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TRANSFERENCIAS GENETICAS
Fueron establecidas por Gregor Mendel en 1865, definindolas como las
transferencias de diferentes caractersticas de un organismo otro.
TRANSFERENCIA GENTICA HORIZONTAL
Se refiere a cualquier proceso mediante el cual se transfiere material gentico
de un organismo donador a un receptor no descendiente. La transferencia
horizontal ocurre entre organismos sin relacin de parentesco directo.
La transferencia horizontal es un fenmeno conocido sobradamente en
procariotas y es muy comn sobre todo entre las bacterias, donde ocurre
incluso entre especies distantes. Esta transferencia de material gentico es
especialmente importante en el entorno sanitario, ya que la transmisin de
genes de resistencia a antibiticos es un ejemplo clsico de transferencia
horizontal.
La transferencia horizontal en bacterias puede realizarse mediante tres
procesos diferentes: trasformacin, transduccin y conjugacin.
La trasformacin aprovecha la capacidad de muchas bacterias de atrapar
material gentico libre en el medio, procedente de otras bacterias que hayan
sufrido algn tipo de lisis y hayan liberado fragmentos de su ADN. Esta
transformacin puede forzarse experimentalmente, preparando un cultivo
bacteriano de forma que se haga susceptible a la transformacin. La
transformacin bacteriana para incluir en un cultivo ADN recombinante es una
tcnica bsica en biologa molecular.
La transduccin necesita un vector viral, en este caso un bacterifago, que al
ensamblarse en la clula infectada arrastre parte del material gentico de la
bacteria en su genoma. De esta forma, al infectar otra bacteria, este material
puede integrarse en el genoma de la misma, producindose la transferencia.
La conjugacin normalmente ocurre a travs de estructuras especiales en las
bacterias llamadas pilus, que son pequeos tneles que conectan los citosoles
de la bacteria donadora y receptora. El material gentico transferido suele ser
un plsmido, que suele portar genes de resistencia a antibiticos.
En eucariotas, la transferencia horizontal es mucho menos conocida, aunque
hay evidencias de su existencia, sugerida a raz del anlisis de secuencias de
ADN. Estos anlisis parecen indicar que este tipo de transferencia ha ocurrido
a lo largo de la evolucin. Adems, la existencia de genes mitocondriales y de
cloroplasto podran considerarse casos de transferencia gentica horizontal,
segn la teora endosimbiotica.

TRANSFERENCIA GENTICA VERTICAL

Es la que se da en las eucariotas a partir de una clula madre.
TECNICA SOUTHERN BLOT
La tcnica de Southern Blot desarrollada en Edimburgo por E.M. Southerm,
permite identificar regiones especficas de ADN que han sido fragmentadas por
una enzima de restriccin. El ADN se separa mediante electroforesis en gel de
agarosa. Tras teirlo con bromuro de etidio, el gel se fotografa bajo luz
ultravioleta. Posteriormente se trata con hidrxido sdico o a altas temperaturas
para desnaturaliza el ADN y romper la unin entre sus dos cadenas. Entonces
el gel se neutraliza con un buffer adecuado. En una cubeta se extiende una
pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte elevado, con los extremos del
papel de filtro sumergidos en una solucin altamente salina. Se sita el gel
sobre la pieza de papel de filtro y sobre el gel se coloca una membrana de
nylon especial. Encima de todo ello se pone una pila de toallas de papel. Por
ltimo se presionan todas las capas con un peso. La solucin altamente salina
asciende a travs de la pieza de papel y atraviesa el gel por accin capilar,
llevando consigo el ADN desnaturalizado. El ADN es transportado hasta la
membrana de nitrocelulosa, a la cual se adhiere. De este modo el filtro se
convierte en una rplica del gel original. Cuando se ha completado la
transferencia, el ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro mediante calor
o exposicin a luz ultra violeta. El producto del Southern puede ser hibridado
con una sonda de ADN marcada radiactivamente especfica para el gen o
regin del ADN objeto de estudio. Despus de varias horas en contacto con el
filtro se elimina la sonda. La localizacin de la unin de la sonda con el filtro se
identifica mediante una autorradiografa. Para determinar el tamao del
fragmento de restriccin que contiene la secuencia de inters, se puede hacer
una comparacin con marcadores de peso molecular en un gel de agarosa.
TECNICA DE WESTERN BLOT
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de
protenas. Este mtodo, descrito por primera vez por Towbin, et. al, permite la
deteccin de una sola protena dentro de una muestra biolgica. La
especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un anticuerpo
que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de inters. Con la
tcnica de Western Blot se puede estimar el tamao de una protena, confirmar
la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilacin, y ser
utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de protena entre
muestras.

