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Introduction aux dosages microbiologiques d'antimicrobiens par diffusion en milieu solide.

Travail pratique d'application : dosages de Nisine, comparaison d'chantillons obtenus de 2
mots de fermentation
La nisine est une bactriocine, peptide antimicrobien produit par des souches de bactries lactiques.
Elle est utilise comme conservateur alimentaire.
De la nisine est produite en bioracteur agit sur un milieu non renouvel base de lactosrum par une
souche de Lactococcus lactis . Deux fermentations ont t conduites 2 tempratures diffrentes, 30 et
37C. Des chantillons de mot de fermentation, M 30C et M37C, ont t prlevs afin de doser la nisine
produite et de comparer les rsultats.

1. Principe d'un dosage microbiologique d'antibactrien par diffusion en milieu solide

Un milieu glos est ensemenc en surface ou dans la masse avec une souche test sensible
l'antimicrobien est ralise. La mthode consiste comparer les diamtres d'inhibition obtenus avec une srie
de dilutions de l'chantillon doser et avec une srie de dilutions d'une solution talon dposes sur des
disques de papier buvard placs la surface du milieu ensemenc. On pourrait aussi dposer les dilutions dans
des puits confectionns lemporte pice.
On analyse lallure des 2 fonctions diamtre dinhibition = f(Ln(dilution)) pour la solution talon et la
solution essai pour valider le dosage puis on peut calculer la concentration de la solution doser en utilisant la
mesure du dcalage des 2 fonctions.

Diamtre
dinhibition

talon
essai

A mme effet
biologique, mme
concentration en
antibiotique !

La mesure du dcalage
exprime en dilution
(attention lchelle
logarithmique des
abscisses) donne le rapport
des concentrations entre
lessai et ltalon.

Ln de dilution
Remarque : on peut aussi simplement vrifier le paralllisme des 2 droites, ce qui valide le dosage. Puis on
trace la fonction d= f(Ln(concentration en antibiotique)) pour ltalon puis on reporte les diffrents rsultats
obtenus pour les diffrentes dilutions de lessai doser. On calcule alors les diffrentes valeurs obtenues pour
la concentration de lessai doser et on fait la moyenne.

2 Travail pratique raliser et modes opratoires

Prparation des boites de culture
- Prparer 55 mL de milieu de culture Mueller-Hinton en surfusion (45 C).
- Prvoir une culture rcente de la souche test sensible Mi crococcus luteus CIP 53160 sur milieu Mueller
Hinton, par exemple sur glose incline. Prparer alors une suspension d'absorbance 0,2 ( 0,1) 620 nm
(limite de linarit des mesures de biomasse vers 0,6 d'absorbance avec le matriel utilis). Incorporer 2 mL
de cette suspension aux 60 mL de glose Mueller Hinton en surfusion. Incorporer aussi du Tween 20 raison
de 1% (v/v) final (le Tween 20 est un tensioactif qui favorise la diffusion de la nisine dans la glose).

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Homogniser et couler en bote de Ptri 120 mmm x 120 mm sur support horizontal. Attention, le Tween 20
est un agent moussant ! Attention, il est important que l'paisseur de milieu dans la bote soit uniforme d'o la
vrification d'horizontalit. Laisser solidifier. Scher la surface.
- Prparer ainsi deux boites.

Prparation de la gamme dtalonnage.

- Utiliser la solution talon nisine S1 fournie 2 10 4 UI/mL (soit 500 mg/L de nisine pure).
- Puis raliser 4 dilutions de raison gomtrique (ou de pas) 1/2 en tube hmolyse, sous un volume final de
100 200 L. On obtient ainsi finalement les 5 standards S1, S2, S3, S4, S5.

Prparation des essais.

Des essais de production prcdents ont montr que les solutions chantillons M30C et M37C devraient
titrer entre 4. 104 UI/mL 16 104 UI/mL.
On fournit M30C et M37C dilus au appels x1 et y1 respectivement. Raliser une srie de 4 dilutions
de raison gomtrique des chantillons x1 et y1 sous un volume de 100 200 L. On obtient ainsi
finalement x1 x5 et y1 y5.

Technique des disques imprgns

- Il est indispensable de travailler avec des boites la surface parfaitement exempte d'eau superficielle
(par exemple par schage sous hotte flux laminaire).
- Pour chaque disque de papier, dposer le disque l'aide d'une pince strile puis, immdiatement,
l'imprgner avec 16 L de solution d'antimicrobien, au moyen d'une pipette automatique et en suivant le
schma fourni ci-dessous (deux boites sont ncessaires). Ou mieux, imprgner le disque alors qu'il est tenu
avec des pinces, en l'air, avant de le dposer.
- Laisser diffuser une demi-heure la temprature du laboratoire.
- Incuber 37 C pendant dix-huit heures.

T-

x2

y3

S5

S1

y1

x5

x1

y5

S2

y2

y4

S4

x3

S3

x4

Tableau 16 dpts. T- = tmoin ngatif.

3. Exploitation des rsultats. Compte rendu.

Compte-rendu du travail ralis : rsultats exprimentaux, tracs de graphe ...

Justification de la dilution pralable au des solutions chantillons M30C et M37C.
Calcul du titre des 2 solutions chantillons M 30C et M37C.

Bibliographie :
- Sujet de TP, BTS Biotechnologies, session d'examen 2006
- Influence of the carbon source on nisin production in Lactococcus lactis subsp. lactis batch fermentations, DE VUYST
and VANDAMME, J Gen Microbiol 138 (3): 571.

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