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TEMA:
AISLAMIENTO Y PATOGNICIDAD DEL HONGO NATIVO Beauveria bassiana
(Bals) Vuill. CONTROLADOR BIOLGICO DE LA BROCA DEL CAFETO
Hypothenemus hampei (Ferrari).
POR:
ELMER MOISES ARIAS ZEPEDA.
I.
UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR.
RECTORA:
SECRETARIO GENERAL:
DECANO:
SECRETARIO:
ii.
DOCENTES DIRECTORES.
iii.
RESUMEN.
La investigacin se realizo en su primera parte en las instalaciones de los
laboratorios de investigacin de PROCAFE Fundacin Salvadorea para la
investigacin del caf; ubicada en la ciudad de Santa Tecla. El objetivo de la
presente investigacin fue el de aislar el hongo nativo Beauveria bassiana que se
encuentra naturalmente infectando la broca, proveniente de fincas cafetaleras a
partir del cual posteriormente se desarroll la tcnica de produccin de esporas
en
medio
slido
arroz
precocido.
Para
determinar
la
patognicidad,
sintomatologa, crecimiento del micelio y que dosis causa mayor mortalidad por la
actividad fngica sobre los insectos diaria en el transcurso de diez das. Se instalo
un bioensayo en condiciones de laboratorio bajo un diseo completamente al
azar con cinco tratamientos los cuales consistan en suspensiones de esporas en
agua del aislado Esmeralda sobre una poblacin de brocas las cuales se
inocularon por inmersin durante dos minutos en cada uno de los siguientes
tratamientos: T1: testigo, T2: 1gr de B. bassiana/ lt de agua, T3: 5gr de B.
bassiana/ lt de agua, T4: 10 gr. de B. bassiana/ lt de agua y T5: 15gr de B.
bassiana/ lt de agua. Cada uno de los cuales cont con 23 repeticiones las cuales
fueron brocas inoculadas por inmersin y confinadas individualmente en tubos de
vidrio.
iv.
para causar
v.
DEDICATORIA.
A DIOS TODO PODEROSO: por estar siempre a mi lado tanto en los malos
como en los buenos momentos de mi vida y darme la fortaleza para salir avante
en mi formacin profesional.
vi.
AGRADECIMIENTOS.
INDICE
PG.
Autoridades Universitarias..
Asesores .
Resumen..........
Dedicatoria...
Agradecimientos......
i
ii
iii
v
vi
1 Introduccin...
2 Revisin de literatura..
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
3
3
3
4
4
4
4
5
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
16
18
18
21
21
23
23
24
25
25
26
PAG.
Materiales y mtodos
3.1 Fase I. Recoleccin del material.....
3.2 Fase II. Aislamiento del hongo B. bassiana..
3.2.1 Reproduccin y produccin de esporas en medio slido
arroz (arroz precocido). ..
3.2.1.1 Preparacin del Arroz..
3.2.1.2 Inoculacin en botellas....
3.2.1.3 Obtencin de esporas...................
3.2.1.4 Recuento de conidias..
3.3 Fase III. Bioensayo de patognicidad de laboratorio..
3.4 Fase IV. Ensayo de patognicidad a nivel de campo.
27
27
28
29
Resultados y discusin
4.1
Resultado del aislamiento el hongo nativo B. bassiana..
4.2
Resultado de produccin de esporas.
4.3
Resultado del bioensayo de patognicidad de laboratorio.
4.4
Resultado del bioensayo de patognicidad de campo...
36
36
37
38
40
5
6
7
8
Conclusiones
Recomendaciones..
Bibliografa
Anexos...
43
44
45
50
29
29
30
31
32
34
INDICE DE CUADROS.
PAG.
Cuadro 1 Dosis aplicadas por litro de agua en el bioensayo de
laboratorio para determinar la patognicidad de B. bassiana
sobre la broca.. 32
INDICE DE FIGURAS.
PAG.