TECNICA SOUTHWESTERN BLOT

La tcnica southwestern blot se utiliza para investigar las interacciones
protena-ADN. La ventaja de esta tcnica sobre otros mtodos relacionados,
tales como ensayo de cambio de movilidad electrofortica (EMSA) y la huella
de ADN es que proporciona informacin sobre el peso molecular del factor de
protena desconocida. Este mtodo combina las caractersticas Southern y
tcnicas de Western blotting. Un desnaturalizante SDS-PAGE se emplea
primero a las protenas separadas por electroforesis basados en el tamao, y
despus de transferir las protenas a un soporte de membrana, las protenas
unidas a la membrana se renaturalizaron y se incubaron con un sonda de
oligonucletido (32)P marcado de doble cadena de secuencia especfica de
ADN. La interaccin de la sonda con la protena (s) ms tarde se visualiz por
autorradiografa.
NORTHERN BLOT
Es similar a la tcnica anterior, pero permite detectar ARN en vez de ADN (Innis
y Gelfand, 1990). En sntesis la tcnica consiste en extraer el ARN de las
clulas pertinentes y su posterior separacin por tamao mediante
electroforesis en gel. Las muestras de ARN son normalmente separadas en
geles de agarosa que contienen formaldehdo como agente desnaturalizante
del ARN para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teidos
con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el ARN.
Los geles de poliacrilamida con urea tambin pueden utilizarse, aunque esto
suele limitarse a fragmentos de ARN o miRNA, ya que crean un tamao de
poro ms estrecho en su matriz, por lo que el ARN que suele utilizarse no
podra desplazarse por el gel. Las molculas de ARN son transferidas y unidas
al filtro, al igual que en el Southern blot. Despus de la hibridacin con una
sonda marcada (y posterior a la deteccin segn el mtodo de marcaje
utilizado), las bandas en el gel indican la ubicacin de los tipos de ARN que
sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de ARN de tamao
adecuado, se puede conocer el tamao de los ARN que se han identificado.
As, la tcnica permite conocer el tamao preciso de un ARNm, luego del
empalme transcripcional. Adems, sirve para identificar diferentes tipos de
ARNm codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido
especfico (o tipo de clulas) en que se encuentra un ANRm especfico. As,
ser posible determinar los niveles de actividad gnica, por ejemplo durante el
desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un perodo
definido dela vida, o despus de haber sido sometido a los organismos a
diferentes estmulos fisiolgicos.
HIBRIDACIN IN SITU
Es una tcnica que detecta secuencias de cidos nucleicos en clulas,
cromosomas o tejidos preservados. La deteccin in situ provee una

visualizacin directa de la localizacin espacial de secuencias especficas que

es crucial para dilucidar la organizacin y funcin gnica, por lo que el mtodo
de hibridacin in situ se ha convertido en una tcnica importante en diversos
campos, incluyendo diagnstico de rearreglos cromosomales, deteccin de
infecciones virales y anlisis de la funcin gnica durante el desarrollo
embrionario, Secuencias de inters mdico pueden ser aquellas asociadas a
enfermedades de origen gentico, las que revelan la presencia de algn
patgeno, las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores o las que se
emplean como indicadores de alteraciones numricas del conjunto de
cromosomas de un individuo. La hibridacin in situ toma como fundamento la
complementaridad de los cidos nuclicos, la cual puede ser DNA y/o RNA, a
travs de puentes de hidrgeno formados entre las bases: adeninatimina
(DNA) o uracilo (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da
lugar a una doble cadena en la cual una cadena, tiene la orientacin opuesta a
la otra con respecto al esqueleto azcar-fosfato. La secuencia es leda de 5' a
3'.

