareceninguntranscritonormalresultadodelalelo
mutante.Ademsseobserva,comoocurreenlasclulasdelpaciente,quecasilatotalidad
delostranscritosgeneradossufrenademsskippingdelexon3.Enelcasodelalelosalvajese
produde mayoritariamente la inclusin de los exones 3 y 4, pero tambin aparecen
transcritosconskippingdelexon3debidoaladebilidaddel3ssdelintrn2(Fig.39,B)

Recientemente se ha descrito una mutacin inusual en este tipo de defectos. El

paciente es un compuesto heterocigoto de una mutacin missense c.691G>A (V231M)
(Schollenetal.2007)yunamutacinpuntualenlaposicin15479delltimointrndelgen
PMM2. Se trata de la transversin c. 64015479C>T (IVS715479C>T), cambio que parece
afectaralcorrectoprocesamientodelmRNAporactivacindeunsitio5donadordesplicing,
generandounainsercindeunpseudoexnde123pbentrelosexones7y8(Fig.40).

63

Resultados

A)

SD6

AG

SA2

AC

GT

IVS31C

IVS31G

B)

Ex3-EX4

EX4

EX3

Figura39.AnlisisfuncionaldelamutacinIVS31G>Cporminigenes.A)Esquemadelfragmentode

gDNA
introducida en el vector pSPL3. B) La figura muestra el patrn de RTPCR y la secuencia de los
fragmentosobtenidosresultadodelosminigenesnormalymutante.ParalaRTPCRseutilizaronprimers

especficosdelvector(SD6ySA2).V=secuenciaexnicadelvector.

C
SCORE

0.88

Exon 7 gt

ag CTACT

0.94
GCCTGA gTaggttgtgtttgtgatg

a Exon 8

AMOB
IVS7nt-15479C>T (c.640-15479C>T; r.639_640ins123 ; g.34411C>T)
Figura40. Representacin esquemtica de la mutacion IVS715479C>T que afecta al procesamiento del

mRNA.SeindicanlosexonesypseudoexnenrecuadrosylaposicindelAMOButilizadoparabloquearel
splicing.Loscambiosnucleotdicosaparecenenunrecuadro.Enrojoseindicalaprobabilidaddesplicingde

cadasitiodonadoryaceptorestimadainformticamente(20Hhttp://www.fruitfly.org/seq_tools/other.html).

Sellevacaboelanlisisfuncionaldelamutacinc.64015479C>Tmedianteelvector
pSPL3 conteniendo el pseudoexn y sus secuencias adyacentes (Fig. 41 A), con ello se
pretendacomprobarqueesecambionucleotdicoprovocabalainsercinde123pb,yenque
porcentajedetranscritoslohaca.

Los resultados obtenidos se ajustaron a lo observado in vivo (Schollen et al. 2007), es

decir, el cambio nucleotdico provoca un splicing aberrante por la creacin de un sitio
crptico,generndoselainsercindeunpseudoexnde123pbentodoslostranscritos(Fig.
41B).

64

Resultados

AG

PSEUD.

SA2

GT

123pb

IVS7640C

B)

SD6

IVS7640T

A)

RTPCR

Figura 41. Anlisis funcional de la mutacin c.64015479C>T por minigenes. A) Esquema del fragmento de

gDNAintroducidoenelvectorpSPL3.B)LafiguramuestraelpatrndeRTPCRylasecuenciadelosfragmentos
obtenidos resultado de los minigenes normal y mutante. Para la RTPCR se utilizaron primers especficos del

vector(SD6ySA2).V=secuenciaexnicadelvector.

4.6 ESTUDIO DE TERAPIAS ESPECFICAS DE MUTACIONES DE

SPLICING.

Seplantearon2alternativasquepudieranseraplicadasenlasmutacionesdesplicing:la
sobreexpresin de distintos factores de splicing con la intencin de modular el proceso de
maduracin del mRNA y recuperar transcritos correctamente procesados, en aquellas
mutaciones que tienen afectadas las secuencias consenso implicadas en este proceso, y la
aplicacindeoligonucletidosantisentidoconlaintencindebloquearaceptoresodonadores
desplicingimplicadosenlaexonizacindesecuenciasintrnicas.

4.6.1 Efecto de la sobreexpresin de factores de splicing sobre

mutacionesqueafectanalprocesamientodelmRNA

Algunas mutaciones de splicing pueden dar lugar a niveles detectables de mRNAs

correctamente procesados, generndose ciertos niveles de protena normal. Se ha
demostrado en diversos trabajos que la sobreexpresin de factores de splicing y diversas
drogas incrementan los niveles de mRNA correctamente procesado (NissimRafinia et al.
2004). Se procedi a estudiar el efecto que podra tener la sobreexpresin de distintos

65

Resultados
factores de splicing sobre las mutaciones IVS79T>G y IVS31G>C identificadas en el gen
PMM2queafectanalcorrectoprocesamientodelmRNA.

Debido a que la mutacin IVS79T>G parece estar localizada en el tracto

polipirimidnico del intrn 7 del gen PMM2, se pens que podra estar afectando la unin
del factor de splicing U2AF65 (Tronchere et al. 1997; Zuo and Maniatis 1996). Adems, est
descritoqueunasobreexpresindelosfactoresdesplicingSC35ySF2/ASFparecetenerun
efecto activador de splicing normal en mutaciones que se encuentran localizadas en esta
regin (Manley and Tacke 1996). Por este motivo, se realiz un estudio cotransfectando
clulasdehepatomaHep3Bconelminigencorrespondienteydistintosfactoresdesplicing
(U2AF65, SC35, SRp40, SRp55 y SF2/ASF). Los resultados mostraron que con la
sobreexpresin de los factores SC35 y SF2/ASF aunque no se consigue la activacin del
splicingnormalsserecuperaeltranscritoportadordelainsercinde66pbqueseobservaba
enelperfiltranscripcionaldelospacientes(Fig.42).

66pb

Ex8

SF2/ASF

SRp55

SRp40

SC35

IVS7-9G

IVS7-9T

U2AF65

IVS7-9G

IVS7-9T

66 pb E8-E2

Figura 42. Efecto de la sobreexpresin de factores de splicing sobre la mutacin IVS79T>G. La figura

muestraelpatrndeRTPCRresultantedelatransfeccinconlosminigenesportadoresdelalelonormaly
junto con factores de splicing. Para la RTPCR se utilizaron primers especficos del vector (SD6 y
mutante

SA2).V=secuenciaexnicadelvector.

U2AF65

U2AF35

IVS3-1C

IVS3-1G

Delmismomodo,comolamutacinIVS31G>Cpareceestarafectandotambinala
unin de los factores U2AF65 o U2AF35, se realiz un estudio cotransfectando clulas de
hepatomaHep3Bconelminigencorrespondienteydichosfactoresdesplicing.Elresultado
obtenido fue que con la sobreexpresin de U2AF65 se produjo la activacin del aceptor de
splicing dbil(score=0.18)del intron 2pero no se compens lamutacin, niserecuperel
splicingnormaldelintrn3(Fig.43).

EX3

Figura 43. Efecto de la sobreexpresin de factores de splicing sobre la mutacin IVS31G>C La figura
muestra el patrn de RTPCR resultante de la transfeccin con los minigenes portadores del alelo normal y
mutantejuntoconfactoresdesplicing.ParalaRTPCRseutilizaronprimersespecficosdelvector(SD6ySA2).
V=secuenciaexnicadelvector.

66

Resultados

4.6.2 Usodeterapiaantisentidotipomorfolino(AMOs)enmutaciones
causantesdeexonizacindesecuenciasintrnicas.

Los alelos portadores de mutaciones intrnicas, como la IVS715479C>T, con

activacindesitioscrpticosdesplicing,sonparticularinteresantesparaintentarunaterapia
gnica basada en el bloqueo del sitio de splicing aberrante quedando el sitio salvaje intacto
recuperndoseelsplicingnormal.

Para comprobar la patogenicidad de la mutacin IVS715479C>T, que provoca la

insercin de 123 pb, adems de los estudios funcionales con los minigenes descritos
anteriormente, se disearon dos oligonucletidos antisentido (AMOs) que bloquearan
estricamenteelsitio5o3desplicingdelpseudoexnconelobjetivoderecuperarelsplicing
normal,yconellolafuncionalidaddelaprotena.Setransfectaronfibroblastosdelpaciente
con los oligonucletidos antisentido (AMOs) a distintas concentraciones y se monitoriz el
efectomediantelosanlisisdelperfiltrancripcionalydeexpresinyactividaddelaprotena
PMM2.