Fig. 1
Fig. 2
15
Fig. 3
19
Fig. 4
20
Fig.5
Fig.6
Fig. 7
Fig. 8
Fig. 9
33
Fig.12
36
Fig.13
36
Fig.14
Fig.15
Fig.16
43
NDICE DE ANEXOS.
PG.
Numero de brocas muertas registradas por la infeccin de B. 51
Anexo.1 bassiana de forma natural e inducida despus de la aplicacin
en el tratamiento testigo T1.
Numero de brocas muertas registradas por la infeccin de B. 51
Anexo.2 bassiana de forma natural e inducida despus de la aplicacin
en el tratamiento T2
Numero de brocas muertas registradas por la infeccin de B. 52
Anexo.3 bassiana de forma natural e inducida despus de la aplicacin
en el tratamiento T3.
Numero de brocas muertas registradas por la infeccin de B. 52
Anexo.4 bassiana de forma natural e inducida despus de la aplicacin
en el tratamiento T3.
1
1. INTRODUCCIN.
El cultivo del caf es uno de los ms importantes de la agricultura tropical y
subtropical, cultivndose en casi todos los pases del trpico. Sin embargo se ve
seriamente
amenazado
por
el
insecto
plaga
llamado
broca
del
fruto
Es por ello que la presente investigacin llevada acabo desde junio del 2005 a
febrero del 2006 tuvo como objetivo el aislamiento, produccin y patognicidad
del hongo nativo proveniente de fincas cafetaleras aislado de brocas infectadas y
purificndolo en medio nutritivo PDA. El cual posteriormente se produjo en medio
slido arroz para obtener suficiente cantidad de inoculo y comprobar mediante
ensayos de laboratorio y de campo su patognicidad sobre la broca del caf.
3
2. REVISION DE LITERATURA.
2.1 La broca (Hypothenemus hampei).
2.1.1 Clasificacin taxonmica.
La clasificacin sistemtica de la broca
Clase:
Insecta.
Orden:
Sub.-orden:
Polyphaga.
Infra-orden:
Cucujiformia.
Sper-familia: Cucurlionidea.
Familia:
Scolytidae
Sub.-familia:
Ipine.
Genero:
Hypothenemus.
Especie:
4
2.2.1 Huevos.
Los huevos son de color blanco lechoso, recin ovipositados y a medida que el
periodo de incubacin progresa se tornan de color amarillento, midiendo de 0.54 a
0.83 mm de largo y 0.2 mm de dimetro (Barrientos et.al, 1995).
2.2.2 Larvas.
La hembra tiene tres estados larvarios y los machos dos. Las larvas presentan el
aspecto y color de un grano de arroz .Las larvas jvenes son ms o menos
rectilneas y ligeramente estrechas en la parte ventral. A medida que se
desarrollan, la depresin ventral es menos marcada y se curvan en forma de C.
Las larvas adultas son blandas, de color blanco lechoso y su cabeza esta bien
diferenciada. El cuerpo esta cubierto por grandes setas, que miden de 1.17 a 1.75
mm. de largo y 0.37 a 0.58 de grosor (Borbn, 1991).
2.2.3 Ninfas
Son de color blanco y corresponden al tipo de Pupa libre, en el cual a medida
progresa el desarrollo, se van diferenciando cada uno de los apndices de la
cabeza, las alas y las patas. Prximo a transformarse en adultos, tienen todos los
apndices bien diferenciados y se tornan de color amarillento plido a caf oscuro
(Barrientos et.al, 1995).
2.2.4 Adultos.
Existe un marcado dimorfismo sexual entre los adulto; la hembra es mas grande
que el macho, ella mide 1.37 A 1.82 mm de largo y 0.62 a 0.80 mm de ancho,
mientras que el macho mide 1.00 a 1.25 mm de largo y 0.50 a 0.60 mm de ancho.
