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Clulas madre de Placenta: su papel en el

tratamiento del cncer de mama
Diapositiva 1: PRESENTACIN
Para m es un placer enormemente el poder compartir en este curso en El Escorial los
resultados que he obtenido desde mi incorporacin al hospital 12 de Octubre y crear el
grupo de Medicina Regenerativa que era una lnea de investigacin totalmente nueva en
el hospital y probablemente en todo el pas en ese momento.

Diapositiva 2: CELULAS DE LOS MAMFEROS

Las clulas de los mamferos se pueden clasificar en tres categoras:

Las clulas de la lnea germinal: que estn destinadas a la formacin de gametos

(vulos o espermatozoides) y son las nicas capaces de transmitir su material gentico a
las generaciones siguientes.
Las clulas somticas: la mayora de las clulas son diploides, es decir, que poseen dos
copias de cada cromosoma. Estas clulas se llaman clulas somticas. Cada una de las
cerca de 100 mil millones de clulas del cuerpo humano posee su propia copia del
genoma, excepto ciertas clulas que han perdido su ncleo celular durante su
diferenciacin, como es el caso de los hemates. La mayora de las clulas que forman el
cuerpo humano son de esta categora.
Las clulas madre: La clula madre es la nica que tiene la capacidad de dividirse
indefinidamente y proporcionar clulas especializadas. Existen clulas madre en todos
los rganos estudiados, pero en muy pequeas cantidades y estn quiescentes, es decir,
no se dividen.

Diapositiva 3: DEFINICIN DE CLULAS MADRE

Para empezar creo que es necesario definir Qu son las clulas madre?
-

Son clulas comodn o clulas en blanco (como una cinta de video sin grabar)
que son capaces de convertirse en cualquier clula del cuerpo humano.

Son clulas que son capaces de renovarse constantemente. Es decir, cada clula
se divide en 2 clulas hijas y stas a su vez en 4. Y esto ocurre de forma
constante.

Esta flexibilidad o capacidad de diferenciacin las convierte en una potencial

fuente inagotable de tejidos y rganos para el transplante. Esto es lo que se
conoce como plasticidad.

Diapositiva 4: Caractersticas de las clulas madre

El retrato robot de una buena clula madre para su uso en terapias celulares y
trasplantes en humanos sera como sigue:
1. Debera aislarse de un modo fcil.
2. Debera ser efectivamente pluripotente, idealmente que se pudiera generar
cualquier tipo buscado de clula bajo los estmulos adecuados.
3. Debera ser inmortal, es decir, tener la capacidad de proliferar (autorrenovarse)
indefinidamente sin que ocurra diferenciacin espontnea para poder as
disponer del nmero adecuado de clulas necesarias para los transplantes.
4. Debera poseer un fenotipo estable, bien caracterizado desde el punto de vista
molecular
5. Debera carecer de potencial tumorignico
6. Debera ser susceptible de manipulacin gentica, para permitir
modificaciones genmicas precisas, incluyendo la introduccin de genes
teraputicos.

Diapositiva 5: APLICACIN DE LAS CLULAS MADRE

El gran auge de las clulas madre se debe a su posible uso para:
-

Obtener clulas y tejidos que van a poder reparar cualquier tejido daado de los
enfermos.

Estudiar acerca de los acontecimientos complejos que ocurren durante el

desarrollo humano y sobre los defectos genticos que llevan al desarrollo de
muchas enfermedades. La meta ms ansiada es descubrir qu mecanismos hacen
que la clula decida especializarse en un momento determinado hasta formar
uno u otro tejido.

Tambin para encontrar medicamentos ms seguros y eficaces y probar

toxicidad en clulas especficas que intervienen en una determinada enfermedad.