CuandoseanalizelefectoqueproducalatransfeccinconAMOs(AMOAyAMOB)
sobre clulas del paciente a distintas concentraciones, se obtuvo como resultado que a una
concentracin de 20 M se recuperaba totalmente el splicing normal, obtenindose la
amplificacin de un solo transcrito que contena la mutacin V231M en heterocigosis (Fig.
44).ConambosAMOsseobtuvoelmismoresultado,siguiendoelestudiosloconAMOB.

A) 0 10 20
M
Figura 44. Perfil transcripcional del paciente
CDG Ia obtenido tras la transfeccin con
AMOs. A) Se realiz el estudio a partir de
fibroblastos de piel del paciente sin tratar (0) y
tratados con AMO A o B a 10m y 20 M
durante24h.Paraelanlisissehautilizadoun
primer localizado entre el exon 6 y 7 y otro
localizado en la zona 5UTR. El transcrito
amplificado
se
ha
identificado
por
secuenciacincclicadirecta.B)Secuenciadela
banda inferior en la que aparece la mutacin
V237Menheterocigosis.

ex7 123pb ex8

ex7

ex8

B)

Una recuperacin del splicing normal deba corresponderse con un aumento en la

expresindelaprotenaPMM2.Paracomprobarlo,serealizunestudiomedianteWestern
blotdefibroblastosdelpacientetransfectadosconAMOBaunaconcentracinde20Me
incubados durante 48 horas. Con este estudio pudimos observar un aumento del 14% de
protenainmunorreactiva(Fig.45).

0
9%

20
23%

PMM2

Figura45. Aumentodelaexpresindelaprotena
PMM 2 tras el tratamiento con AMO B detectado
medianteWesternblot.Serealizelestudioapartir
de clulas del paciente sin tratar (0) y tratadas con
AMO B 20 M durante 48 h. C = fibroblastos
control.

67

Resultados

m U /m g

Porltimo,unaumentoenlaexpresindelaprotenaPMM2sedebacorresponder,
tambin,conunaumentoenlaactividaddelamisma.Paraello,setransfectaronfibroblastos
delpacienteconoligonucletidosantisentido(AMOB)a20Mdurante48hysemidila
actividadPMM2segnelmtododeVanSchaftingenetal.,1995modificadoporDeKoning
etal,1998(Fig.46).

15,0

Figura 46. Correccin de la actividad PMM 2 tras el

tratamientoconAMOB.Serealizelestudioapartir
declulasdelpacientesintratarytratadasconAMOB
20Mdurante48h.C=fibroblastoscontrol.**indica
el grado de significacin estadstica con p<0.01 en la
recuperacindelaactividad.

10,0

**

5,0

0,0
C

20

Coneltratamientoconmorfolinosconseguimosunaumentoaldobledelaactividad
PMM 2 y con ello, una actividad estadsticamente significativa cercana a los valores
normales.

68

5.DISCUSIN

Discusin

En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterizacin bioqumica y molecular de

pacientesconDefectosCongnitosdeGlicosilacin,ascomolacaracterizacinyelestudio
funcionaldelasvariantesallicasencontradas.Conellosepretendeampliarelconocimiento
deestetipodedefectosyastenerlaposibilidaddeprofundizarenlaaplicacindenuevas
estrategiasdiagnsticasyteraputicas.

5.1 DIAGNSTICO Y CARACTERIZACIN DE PACIENTES CON

DEFECTOSCONGNITOSDEGLICOSILACIN

Durantelosltimos20aos,investigadoresclnicosybioqumicoshancolaboradoen
laidentificacindemsdeunaveintenadeenfermedadesgenticas,losDefectosCongnitos
de Glicosilacin (CDG), causadas por algn defecto en la ruta de la Nglicosilacin de
protenas. Este grupo de enfermedades presenta un amplio espectro de manifestaciones
clnicasqueabarcanmultitudderganosytejidos.Sehandescritoenlosindividuosafectos
alteraciones visuales, gastrointestinales, endocrinas, hepticas, del sistema inmunitario, del
proceso de coagulacin, alteraciones del sistema nervioso y malformaciones. La
heterogeneidad de estas manifestaciones clnicas hace difcil el diagnstico clnico, siendo
necesaria la puesta a punto de diversas tcnicas bioqumicas y genticas para llegar a un
diagnsticocertero.

Inicialmente,serealizunscreeningmediantelacuantificacindel%CDT(porcentaje
de transferrina deficiente en carbohidratos) en sueros de pacientes remitidos desde
hospitalesdelaComunidaddeMadridyotrascomunidadesautnomasparaelestudiode
enfermedades metablicas hereditarias, con el fin de seleccionar de forma rpida pacientes
candidatos a tener un CDG. Durante el desarrollo de este trabajo se ha puesto a punto un
conjuntodeanlisisbioqumicos,enzimticosymolecularesquehapermitidoeldiagnstico
de26pacientesconCDGIendistintossubgrupos14pacientesCDGIa,2CDGIb,2CDGIe,
1 CDG Ij y 7 pacientes CDG Ix en los que no se conoce an el defecto gentico. El
conocimiento del espectro mutacional de estas enfermedades genticas adems de un valor
diagnstico tiene un valor teraputico aadido, ya que existen terapias especficas de
mutacin.AdemssehainiciadoelestudiodelproteomasricodepacientesCDGIa,loque
podraserdeutilidadenlabsquedadenuevosmarcadoresbioqumicosparaeldiagnstico
ynuevasdianasteraputicas.

Enprimerlugar,seclasificaronlospacientesconelestudiodelgradodeglicosilacin
de ciertas glicoprotenas sricas como son la transferrina, 1antitripsina y apolipoprotena
CIIImedianteIEF.

Elanlisisdelatransferrinapermitiidentificar45posiblespacientesCDGconalgn
tipo de defecto de glicosilacin, bien secundario a otra enfermedad, bien causado por una
variantepolimrficade lapropiaprotenaobienunautnticoCDG.Latransferrinaparece
serelbiomarcadorporexcelenciadeestetipodedefectos,yaquelapresenciadeunpatrn
anmalo de sus isoformas sricas permite identificar a los pacientes y adems, segn la
tipologa del patrn alterado, clasificarlos en CDG I o II, es decir, en aquellos que

70

Discusin
posiblemente presenten un defecto en el ensamblaje y transferencia del LLO (tipo I) o en
aquellosquepuedenpresentareldefectoenlasposterioresmodificacionesdelglicanounido
alaprotena(tipoII)(Grunewaldetal.2002).Medianteeltratamientoconneuraminidasade
lossueros,yportanto,laeliminacindeloscidossilicos,pudimosdiscriminarsielpatrn
alterado de la Tf se deba a la existencia de una variante aminoacdica o subtipo de dicha
protena,loquepodraconfundireldiagnstico.

Complementariamente, el anlisis de las isoformas de la 1antitripsina srica

medianteIEFhaayudadoaladeteccindepacientesquepresentabanunpatrndudosode
la transferrina. De hecho, en un paciente (19042) en el que se haba observado un patrn
dudoso en la Tf en suero y en el que se haba verificado la existencia de una variante
aminoacdica de la misma, se observ la presencia de bandas de hipoglicosilacin en el
anlisisdela1antitripsina,loquecorroborlasospechadeunCDG.Finalmente,elestudio
enzimticoygenticoconfirmundefectoenlaenzimaPMM2(CDGIa).