Figura 1. Principios de la hibridacin in situ. La relacin entre la doble cadena

de DNA y su transcrito a RNA. El DNA genmico consiste de dos cadenas
complementarias, A aparea con T y G con C en orientacin opuesta (5' a 3' y 3'
a 5'). La transcripcin usa la cadena lder como templado y genera una
secuencia idntica de RNA.
Pasos y consideraciones para la hibridacin in situ. La tcnica involucra:
a) Generacin de cidos nucleicos marcados para una deteccin subsecuente.
b) Fijacin de tejidos (seccionados), preparacin de cromosomas.
c) Preparacin del tejido para incrementar el acceso del cido nucleico
marcado.
d) Hibridacin de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.
e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.
HIBRIDACIN DE COLONIAS
La hibridacin consiste en desnaturalizar el DNA e incubarlo con sondas
moleculares. Estas sondas son fragmentos cortos y de una sola cadena de
DNA o RNA, marcados con tomos radiactivos. Las sondas se aparean con

secuencias especficas, que permiten la identificacin de un fragmento

determinado de DNA que forma parte de una molcula mucho mayor.
El mtodo empleado para identificar colonias bacterianas que contengan
determinada secuencia de cido nucleicos de alto inters. Consiste en sembrar
los clones sobre placas de Petri con agar para despus de crecidos
transferirlos a membranas de bylon o nitrocelulosa y luego realizar la
hibridacin
Pasos para realizar la hirbridacin:

Se parte de una mezcla de bacterias recombinantes que portan distintos

fragmentos de DNA exgeno, entre ellos el fragmento que interesa
localizar
y
un
marcador
que
confiere
resistencia
a
un antibitico determinado.
Se distribuye la muestra en una placa de Petri con un medio de cultivo
slido que contiene el antibitico de seleccin. Slo las bacterias que
hayan adquirido el plsmido recombinante crecern formando colonias
aisladas. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una nica
bacteria inicial y todas las clulas de una colonia son idnticas. Por lo
tanto, contienen el mismo plsmido recombinante, es decir, constituyen
un clon.
Por medio de la aplicacin de un filtro de nitrocelulosa que se pone en
contacto con la superficie de la placa de Petri, bacterias de cada una de
las colonias se transfieren al filtro (tcnica de blotting) y se forma una
rplica.
La rplica se trata con una solucin alcalina que rompe las clulas y
desnaturaliza el DNA del plsmido. El DNA se une qumicamente al filtro.
El filtro con el DNA desnaturalizado se incuba en una solucin que
contiene sondas radiactivas (molculas de DNA o RNA de cadena
simple, complementarias al fragmento de DNA de inters). Se deja que
las sondas hibriden.
Se lava del filtro el exceso de solucin que contiene las sondas que no
han hibridado. Las molculas de cadena doble que se hayan formado
permanecen en su lugar en el filtro y se visualizan por medio de
autorradiografia. En esta tcnica, cada filtro se cubre con una pelcula
fotogrfica y se deja en la oscuridad. Durante el perodo de exposicin,
el radioistopo presente en las sondas radiactivas libera energa que
impacta la emulsin fotogrfica. Cuando se revela la pelcula, la posicin
del fragmento radiactivo aparece como una marca oscura, como cuando
se expone un sector de pelcula a la luz. Las rplicas de las colonias que
estn marcadas con la sonda radiactiva despus de este tratamiento
permiten identificar a las colonias originales que contenan vectores con
el fragmento de DNA que se deseaba estudiar.