Diapositiva 6: TIPOS DE CLULAS MADRE

Las clulas madre se clasifican fundamentalmente en embrionarias y adultas.
- Clulas madre Embrionarias:
.-Clulas madre adultas:
No voy a entrar en detalles en ninguna de ellas. Aqu he puesto algunos ejemplos de
clulas madre adultas, como las de mdula sea, sangre perifrica y sangre de cordn,
porque ya se estn utilizando en clnica desde hace muchos aos, y tambin he puesto
las clulas de la placenta que son consideradas clulas madre adultas y es en el campo
en que yo estoy trabajando.
Diapositiva 7: CARACTERSTICAS DE LAS CELULAS MADRE ADULTAS

- Se han encontrado en la mayora de los tejidos adultos examinados aunque en

cantidades muy pequeas.
- Estas clulas madre adultas sirven para reparar los tejidos daados cuando las lesiones
son muy pequeas.
- Se trata por tanto, de clulas progenitoras no diferenciadas con cierta capacidad de
diferenciacin. En un principio se pens que las clulas madre adultas eran
multipontenciales, es decir, slo podan dar lugar a clulas diferenciadas del tejido
donde se encontraban o como mucho de la misma capa embrionaria.
Sin embargo, es cada vez ms evidente que las clulas de un tejido son capaces de dar
lugar a clulas especializadas de otros tejidos, incluso de tejidos procedentes de capas
diferentes del embrin. El caso ms tpico es el de las clulas madre hematopoyticas
que son capaces de diferenciarse a tejido heptico, cardiaco y nervioso.
- Son clulas ms difciles de manejar y cultivar que las embrionarias y con mucha
menor capacidad de diferenciacin.
- Hace ya ms de 50 aos que se descubrieron las clulas madre de la mdula sea y
desde entonces se han usado en clnica. Se estn produciendo diariamente en un adulto
y van a dar lugar a clulas ms especializadas como por ejemplo, se producen 200
billones de clulas rojas de la sangre cada da en el cuerpo humano.

Diapositiva 8: CLULAS MADRE DE LA MDULA SEA

Existen dos tipos principales de clulas madre en la mdula sea, las clulas madre
hematopoyticas y las clulas mesenquimales.

Diapositiva 9: CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS

Las HSC han sido identificadas tanto in vitro como in vivo por varios laboratorios y
utilizadas clnicamente desde hace ms de 50 aos.
El trasplante alognico de progenitores hematopoyticos ha demostrado definitivamente
que existen clulas madre multipotenciales hematopoyticas en la mdula sea y en la
sangre perifrica.
Las clulas madre hematopoyticas reabastecen tres tipos de clulas sanguneas:
eritrocitos, comnmente conocidos como glbulos rojos; plaquetas, tambin conocidas
como clulas coaguladoras de la sangre; y leucocitos, los glbulos blancos del sistema
inmunolgico (neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos T y linfocitos B).
Cuando el cuerpo necesita reemplazar glbulos rojos, plaquetas para la coagulacin de
la sangre o clulas inmunes, las clulas madre localizadas en la mdula sea maduran en
un proceso conocido como hematopoyesis. La hematopoyesis contina ocurriendo
constantemente en el cuerpo humano, pero ciertas condiciones requieren una actividad
incrementada. Por ejemplo, cuando una persona se muda a un lugar de gran altitud o
intenta recuperarse de un sangrado grave, nmeros incrementados de clulas madre
deben movilizarse de la mdula sea hacia adentro del torrente sanguneo.

Diapositiva 10: CELULAS MADRE MESENQUIMALES

Una de los tipos de clulas madre adultas ms estudiadas son las clulas madre
mesenquimales de la mdula sea. The International Society for Cellular Therapy en el
ao 2006 defini los criterios mnimos que debe de cumplir una clula para ser definida
como mesenchymal or stromal. Entre ellos, las MSC se aslan fcilmente de mdula
sea debido a su capacidad de adherencia al plstico.
Tienen que tener una morfologa de fibroblasto y no existe ningn marcador especfico
que defina estas clulas y su identificacin se realiza por la presencia de distintos
marcadores de superficie como CD90, CD73, y, CD105. Las MSC no expresan
antgenos se superficie tpicos de las HSC como CD34, CD45 o CD14.

Diapositiva 11: DIFERENCIACIN DE LAS MSC

Las clulas madre mesenquimales (MSC) humanas se caracterizan adems porque se
diferencian a tejidos derivados del mesodermo como son la grasa, hueso, cartlago y
msculo.Posteriormente, se vi que tenan una capacidad de diferenciacin mayor a la
esperado y se vi que se diferenciaban a tejidos derivados del endodermo como el
hgado y del ectodermo, como las neuronas.
La mdula sea es la fuente de MSC ms estudiada para su uso en terapia celular.
Sin embargo, existen una serie de inconvenientes como son, que su obtencin se realiza
mediante una tcnica invasiva que tiene sus riesgos para el donante y adems el nmero
de clulas madre presentes y la capacidad de proliferacin y diferenciacin de estas
clulas disminuye con la edad del donante. Esto hace que se busquen alternativas en
otros tejidos.

