Vectores devivados de RP4

Como alternativa se ha diseado un sistema de dos plsmidos uno, el vector,

que contiene el replicn de RP4, el gen TCr, sitios nicos para el clonaje del
pasajero y adems conserva el locus rlx que permite su movilizacin, el
segundo, el plsmido ayudante, es un replicn col E1 con el gen Kmr, que lleva
clonados los genes de transferencia de RP4 y que puede movilizar en trans al
vector. Si la clula receptora es fcilmente transformable, se puede utilizar solo
el primer plsmido, si no, el vector con el inserto clonado se utiliza primero
para transformar a una estirpe de E. cole que contenga al segundo plsmido
para, a a continuacin, insertar la conjugacin con el receptor deseado. Para
reducir el riesgo de inestabilidad se ha incorporado en algunos vectores la
regin par identificada en RP4.

Vectores derivados de transposones

Los trasposones son elementos genticos mviles que se insertan alzar en
cualquier DNA celular, cromosmico o plasmidico. El proceso depende de unas
funciones de transposicin (transposasa y de unas seales (repeticiones
invertidas, secuencias IR, inverted repeats) que fijan los lmites de la regin
movilizable. Los transposones bacterianos suelen contener tambin genes que
confieren resistencia a antibiticos. A partir de estos elementos se han
desarrollado muchos tipos de vectores de amplio espectro de hospedador que
permiten la integracin de genes clonados en el cromosoma bacteriano. Esto
conduce a un clonaje en mono copia que supone una sobrecarga metablica
mnima a la clula receptora lo que es de gran inters por sus aplicaciones
industriales. El sistema original estaba basado en el uso de dos plsmidos de
amplio espectro y compatibles.
El primero es un derivado de RP4 inestable, que solo se mantiene en presencia
de presin selectiva (lleva el gen TCR r) contiene un derivado del transposon
TN7, con su ma4rcador (SMr). Pero incapaz de transponer por s mismo, ya que
la regin que codifica las funciones de transposicin es sustituida por el
pasajero, aunque, al conservar las secuencias IR, si pueden ser movilizados en
trans, el segundo plsmido (ayudante) es un derivado de RSF 1010, portador
del gen KMr y de los genes de transposicin ausentes en el primero. En
ausencia de antibiticos, el vector no se mantiene en la clula hospedada, que
incluso pierde la resistencia a ese Sm, ya que el transposon no puede
transponer. Pero si la clula ya alberga al plsmido ayudante, este podr
aportar las funciones de transposicin y movilizar en trans al derivado TN7 que
transporta al pasajero; la seleccin posterior en Sm y la identificacin se
sensibles Tc conducir al aislamiento de clones con el trnaposon (y el pasajero)
insertado en el cromosoma celular. La ausencia de seleccin por Km hace que
el plsmido ayudante se pierda y con l las funciones de transposicin, lo que
evita la sucesiva movilizacin del derivado del Tn7 integrado.

Posteriormente, este sistema se ha ido enriqueciendo con la incorporacin de

nuevas secuencias (el gen lazZ como marcador de transposicin, nuevos
promotores modificacin de sitios de restriccin, de lecciones de regiones no
esenciales de Tn7) y el uso de nuevos plsmidos. Otro tipo de estrategia
SIMILAR ms reciente y ms simple, utiliza los denominados vectores suicidas
para aportar el transposon: el plsmido que lo contiene es incapaz de replicar
en la clula hospedadora por lo que, tras la transformacin, su duracin en el
cultivo es limitada. Los resistentes al marcador del transposon son clulas en
las que este (con el pasajero) se ha insertado en el cromosoma. El gen de la
transposasa se ha retirado del transposon pero se ha colocado en el mismo
plsmido por lo que puede promover el proceso parcial de transposicin pero
luego se pierde con el vector

Los transposones son fragmentos de DNA que pueden pasar de un cromosoma

a otro sin una etapa de existencia independiente.
En algunos casos se escinden del cromosoma y se insertan en otro lugar; otras
veces, el fragmento original permanece en su sitio y una copia se inserta en
otro lugar.
Otras veces, se copian primero en RNA y, a travs de una transcriptasa
inversa, producen DNA que se inserta en un cromosoma.
Cuando cambian de posicin y abandonan el lugar en el que estaban, en ese
sitio, se produce un delecin o prdida de bases. Si el elemento transponible
estaba insertado en el interior de un gen, puede que se recupere la funcin de
dicho gen.
De igual forma, si el elemento gentico mvil al cambiar de posicin se inserta
dentro de un gen se produce una adicin de una gran cantidad de nucletidos
que tendr como consecuencia la prdida de la funcin de dicho gen.
Por consiguiente, los elementos genticos transponibles producen mutaciones.
En bacterias existen dos tipos de elementos genticos mviles:
Transposn Simple, Secuencia de Insercin o Elemento de Insercin (IS): los
transposones simples contienen una secuencia central con informacin para la
protena transposasa
Transposn Compuesto (Tn): contienen un elemento de insercin (IS) en cada
extremo en y una regin central que adems suele contener informacin de
otro tipo. Por ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF),

poseen informacin en la zona central para resistencia a antibiticos

(cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.).