Se ha observado que todos los pacientes con sospecha de CDG I presentaron un

patrn alterado de las isoformas de la 1antitripsina, sin embargo, slo la mitad de los
pacientestipificadoscomoposiblesCDGIIpresentaronalteracindeestaprotena.Todava
nosehalocalizadoeldefectogenticoenestosltimos,porloquenosabemossielpatrn
normal de la 1antitripsina srica de algunos pacientes tipificados como CDG II se
correspondeconelhechodequerealmentenosonpacientesCDGylaalteracindelpatrn
delatransferrinaessecundariaaotrapatologa.Porotrolado,laincoherenciaderesultados
entreestasdosglicoprotenashepticastambinpodraestarrelacionadaconlagravedaddel
defectodeglicosilacindelospacientes,yaquelatransferrinaesunmarcadormssensible
para detectar la hipoglicosilacin que la 1antitripsina (Fang et al. 2004). Esta mayor
sensibilidad, adems, nos ha permitido valorar la evolucin bioqumica de uno de los
pacientes con deficiencia en la enzima PMI (CDG Ib) al ser tratado con manosa,
observndosecomosecorrigeelpatrnanmalodelasisoformasdelatransferrinaalolargo
de los meses de tratamiento, lo que confirma la adecuada glicosilacin de sus protenas
(Hendrikszetal.2001).

DebidoaquelasrutasdelaNylaOglicosilacindeprotenascompartenenzimasy
transportadoresen el aparato de Golgi,se han descrito pacientes que presentan un defecto
simultneoenambasrutas.Estospacientestienenundefectoenalgunadelassubunidades
del complejo conservado oligomrico de Golgi (COG), implicado en la regulacin,
compartimentalizacin,transporteyactividaddevariosenzimasdelaparatodeGolgi,oen
algunostransportadoresdeazcares,presentanundefectocombinadofcilmentedetectable
por el anlisis de la transferrina y de la Apo CIII, lipoprotena Oglicosilada tipo mucina
(Foulquier et al. 2006; Spaapen et al. 2005). Finalmente, el estudio mediante IEF de las
isoformasdelaapolipoprotenaCIIIsricadelos6pacientestipificadoscomoCDGtipoII
descartlaexistenciadeestetipodedefectos(Albahrietal.2006)entrenuestrospacientes.

La determinacin de las actividades PMM 2 y PMI en fibroblastos de piel de

pacientes CDG I permiti diagnosticar 8 pacientes con CDG Ia. Aunque est descrito en la
literatura que la actividad PMM 2 en fibroblatos de pacientes puede solaparse con la de
controles (Niehues et al. 1998; Van Schaftingen and Jaeken 1995), en nuestra experiencia,

71

Discusin
todos los pacientes CDG Ia presentaron una actividad PMM 2 en fibroblastos de piel
deficientedel8al31%respectoalvalorcontrolyunratioPMI/PMM2patolgicode2a10
vecesmayor,quenospermitirealizarundiagnsticoprecisodeldefecto.Elhechodeque
no hayamos identificado pacientes con actividades menores del 8% junto con que no se
hayan descrito pacientes homocigotos para mutaciones nulas (Pirard et al. 1999) parece
corroborar que es esencial para la vida mantener cierta actividad residual de glicosilacin.
Este hecho es apoyado por estudios realizados en ratones knockout para PMM2 donde se
demostrabaquelagestacinsedetenaalospocosdasdelafecundacin(Thieletal.2006).
Tambin se diagnosticaron 2 casos con CDG Ib que presentaban una actividad PMI
deficiente del 16 al 30% respecto a la media de controles. Estos pacientes presentaban una
sintomatologa clnica diferente a los pacientes CDG Ia, ya que no padecan sntomas
neurolgicossinosntomasgastrohepticos.EselnicotipodeCDGIquetienetratamiento
efectivoenlaactualidadyunavezconfirmadoeldefecto,seadministrmanosaoralmente
que ha resultado en la remisin de gran parte de la sintomatologa tpica y en una buena
evolucin psicomotora y mental. Esto confirma lo ya observado en otros casos de que la
aportacindemanosaaladietapromuevelavaalternativaatravsdelahexoquinasapara
lasntesisdemanosa6P,siendountratamientoeficazparaestetipodedefecto(Hendriksz
etal.2001;Niehuesetal.1998)
El anlisis molecular de los pacientes ha permitido confirmar el diagnstico en
individuossintomticospreviamenteidentificadosmedianteensayosenzimticos.Ademsha
permitido llevar a cabo el diagnstico prenatal gentico en familias con hijos afectados y el
diagnsticodeportadoresenindividuosasintomticosconantecedentesfamiliares.Duranteel
transcurso de este trabajo se ha realizado el diagnstico prenatal en 4 familias previamente
genotipadasyelestudiodeportadoresencasiuncentenardefamiliares.
En este estudio se ha llevado a cabo la caracterizacin molecular de los pacientes
previamenteclasificadosenCDGIayIb.Elanlisisgenticodelos14pacientesCDGIaha
permitido definir un espectro mutacional del gen PMM2 formado por un total de 18
variantes allicas: 13 descritas (L32R, D65Y, T237M, V44A, P113L, R123Q, R141H, F157S,
R162W,F183S,E197A,F207SyT226S),todasporcambiodeaminocido(Matthijsetal.2000),
y5nuevas,3presumiblementeporcambiodeaminocido(D209G,P184TyT118S)quenose
encontraronenlasbasesdedatosdeSNPsniencontroles,y2mutacionesintrnicas,IVS7
9T>GyIVS31G>CqueparecenafectaralprocesodemaduracindelmRNA.

Elprimerindiciodequeuncambioaminoacdicoescausantedeenfermedadesporque
ocurre en algn residuo conservado de la protena, es decir, en dominios esenciales para
conservar su estructura y/o funcin. Los estudios de conservacin a nivel de la secuencia de
aminocidosenprotenasortlogas,porlotanto,tambinsondeutilidadalahoradeanalizar
silasnuevasvariantesidentificadassoncausantesdeenfermedad,yaqueestoscambiossuelen
producirse en residuos que se encuentran altamente conservados entre las enzimas de las
distintas especies. En este trabajo se han analizado los cambios puntuales por cambio
aminoacdico identificadas en el gen PMM2. Este anlisis ha mostrado que, efectivamente
todasloscambios,conexcepcindeE197A,afectanaresiduosidnticosomuyconservados
entodaslassecuenciasaminoacdicasestudiadasdelasprotenasortlogasalineadas,incluso
entre especies muy alejadas evolutivamente, sugiriendo que estas posiciones pueden ser

72

Discusin
crticasparalafuncindelpptido.Estoesdebidoaunfenmenodeseleccinnaturalqueno
permitequecambiosenlasecuenciadeaminocidosquetenganunefectopatognicosobrela
protenaseanseleccionadosevolutivamente.Porelcontrario,E197Apareceestarafectandoa
unresiduonoconservadosugiriendoquepuedesertoleradoporlaseleccinnatural,yporlo
tanto, parecera tratarse de un SNP. Adems se haba encontrado en alelos de individuos
controles.ParalelamenteaestetrabajofuedescritocomoSNPmedianteestudiosdeexpresin
(LeBizecetal.2005).Conlosestudiosfuncionalesrealizadosposteriormente,seconfirmque
todas las variantes allicas identificadas en el gen PMM2 son causantes de enfermedad,
exceptoelcambioE197AqueseclasificcomoSNP.

ComosehavistoenotrosestudiosgenticosdepacientesconCDGIa,seobservauna
clara predominancia de las mutaciones missense (86%) aunque hay un aumento de las
mutaciones de splicing (14%), frente a lo encontrado en otras series europeas, donde las
mutaciones missense aparecen con una frecuencia del 98% y las mutaciones de splicing y
mutaciones por cambio de marco de lectura o frameshift de un 1%
(http://www.euroglycanet.org/home.html).

Es interesante destacar que aunque es poco probable la aparicin de pacientes

homocigotosparamutacionesenelgenPMM2(Kjaergaardetal.1998;Matthijsetal.1998),
entre nuestros pacientes encontramos un homocigoto para la mutacin T237M (8%) que
presenta fenotipo leve, lo que parece indicar que la mutacin T237M podra considerarse
mutacin leve. A pesar de ello, la frecuencia de heterocigotos sigue siendo muy elevada
(92%).

De todas las variantes allicas encontradas en el gen PMM2, las dos ms frecuentes
son la T237M y la R141H, ambas con una frecuencia del 15% en los alelos mutantes. Sin
embargo, se ha observado que las variantes allicas ms frecuentes en otras poblaciones
caucasianas son la R141H (35%) seguida de la mutacin F119L (13%)
(http://www.euroglycanet.org/home.html),cambioquenohemosencontradoentrenuestros
pacientes.LaT237Maparececonunafrecuenciadel2%enotrasseries.Estosdatos,juntocon
lospublicadosenelao2002porelgrupodeBriones(Brionesetal.2002),parecenindicar
que el espectro mutacional de pacientes espaoles es diferente al de otras poblaciones
europeas(http://www.euroglycanet.org/home.html).