Diapositiva 12: CLULAS MADRE OBTENIDAS DE LA PLACENTA

Placenta y el lquido amnitico como fuente de clulas madre.
Fuente de clulas:

Hematopoyticas.

Clulas semejantes a las clulas mesenquimales.

Clulas obtenidas de:

Del lquido amnitico: procedente de amniocentesis.

Del villi corinico.

De la membrana amnitica.

Del cordn umbilical.

No existe riesgo para el donante.

Tejido adulto sin problemas ticos.
Gran capacidad de diferenciacin.

La placenta puede representar una gran fuente importante de obtencin de clulas madre
adultas. La placenta es un tejido que se desecha despus del nacimiento y su uso no
presenta ningn riesgo para el donante. Un tejido considerado adulto y que adems se
descarta despus del parto es la placenta.
La placenta una fuente de clulas madre tanto hematopoyticas como mesenquimales.

Se han obtenido clulas madre de los distintos tejidos que componen la placenta.
Una ventaja respecto a otros tejidos es que la obtencin de clulas no existe riesgo para
el donante.
Se trata de un tejido adulto sin problemas ticos.
Y se ha visto que las clulas obtenidas tienen una gran capacidad de diferenciacin

Diapositiva 13: Obtencin de clulas madre de la placenta humana

Nuestro trabajo se basa en el aislamiento de clulas madre del saco amnitico.
Mediante una serie de digestiones enzimticas obtuvimos unas clulas que en un
principio se trata de un cultivo heterogneo con clulas adherentes, clulas semiadherentes que crecen en grupos o clusters y clulas en suspensin.

Diapositiva 14: MORFOLOGA DE CLULAS ADHERENTES

Lasno adherentes se eliminan y las clulas adherentes forman colonias alrededor del da
10 de cultivo, que poco a poco van llenando la placa de cultivo. Estas clulas tienen
morfologa tipo fibroblasto, como veis en esta diapositiva en cultivo a baja ya alta
densidad. Esta morfologa tipo fibroblasto se mantiene hasta el final del periodo de
cultivo. Alrededor del pase 20 las clulas dejan de dividirse y adquieren una morfologa
tpica de clulas senescentes donde las clulas se agrandan y se vacuolizan.

Diapositiva 15: DINMICA DE LA POBLACIN

La dinmica de crecimiento de las clulas derivadas del saco amnitico es de tipo
exponencial, como se observa en el ejemplo presentado en esta diapositiva. Las clulas
se expanden a lo largo de 148 das (5 meses) y una media de 20 pases, desde un nmero
inicial medio de 6 x 106 y generando un nmero acumulado de clulas de 1014, es decir,
el nmero de clulas ha aumentado una media de 37 millones de veces.

Diapositiva 16: Determinacin del origen de las clulas obtenidas de la placenta

(FISH).
El saco amnitico est formado por dos capas de origen fetal (amino y corion) y una
capa de origen materno. Para determinar el origen materno o fetal de nuestras clulas,
clulas procedentes de una placenta de varn se analizaron mediante Hibridacin in situ
fluorescente para los cromosomas sexuales X e Y. El cromosoma X aparece teido en
verde (FITC) y el cromosoma Y en rojo (TRITC). La cromatina de las clulas se ti

con DAPI y aparece en azul. En todas las clulas analizadas se observa presencia de dos
seales de cromosoma X sugiriendo que las clulas son de origen materno y por tanto,
procedentes de la decidua. Estos experimentos se realizaron en 3 placentas de varn.

Diapositiva 17: Marcadores de clulas hematopoyticas (HSC)

Mediante citmetria de flujo se ha analizado el fenotipo de las clulas obtenidas. Como
se observa en esta diapositiva, las clulas obtenidas de la placenta son negativas para los
marcadores de clulas hematopoyticas CD45, CD34, y otros marcadores de clulas
hematopoycticas menos diferenciadas (CD133 y BCRP1 (caracterstico de la
subpoblacin muy primitiva denominada SP o side population).