Clonaje en pseudomonas
Este grupo de bacterias es incapaz de metabolizar compuestos orgnicos
(hidrocarburos de cadena larga o aromticos, como el tolueno, terpenos, etc) y
llevar a cabo reacciones de destoxificacion con metales pesados libres o
complejados a compuestos orgnicos e inorgnicos. Es por ello un gnero de
gran inters por su posible aplicacin en biodegradacin o biorremediacion
Para el trabajo con pseudomonas, se utilizan diversos tipos de vectores. El
plasmido pVS1 (30 kb) de pseudomonas no es conjugativo pero si movilizable y
es activo en agrobacterium tumefaciens y en Rhizobium leguminosarum pero
no en E. coli por otro lado, se han desarrollado vectores de amplio espectro,
algunos son derivados de plsmidos no conjugativos, de bajo nmero de copia
del grupo IncP, como RP4 o RK2. Finalmente tambin existen vectoires
lanzadera (pME290) no movilizables que funcionan en pseudomonas y en E.
Coli.
Una de las caractersticas de las bacterias del gnero Pseudomonas es su gran
capacidad para catabolizar distintos hidrocarburos aromticos y alifticos. Esta
caracterstica generalmente est codificada en plsmidos, llamados
catablicos,que casi siempre se encuentran en cepas de P. putida y rara vez
en P. aeruginosa. En el caso de esta ltima bacteria su enorme versatilidad
metablica parece deberse al gran nmero de genes cromosomales que
codifican para enzimas con actividades novedosas. Los plsmidos que se
presentan en P. aeruginosa codifican para resistencias a antibiticos o a
metales y su extensa distribucin representa un problema clnico.
Es interesante mencionar que si bien son frecuentes los plsmidos que
confieren resistencia a antibiticos y metales pesados entre los aislamientos
de P. aeruginosa, no lo son tanto como para considerar que estos elementos
genticos formen parte de su genoma. Por otra parte, no existen datos que
sugieran que los plsmidos tengan un papel en la alta tasa de recombinacin
que presenta esta bacteria.
Algunos plsmidos originalmente aislados de cepas de P. aeruginosa fueron
importantes para la construccin del mapa gentico de esta bacteria. Adems,
ya que estos plsmidos pueden replicarse en distintos fondos genticos, han
sido utilizados en el estudio gentico de distintas bacterias gram-negativas,
diferentes a las enterobacteria Tambin tienen importancia dentro de la

ingeniera gentica pues a partir de ellos se han construido mltiples vectores

de clonacin capaces de replicarse en diversas bacterias gram-negativas.
La membrana externa de las bacterias gram-negativas es una membrana
semipermeable que permite la difusin de solutos hidroflicos pequeos y tiene
muy baja permeabilidad para los compuestos hidrofbicos .La permeabilidad
de la membrana externa depende principalmente de las porinas, que son
proteinas formadoras de poros con una baja especificidad y de los sistemas de
transporte especficos. La baja permeabilidad de las porinas de la membrana
externa de P. aeruginosatiene un papel importante en el alto nivel de
resistencia natural a los antibiticos de esta bacteria.
Sin embargo, es claro que en P. aeruginosa, tanto la resistencia a antibiticos
intrnseca como la adquirida, dependen principalmente de la presencia de un
gran nmero de transportadores que secretan estos compuestos al exterior de
la clula. El mayor nmero de estos transportadores se agrupan en dos
familias, segun su parecido estructural, una de ellas est formada por los
sistemas llamados eflux(4y la otra se denomina MFS, por sus siglas en ingls
(major facilitator superfamily)Es notorio la gran abundancia de estos dos tipos
de transportadores en el genoma de la cepa PAO1 comparado con el nmero
encontrado en otras bacterias como E. coli(www.pseudomonas.com).Los
sistemas eflux estn formados por tres proteinas, un intercambiador drogaprotn, presente en la membrana interna, una proteina de membrana externa
que parece formar un canal y una proteina periplsmica que une a las dos
proteinas membranales. El sistema eflux que ms contribuye a la resistencia
intrnseca de P. aeruginosa es el sistema AcrAB/MexAB que es capaz de
transportar una amplia variedad de antibiticos como: quinolonas, macrolidos,
cloranfenicol, tetraciclina, trimetroprima y -lactmicos.Adems de los
antibiticos, el sistema AcrAB/MexAB tambin puede translocar soventes
orgnicos.