Enlos2pacientestipificadoscomoCDGIbseidentificaron3variantesallicasenel
gen MPI ya reportadas en la literatura pero sin estudios de expresin que demuestren su
patogenicidad (Niehues et al. 1998; Schollen et al. 2000a). Se trata de 2 cambios de
aminocido,R219Qenelexon5yM51Tenelexon3,yunainsercindeunabaseenelexon
3(166167insC)queprovocacambiodelmarcodelecturaconlaaparicindeuncodonstop
prematuro (PTC) y por lo tanto, la degradacin de dicho transcrito por los sistemas de
vigilanciadelaclula(NMD)(LejeuneandMaquat2005;Wangetal.2002).

Se realiz el anlisis gentico de varios genes causantes de CDG en fibroblastos de

pieldelospacientescatalogadoscomoCDGIx,quepresentabanactividadesPMM2yPMI
normales. Se eligieron los genes ALG6 (CDG Ic) por ser responsable del defecto ms
frecuente despus de los CDG Ia, DPM1 (Ie) debido a que dos pacientes en estudio eran

73

Discusin
originariosdelamismacomunidadautnomaenlaqueyahabauncasodocumentadoyel
genDPGAT1(Ij)porlaausenciadeespeciesanmalasdeLLOenfibroblastosdepieldeuno
deloscasos,estudiorealizadoporelDr.Jaeken(Leuven,Blgica),queorientabahaciaun
defectoenlospasosinicialesdelasntesisdeloligosacridoestndaroLLO.Los2pacientes
diagnosticados como CDG Ie por ser portadores de mutaciones en el gen DPM1, son
compuestos homocigotos de una nica mutacin, ya descrita (GarciaSilva et al. 2004) de
cambio de aminocido, serina por prolina en la posicin 248 (S248P) en el exon 9 del gen
DPM1. El aumento encontrado en su frecuencia allica, probablemente, se debe a que los
pacientespertenecenaunapoblacinconciertogradodeaislamientogentico,yaquetodos
sonoriginariosdelasIslasCanariasyaunquelosdatosdeconsanguinidadnoindicanque
sean pacientes relacionados, probablemente sea el mismo alelo. No parece existir relacin
genotipofenotipo, seguramente debido a que a la expresin clnica de la enfermedad
contribuyenotrosfactoresgenticosyambientales.Porotrolado,elpacientediagnosticado
comoCDGIj,conmutacionesenelgenDPGAT1,esuncompuestohererocigotoformadopor
2variantesallicasporcambioaminoacdico(R301CyL385R)identificadasporprimeravez
en este estudio. En la actualidad slo hay un caso descrito en la literatura por el grupo
americanodeFrezze(Wuetal.2003).Setratadecambiosnoconservativos,yaquesetratade
uncambiodeunaminocidobsicoporunopolarenlaposicin301yunoapolarporuno
bsico en la posicin 385. Adems, ambos cambios aminocidicos afectan a un residuo
idnticoomuyconservadoentodaslassecuenciasdelasprotenasortlogasalineadas,incluso
entre especies muy alejadas evolutivamente, sugiriendo que estas posiciones pueden ser
crticas para la funcin del pptido. En cualquier caso sern necesario estudios funcionales
paracomprobarqueestoscambiossoncausantesdeenfermedad.

Enlosltimosaoslastcnicasprotemicashanprotagonizadoungrannmerode
estudiosendiferentesenfermedadesgenticasdebidoaquepermitenelconocimientodelos
nivelesdeexpresindeprotenasyladeteccindiferencialdeprotenasconmodificaciones
posttraducionales. Por ello, adems de la caracterizacin bioqumica y molecular se ha
profundizado en el anlisis del proteoma srico de 2 pacientes CDG Ia que comparten un
alelomutanteconelobjetivodeintentarrelacionarfenotipocongenotipo.

Se han encontrado diferencias en la expresin de 14 glicoprotenas, las cuales

participan principalmente en la respuesta inmune, procesos de coagulacin y en los
mecanismosdeproteccindetejidosfrentealestrsoxidativo.Variasprotenascomola1
antitripsina,transferrina,elcomplemento,haptoglobina,antitrombinaIII,protenaunidaal
retinol y ceruloplasmina haban sido ya involucradas previamente en la patologa de los
CDG Ia (Butler et al. 2003; Henry et al. 1997; Mills et al. 2001; Mills et al. 2003) y en otras
enfermedades neurolgicas (Lehmensiek et al. 2007). Pero en este estudio se asocia por
primera vez la sobreexpresin de varias isoformas de la haptoglobina, 2macroglobulina,
afamina,fibrinayfibringenoconCDGIa.Varias de las protenas identificadas estn
involucradas en la cascada del complemento, el cual es un importante mediador de la
inflamacinycontribuyealaregulacindelarespuestainmunitaria.Siatendemosalfactor
C3c del complemento vemos que el paciente 22692 que presenta disminucin en las
isoformasdeestaprotenahasufridoinfeccionesrecurrentes,mientrasqueelpaciente20484,
queporelcontrariopresentaaumentodesusniveles,pareceposeerresistenciafrenteaellas.

74

Discusin
El fibringeno participa en la coagulacin, inflamacin y respuesta inmunitaria,
siendo especialmente importante en la formacin del trombo. La trombina es una protena
encargadadeladegradacindeltrombo.Altosnivelesdefibringenosehanvistoasociados
a enfermedades cardiovasculares. Se ha visto que anomalas en el proceso de coagulacin
debidas a una inadecuada glicosilacin de los factores de coagulacin o inhibidores de la
misma pueden provocar cuadros trombticos o hemorrgicos en este tipo de pacientes
(Fiumaraetal.1996;Stibler et al.1996;Young and Driscoll 1999). Elaumento deexpresin
delfibringenojuntoconladisminucinenla expresindelaantitrombinaIIIennuestros
pacientespodraestarindicndonosunaltoriesgodesufrireventostrombticos.Segnesto,
sepodrautilizarlaprotemicacomoherramientaparadistintasintervencionesteraputicas.
SehapropuestolaaspirinaenbajadosiscomoprofilaxisenpacientesCDGIaquepresentan
eventos trombticos (Arnoux et al. 2008). La diferencia en la expresin en protenas
involucradas en la inflamacin y en los procesos de coagulacin corrobora las alteraciones
encontradasenestosprocesosenestetipodedefecto.

Siatendemosalgenotipodeestospacientes,ambossoncompuestosheterocigotosde
unamutacinmissenseconlamutacinIVS79T>G,consideradanulasegnhemosvistoen
los estudios funcionales descritos en este trabajo. Podemos observar que el paciente 22692
portador de la mutacin D65Y, que in vitro presenta menor actividad residual (20%),
presentaunamayoralteracinenelpatrnprotemicoqueelpaciente20484portadordela
mutacinT237M,lacualretienemayoractividadresidualinvitro(48%).Segnesteestudio
parece haber una buena correlacin entre las alteraciones protemicas encontradas y la
clnicaquepresentanlospacientes,loquenospodrahacerconsideraralaprotemicacomo
herramienta para el diagnstico y profilaxis en estos defectos y para el estudio de nuevas
dianasteraputicas.

5.2

ANLISIS FUNCIONAL DE LAS VARIANTES ALLICAS

IDENTIFICADASENELGENPMM2.

Para poder predecir la gravedad del fenotipo clnico y bioqumico en los pacientes
CDGIayademspoderinvestigarnuevasterapiaspotencialmenteaplicablesapartirdesu
genotipo,esnecesarioconocertantolagravedaddelefectocausadoporlasmutacionessobre
lafuncinproteicacomolosmecanismosatravsdeloscualesestasmutacionescausanla
prdidade dichafuncin.Desdelainformacincodificada enungenhastalatraduccina
una protena efectora existen varios procesos intermedios, que tambin estn sujetos a
regulacinysonsusceptiblesdecambios.Portanto,cualquiervarianteallicaasociadaauna
enfermedad gentica podr afectar no slo a nivel de protena efectora, sino tambin los
procesosdetranscripcinyprocesamientodelmensajero,ascomosuestabilidad.