Diapositiva 18: Marcadores de clulas mesenquimales (MSC)

Sin embargo, la clulas son positivas para los antgenos caractersticos de las clulas
mesenquimales: CD73, CD105, CD44, CD117, CD90 y CD13.
.
Estos resultados demuestran que las clulas con morfologa de fibroblasto obtenidas del
saco amnitico de la placenta humana son clulas de tipo mesenquimal y proviene de la
decidua y decidimos llamarlas decidua-derived mesenchymal stem cells (DMSCs) de
sus siglas en ingls.

Diapositiva 19: Marcadores de inmnoreactividad

Al igual que las MSC de mdula sea, las DMSCs son positivas para marcador I de
histocompatibilidad tipo I y negativas para el marcador II de histocompatibilidad. Estas
clulas de la placenta no expresan otras molculas que son co-estimuladoras de los
linfocitos T, como son CD40L, CD80 y CD86. Por lo tanto, es un indicador de que las
clulas no van ser reconocidas por el sistema inmune del receptor y no van a presentar
rechazo en trasplantes alognicos.

Diapositiva 20: Marcadores de clulas embrionarias

Como la placenta es un rgano fetal y aunque se considera rgano adulto decidimos
estudiar si las clulas que hemos aislado presentan alguna caracterstica de las clulas
embrionarias. Por ejemplo se ha visto que las clulas del lquido amnitico si expresan
marcadores embrionarios. Sin embargo, las clulas de placenta no expresan los
marcadores embrionarios SSEA1, SSEA3 y SSEA4 (embryonic stage-specific marker).

Tampoco parecen expresar los marcadores TRA1-60 y TRA1-81 (las clulas de lquido
amnitico si que expresan el SSEA4 aunque no los otros).

Sin embargo, si que expresan otros marcadores embrionarios como son el Oct4 y Rex y
que son factores de transcripcin asociados con la proliferacin y la capacidad de
diferenciacin de las clulas embrionarias y de las clulas madre adutas.
Oct4 se expresa slo en clulas que pueden diferenciarse a tipos celulares de las 3 capas
embrionarias. Estos dos factores estn relacionados ya que un cambio en la expresin de
Oct4 (over or under-expression) lleva a una down-regulation de la expresin de Rex y
se induce diferenciacin.
Otro factor de transcripcin es el GATA4 que es un factor de transcripcin
mesodrmico embrionario y que juega un papel importante en la diferenciacin
mesodrmica y endodrmica tambin se expresa en estas clulas. Este factor no se
expresa normalmente en clulas mesenquimales de la mdula sea a no ser que se
expresen en condiciones especiales de bajo suero y baja densidad.
La expresin de estos 3 factores raramente se ha reportado en clulas adultas.
El hecho de que se expresen algunos de los factores embrionarios (Oct-4, Rex y GATA)
en estas clulas y no otros (SSEA y TRA) indica que estas clulas de placenta no son
tan primitivas como las clulas embrionarias pero pueden tener un potencial mayor que
otros tipos de clulas adultas.

Diapositiva 21: Estudio de su potencialidad

Por ello, decidimos estudiar la capacidad de diferenciacin de estas clulas a diferentes
tejidos.

Diapositiva 22: Diferenciacin mesodrmica.

Entre las caractersticas que definen a una clula como mesenquimal o estromal es su
capacidad de diferenciacin a hueso, donde aqu vemos la formacin de depsitos de
cristales de calcio que se tieron con una tcnica que se llama Alizarin red.

Tambin se diferencian a tejido graso. Los adipocitos formados acumulan gotas de

grasa dentro de las clulas que con la tincin con Oil Red las clulas aparecen de color
rojo brillante al microscopio.

Tambin se diferencian a condroblastos formando una de matriz extracelular

tridimensional de proteoglicano, y que se evidencia mediante tincin por
inmunocitoqumica de la protena condroitin sulfato que se expresa en los
condroblastos.

Las clulas se diferencian a msculo esqueltico y presentan una morfologa alargada

caracterstica de los precursores de miotubos y son positivas para la protea
caracterstica de ese tejido.
Tambin se diferencian a msculo cardaco, y expresan el pptido natriurtico atrial,
una hormona natriurtica sintetizada, almacenada y liberada por los cardiomiocitos
auriculares

Estas tinciones son negativas en las clulas sin diferenciar.