DOT BLOT
Es una tcnica de biologa molecular para detectar biomoleculas. Representa
una simplificacin de los mtodos Northern blot, Southern blot o Western blot.
En un dot blot las biomoleculas para ser detectados no son separadas por
cromatografa. En cambio, una gota que contiene la molcula para ser
detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la
deteccin por sondas de nucletidos (Northern blot y Southern blot) o
anticuerpos (para un western blot).
La tcnica ofrece importantes ahorros en tiempo. Sin embargo, no ofrece
informacin sobre el tamao de la biomoleculas blanco. Adems, si dos
molculas de diferentes tamaos son detectadas, se seguir viendo como un
solo punto. Por lo tanto el dot blot slo puede confirmar la presencia o ausencia
de una biomolcula o biomolcula que pueden ser detectados por las sondas
de ADN o el anticuerpo.
La siguiente imagen ilustra el resultado obtenido de realizar un protocolo dot
blot en el que se fijaron muestras de ADN a la membrana, y posteriormente se
hibridaron con sondas marcadas radiactivamente especficas de ciertas
regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la regin
de inters se revelaron (puntos oscuros). Cuanto mayor es la cantidad del ADN
de inters, mayor es la intensidad del color negro.

CGH (HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA)

La hibridacin genmica comparada es una tcnica citogentica para detectar
regiones cromosmicas que estn amplificadas o delecionadas en una
muestra, especialmente en tumores. En la CGH, dos muestras de DNA
genmico (una tumoral y una normal) se marcan con diferentes fluorocromos
yse hibridan simultneamente sobre una extensin de cromosomas
metafsicos. La relacin de intensidad entre las dos seales fluorescentes
proporciona una medida de la relacin entre el nmero de copias de las dos
muestras de DNA genmico. Una tcnica derivada de la anterior es la matriz de
CGH (CGHarray), en la que los DNAs marcados se hibridan sobre una matriz
de fragmentos de DNA bien definidos, inmovilizados sobre un soporte slido.
Como resultado, la resolucin obtenida se incrementa enormemente, ya que
existe una gran cantidad de fragmentos gnicos representados y de
relativamente pequeo tamao. La alta resolucin de esta tcnica permite la

deteccin de desequilibrios genmicos submicroscpicos. El objetivo de esta

tcnica es comparar de manera rpida y eficientemente dos muestras de ADN
genmico derivado de dos organismo diferentes, que a menudo se relacionan
pues se sospecha que tienen diferencias ya se en la ganancia o prdida de
cromosomas completos o regiones subcromosomales (una porcin del
cromosoma). Esta tcnica implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a
comparar, etiquetado independiente de cada muestra de ADN con un diferentes
fluorforos (molculas fluorescentes) de distintos colores (generalmente rojo y
verde), desnaturalizacin del ADN para volverlo monocatenario, y la hibridacin
de las dos muestras resultantes en una proporcin de 1:1 para una metafase
de propagacin de cromosomas normal, a los cuales las muestras de ADN
marcadas se unirn en su locus de origen. Tenemos que las seales
fluorescentes de colores se comparan con el uso de un microscopio de
fluorescencia y un software, esto a la longitud de onda de cada cromosoma
para identificar las diferencias cromosmicas entre las dos muestras. Una
mayor intensidad de color proveniente de la muestra de prueba en una regin
especfica de un cromosoma indica la ganancia de material en esa regin,
mientras que una mayor intensidad de color de la muestra de referencia indica
la prdida de material en la muestra de ensayo en una regin especfica. Un
color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluorforos son de color rojo y
verde) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa regin.
Esta tcnica solo puede detectar anormalidades cromosmicas no
balanceadas, debido a que las anomalas cromosmicas equilibradas como lo
son las translocaciones recprocas, las inversiones, o los cromosomas anillo
no afectan el nmero de copias, que es lo que se detecta por medio de la
tecnologa CGH. Sin embargo, el CGH permite la exploracin de los 46
cromosomas humanos en una sola prueba, y la deteccin de deleciones y
duplicaciones, en escala microscpica lo que puede conducir a la identificacin
de genes candidatos para estudiarlos ms a fondo mediante otras tcnicas
citolgicas.
MICROARRAY DE ADN (CHIP DE ADN)
Un chip de ADN (microarray ADN) es una superficie slida a la cual se une una
coleccin de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN
son muy variables y pueden ser de vidrio, plstico e incluso de silicona. Los
chips de ADN se usan para analizar la expresin diferencial de genes, y se
monitorean de manera simultnea los niveles de miles de ellos. Su
funcionamiento consiste, bsicamente, en medir el nivel de hibridacin entre la
sonda especfica, y la molcula diana, y se indican generalmente mediante
fluorescencia y a travs de un anlisis de imagen, lo cual indica el nivel de
expresin del gen. Suelen utilizarse para identificar genes con una expresin
diferencial en condiciones distintas. Por ejemplo, para detectar genes que
producen ciertas enfermedades mediante la comparacin de los niveles de