Enelcasodemutacionesquecausanuncambiodeaminocidoenlasecuenciadela
protenaPMM2(querepresentanel86%delosalelosmutantesdetectados),losestudiosde
expresin in vitro son necesarios para caracterizar sistemticamente el efecto causado por
estas mutaciones sobre la estabilidad, funcin y regulacin de la protena, y adems para

75

Discusin
determinar si las variantes allicas nuevas son causantes de enfermedad. Para ello, en este
trabajohemosrealizadoestudiosinvivoapartirdefibroblastosdepieldepacientesCDGIa
enlosqueseanalizabalosnivelesdeexpresindelaprotenaPMM2medianteWesternblot
y los niveles de expresin del gen PMM2 mediante qRTPCR. Adems hemos realizado
estudios funcionales de las variantes allicas por cambio de aminocido mediante su
expresinenunsistemaprocariota.

Losanlisisde expresin delaprotena PMM2enfibroblastos de piel de pacientes

CDG Ia nos mostr, que excepto el paciente 22682, con genotipo D209G/ P113L, que
presentaba un 74% de protena inmunorreactiva, el resto de pacientes presentaban una
disminucinsignificativaenlosnivelesdeexpresindelaprotena,loquepodraserdebido
a que las mutaciones causan inestabilidad del mRNA y/o inestabilidad de la protena. A
excepcin de las lneas celulares portadoras de la mutacin IVS79T>G que presentaron
niveles disminuidos de mRNA cuando se analiz por qRTPCR, en el resto de las lneas
celulares portadoras de mutaciones missense los resultados sugieren que no hay un efecto
sobre la estabilidad del mRNA. Lo que parece indicar que la disminucin significativa
encontradaenlosnivelesdeprotenaPMM2inmunorreactivasondebidosaunefectosobre
laestabilidaddelaprotenaporaumentoenlatasadedegradaciny/oagregacinproteica.

Con los estudios de expresin in vitro a 37C de las mutaciones missense llevadas a
cabo en E.coli, se ha detectado una actividad deficiente de la protena PMM 2 en todas las
variantes allicas analizadas, incluidas las nuevas D209G, P184T y T118S identificadas en
estetrabajo,loqueconfirmaque soncausantesde enfermedad, exceptoE197A convalores
cercanosalaprotenasalvajeyqueporlotanto,hasidocatalogadacomounSNP(LeBizec
etal.2005).Elrestodelasmutacionespuedenserclasificadasengrupossegnsuactividad
residual: mutaciones de actividad intermedia (5444%) como T118S, L32R, T237M y P113L,
mutacionesdebajaactividadresidual(2116%)comoD65YyV44Ayporltimomutaciones
conactividadnula(<1%)comosonF157S,P184T,F207S,R123Q,R141HyD209G.Adems
estos estudios tambin nos ha permitido clasificar las mutaciones en aquellas que parecen
estarafectandoalafuncincatalticadelaprotenay5posiblesmutacionesquepodranestar
afectando al plegamiento y/o estructura de la PMM 2, D65Y, V44A, F207S, F157S y P184T,
pues se detectaba una disminucin en la cantidad de protena inmunorreactiva, como ya se
haba detectado en los estudios realizados en las lneas celulares de los pacientes. Podemos
observar que los niveles de protenas obtenidos en los estudios de expresin en el sistema
procariota son ligeramente ms elevados que los obtenidos en los estudios de estabilidad
llevada a cabo en fibroblastos de pacientes, dnde hay disminucin de protena
inmunorreactivaprcticamenteentodosloscasos.Probablemente,estehechoseadebidoaque
laprotenaGSTfusionadaalaPMM2,utilizadaenlosestudiosdeexpresin,estabilizaalas
protenas mutantes. Este hallazgo parece indicar que para confirmar que las mutaciones
catalogadas como catalticas son, finalmente, mutantes que no afectan al plegamiento de la
protena,seranecesariorealizarotrosestudios,comoperfilesdedegradacinquepermitenel
clculodevidamediaoestudiosdecoexpresinconchaperonas(Brossetal.1993;Brossetal.
1999;Peyetal.2003).

En muchas ocasiones el anlisis de expresin de alelos missense se traduce en niveles

reducidos de protena, que se corresponden con una actividad enzimtica disminuida,

76

Discusin
resultadodeladegradacinaceleradadelasprotenasmutantesdebidoasuinestabilidad.Este
pareceserunmecanismocomnpatognicocaractersticodemuchasenfermedadesgenticas
(Gregersenetal.2001b;Mohsenetal.1998).Ademssehavistoenciertasenfermedadescomo
las deficiencias en acilCoA deshidrogenasas (Bross et al. 1995; Corydon et al. 1998) o la
fenilcetonuria (Gamez et al. 2000; Pey et al. 2003), que la estabilidad de pptidos mutantes
puedesermoduladainvitromediantecambiosenlatemperaturadecultivoyenlosnivelesde
chaperonas (Chaudhuri and Paul 2006). Para conocer si las mutaciones D65Y, V44A, F207S,
F157SyP184TpodranestarafectandoalplegamientooestructuradelaPMM2desarrollamos
unaaproximacinexperimentalcombinandoestudiosdeestabilidaddelasprotenasnomaly
mutantes mediante su expresin a 26 y 37C, con una metodologa que permite analizar el
recambio proteico mediante la determinacin de la vida media de la protena normal o
mutante. Expresando dichas protenas a 26C, es decir, favoreciendo el plegamiento,
detectamosunaumentoenlaexpresindelasprotenasportadorasdelasmutacionesF157S,
F207S y P184T, hacindolas candidatas a ser mutaciones que afectan al plegamiento o
estructura de la PMM 2. Los perfiles de degradacin a 37C confirmaron esta hiptesis al
observarseunadrsticadisminucinenlavidamediade2deestasprotenasmutantes.

Los defectos observados en el plegamiento y estabilidad de estas protenas mutantes

podran catalogar a los Defectos Congnitos de Glicosilacin Ia como una enfermedad
conformacional,comolosonotrasenfermedadesgenticas,porejemplolafibrosisqustica
(GelmanandKopito2003),lafenilcetonuria(Peyetal.2003)ylasdeficienciasenacilCoA
deshidrogenasas (Gregersen et al. 2001b). Nuestros resultados indican que el control de
calidad proteico celular (protein quality control), actuando sobre su plegamiento y/o
degradacin, puede ser un importante agente modulador de la actividad PMM2 in vivo,
especialmente en el caso de las mutaciones estructurales. Esto permite el planteamiento de
realizar futuros estudios mediante el uso de chaperonas farmacolgicas que abriran nuevas
expectativasteraputicasenestetipodedefectos(ChaudhuriandPaul2006;Peyetal.2008).El
rescate de protenas mutantes con defecto en elplegamiento mediante eluso de frmacoses
ahora considerado como una posible opcin para la correccin de varias enfermedades
genticascomofibrosisqustica,enfermedaddePompeodiabetesneonatal,ilustrandoquela
combinacin de la farmacologa y la gentica ofrecen la posibilidad de identificar nuevas
dianasteraputicasespecficasdelgenotipo(Caietal.2006;ChaudhuriandPaul2006;Parenti
etal.2007;Pearsonetal.2006).

LasmutacionesqueafectanalcorrectoprocesamientodelmRNAsehananalizadoen
unsistemacelularmedianteminigenes.Losresultadosdelensayodesplicinginvitrosugieren
quelos3cambios(IVS79T>G,IVS31G>CyIVS715479C>T)soncausantesdeenfermedad,lo
queapoyaqueningunodeellosfueraencontradoenlasbasesdedatosdeSNPs.Losperfiles
transcripcionalesdelaslneascelularesdeestospacientesfueronsimilaresalosobtenidosen
losminigenes.

La precisa descripcin del efecto que las mutaciones tienen sobre el mecanismo de
splicing,esimportantedebidoalaelevadafrecuenciadevariantesallicasidentificadasque
alteranesteproceso.Enestetrabajosehaanalizadoelposibleefectode3mutaciones,IVS7
9T>G, IVS31G>C y IVS715479C>T, identificadas en el gen PMM2 sobre el procesamiento
delmensajero.