Diapositiva 23: Diferenciacin mesodrmica (RT-PCR).

Adems, estas diferenciaciones se comprobaron mediante la tcnica de las transcricin
inversa (RT-PCR), donde se comprobo que ldistintos genes especficos de cada tejido,
no se expresaban en las clulas sin diferenciar o su expresin aumentaba con la
diferenciacin.

Diapositiva 24: Diferenciacin endodrmica y ectodrmica.

Las DMSCs en medio de diferenciacin heptica cambiaban la morfologa formando
clulas primero similares a los hepatocitos y finalmente estructuras tridimensionales
conocidas como hepatosferas.
En diferenciacin pulmonar se obtienen clulas con morfologa epitelioide con
estructuras interiores similares a los cuerpos lamelares en su interior y que son las
estructuras que producen el surfactante pulmonar. Aqu veis la visin de una de ellas
con el microscopio elctrnico. Estas clulas son positivas para protenas del
surfactantes como la Protenas Surfactante C.

En cuanto a la diferenciacin ectodrmica, las clulas en presencia de medio de

diferenciacin neural fueron capaces de adquirir morfologa de neuronas y expresar una
protena tpica neuronal como la -III tubulina.

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Diapositiva 25: Diferenciacin endodrmica y ectodrmica (RT-PCR).

De nuevo, estas diferenciaciones se comprobaron mediante la tcnica de las transcricin
inversa (RT-PCR), donde se comprobo que ldistintos genes especficos de cada tejido,
no se expresaban en las clulas sin diferenciar o su expresin aumentaba con la
diferenciacin.

Diapositiva 26: Capacidad de diferenciacin clonal I

Una de las cuestiones ms importantes acerca de las clulas madre es la posibilidad de
que se trate de una poblacin heterognea como as ocurre con las MSC de mdula sea
que est compuesta por diferentes precursores con distinta capacidad de diferenciacin.
Para descartar esta posibilidad seleccionamos 4 clones procedentes de dos placentas
diferentes y estudiamos su capacidad de diferenciacin.
Estos son los 4 clones que vimos que eran capaces de diferenciarse a las 3 capas
embrionarias; a gras del mesodermo, a pulmn del endodermo y neuronas del
ectodermo. Esto sugiere que las DMSCs son una poblacin homognea de clulas
mesenquimales/stromales.

Diapositiva 27: Anlisis del cariotipo.

Para que las clulas puedan utilizarse en un futuro hay que estudiar si son clulas que
pueden ser seguras y que no van a presentar riesgos como la formacin de tumores.
Nosotros analizamos el cariotipo de 3 cultivos diferentes al final del cutivo cuando las
clulas son casi senescentes y no observamos ningn tipo de aberracin cromosmica lo
cual indica que las clulas pueden ser seguras para un uso futuro en la clnica.

Diapositiva 28: Anlsis de la actividad telomerasa.

Uno de los problemas de las clulas embrionarias es que cuando se transplantan en
animales son capaces de inducir tumores debido a la gran capacidad de proliferacin de
dichas clulas. Esa alta capacidad de proliferacin es debida a que las clulas
embrionarias presentan una alta actividad telomerasa.
Las clulas de la placenta aisladas por nosotros presentan una modesta actividad
telomerasa cuando se comparan con las clulas control que vienen con el kit de
actividad. Adems, esta actividad disminuye a lo largo del cultivo y es prcticamente
indetectable a partir del pase nmero 10.

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Este resultado sumado a la establidad cromosmica es indicativo de que las clulas que
hemos aislado de la placenta van a ser seguras para su uso futuro en la clnica.
Esto ya lo hemos analizado mediante su inyeccin en ratones inmunodeprimidos para
estudiar y despus de 5 meses no encontramos ningn tumor en ninguno de los 10
ratones inyectados.

Diapositiva 29: Publicaciones.

Estos resultados han sido el resultado de dos publicaciones que ya estn colgadas creo
en el campus virtual del curso.

.
Diapositiva 30: Papel de las MSCs en cncer.