Ambos tienen en el cuerpo setas y en la cabeza tienen una corona de
protuberancia como dientes. Los jvenes adultos son de color amarillo al
nacimiento y van oscurecindose con el tiempo, hasta alcanzar el color negro
brillante (Borbn, 1991).
Segn Hernndez y Paz (2000) entre las actividades culturales que se realizan
para reducir el dao de la broca se encuentran:
Buen control de malezas.
Recoleccin de los frutos del suelo y de la planta inmediatamente luego de
realizada la cosecha.
Recoleccin de los primeros frutos perforados por la broca que permanezcan en
las fincas (maduros y verdes).
Iniciar la recoleccin por los lotes mas afectados por la broca.
Sombra regulada en fincas.
Poda de cafetos (sanitaria y de produccin).
8
Registro de floracin.
Muestreos para conocer los niveles de infestacin.
Una de las causas de infestacin de las nuevas cosechas es atribuida a una
poblacin remanente de adultos que permanecen en al suelo como consecuencia
de la cada de frutos infestados. Donde los estados biolgicos presentes pueden
desarrollarse y provocar en el tiempo ataques severos (Bernal et, al. 1997).
10
11
El
desarrollo
de
tcnicas
de
produccin
masiva
de
parasitoides
Los parasitoides atacan todos los estados de la broca cuando colonizan los frutos
infestados. Primero matan el adulto alimentndose de su hemlinfa, luego
consumen los huevos. Posteriormente paralizan las larvas del segundo instar, las
prepupas y pupas sobre las cuales ovipositan y se desarrollan (Bustillo et,al.
1998).
12
Cephalonomia stephanoderis y
Prorops nasuta realizan accin depredadora sobre los adultos que se encuentran
colonizando frutos. Dicho autor detalla que el nivel de ataque puede variar del
48% hasta el 65% para Cephalonomia stephanoderis y en el caso de P. nasuta
los niveles registrados son de 60% y 70%.
13
El uso de estos hongos contra insectos fue sugerido desde hace mucho aos,
cuando en 1879, M. anisopliae se utilizo para el control del picudo de la
remolacha Cleonis punctriventis (Barnet y Hunter, 1972). El rango de hospedantes
de algunos gneros de hongos entomopatgenos es variable, y tiende a ser ms
comn en reas tropicales, en las cuales factores tales como la temperatura y la
humedad relativa favorecen su crecimiento. Sin embargo pueden encontrarse en
reas templadas (Doberski y Tribe 1978; citados por Vlez y Montoya, 1993).
Divisin:
Eumycota.
Sub-divisin: Deuteromycotina.
Clase.
Deuteromycetes (Hypomycetes)
Orden:
Monilliaceae.
Genero:
14
15
Otros autores como Robert y Humber (1981) citado por Lecuona, Parierok y Riva,
(1996) mencionan que el desarrollo de los hongos entomopatgenos en particular
los Deuteromycetes puede dividirse en diez etapas: adhesin al tegumento del
insecto, germinacin de los conidios o esporas sobre este, penetracin a travs
de la cutcula del insecto, multiplicacin del hongo en el hemocle y la
produccin de toxinas (en ciertos hongos). Sobrevinindose la muerte del
insecto y el hongo coloniza todo el interior del hospedante. Para posteriormente
el micelio sale hacia el exterior pasando a travs del tegumento, esporula sobre
la superficie del insecto y finalmente los propgulos son diseminados al medio
(Ver figura 2). Cada uno de estos pasos son importantes no solo para provocar la
muerte del hospedante si no tambin, su posterior diseminacin en el hbitat
(Lecuona, Parierok y Riva, 1996).
16
plaga de
17
El hongo puede atacar a la broca cuando sta llega por primera vez a un cafetal
por que B. bassiana es un habitante natural del suelo y est presente en el
ambiente ya que sobrevive en la materia orgnica en descomposicin y atacando
a insectos hospedantes como el picudo del pltano y larvas y adultos de gallina
ciega (Caldern y Cortes, 1993).