77

Discusin

Enelanlisisdelperfiltranscripcionaldelosfibroblastosportadoresdelamutacin
IVS79T>G se observ que este cambio de nucletido en la posicin 9 del intrn 7 del gen
PMM2 provoca una alteracin en el mecanismo de maduracin del mRNA debido a la
activacindeunsitiocrpticodesplicingquedacomoresultadolainsercinde66bpentreel
exon7yelexon8.Estetranscritoaberrantepareceserdianadelossistemasdevigilanciade
la clula (NMD) ya que no aparece en los transcritos analizados. Se ha postulado que la
imposibilidad de analizar algunas de estas mutaciones a nivel de mRNA mediante RTPCR,
cuando se presentan en heterocigosis en el gDNA, es debida a que la disminucin de la
estabilidad y, por tanto, cantidad de los transcritos que las portan respecto al mRNA
procedentedelotroalelo,daralugaralaretrotranscripcinyamplificacinfavorecidadeeste
ltimo (Jacobson 1996; Maquat 1996). El estudio realizado sobre el efecto de las mutaciones
identificadas sobre los niveles de expresin del mRNA del gen PMM2 ha revelado que la
mutacinIVS79T>GparecetenerefectosobrelaestabilidaddelmRNA,pueslosfibroblastos
de piel de los pacientes que portan esta mutacin (20484 y 22692) tienen una bajada de
expresinentreel6040%,siendomsacusadaenelpacienteconsintomatologamssevera,
lo que apoyara la idea de que hay una degradacin por el sistema propio de la clula, el
sistemaNMD,apesardenopresentaruncodonstopprematuro(PTC)almenosa5055pb
antes de un sitio de unin exonexon formado tras el proceso de maduracin (splicing)
(Lejeune and Maquat 2005; Wang et al. 2002). Este hallazgo podra estar indicando que el
determinanteparaquesedisparelareaccindelsistemaNMDesmuchomscomplejoque
laregladelos5055ntcorrientearribadelauninexonexon.

Aunque el estudio de las probabilidades de splicing, estimadas informticamente,

queposeeneldonadorylosaceptoresnoparecenexplicarelprocesoresponsabledelefecto
delamutacin,lasevidenciasinvitropermitenpostularquelamutacinIVS79T>Gafectaa
launindelfactordesplicingU2AF65 altractopolipirimidnico(Hollinsetal.2005),loque
provoca el no reconocimiento del aceptor de splicing normal y la activacin del aceptor
crptico antes mencionado. Adems este cambio nucleotdico no se haba encontrado en el
estudioporsecuenciacinde100alelos.

Paraconfirmarqueestecambionucleotdicoescausantedeenfermedadseanalizin
vitro mediante minigenes cmo afectaba esta mutacin al proceso de splicing. Como se
tratabadelestudiodelltimoexon,elminigeneraunaconstruccinartificialdelexon8con
suzonaintrnicaadyacenteportadordel3aceptordesplicing,unidoalexon2consuzona
intrnicaadyacentequeleaportaraeldonador5desplicing(Abuhatziraetal.2005).Eneste
sistema no se pudo reproducir el splicing aberrante observado en fibroblastos de los
pacientes genotipados, pues aunque se demostraba que en ninguno de los transcritos se
realizabasplicingnormal,tampocoseobtuvierontranscritosportadoresdelainsercinde66
pb.Estehechopuedeserexplicadoobienporquelostranscritosportadoresdelainsercin
sean resultado del alelo mutante pero de forma minoritaria y que sea otro transcrito el
mayoritario y responsable de la degradacin por el sistema NMD o porque el sistema de
minigenes,aunqueesmsaproximadoalasituacininvivo,puedenoestarreproduciendoel
efecto de algunas mutaciones analizadas probablemente porque carecen de la secuencia
genmica adyacente, cuyo contexto es importante para la correcta definicin exonica, tal y
comosucedeenlaparaplegiaespsticahereditaria(Svensonetal.2001),ymssitenemosen

78

Discusin
cuenta que se trata de un exon construido artificialmente y que en el minigen no es el
ltimoexon.Probablemente,silamutacinestuvieralocalizadaenelsitio3desplicingdeun
exon interno el perfil transcripcional de los fibroblastos portadores de la mutacin
provocaraelskippingdelcorrespondienteexon,comoocurreenelminigen.

Enelanlisisdelperfiltranscripcionaldelosfibroblastosportadoresdelamutacin
IVS31G>Cseobservqueestecambiodenucletidoen laposicin1delintrn3delgen
PMM2dalugaraunaalteracinenelmecanismodemaduracindelmRNAprovocandola
desaparicin de la secuencia consenso del 3donador de splicing del intrn 3 y con ello, el
skippingdelosexones3y4.Estetranscritoaberrantenopareceserdianadelossistemasde
vigilanciadelaclula(NMD),apesardepresentaruncodonstopprematuro(PTC)amsde
55 nucletidos antes del sitio de unin exonexon formado tras el splicing (Lejeune and
Maquat 2005; Wang et al. 2002) pues es amplificado por RTPCR convencional y en los
estudiosdeestabilidaddelmRNAporqRTPCRnoseobservabajadadeexpresin.Adems
conelestudiodelasprobabilidadesdesplicing,estimadasinformticamente,queposeenel
donador y los aceptores de los distintos intrones, podemos postular que la eliminacin de
estos 2 exones podra ser debido a que se afecta la unin del fator U2AF65 en el intrn 3 y
ademspodrarealizarsedeformanaturalelskippingdelexon3,yaquelaprobabilidadde
splicingdelaceptordelintrn2estimadaesdel18%.

Para analizar cmo afectaba la mutacin al proceso de splicing, se construy un

minigen que contena los exones 3 y 4 con sus zonas intrnicas adyacentes y el intrn 3
completo. En este sistema se reprodujo lo que observamos en fibroblastos de pacientes
mediante qRTPCR convencional, pues de forma mayoritaria esta mutacin genera un
transcrito con skipping de los dos exones 3 y 4, aunque tambin se produce un transcrito
minoritario,quenoseobservaenpacientes,enelqueslohayskippingdelexon4.Elqueuna
alteracinenelaceptor3desplicingdelintron3afectealprocesodemaduracindelintrn
2, parece indicar que el proceso de splicing en un mismo gen est fuertemente regulado y
que la alteracin del proceso en uno de los intrones puede modificar la intensidad del
splicingenintronesadyacentes(Hertel2008).

Enelanlisisdelperfiltranscripcionaldelosfibroblastosportadoresdelamutacin
IVS715479C>Tseobservqueestecambiodenucletidoenlaposicin15479delintrn7
del gen PMM2 provoca una alteracin en el mecanismo de maduracin del mRNA dando
lugarauninsercinenfasede123pbentrelosexones7y8(Schollenetal.2007).Comoera
esperable,alnogenerarunPTC,dichotranscritonoesdianadelsistemaNMD.Losestudios
in silico de las regiones 3y 5de este pseudoexn incorporado en el gen PMM2 predijeron
scores de splicing elevados, lo que explicaba que se produzca dicha insercin. Mediante el
estudio con minigenes se comprob que el efecto de dicho cambio nucleotdico es la
activacindeun5donadordesplicingyquedichasecuenciatieneloselementosnecesarios
paraserprocesadacomounexon,generandounsolotranscritoconlainsercinde123pb.El
hecho de que las regiones consenso de splicing sean tan abundantes en el interior de las
secuenciasintrnicasindicaquelosintronestienenlahabilidadpotencialdecodificarfalsos
exones, los que comnmente son llamados pseudoexones (Buratti et al. 2006). Se ha
propuesto la teora de que la insercin de pseudoexones represente un sustrato para la
evolucin de nuevos exones o incluso que estas secuencias participen en la regulacin del

79

Discusin
proceso de splicing. Por otro lado, se ha observado la relacin entre la inclusin de
pseudoexones en el mRNA maduro y diversas enfermedades genticas (Buratti et al. 2006;
Gurvichetal.2008;Rinconetal.2007).

5.3 CORRELACIN GENOTIPOFENOTIPO

TERAPIASESPECFICASDEMUTACIN.