MSCs tienen afinidad por los sitios donde hay heridas y/o inflamacin

Los tumores se consideran como heridas que nunca se curan

MSCs migran a los tumores y afecta su biologa y crecimiento

MSCs como vehculos celulares de agentes teraputicos reduciendo as su

toxicidad y aumentando su efectividad

La migracin de las clulas a los sitios donde haya una herida, una inflamacin es un
proceso intrnseco de estas clulas que se ha explotado para usarlas como vehculos
celulares de agentes teraputicos, para hacer una terapia dirigida y localizada. Esto,
unido a su capacidad de expresar genes exgenos, hace a las MSCs como unos
excelentes vehculos celulares para el tratamiento antitumoral, previamente demostrado
no solamente en el tratamiento de tumores sino adems en otras enfermedades como la
enfermedad de injerto contar huesped, la esclerosis mltiple o la artritis (estas eran
referencias de otros tipos de clulas no de MSCs).

Los fibroblastos y las clulas endoteliales son las clulas que estn normalmente
implicadas en el proceso de reparacin de una herida del tipo que sea. Los fibroblastos
como fuente de matriz extracelular y las clulas endoteliales controlan la angiognesis.
Las MSCs migran a la zona daada y secretan factores de crecimento tales como EGF,
FGF, PDGF, VEGF, IGF-1, angiopoietin-1, SDF-1, todos, los cuales van a afectar el
desarrollo de los fibroblastos y las clulas endoteliales. Este parece ser el mecanismo

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fundamental en el que las clulas MSCs participan en la reparacin de una herida, es

decir, de forma paracrina. De hecho, las MSCs in vivo desaparecen al poco tiempo
despus de su infusin en los tejidos daados y su diferenciacin a esos tejidos es un
evento raramente observado en enfermedades como el infarto de miocardio o el fallo
renal agudo, entre otros. De hecho, el sobrenadante de las clulas MSCs es efectivo en
el tratamiento de una herida de piel.

Diapositiva 31: MSCs transformadas mediante ingeniera biomdica para el

tratamiento de tumores
This is just an example of engineered mesenchymal stem cells (MSCs) as targeted
tumor therapy (Trojan Horse MSC therapy). Therapeutic genes under the control of
a promoter/enhancer are transfected into MSCs. After systemic application, engineered
MSCs home to the tumor environment where they undergo differentiation and
consecutive promoter-driven activation of the transgene.

Diapositiva 32: Migracin de las DMSCs in vitro

Primero estudiamos in vitro la capacidad que tenan estas clulas mesenquimales de
placenta. Para estos estudios in vitro se usaron unos trans-well o cmaras que tienen una
membrana con un poro lo sufientemente grande para que las clulas puedan pasar al
otro lado.
Las clulas se colocan en suspensin en la parte superior de la membrana y el
homogenado de tejido en la parte inferior y que los factores que estn all van a actuar
como atrayentes de las clulas. Como control se utiliza el mismo medio pero sin tejido.
Posteriormente, a diferentes tiempos se quitan las clulas de la parte superiror del tranwell que no han migrado y las clulas que han migrado se tien de azul con un tinte.
Posteriormente, es transwell se pasa a un pocillo vaco al que se le aade solucin de
extraccin que va a extraer el color de las clulas y esa solucin se mide a 560 nm.
Estudio de la capacidad de migracin y de injerto de las clulas mesenquimales de
placenta en ensayos in vitro e in vivo.

Diapositiva 33: Migracin en presencia de tejido mamario humano

Primero estudiamos si las clulas migraban en presencia de tejido mamario humano
sano y tumoral de la misma paciente. En presencia de medio solo (control) se ve que las
clulas no migraban ya que la DO era la misma que la de la solucin de extraccin.

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En presencia de tejido mamario sano las clulas tienen una migracin mayor y que es
significativa respecto al medio solo. Pero lo interesante es que esta migracin en mucho
mayor en presencia de tejido tumoral de la misma paciente y es significativamente ms
alta si se compara con el tejido sano. Por lo tanto, en el tumor hay una serie de factores
de crecimiento, citoquinas, factores de inflamacin, etc que hacen que las clulas de
placenta tengan una migracin mayor.