Clonaje de bacterias gram positivas

Clonaje en bacillus subtilis
Bacillus
subtilis es
una bacteria Gram
positiva,
Catalasa-positiva,
aerobio1 comnmente encontrada en el suelo. Miembro del Gnero Bacillus, B.
subtilis tiene la habilidad para formar una resistente endospora protectora,
permitindole tolerar condiciones ambientalmente extremas.

a. Transferencia de DNA a B. subtilis

Transferencia de DNA B.Subtilis , las clulas de B. sutiles pueden ser
transformadas de forma natural, su estado competente aparece como
respuesta a una limitacin de nutrientes. El mecanismo de captura de
DNA no es igual al sigue E. coli y est bastante bien definido: las
molculas de dsDNA son absorbidas por la superfiecie de la celula
competente, donde son procesadas por exo-iendonucleasas, tras lo que
son internalizadas en forma de fragmentos mocaterianos (de a13Kb) su
mantenimiento estable en el hospedador se puede dar por
recombinacin homloga (en clulas rec(+)) o por re naturalizacin de
piezas solapantes y sntesis reparadora (en clulas rec(-)). Esto explica

que la transformacin sea mucho ms fcil con DNA cromosmico que

con DNA plasmidico, estos son captados mejor en forma oligomerica.
Un mtodo alternativo para transferencia de DNA al interior de las
clulas B. subtilis consiste en la transformacin de protoplastos
mediante induccin con polietilenglicol ()EG) y regeneracin posterior de
la pared celular. Es un mtodo ms eficaz que el anterior y no requiere
clulas competentes, aunque su rendimiento disminuye mucho con el
tamao del DNA.

b. Vectores de clonaje en B. Subtilis

Un plsmido pC194, que codifica la resistencia a cloranfenicol, puede servir
como un vector de clonacin en Bacillus subtilis 168 para otros segmentos de
ADN escindido con HindIII. Replicones construido mediante la vinculacin de
pC194 a varios plsmidos de Escherichia coli puede ser utilizado para introducir
y comparar la expresin de los mismos genes en estos dos huspedes
bacterianos.
Desde los experimentos pioneros de Cohen y sus colegas, la tecnologa de
clonacin de ADN en Escherichia coli tiene convertido en una herramienta
importante de la gentica molecular. Las principales extensiones ms all de E.
coli son experimentos con el plsmido RP4 y su amplia gama de huspedes
Gram-negativas.
Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva, esporulacin, aerbico bacteria
filogenticamente muy distante de E. coli. A B. sistema de clonacin subtilis
paralela a la desarrollada para E. coli permite estudios de la interaccin de los
mismos genes con dos, posiblemente muy diferentes, entornos celulares, lo
que ofrecer una mayor comprensin de los diversos procesos que convierten
la informacin gentica para el fenotipo correspondiente.
El desarrollo del sistema de clonacin subtilis B. ha sido impedido
principalmente por la ausencia de replicones vector adecuado. Varios
plsmidos pueden ser introducidos y mantenidos en el altamente
transformable cepa de B. subtilis 168; sin embargo, carecido de marcadores
genticos para la seleccin y clonacin de ADN. Ms recientemente, plsmidos
aislado originalmente de Staphylococcus aureus que codifican para la
resistencia a la tetraciclina o cloranfenicol han sido transfectadas en B. subtilis.
estos pueden ser probados por su capacidad para aceptar segmentos de ADN
insertados, mientras que todava mantiene la capacidad de replicar y expresar
su informacin gentica en este husped. Los presentes experimentos
muestran que los segmentos de ADN se pueden insertar en la cloranfenicol
resistencia plsmido pC194, que constituye entonces una vector de clonacin
de ADN para B. subtilis 168. En la construccin vitro de B. subtifis resistente al
plsmido tetraciclina y cloranfenicol pC194 tiene un solo sitio HindHI y pT127,
un plsmido B. subtilis que codifica la resistencia a la tetraciclina, lleva tres de
tales sitios. Esto provoc el intento de insertar la HindIl-generado segmentos
de pT127 en el sitio HindIII de pC194. Los resultados se summarized. Como era
de esperar (6), la escisin HindIII destruy el transformante la actividad de los
ADN de plsmido. Esto podra ser restaurado por tratamiento T4 ligasa de
pC194 troceados, pero no de pT127. Sin embargo, si los dos ADN se ligaron

juntos, algunos TcR clones podran ser recuperados. Estos eran resistentes al
cloranfenicol as, y contena ADN de plsmido (mostrado por etidio bromuro /
CsCl gradiente de densidad de centrifugacin). Un hbrido plsmido, designado
pHV11, se caracteriz por electroforesis y la transformacin. Los resultados se
resumen en la El tamao de pHV1I es igual a la suma de la de pC194 y de el
ms grande de los segmentos de HindIII del pT127. Tratamiento HindIII de ADN
pHV11 da lugar a dos segmentos de ADN, que coincidir con el pC194 escindido
con HindIII y el ms lento de la pT127 segmentos en la movilidad
electrofortica (Fig. 1). Plsmido pHV1 ADN transforma B. subtilis, que confiere
resistencia a la tetraciclina y cloranfenicol. Estos datos son consistentes con la
estructura mostrada: el segmento de ADN 1,5 X 106 daltons de pT127, que
lleva el marcador TcR, se ha insertado en el sitio HindIII de pC194.
Construccin de E. coli-B. Replicones hbridos subtilis Los resultados
presentados en la seccin anterior indican que pC194 se puede utilizar como
un vector de clonacin HindIII en B. subtilis.
La insercin de los segmentos de ADN distintos de los del plsmido por lo
tanto, pT127 en pC194 deben ser factible. Esto fue probado mediante la
construccin de replicones hbridos entre pC194 y varios E. coli los plsmidos,
que contienen cada uno un nico sitio de escisin HindIII. Para este propsito,
pBR313, pBR322 [tanto llevar ApR TcR, o pWL7 (que codifica ApR KmR, W.
Goebel, personal comunicacin) se escindi con HindIII y se lig a HindIII
tratado
con
pC194.