DISEO

DE

Unodelosfinesdelanlisisfuncionaldelasvariantesallicasespoderclasificarlas
mutacionesencuantoasuseveridad,correlacionarloconelfenotipoclnicoybioqumicode
los pacientes y as, en baseal genotipo predecir el pronstico y evolucin de los pacientes.
Esta correlacin es difcil de establecer en pacientes con CDG Ia debido a la gran
heterogeneidad gentica de los mismos, y a que la mayor parte de ellos son compuestos
heterocigotos(92%).Engeneral,ennuestraseriedepacientesCDGIanosehaencontradouna
correlacingenotipofenotipoclara,yaunquetodospermanecenvivosenlaactualidad,debido
alrecientedesarrollodelossistemasdediagnsticoylaausenciadeuntratamientoeficazpara
estetipodedefectos,lamayoradeellospresentangravessecuelas.

La relacin genotipofenotipo es ms evidente cuando los pacientes son homocigotos

paraunamutacinofuncionalmentehemicigotos(portadoresdeunamutacinPTC),puesse
predice ms claramente el efecto de dicha mutacin. As, en numerosas enfermedades
genticaslasmutacionesseveras,bienporafectaralafasedelecturadelaprotenaygenerar
PTC (deleciones, inserciones) o bien por presentar actividad residual nula in vitro (missense)
estn,generalmente,asociadasalasformasmsgravesdelaenfermedad.Ennuestraseriede
pacientes, con excepcin del paciente 18440 homocigoto para la mutacin T237M con
actividad residual intermedia que presenta un fenotipo leve, el resto de los pacientes son
hemicigotosdeunamutacinnuladesplicingomissense(D209G,P184T,F207S,F157S,R123Qy
R141H) y una mutacin que retiene actividad residual (T118S, T237M, L32R, P113L, D65Y y
V44A).Entreloshemicigotosfuncionalespodemosdistinguirpacientesconunfenotipoms
leve que podra estar asociado a mutaciones con actividades in vitro intermedias (R162W,
L32R,P113L)ypacientesmsgravesasociadosamutacionesconactividadesinferiores(D65Y,
V44A)tambindescritasenotrasseriesdepacientes(Grunewaldetal.2001).Sinembargo,la
mutacin T237M en heterocigosis y con una actividad residual intermedia est asociada a
fenotipos leves y moderados, y aunque los estudios de estabilidad in vitro no indican que
afectealplegamientodelaprotena,enlaslneascelularesdelospacienteslaestabilidadest
fuertementecomprometida,especialmenteenelpacientehomocigotodondesedetectaun50%
de PMM 2 inmunorreactiva. Las inconsistencias en la relacin fenotipogenotipo en los
pacientes portadores de esta mutacin podran ser explicados por las diferencias inter
individuales en el sistema de control celular proteico, como se han descrito en otras
enfermedadesconformacionales(Brossetal.1995;Peyetal.2003).

En cualquier caso, las discrepancias observadas entre el genotipo mutante y la

manifestacin fenotpica de las enfermedades monognicas ilustran la idea, cada vez ms
aceptada, de que la expresin del producto de un locus principal no es el nico factor
responsable de la manifestacin del fenotipo, sino que existen mltiples factores, tanto

80

Discusin
genticos (diferencias intertisulares e interindividuales en la expresin gnica de los genes
responsablesdelosfactoresdesplicing(NissimRafiniaetal.2004;NissimRafiniaandKerem
2005; Tazi et al. 2005), sistema NMD (Khajavi et al. 2006), control de calidad de protenas
(Bernieretal.2004)entreotros)comoepigenticosyambientales,queafectanalfenotipoyque
demuestran el carcter complejo tambin de los defectos monognicos (Scriver and Waters
1999).

Envariasenfermedadesgenticaselanlisisfuncionaldelasmutacionesharesultado
seresencialnosloparaeldiagnsticodeldefectosinotambinparadisearaproximaciones
teraputicas especficas. Se han utilizado frmacos inhibidores de histonas desacetilasas que
son capaces de aumentar la transcripcin de ciertos factores de splicing o protenas SR
regulandoelsplicingalternativo(Brichtaetal.2003;Gottlicher2004;Shietal.2008).Porltimo,
se estn creando como una potente alternativa al tratamiento convencional de defectos
genticosterapiasbasadasenelRNAcomodianateraputica.Estasnuevasterapiassebasan
endistintasestrategiasdereparacindelmRNAmediantemodificacindelsplicingconeluso
deoligonucletidosantisentidoomedianteelsilenciamientodealelosotranscritosespecficos
medianteRNAinterferente(Woodetal.2007).

Enestetrabajohemosutilizadodosaproximacionesteraputicascapacesdemodular
elsplicing:lasobreexpresindefactoresdesplicingyelusodeoligonucletidosantisentido.
Conlasobreexpresindefactoresdesplicing,msconcretamenteconelfactorU2AF65,seha
podidoactivarunsitio3desplicingdbil,sinembargonorecuperamoselsplicingnormalen
mutacionesqueafectanaltractopolipirimidnicoocuandodesaparecelasecuenciaconsenso
delsitio3,indicandoqueprobablementesoncambiosmecansticamentediferentes.

Traslacotransfeccinconvariosfactoresdesplicing(SRp40,SRp55,SC35ySF2/ASF),
hemosvistoquelasobreexpresindeSC35oSF2/ASFprovocaunamodulacindelsplicing
en los pacientes portadores de la mutacin IVS79T>G ya que se produce la activacin del
sitiocrpticopresenteenelintrn7.VariosestudiosindicanquelasprotenasSRjueganun
papelimportantealahoradeseleccionarelsitiodesplicing.SC35ySF2/ASF,considerados
activadoresdesplicing,parecequesonrequeridosenesteprocesoyseleccionanelsitiode
splicingenpremRNAsquecontienenmltiplessitios5o3(Fuetal.1992).Sehavistoque
la sobrexpresin de ciertos factores de splicing incrementan los niveles de mRNA
correctamenteprocesados(NissimRafiniaetal.2004),msconcretamente,lasobreexpresin
de los factores de splicing SC35 y SF2/ASF parecen tener un efecto activador de splicing
normal en mutaciones que se encuentran localizadas en el tracto polipirimidnico, pues
participan en el reclutamiento y estabilizacin de la unin del factor U2AF a esta regin
(ManleyandTacke1996).

Este hecho podra utilizarse para el estudio de nuevas dianas teraputicas en

pacientesportadoresdedichamutacinsilaprotenamutanteresultante,conlainsercinde
22aminocidos, fuerafuncionalmente activa y fueraposible aumentarla expresin deeste
transcritoenfibroblastosdelpaciente.Sehavistoquehayfrmacoscapacesdemodularel
splicing en algunas enfermedades genticas pues provocan un aumento en la transcripcin
de ciertos factores de splicing. Este es el caso de la cafena que parece modular el splicing
mediante el aumento de transcripcin del factor SC35. Esto ha sido observado en genes

81

Discusin
asociadosacncer(Shietal.2008).Segnestolaregulacindelsplicingtambinpodraestar
influyendo en los parmetros fenotpicos en los CDG Ia. La modulacin del perfil
transcripcional por factores proteicos o compuestos qumicos, podra constituir un nuevo
campoparalaaplicacindeposiblesterapias.

La segunda aproximacin teraputica utilizada fue el uso de oligonucletidos

antisentido. Cuando se llev a cabo el tratamiento con AMOs en fibroblastos de piel del
paciente25232,portadordelpseudoexn,seobservqueelperfiltranscripcionalobtenidoa
partir del RNA total y mediante RTPCR cuando la concentracin de AMO era de 20 M
presentabaun 100% de transcritoscorrectamenteprocesados. Aunque no se puede afirmar
que en la poblacin de clulas tratadas slo exista mRNA correctamente procesado, la
cantidad de ste parece suficiente para paliar el defecto enzimtico. Esto se deduce por el
aumento de protena inmunorreactiva detectada por Western blot y el aumento de la
actividadPMM2avalorescercanosalanormalidad,loquepareceindicarqueelmRNAes
procesado correctamente y traducido en protenas activas. Adems la recuperacin de la
actividadanivelescercanosalanormalidadalimpedirlaincorporacindelpseudoexnen
los mRNA, demuestra que la mutacin IVS715479C>T, la cual genera la insercin de 123
pb, es la causa de la enfermedad. La modulacin del splicing mediante el uso de
oligonucletidos antisentido (AMOs) ha sido utilizada con xito en el tratamiento de varias
enfermedadesgenticascomolafibrosisqustica(Friedmanetal.1999),ladistrofiamuscular
deDuchene(Takeshimaetal.2006)ylatalasemia(Suwanmaneeetal.2002)porinterferiren
elprocesodesplicingyoriginarprotenafuncional.LaexistencadeunpacienteconCDGIa
cuyas caractersticas genticas permita postular una posibilidad de beneficio con la
aplicacindeestaterapianosimpulsarealizarestosensayos,pueslautilizacindeAMOs
podraserunaterapiagnicapotencialmenteaplicableapacientesconDefectosCongnitosde
Glicosilacin.