Diapositiva 34: Histologa de los tumores mamarios de rata

Para estudiar demostrar el efecto migratorio de estas clulas no solo in vitro, sino
tambin in vivo, necesitbamos un modelo animal. Los estudios experimentales en
animales nos dan la posibilidad en primer lugar de disear modelos muy similares a los
humanos.
Existen numerosos estudios, tanto de la Dra. Vegh, con quien he desarrollado este
proyecto, como de otros grupoes en los que se demuestra que mediante un agente
qumico, como es la nitrosometil urea, indujimos tumores de mama en ratas que
histolgicamente son adeno-carcinomas. Aqu podemos ver tanto en una foto de
contraste de fase del tumor como un anlisis anatomopatolgico, la demostracin de que
dichos tumores son dadenocarcinomas mamarios.
Los tumores en las ratas claramente son adenocarcinomas como se aprecia tanto en la
fotografia de contraste de fase como en la tincin con hematoxilina pues se aprecia la
formacin de glndulas muy bien definidas, con clulas epiteliales pequeas, de ncleos
redondos, hipercromticos y homogneos y en los que no se aprecia el nucleolo. Las
clulas neoplsicas forman glndulas, muy bien definidas, que muestran un material de
secrecin plido.

Diapositiva 35: Migracin a diferentes concentraciones de tejido tumoral (3 horas)

Ensayamos la migracin de las clulas de placenta en presencia de homogenado de los
tumores de rata a 3 horas y en presencia de diferentes concentraciones de tumor. En
todas las concentraciones existe una gran migracin si se compara con las clulas en
presencia de medio solo y sin tejido. Esta es una foto hecha con un microscopio
invertido de la membrana despus de teirse.

Diapositiva 36: Cuantificacin de la migracin en funcin del tiempo y la

concentracin

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Si cuantificamos la migracin a diferentes concentraciones de tejido y a diferentes

tiempos, 1.5, 3 y 6 horas y lo referimos al control, vemos que la migracin es similar a
las diferentes concentraciones y a los diferentes tiempos y significativamente ms lata
que en presencia de medio sin tejido tumoral.

Diapositiva 37: Migracin en presencia de homogenado de clulas tumorales

Puede ser que la migracin la estn produciendo factores presentes en el microambiente
tumoral o factores liberados por las propias clulas tumorales.
Cuando ensayamos la migracin en presencia de clulas aisladas de esos tumores de
rata, con el tejido, vimos que no haba diferencias significativas entre ambos, lo que
sugiere que son las propias clulas tumorales la que estn induciendo la migracin de
las clulas de placenta.
Es interesante ver como fibroblastos de piel apenas inducen migracin en estas clulas,
lo que indica que las clulaslde placenta tienen una alta afinidad por el tejido mamario,
y esta afinidad es mayor cuando existe un tumor.

Diapositiva 38: Ensayos de migracin in vivo

Por ltimo, haba que comprobar si las clulas eran capaces de migrar in vivo hacia los
tumores. Para ello las clulas se marcaron con el marcador fluorescente PKH26.
PKH26 es un marcador fluorescente con largas cadenas alifticas que se incorpora en
las regiones lipdicas de las membranas celulares. La primera foto es las clulas en
suspensin nada ms teirse y que se se inyectaron en la cola de las ratas.

En esta segunda foto, son las clulas despus cultivadas in vitro en las placas de cultivo
donde se ve que la tincin es de membrana.

Diapositiva 39: Migracin in vivo de las DMSCs

Una vez inyectadas las clulas en las ratas con tumor, a las 24-72 horas se extrajeron los
tumores, se cortaron y se vieron zonas donde estaban clulas marcadas rojo fluorescente
en medio de grandes zonas donde no haba clulas rojas. Con ello, demostramos dos
cosas, las clulas de la placenta son capaces de migrar y de injertar en la zona tumoral in
vivo.
Como las DMSCS son clulas humanas, para demostrar que la fluorescencia roja que
veamos era especfica de las clulas, marcamos la misma zona del tumor mediante

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inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-nucleo humano que va a reconocer

especficamente las clulas humanas vemos que el marcaje en rojo del PKH26 coincide
con el marcaje en verde del anticuerpo anti-nucleo humano. Por lo tanto, esto confirma
que las clulas humanas, migran y se injertan dentro de los tumores.