B. subtilis suspensin de clulas (0,1 ml), en el nivel de competencia del 0,2%,

se mezcl con 0,2, g del ADN correspondiente, se incubaron durante 30 min, y
se sembr en placas de L suplementado con 3 MAg de cloranfenicol o 15 mg de
tetraciclina por ml. HindIII de escisin fue completa, y la reaccin de la ligasa
fue de un 50% de avance, como se juzga por electroforesis en gel de agarosa. *
CmR, la resistencia al cloranfenicol; TcR, resistencia a la tetraciclina. Se da t N
de transformantes. Transformar E. coli. Este ordenador fue preferido a B.
subtilis porque era posible para la deteccin de los genomas recombinantes
por una prueba gentica sencilla. La insercin de ADN en las inactiva sitio
HindIII el marcador de TcR de los plsmidos pBR o el marcador de KmR pWL7.
Muchas colonias que mostraban la inactivacin marcador esperado y la
resistencia tambin adquirida (a 100lg / ml) de cloranfenicol fueron aislados. El
ADN del plsmido se extrajo a partir de clones representante y se analizaron

por electroforesis y pruebas genticas. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

En todos los casos los plsmidos hbridos aislados de E. coli eran de un tamao
equivalente a la suma de los padres (es decir, la E. coli plsmido y pC194), y se
escinde por la endonucleasa HindIII en segmentos que tienen movilidades que
coincidan con las de los ADN de los padres escindidos (Fig. 1). Estos resultados
muestran que hbridos entre plsmidos de E. coli y pC194 fueron xito
construido. Sus estructuras se representan esquemticamente en la Higo. 2. En
todos los casos los ADN hbridos podran transformar E. coli no slo para
resistencia a la ampicilina, pero tambin a la resistencia a cloranfenicol. Esto
confirma el fenotipo observado de las colonias seleccionadas originalmente
(vase ms arriba) y representa otro ejemplo de funcional, la transferencia de
genes entre procariotas heteroespecifico. Los plsmidos pHV12, pHV14, y
pHV15 transformaron E. coli para ambos marcadores con esencialmente la
misma eficacia. pHV16, sin embargo, transformado% AOOO menos eficiente
para el cloranfenicol resistencia. Esto no fue debido a la ausencia del gen que
codifica

c. Destino del DNA clonado

Si el pasajero clonado tiene muy poca o nula homologa con el DNA
cromosmico de B. Subtilis, la estabilidad del plsmido recombinante
depende de la del vector y de la presin selectiva del medio. Pero si la
similitud es mayo, la regin homologa puede incorporarse al cromosoma
por un proceso normal de recombinacin que lleva a una situacin, si se
da doble sobre cruzamiento, o a la integracin del plsmido
recombinante completo, si se da un doble sobre cruzamiento sencillo.
Este camino por el que puede discurrir un clonaje en B. Subtilis marca
una gran diferencia con el trabajo en E. coli, en el que los procesos de
recombinacin son ms raros (sobre todo si se utilizan estirpes rec).

Esta va integrativa puede favorecerse usando vectores que no puedan

replicar en B. Subtilis, como por ejemplo, cualquier replicn con ori tipo
colE1, siempre que la regin a integrar lleve algn marcador que permita
su seleccin. Adems existen ciertos vectores de B. Subtilis cuya
replicacin es muy sensible a la temperatura: por encima de 37 C no
son capaces de replicar, y al crecer el cultivo a alta temperatura y en un
medio con el marcador se seleccionan los clones en los que se ha
producido la integracin. Por otro lado ,si el fragmento integrado incluye
un gen de resistencia, aumentando la concentracin del antibitico en el
medio de cultivo se puede conseguir la seleccin de clones con el gen
clonado amplificado ( el nmero de sus copias cromosmicas aumenta
como resultado de duplicaciones).
Si la secuencia clonada no guarda homologa con el DNA de B. Subtilis,
pero va flanqueada en el vector por regiones homologas a su
cromosoma, puede resultar integrada tras doble sobre cruzamiento. Este
es un modo de incorporar de forma estable secuencias extraas de B.

Subtilis. La misma estrategia puede tambin usarse para producir

delegaciones: una vez aislado y clonado el gen que se quiere delecionar,
se manipula in vitro para sustituir su parte central por un marcador se
resistencia, tras lo que se transfiere a B. Subtilis forzando la integracin
y seleccionando los resistentes al antibitico.
Esta posibilidad de inducir una integracin dirigida abre las puertas al
clonaje de regiones adyacentes al gen estudiado. Tras la integracin de
un vector que aporta al gen en cuestin y utilizando una endonucleasa
que no presente dianas ni en dicho gen ni en el vector , puede dirigirse
el DNA cromosmico, religar fragmentos , transformar un cultivo de E.
coli y seleccionar con el marcador del vector, los clones positivos
llevaran las regiones adyacentes al gen estudiado.

d. Vectores derivados de bacterifagos

Segmentos

al

azar

de Bacillus

amyloliquefaciens y

la

levadura Saccharomyces cerevisiae se utilizaron ADN para determinar

dos parmetros pertinentes a la clonacin en Bacillus subtilis , el
rendimiento de los hbridos y el tamao medio de los segmentos
clonados. 10

a 10

hbridos / g se obtuvieron de segmentos de

ADN. Los hbridos representados 11-18% de los transformantes. La

media m.en peso. de segmentos de ADN clonados era aproximadamente
1 10

, sustancialmente menor que 3 10

encontrado de ADN del

donante despus de la digestin con endonucleasas de restriccin.