Las terapias basadas en el RNA, dentro de las cuales se encuentra la terapia con
AMOs presentan toda una serie de ventajas con respecto a las terapias convencionales de
reemplazamientognico.yaquenopresentanpeligrodeintegracinenelgenomahusped
ypermitenmodificarlaexpresingnicasinalterarlaregulacinnormaldelgenanivelde
gDNA (Wood et al. 2007). Una gran ventaja de estos oligonucletidos antisentido tipo
morfolinos es que tienen una gran estabilidad, son muy resistentes a nucleasas y a la
degradacin por RNAsaH cuando forman hbridos con el RNA. Si embargo, las mayores
dificultadesparalautilizacininvivodeestosAMOssonsuvehiculizacinparaquepuedan
llegaralostejidosdeintersyladeterminacindeladosisptimaquepermitaobtenerde
formasimultnealarecuperacindelostranscritosdeinterssinunatoxicidadelevada.Un
ejemplo de su utilizacin in vivo es la distrofia muscular de Duchene en la que los
oligonucletidos antisentido han sido utilizados en pacientes de forma intramuscular
restaurndoseparcialmenteladistrofina(AartsmaRusetal.2007;vanDeutekometal.2007).
ElefectoquelosAMOshanproducidoinvitroenlasclulasdelpacientenoshaceespecular
que este tipo de terapia pudiera ser una estrategia teraputica eficiente y prometedora en
estetipodedefectos.

En las enfermedades metablicas hereditarias el porcentaje de variantes allicas

identificadas,analizandolosfragmentosexnicosconlaregincodificantemslasregiones

82

Discusin
intrnicasadyacentesdecadaexon,estentreel9598%delosalelos.Elrestodevariantes
allicasnoidentificadas(25%)sepostulaquepodranencontrarseenregionespromotoras,
regionesdepoliadenilacinopodranproducirinsercionesdepseudoexonesquegeneraran
un mRNA aberrante. Las inserciones o deleciones que no provocan PTC seran detectadas
porRTPCRconvencionalperolasqueprovocancambioenlafasedelecturaygeneranPTC
seran diana del sistema NMD, siendo degradado el mRNA de manera acelerada y no
pudiendo ser detectado por los sistemas tradicionales de deteccin de mutacin. En estos
casos, con la utilizacin de compuestos (emetina o puromicina) que inhiben este sistema
NMD, se podran detectar transcritos aberrantes, algunos con pseudoexones, por lo que
potencialmente podra haber un mayor nmero de pacientes que los identificados
actualmentesusceptiblesdesertratadosconterapiaantisentido,tantoenstacomoenotras
enfermedadesgenticashumanas.

Lasestrategiasbasadasenlamodulacindelosprocesosdesplicingrepresentanenla
actualidad una opcin teraputica que podra ser aplicada en sta y otras enfermedades
genticas humanas. El siguiente reto es la investigacin de vehculos seguros y efectivos
basadosenlatecnologadelasnanopartculasquenospermitandirigirespecficamentelos
oligonucletidos a los tejidos diana, as como la generacin de modelos animales knockin
parasuensayoinvivo.

83

6.CONCLUSIONES

Conclusiones

1. La utilizacin de la transferrina como marcador srico es muy til para la

deteccin de los Defectos Congnitos de Glicosilacin, aunque es necesario para
unacorrectaclasificacin,quesecomplementeconelanlisisdeotrosmarcadores
sricoscomola1antitripsinaylaapolipoprotenaCIII.

2. El estudio del proteoma srico de pacientes CDG representa una buena

herramientaparainvestigarlossistemasbiolgicosafectados.Podrasertambin
de gran utilidad para la bsqueda de nuevas aproximaciones teraputicas
dirigidashaciaunamejorprevencinsintomatolgicayunmejorseguimientode
laevolucinclnicadelpaciente.

3. ElespectromutacionaldenuestraseriedepacientesCDGIadifierealdescritoen
otras poblaciones europeas, siendo las mutaciones T237M (15%) y R141H (15%)
lasmsfrecuentementeencontradasyconunapresenciainusualmenteelevadade
mutacionesdesplicing.

4. ElanlisisfuncionaldelasvariantesidentificadasenelgenPMM2hademostrado
que todos los cambios nuevos identificados en este estudio son causantes de
enfermedad y que varias de ellas afectan al plegamiento de la protena
(enfermedad conformacional). Este hecho permitir, posiblemente, la futura
aplicacin de chaperonas farmacolgicas como tratamiento en numerosos
pacientes.

5. Con este estudio hemos identificado mutaciones severas con actividad residual
nula(D209G,P184T,R141H,R123Q,F207S,F157S,IVS31G>C,IVS79T>GyIVS7
15479T>C) y mutaciones que presentan cierta actividad residual (T118S, L32R,
T237M, P113L, D65Y yV44A). Todos los pacientes genotipados son hemicigotos
funcionalesdeunamutacinseverayunaqueretieneactividadresidual.

6. Aunque la relacingenotipofenotipo esdifcil de establecer en una enfermedad

genotpicamente tan heterognea como los CDG Ia, podemos concluir que las
mutaciones V44A y D65Y parecen estar asociadas a fenotipos clnicos ms
severos,mientrasquelasmutacionesL32R,P113L,R162WyT237Mparecenestar
asociadasafenotiposclnicosmsleves.

7. ElusodeoligonucletidosantisentidoenfibroblastosdeunpacienteconCDGIa
hademostradoquelainsercindetectadaensuperfiltranscripcionalescausante
de enfermedad, y que la terapia antisentido aplicada in vitro es efectiva para
mutacionesquegeneraninsercindepseudoexones.Estetipodeterapiapudiera
serunaopcinprometedoraenpacientesCDGIa,paraloscuales,hastalafecha,
nohaytratamientoefectivo.

85

Conclusiones

8. Los estudios de las bases moleculares de las enfermedades genticas y el

conocimiento de los mecanismos de accin de las variantes allicas aportan una
basecientficaparalaaplicacineinvestigacindenuevasdianasteraputicas,y
demuestran que el estudio molecular de las enfermedades genticas humanas
ademsdetenerunvalordiagnsticotieneunvalorteraputicoaadido.

86

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8.PUBLICACIONES

Publicaciones

Partedeestetrabajoseencuentradescritoenlassiguientespublicaciones:

Martn Hernndez E, Vega Pajares AI, Prez Gonzlez B, Ecay Crespo MJ, Leal Prez F,
Manzanares LpezManzanares J, Ugarte Prez M, PrezCerd Silvestre C.
[Congenitaldisorder of glycosylation type 1b. Experience with mannose treatment].
AnPediatr(Barc).2008Oct;69(4):35865.Spanish.

PrezCerdC,QuelhasD,VegaAI,EcayJ,VilarinhoL,UgarteM.Screeningusingserum
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RichardE*,VegaAI*,PrezB,RocheC,VelzquezR,UgarteM,PrezCerdC.Congenital
disorderofglycosylationIa:Newdifferentiallyexpressedproteinsidentifiedby2DE.
BiochemBiophysResCommun.2009Feb6;379(2):26771.Epub2008Dec25.

*Autoresquecontribuyendeigualformaenestetrabajo

VegaAI,PrezCerdC,DesviatLR,MatthijsG,UgarteM,PrezB.Functionalanalysisof
three splicing mutations identified in the PMM2 gene: towards a new therapy for
CongenitalDisorderofGlycosylationtypeIa.HumanMutationEnprensa.

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