Diapositiva 40: Efecto de las DMSCs en el crecimiento de los tumores mamarios.

En los ltimos aos se han publicado trabajos con resultados encontrados respecto al
papel inhibitorio o de ayuda en la expansin de los tumores de las MSCs.
Estudiar primero el efecto de estas clulas sobre la biologa y el crecimiento de los
tumores era algo fundamental ntes de poder emplearse como vehculos celulares de
agentes anticancergenos.
Para ello, efectuamos una serie de inyecciones intravenosas a las ratas, un total de 5
inyecciones semanales. Como controles usamos ratas con tumores a las que se les
inyect el vehculo pero sin clulas.
Lo que observamos es que el crecimiento de los tumores en las ratas control era bastante
importante de una semana a otra y a las dos semanas, el tamao ya era
significativamente ms grande que cuando apareci el tumor.
Sin embargo, en las ratas tratadas con clulas, haba una disminucin inicial de los
tumores con un crecimiento mucho ms lento, de manera que hasta la semana 5 no
haba un diferencia significativa respecto al tamao inicial. Al final del experimento la
diferencia entre los tumores de un grupo y otro era significativamente ms alta en las
ratas control que en las ratas tratadas con las clulas madre de placenta.
Otro dato importante es que los tumores secundarios aparecan ms tarde en las ratas
tratadas con clulas y el tamaos inicial de dichos tumores secundarios era
significativamente ms bajo en las ratas tratadas con las clulas que en las ratas control.

Diapositiva 41: Efecto de las DMSCs en el crecimiento de los tumores mamarios.

Al final del experimento comparamos la media del nmero total de tumores y vimos
que era significativamente ms alta en las ratas control que en las tratadas con clulas
respecto al inicio del experimento.
Y tanto el volumen como el peso de los tumores primarios es tambin
significativamente ms alto en las ratas tratadas con las clulas. Aunque no encontramos
diferencias en el volumen y el peso de los tumores secundarios dado que estos ya
aparecen cuando se deja de administrar las clulas.

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Diapositiva 42: Cancer Gene Therapy

Estos resultados acaban de ser publicados en la revista Cancer Gene Therapy del grupo
Nature.

Diapositiva 43: Capacidad de transfeccin. Nucleofeccin.

Para poder usar las DMSCs como vehculos celulares para el transporte de genes
anticancergenos necesitamos usar una tcnica que nos permita introducir genes en estas
clulas.
Hemos usando la tecnologa de la nucleofeccin que es una nueva tcnica no basada en
virus y especialmente diseada para clulas primarias. Esta tcnica combina parmetros
elctricos con disoluciones especficas para cada tipo celular con el fin de introducir
plsmidos de ADN en el interior del ncleo celular. Dadoque son clulas de naturaleza
mesenquimal usamos la solucin especfica para la transfeccin de las clulas
mesenquimales de mdula sea.

Diapositiva 44: Capacidad de transfeccin.

Mediante nucleofeccin y como se aprecia en la diapositiva, las clulas se transfectaron
con una alta capacidad (entre el 80-90%, medido mediante citometra de flujo) y con
una muerte celular baja (alrededor del 17-20%).

Diapositiva 45: Resumen.

La placenta es un tejido adulto sin problemas ticos
No existe riesgo para el donante
Se pueden obtener clulas en gran cantidad
Las clulas tienen gran capacidad de expansin y diferenciacin
Las clulas tienen baja capacidad inmunolgica, por lo que van a ser muy tiles en
trasplantes sin tener que buscar un donante compatible,
Son clulas que migran hacia los tumores e inhiben su crecimiento. Por lo tanto, son
agentes teraputicos en s mismas.
Pero a la vez se pueden adems usar como vehculos celulares de agentes teraputicos
puesto que se pueden transfectar usando la tcnica de la nuclefeccin para inrtaducir
agentes anti-cancergenos.

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Diapositiva 46: Colaboradores

Irene Vegh
Jess Grande Garca
Paz de la Torre
Monserrat Grau
Marbella Gracia

Rafael Bornstein
M Isabel Macas
Ana Moreno
Irene Domnguez

Diapositiva 47: Gracias por su atencin

Este es nuestro hospital y aqu se encuentra localizado nuestro centro de investigacin.