Hemos

clonado

un B. amyloliquefaciens segmento

de

ADN

que

complementa una deficiencia en B. subtilis hisH y E. coli HISC genes, que

codifican aminotransferasa imidazolylacetolphosphate. La eficiencia de
la clonacin con este gen era 10 huspedes transformados / g de ADN
del donante.
Varios B. subtilis se examinaron los vectores de clonacin de insercininactivacin. Uno, pHV41, permite la inactivacin de la resistencia a la
kanamicina (Km

gen) por insercin en su nico Bgl sitio II. En otros dos

vectores, pHV11 y pHV23, la insercin en su nica Kpn sitio inactiva la

resistencia

la

tetraciclina

(Tc

gen). pHV23

replica

tanto

en E. coli y B. subtilis , y lleva siete sitios nicos para endonucleasas de

restriccin ( BamHI , Eco RI,Hpa I, Kpn I, Pst I, Sal I, Xba I). Esto hace que
sea uno de los ms verstiles B.subtilis Los vectores de clonacin pero
descritas.

e. Vectores de expresin
Bacterias gram-positivas son bien conocidas por sus contribuciones a la
biotecnologa agrcola, mdica y alimentaria y para la produccin de protenas
recombinantes. Entre ellos, Bacillus subtilis se ha desarrollado como un
husped atractivo.
Es no patgeno y se considera como un organismo GRAS (generalmente
considerado como seguro)
No tiene ningn sesgo significativo en el uso de codones
Es capaz de secretar protenas extracelulares funcionales directamente en el
medio de cultivo (en la actualidad, aproximadamente el 60% de las enzimas
disponibles en el mercado son producidos por especies de Bacillus)
Una gran cantidad de informacin relativa a la transcripcin, traduccin, y los
mecanismos de plegamiento de protenas de secrecin, la manipulacin
gentica y fermentacin a gran escala ha sido adquirida
til para la construccin de bibliotecas metagenomic
pHT43 utilizado con xito para la produccin de pptido antimicrobiano libre de
endotoxina (Luan et al. , 2014)
Descripcin
Pero tambin hay dos obstculos que reducen el uso de B. subtilis :
(i) la produccin de una serie de proteasas extracelulares que reconocen y se
degradan
las
protenas
heterlogas
(ii) los plsmidos de vectores estables. El primer obstculo ha sido resuelto en
gran medida por la construccin de cepas deficientes en proteasa, como
nuestra
cepa
WB800N
El segundo ha sido completamente superar mediante la introduccin de
plsmidos utilizando el theta-modo de replicacin, tales como los derivados de
los plsmidos naturales pAM1 y pBS72 (Janniere et al . , 1990; Titok et al. ,
2003).
La construccin y uso de cuatro vectores de expresin diferentes en base a
la E. coli - B. subtilis pMTLBS72 vector lanzadera que exhibe una estabilidad
estructural completa se public en 2005 (Nguyen et al. , 2005).
Los dos vectores pHT01 y pHT43 permiten la expresin de alto nivel de
protenas recombinantes dentro del citoplasma, donde pHT43 dirige las
protenas recombinantes en el medio. Ambos vectores se basan en el promotor
s A-dependiente fuerte anterior del opern groE de B. subtilis que se ha
convertido en un promotor eficiente controlable (inducible por IPTG) mediante
la adicin del operador lac. Los derivados de pHT01 estn disponibles ya sea
con una etiqueta 8xHis (pHT08), una etiqueta Strep (pHT09) o una etiqueta cMyc (pHT10).

CLONAJE DE DNA en bacterias Gram (+) diferentes a B. Subtilis

Otros grupos de microorganismos gram (+) en los que se estn
aplicando las tcnicas de manipulacin y clonaje de dna son los
estreptomicetos y los estreptococos lcticos, fundamentalmente por el
inters que tienen sus aplicaciones industriales. Los ltimos (por ejm,
stretococcus lactis) se utilizan en la produccin de productos lcteos
fermentados (yogur, queso, etc). Los streptomyces son los mayores
productores (ms del 60%) de antibiticos naturales y, por tanto,
enormemente investigados en programas de rastreo para la deteccin
de nuevos aislados. La tecnologa de DNA recombinante se est
utilizando con ellos con el objeto de generar nuevos antibiticos y
mejorar los actuales. Se han construido vectores de clonaje a partir del
plasmido SCP2 de streptomyces, presente en 1-2 copias por cromosoma
y capaz de integrarse con gran eficiencia. Tambin se han conseguido
vectores lanzadera para trabajar entre Streptomyces y E. Coli en
general, las tcnicas y procedimientos de manipulacin de genes de
estas bacterias Gram (+) difieren muy poco de los utilizados con B.
Subtilis.