expresin entre clulas sanas y clulas que estn desarrollando ciertos tipos de
enfermedades.

TIPOS DE MICROARRAYS
Microarrays de dos canales
En este tipo de chips de ADN, las sondas son oligonucletidos, ADN
complementario (ADNc) o pequeos fragmentos de reaccin en cadena de la
polimerasa, que corresponden con ARN mensajero (ARNm). En este tipo de
chip de ADN se utilizan preparaciones de ADNc obtenido a partir de dos
muestras biolgicas distintas; por ejemplo, de clulas cultivadas en dos
distintas condiciones. El ADNc de cada muestra se marca con un fluorforo
diferente, y las dos preparaciones de ADNc marcadas se mezclan e hibridan
sobre el mismo chip de ADN. Una vez realizado este primer paso, se procede
al escaneo del resultado y a la visualizacin del mismo. De esta forma se
pueden detectar genes que se activan o se reprimen en distintas condiciones.
La contrapartida de estos experimentos es que no se pueden observar niveles
absolutos en la expresin y requieren qPCR para un anlisis cuantitativo
absoluto.
Chips de oligonucletidos de ADN
En los chips de oligonucletidos de ADN o micromatrices de canal nico, las
sondas se disean a partir de una secuencia conocida o un ARNm predicho.
Estos chips de ADNs dan estimaciones del nivel de expresin, pero en una
misma matriz no pueden observarse distintas condiciones, por lo que por cada
condicin se debe utilizar un chip. Las sondas se sintetizan in situ (en el chip).
No estn basadas en la hibridacin competitiva. Esto quiere decir: un chip, una
muestra. Las secuencias se construyen en la superficie del chip mediante el
elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un solo nucletido
utilizando fotolitografa.
GeneChips de Affymetrix
Affymetrix es la compaa lder en este tipo de chips. Se denominan
genricamente "GeneChips". Cada gen representado por un conjunto de
secuencias cortas que lo caracterizan. Algunos chips: genomas completos con
ms de 50.000 grupos de sondas.
Chips de ADN para genotipado

Los chips de ADN pueden utilizarse para "leer" las secuencias de un genoma
particular en determinadas posiciones. Los SNP arrays son un tipo particular de
matrices que se utilizan para identificar variaciones individuales y a travs de
poblaciones. Los oligonucletidos pequeos son capaces de identificar
polimorfismos de un slo nucletido (en ingls SNPs, single nucleotide
polymorphisms) que podran ser los responsables de variaciones genticas
dentro de una poblacin, la fuente de susceptibilidad a distintas enfermedades
genticas e incluso a ciertos tipos de cncer. En general, la aplicacin de estas
tcnicas de genotipado es forense, ya que son rpidas en descubrir o medir la
predisposicin de enfermedades o incluso permitir el uso de ciertos
medicamentos para tratar ciertas enfermedades segn sea el ADN del enfermo
o donante. Los chips de ADN de SNPs tambin se utilizan para la identificacin
de mutaciones somticas en cncer, sobre todo la prdida de heterocigosis, la
amplificacin o la delecin de regiones de ADN en el genoma individual de
pacientes afectados, es decir, la deteccin de aberraciones cromosmicas.