18
Este hongo presenta unas estructuras que son visibles al microscopio llamadas
fialidas o clulas conidiogenas que tienen una base globosa o en forma de botella
y se extiende apicalmente en grupos densos (Barnet y Hunter, 1972).
19
Las proteasas y las lipasas son enzimas constitutivas de B. bassiana que actan
degradando la cutcula del hospedante. La quitinasa puede actuar como una
enzima constitutiva o adaptativa, dependiendo de la especificidad del hongo.
20
21
22
Es por ello que diferentes autores sostienen que el efecto de B. bassiana puede
ser variable; ya que en diferentes estudios demuestran que se puede tener
mortalidades de broca hasta de un 80% bajo condiciones de humedad y sombro
adecuadas; pero bajo condiciones no favorables su eficacia se puede reducir a
niveles del 20% a 30%. (Bernal, Benavides, Arcila, Bustillo1997).
23
2.11.3.2 Temperatura.
La influencia de la temperatura en infecciones de insectos con Beauveria
depende de los requerimientos del hongo. El genero Beauveria normalmente se
desarrolla en un rango de 0 a 40 C de temperatur a, con una ptima de 20 a 30
C, lo cual depende del origen geogrfico del aisla miento. Investigaciones
realizadas con Beauveria mencionan que necesita temperaturas entre los 10 y
35 C para la germinacin de esporas.
2.11.3.3 Luz.
La radiacin solar, especialmente la de tipo ultravioleta, desempea un papel
importante en la mortalidad de esporas del hongo (Doberski y Tribe 1980; citado
por Vlez y Montoya 1993). La vida media de diferentes inculos de hongos
expuesto a la luz solar se estima en un tiempo aproximado de una hora para el
hongo ms susceptible y de 96 horas para el ms resistente.
24
25
Las brocas desinfectadas se colocan o siembran tres por botella preparada con
medio de cultivo arroz bien cocido sin exceso de agua para evitar contaminacin
por bacterias u hongos (Caldern y Cortes, 1993).
26
27
3. MATERIALES Y MTODOS.
El presente estudio se desarroll en cuatro fases, dos de campo y dos de
laboratorio realizadas en las instalaciones de la fundacin PROCAFE, ubicada en
La Ciudad de Santa Tecla; latitud 13 40 59.9 N. y longitud 89 17 14.8 W.
Figura 5. Frutos de caf con exposicin del hongo nativo B. bassiana sobre el
orificio de entrada de la broca recolectados en la finca Esmeralda.
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29
30
31
Donde:
NC = numero de esporas por mililitro de la suspensin.
SC = Sumatoria de las conidias contenidas en los cinco cuadros de la cmara
Neubauer.
0.2 mm
0.2 mm
32
Concentracin de
esporas/ml.
T1
Testigo
ml.
T2
T3
1.84X108
ml.
T4
3.69X108
ml.
T5
5.53X108
ml.
33
Esta metodologa ha sido propuesta por Mndez, (1990) quien sostiene que
individualizando las brocas permite establecer el efecto directo del hongo sobre
cada broca, evitando el contagio que pueda ocurrir cuando se evalan
poblaciones en la que una broca infectada puede enfermar a otra poblacin.
Para mantener la humedad se coloco diariamente 0.2 ml. de agua destilada con
una jeringa estril
adecuadas de humedad (> 90 RH) para el desarrollo e infeccin del hongo sobre
el insecto. Los parmetros evaluados fueron: a) mortalidad de las brocas
diariamente, durante 10 das, b) sintomatologa y c) Desarrollo del micelio sobre
las brocas. Para ello se utiliz un microscopio estereoscopio facilitando con este
la observacin detallada y diseccin de los granos sin causar dao a las brocas
que penetraron el fruto, los datos fueron analizados por anlisis de varianza.
Materiales y tratamientos.