Un caso real la historia de un antibitico azul

Streptomyces es el gnero ms extenso deactinobacterias, un grupo
de bacterias gram
positivas de contenido
GC generalmente
alto.1 Se
encuentran predominantemente en suelos y en la vegetacin descompuesta y
la mayora produceesporas (tambin denominadas conidios) en los extremos
de las hifas areas. Se distinguen por el olor a tierra hmeda que
desprenden,
resultado
de
la
produccin
de
un metabolito voltil,
lageosmina (S. coelicolor).
Las especies del gnero Streptomyces se caracterizan por poseer un
metabolismo secundario (rutas metablicas no requeridas para la
supervivencia) complejo.1 Producen numerosos antibiticos de uso clnico
comoestreptomicina, cido
clavulnico, neomicina,cloranfenicol,
etc. Streptomyces es
raramentepatgenos,
aunque
pueden
producir
infecciones en humanos, tales como micetoma por S. somaliensis y S.

sudanensis. En las plantas, S. caviscabies y S. scabies ocasionan costras.

Tambin a partir de ellos, concretamente de S. avermectilis se sintetiz toda
una familia deinsecticidas: las avermectinas.
El genoma completo de S. coelicolor A3(2), fue publicado en 2002.2 En esa
fecha era el genoma bacteriano ms grande conocido. La secuencia genmica
de S. avermitilis fue completada en 2003.3 Este fue el primer genoma
secuenciado de un microorganismo de uso industrial. Ambos genomas tienen
un nico cromosoma lineal, en contraste con la mayora del resto de las
bacterias que contienen cromosomas circulares. La secuencia genmica de S.
scabies, una especie que causa costras en la patata, ha sido completada
recientemente.
En los ltimos aos, Streptomyces spp. ha sido objeto de investigaciones
en biotecnologa para la produccin de protenas recombinantes humanas.
Tradicionalmente, escherichia coli era la especie de eleccin para albergar
genes eucariotas puesto que es una bacteria bien conocida y fcil de
trabajar.4 5 Sin embargo, E. coli introduce algunos problemas tales como
una glicosilacinincorrecta (o una ausencia de la misma) y un plegamiento
protenico incorrecto, resultando en insolubilidad y prdida de bioactividad del
producto.6 Streptomyces spp., por otro lado, tiene la habilidad de secretar
protenas recombinantes correctamente plegadas en el medio de produccin, lo
que simplifica los pasos subsecuentes de purificacin. Estas caractersticas,
entre otras, hacen de Streptomyces spp. una alternativa ms atractiva que
otras bacterias como E. coliy Bacillus subtilis.
Streptomyces coelicolor , un filamentosos, alta GC, bacterias gram-positivas,
fue denominada primera coelicolor Streptothrix en 1908 por R. Muller despus
de que l lo encontr en una patata (2). Ms tarde, se hizo conocido
como Streptomyces
coelicolor . El Streptomyces
coelicolorA3
(2)
cepa
estudiada en profundidad por David A Hopwood y secuenciado por el Centro
John Innes y el Instituto Sanger es en realidad taxonmicamente un miembro
de la violaceoruber Streptomyces gnero, aunque conserva el antiguo nombre,
y no es la misma cepa como la cepa Muller (25). Streptomyces coelicolor ,
como el gnero Streptomyces, en general, viven en el suelo. Streptomyces son
responsables de gran parte de la descomposicin de materia orgnica en el
suelo, as como el olor "terroso" del suelo. Tambin viven en colonias y tienen
similitudes estructurales con el hongo. Las colonias de Streptomyces
coelicolor pigmentos de liberacin que son azul / verde en lcali y rojo en
condiciones cidas, dando as las colonias bacterianas esos colores en las
condiciones respectivas. Otras caractersticas diferenciadoras de Muller
deStreptomyces coelicolor son micelio areo de color amarillo grisceo,
esporas lisas, espirales areas que carecen de micelio, y ningn pigmento
melanoide (5). Desde la A3 (2) cepa es en realidad Streptomyces
violaceoruber , se ve un poco diferente. Una diferencia es que el A3 (2) cepa
tiene ceniza micelio areo gris con espirales (5). Desde este punto en adelante,
me refiero a Streptomyces coelicolor como el (2) la tensin y no la tensin de
Muller A3 porque el (2) cepa A3 fue secuenciado, y una gran cantidad de
informacin disponible sobre el tema. Streptomyces coelicolor son bacterias
importantes y estaban secuenciado debido a su "capacidad de adaptacin al
estrs ambiental", "fuente de molculas bioactivas para la medicina y la
industria", y "relat [ion] a los patgenos humanos" (3). Streptomyces
coelicolor tiene un ncleo del genoma muy similar a Mycobacterium

tuberculosis y Corynebacterium diphtheriae , as como cierta similitud

con Mycobacterium leprae , por lo que puede ser usado para estudiar estas
bacterias causantes de enfermedades (4). El Streptomyces gnero es
responsable de la produccin de la mayora de los antibiticos en uso hoy en
da,
as
como
algunos
inmunosupresores
y
agentes
antitumorales. Streptomyces coelicolor tambin tiene un ciclo de vida interesante
que incluye la diferenciacin en la formacin de micelio y esporas area (3).

Streptomyces coelicolor tiene un cromosoma lineal y dos plsmidos, uno que

es lineal y uno que es circular. El cromosoma lineal fue secuenciado a partir de
clones de las especies, la mayora de los cuales eran csmidos, que no
contenan los dos plsmidos se superponen.Este cromosoma contiene
8,667,507 pares de bases, y fue el mayor genoma bacteriano secuenciado en
el momento. (Desde entonces, los genomas bacterianos ms grandes se han
secuenciado.) El origen de replicacin (oriC) est situado en el medio del
cromosoma, y los extremos de los cromosomas contienen repeticiones
invertidas terminales (Tirs). La extremos terminales 5 'tienen protenas que se
unen covalentemente a ellos. La replicacin se realiza en ambas direcciones,
dejando un hueco en una cadena de la nueva cromosoma, que est parcheado
por la sntesis de ADN. Se considera que el cromosoma que se agrupan en tres
regiones - el ncleo y los dos brazos. La regin de ncleo comprende
aproximadamente la mitad del cromosoma y contiene los genes esenciales
para la supervivencia del organismo, como "la divisin celular, la replicacin
del ADN, la transcripcin, la traduccin y la biosntesis de amino-cido". Las
dos regiones del brazo son diferentes longitudes, uno alrededor de 1,5 MB y los
otros 2,3 MB de largo, y que el cdigo para las funciones no esenciales como
"metabolitos secundarios, exoenzimas hidrolticas, los conservons (operones
conservados) y las protenas 'de vesculas de gas'" . El plsmido SPC1 lineal es
365,023 pares de bases de largo, y es participan de codificacin para algunas
protenas reguladoras incluyendo tres factores sigma y protenas que se
encuentran en las superficies de esporas entre otras funciones. El par 31 317
base, el plsmido circular, SPC2, tiene una regin de estabilidad, origen de
replicacin, y la regin de transferencia. Tiene un nmero de copias
relativamente baja.
La investigacin reciente ha determinado que un grupo de mtbH -como genes
es coelicolor Streptomyces son necesarios para la parte de la produccin de
metabolitos secundarios. Streptomyces coelicolor tiene tres de tales genes,
uno de los cuales es Cloy. Cuando los tres genes estaban ausentes, clorobiocin,
un antibitico, se produjo slo en cantidades muy pequeas, pero
cuando Cloy fue restaurada, clorobiocin se produce a un nivel ms
significativo. Esta investigacin tambin muestra que los tres genes pueden ser
capaces de "reemplazar funcionalmente entre s".
Los BLD genes son responsables de la diferenciacin en Streptomyces
coelicolor. Los investigadores han determinado cmo la protena interacta
BldD en la clula para lograr este propsito. BldD es una protena
homodimrica, de unin a ADN que tiene dos subunidades de plegado
separado. La mitad N terminal de la protena se determin que era responsable
de la dimerizacin y unin al ADN. La estructura y la funcin de esta protena
que muestran BldD puede tener una influencia muy grande en las etapas de
desarrollo de Streptomyces coelicolor.
Se estn realizando investigaciones para determinar cmo Streptomyces
coelicolor vas de transduccin de seal de uso para detectar cambios en sus
ambientes de suelos muy variables, lo que indica a los antibiticos y esporas
de produccin.
El desarrollo bacteriano de Streptomyces coelicolor tambin est en estudio
para determinar "el papel de holoenzimas ARN polimerasa especficos que
controlan el desarrollo y la respuesta al estrs, la caracterizacin global de la

maduracin de las esporas y la germinacin, las protenas del citoesqueleto, y

la organizacin de los cromosomas durante el crecimiento de las hifas".
Streptomyces coelicolor es actualmente objeto de investigacin en la
Universidad de Warwick, debido a su capacidad de producir prodiginines.Estos
compuestos son prometedores en la orientacin de las clulas cancerosas, y
una contraparte sinttica para el compuesto obtenido de forma natural
por Streptomyces coelicolor es en ensayos clnicos como de noviembre de
2006 (10).