34
35
La metodologa empleada fue la descrita por (Bustillo, 1996) quien aplico a un lote
de 35 rboles escogidos al azar dentro de una parcela altas concentraciones de
B. bassiana en dosis de 2.37X1010 conidias por mililitro. 20 das realizo
observaciones evaluando, como unidad de muestreo las ramas productivas en las
cuales se contaron los frutos con infeccin del hongo lo cual da una informacin
real para el estudio de epizootiologa.
Trata.
T1
T2
T3
T4
Concentracin
de esporas
0 ml
3.69X107 ml.
1.84X108 ml.
3.69X108 ml.
36
4. RESULTADOS Y DISCUSIN.
37
Este resultado comprueba lo que menciona Monzn (2001), con respecto a que
el hongo B. bassiana se puede obtener de manera directa a partir del cuerpo del
insecto y que para dicha actividad; debe de realizarse la desinfeccin con alcohol
90% o hipoclorito de sodio al 5%. Es una practica necesaria que se debe llevar
acabo previo al aislamiento directo, ya que nos permite eliminar otro tipo de
microorganismos ajenos a B. bassiana sin causar la muerte de este ultimo el cual
una vez en el medio nutritivo (PDA); desarrolla su micelio de manera optima y
pura.
4.2 Produccin de esporas.
Bajo las condiciones donde se realiz el trabajo, se demostr que los aislados de
B. bassiana obtenidos directamente de brocas recolectadas en fincas cafetaleras;
se reproducen perfectamente en sustrato arroz precocido en un periodo de 10
das el cual produjo una concentracin de esporas de 3.69 x 1011 por gramo de
arroz cosechado. Este resultado es concordante con la experiencia de Colombia
donde la produccin en botellas es de 4 x 1011 esporas/gramo de sustrato a 25
C. Despus de un periodo de 15 das (Bustillo, 1995). Pero la reproduccin en
botellas cuenta con la limitante que se producen bajas cantidades, ya que
nicamente se pueden producir 40g por unidad. Habra la necesidad de utilizar
otro tipo de contenedor como bolsas de polipropileno en las cuales se puede
producir 400 gr. por unidad o desarrollar otro mtodo para la produccin de
mayores cantidades.
diferentes
aislados de B. bassiana una vez que estos hallan sido aislados y purificados. El
hogo B. bassiana cosechado y secado; se puede mantener viable hasta por un
periodo de 5 meses al ser almacenado en refrigeracin a temperaturas de 4 a 8
C. o ser utilizado inmediatamente asperjndolo para el control de la broca en las
fincas cafetaleras.
38
4.3 Bioensayo de patognicidad de laboratorio.
La sobre vivencia de las brocas despus de la desinfeccin fue del 100 %. La
prctica de desinfeccin con hipoclorito de sodio al 5% durante dos minutos no
ocasiono mortalidad en las brocas; ni inhibi el proceso de germinacin de las
conidias en los tratamientos. Lo anterior concuerda con lo mencionado por
Jimnez, (1992) quien obtuvo una sobre vivencia del 80% en el testigo al efectuar
la desinfeccin superficial de las brocas.
39
1
0
10
0
16
15
10
12
12
38
52
tratamiento
T1 testigo
T2 1 gr/ B.
bassiana
T3 5 gr/B.
bassiana
T4 10 gr/B.
bassiana
T5 15 gr/B.
bassiana
TOTAL
N. de brocas muertas.
40
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2 1
10
T2
T3
T4
T5
41
42
350
308
N. de brocas muertas.
300
237
250
200
153
150
165
141
127
100
48
34
50
0
T1
T2
T3
T4
tratamientos.
Mortalidad natural.
Mortalidad inducida.
43
5. CONCLUCIONES.
El hongo entomopatgeno B. bassiana se encuentra presente como un agente
de control biolgico natural de la broca en la zona cafetalera de El Salvador;
debido a que estos Agroecosistemas brindan proteccin contra la radiacin solar y
la humedad relativa alcanza niveles ptimos durante el da para que se desarrolle
la infeccin sobre las brocas.
El estudio del aislamiento de hongo nativo B. bassiana en (PDA), ha sido
fructfero ya que se logro aislarlo de forma pura; a partir del cual se desarrollo
simultneamente un mtodo para la produccin en medio de cultivo arroz lo que
permiti adelantar la evaluacin de su eficacia en laboratorio y campo.
La tcnica de produccin en medio de cultivo slido arroz precocido; es una
forma sencilla y rpida de obtener esporas del hongo a los 20 das, las cuales a
una temperatura de 4 C. se pueden mantener viables hasta por un periodo de 5
meses.
La metodologa utilizada en el bioensayo de patognicidad de laboratorio nos
permite asegurar la evaluacin de otro tipo de aislamientos y seleccionar as los
ms patognicos para su produccin, formulacin y posterior evaluacin en el
campo.
La patogenicidad de laboratorio y de campo nos indican que el hongo nativo
es patognico contra la broca; por lo tanto se puede utilizar como estrategia
dentro del manejo integrado de la broca (MIB), bajo condiciones optimas de
humedad temperatura y cuando la broca se encuentre en el proceso de
penetracin al fruto o volando hacia estos.
44
6. RECOMENDACIONES.
Dado que B. bassiana se encuentra en forma natural en El Salvador, se
recomienda realizar ms aislamientos de diferentes fincas y someterlos a pruebas
de patogenicidad comparndolos con otros Aislados mediante ensayos de
laboratorio y campo, determinando as aquellos que sean ms patognicos y
virulentos para produccin y formulacin.
Realizar un estudio econmico de la produccin de esporas en medio slido
arroz para optimizar la relacin beneficio costo del producto.
Emplear en la produccin otro tipo de contenedor, como bolsas de
polipropileno para aumentar la produccin ya que en estas se puede producir 400
gr. de arroz con B. bassiana por unidad; ya que lo producido en botellas se limita
nicamente a 40gr. /unidad y la tarea de cosecharlo es difcil por lo reducido de la
boquilla.
Incluir el hongo B. bassiana dentro del manejo integrado de la broca del fruto
del cafeto asociado a otras practicas de control cultural y biolgicos en las fincas
cafetaleras de El salvador.
De acuerdo a los resultados obtenidos se recomienda continuar las
investigaciones; con el objetivo de ver cmo se comporta B. bassiana bajo
condiciones adversas, fuentes de variacin en cuanto a patogenicidad y
produccin de esporas e incluir en el estudio cepas monosporcas para garantizar
la uniformidad gentica, con el fin de proporcionar a los caficultores aislados
altamente patognicos y que sean aplicados e introducidos en aquellas reas con
poca presencia del hongo de forma natural.
45
7. BIBLIOGRAFA.
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50
51
N. de brocas muertas.
80
72
70
60
50
40
30
24
20
10
17
1
8
2
0
R1
R2
R3
1
0
R4
R5
1
0
18
R6
R7
R8
R9
14
1
R10
Repeticiones.
Mortalidad inducida.
Mortalidad
70
60
N. de brocas muertas.
60
55
49
50
40
30
40
37
23
22
20
20
10
12
6
5
4
0
R1
R2
16
14
R3
12
2
R8
R9
R10
R4
R5
R6
R7
Repeticiones.
Mortalidad
Mortalidad
52
90
N. de brocas muertas.
80
70
77
73
60
54
50
46
40
30
30
30
21
20
19
17
14
10
17
9
5
0
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9
9
2
R10
Repeticiones.
Mortalidad natural.
Mortalidad inducida.
N. de brocas muertas.
60
51
50
45
39
40
33
30
26
20
16
11
13
10
0
r1
9
4
R2
15
8
4
20
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9
R10
Repeticiones.
Mortalidad natural.
Mortalidad inducida.