Mas sobre el tema: las LAB

Lactobacillales o bacterias del cido lctico (BAL) son un clado de bacterias
Gram-positivas, de bajo GC, cido tolerantes, en general, no esporuladas,
nonrespiring, ya sean bacterias de bastn o de cocos-que comparten
metablica comn y caractersticas fisiolgicas. Estas bacterias, que
normalmente se encuentran en las plantas y los productos lcteos en
descomposicin, producen cido lctico como el principal producto final del
metabolismo de fermentacin de carbohidratos. Este rasgo ha, a lo largo de la
historia, LAB con la fermentacin de alimentos vinculados, como la
acidificacin inhibe el crecimiento de agentes causantes de putrefaccin.
bacteriocinas proteicos son producidos por varias cepas de BAL y proporcionan
un obstculo adicional para el deterioro y microorganismos patgenos.
Adems, el cido lctico y otros productos metablicos contribuyen al perfil
organolptico y de textura de un alimento. La importancia industrial del LAB se
evidencia adems por su generalmente reconocida como segura (GRAS),
debido a su apariencia ubicua en los alimentos y su contribucin a la microflora
saludable de las superficies mucosas humanas. Los gneros que comprenden
el LAB son en su Lactobacillus ncleo, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus y
Streptococcus, as como la Aerococcus ms perifrica, Carnobacterium,
Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus y
Weissella; stas pertenecen al orden Lactobacillales.
Las bacterias de cido lctico (LAB) son o bien en forma de varilla (Bacillus ) , o
esfrica ( coccus ) , y se caracterizan por un aumento de la tolerancia a la
acidez ( rango bajo pH). Este aspecto ayuda a LAB outcompete otras bacterias
en una fermentacin natural, ya que pueden resistir el aumento de la acidez de
la produccin de cido orgnico (por ejemplo , cido lctico ) . medios de
laboratorio utilizadas para LAB incluyen tpicamente una fuente de hidratos de
carbono , como la mayora de las especies son incapaces de respiracin. LAB
son catalasa negativa. Se componen de los orgnulos de una estructura
bacteriana simple. LAB se encuentran entre los grupos ms importantes de los
microorganismos utilizados en la industria alimentaria .
Un amplio nmero de productos alimenticios, productos qumicos de las
materias primas y productos de la biotecnologa se fabrican industrialmente
por fermentacin bacteriana a gran escala de los diferentes sustratos
orgnicos. Debido a enormes cantidades de bacterias se estn cultivando cada
da en grandes cubas de fermentacin, el riesgo de que la contaminacin del
bacterifago lleva rpidamente fermentaciones a un alto y causar reveses

econmicos es una seria amenaza en estas industrias. La relacin entre

bacterifagos y sus huspedes bacterianos es muy importante en el contexto
de la industria de la fermentacin de alimentos. Las fuentes de contaminacin
del fago, las medidas para controlar su propagacin y difusin, y las estrategias
de defensa biotecnolgicos desarrollados para contener fagos son de inters.
La industria de la fermentacin lctea ha reconocido abiertamente el problema
de la contaminacin del fago, y ha estado trabajando con las empresas y el
mundo acadmico cultivo iniciador para desarrollar estrategias de defensa y
sistemas para restringir la propagacin y evolucin de los fagos durante
dcadas. [5]
la interaccin husped bacterifago [editar]
El primer contacto entre un fago que infecta y su husped bacteriana es la
unin del fago a la clula husped. Esta unin est mediada por la protena de
unin al receptor del fago (RBP), que reconoce y se une a un receptor en la
superficie bacteriana. Esas prcticas tambin se conocen como protenas del
husped-especificidad, determinante de acogida, y antirreceptor. Por
simplicidad, el trmino RBP se utiliza aqu. Se han sugerido una variedad de
molculas que actan como receptores de acogida para los bacterifagos que
infectan LAB; entre los que son polisacridos y (lipo) cidos teicoicos, as como
una protena de una sola membrana. Un nmero de las prcticas comerciales
restrictivas de fagos de laboratorio han sido identificados por la generacin de
fagos hbridos con rangos de huspedes alterados. Estos estudios, sin
embargo, tambin encontraron protenas de fagos adicionales a ser importante
para la infeccin por fagos exitosa. El anlisis de la estructura cristalina de
varios prcticas comerciales restrictivas indica que estas protenas comparten
un plegamiento terciario comn, y apoyan las indicaciones anteriores de la
naturaleza sacrido del receptor de host. LAB Gram-positivas tienen una capa
de peptidoglicano de espesor, que debe ser atravesada para inyectar el
genoma del fago en el citoplasma bacteriano. Se espera que las enzimas
peptidoglicano-degradantes para facilitar esta penetracin, y tales enzimas se
han encontrado como elementos estructurales de un nmero de fagos de
laboratorio. [5]
Los pro biticos son productos destinados a la entrega de la vida, las clulas
potencialmente beneficiosos, bacterianas para el ecosistema intestinal de los
seres humanos y otros animales, mientras que los probiticos son
carbohidratos no digeribles entregados en los alimentos al intestino grueso
para proporcionar sustratos fermentables por las bacterias seleccionadas. Las
cepas de LAB son los microbios ms comunes empleados como probiticos.
Dos tipos principales de bacterias pro biticas, los miembros de los gneros
Lactobacillus y Bifidobacterium , han sido estudiados en detalle. La mayora de
las cepas probiticas pertenecen al gnero Lactobacillus. Los pro biticos se
han evaluado en estudios de investigacin en animales y seres humanos con
respecto a la diarrea asociada a antibiticos, diarrea del viajero, diarrea
peditrica, enfermedad inflamatoria del intestino y el sndrome del intestino
irritable. En el futuro, los probiticos , posiblemente, se pueden utilizar para
diferentes enfermedades gastrointestinales , vaginosis , o como sistemas de
administracin para vacunas , inmunoglobulinas, y otras terapias.