Resumo

trs fermentadores foram caracterizados: New Brunswick M-19 14 litros

Applikon biocontrolador 1035 7 litros New Brunswick Bioflo III 7 litros, a
determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (ELK),
gs de reteno (RG) e tempo de mistura (tM). Fermentador New Brunswick
Bioflo III apresentaram os melhores valores, com uma relao do dimetro do
impulsor / dimetro do tanque (DI / DT) de 0,43, KLa = 9,5-208 h-1 e t = 1,0-3,0
M s, de forma que foi seleccionado para a produo de blastosporos de
Beauveria bassiana, utilizando melao como fonte de carbono. Foram
estudadas as condies de mistura, usando diferentes combinaes de
Rushton, MaxFlo e Lightnin tipo impulsores, sob um delineamento experimental
fatorial 32. O tempo de propagao foi de 4 dias, a carga de trabalho de 4
litros, 10% de inculo (1x106 blastosporas / mL), temperatura 30 C, 400-500
rpm de agitao, de arejamento 0,5-1,0 vvm, e o pH de 5,4 o fungo foi cultivado
utilizando a melhor combinao de impulsores de Rushton-MaxFlo a 400 rpm e
1,0 vvm (F = 10,324 , p 0,0123) = (DMS 0585), obtendo-se uma concentrao
de 1.2x109 blastosporos / ml, 2,2 g / L de biomassa e 2,48 g / l de consumo de
substrato (Y x / s = 0,89). As condies de mistura e os parmetros obtidos
podem ser aplicados em outros fermentadores para optimizar a produo
de blastosporos de Beauveria bassiana do desenvolvimento experimental
de bioinsecticidas.
Introduo
Feitos bio-inseticidas base de fungos entomopatognicos (HE) so usados
em diferentes pases, devido sua especificidade e sua ampla gama de
hospedeiros, dentro do qual Beauveria bassiana (Vuilleimin) Balm o mais
amplamente utilizado. O ingrediente activo desta esporos do fungo so de ar
produzido atravs de um sistema de fermentao bifsico (lquido-slido) a
obteno de concentraes de esporos com toxicidade satisfatria em menos
tempo (Mascarin et al., 2010).
blastsporos produo de Beauveria bassiana em meio lquido de
bioprocessos conveniente do ponto de vista da eficincia e rentabilidade em
comparao com a produo de esporos por fermentao em estado slido
(Lozano-Contreras et al., 2007), onde a composio do meio de cultura um
dos factores que determinam que favorecem a formao de blastosporos,
esporos e / ou miclio (Riaz et al., 2013). Estudos recentes tm utilizado
vrias fontes de carbono e azoto, tais como licor de infuso de milho,
cidos aminados e colagnio peptona no meio de cultura, obteno de
miclio abundante e alta concentrao de blastosporos na fermentao
mais curta (Romero-Rangel et al., 2012).
O melao um resduo de a cristalizao final de acares contendo
acar (. Hernandez-Dominguez et ai, 2003) de sacarose, glicose e
frutose, minerais, protenas e vitaminas, entre outros, que fornecem ao
organismo os nutrientes necessrios para a produo de biomassa.
Atualmente, os blastosporos so usados para desenvolver formulaes
utilizadas no controle de sucesso de vrios insetos-pragas na agricultura,
devido a sua germinao rpida em cultura lquida, com a desvantagem
de que estes organismos infecciosos tendem a perecer rapidamente

durante o armazenamento, devido sua sensibilidade ao calor (Jaronsky e

Jackson, 2012).
Para melhorar o rendimento de produo e estabilidade Isaria
blastsporos fumosorosea (Wise) (Brown & Smith) dessecao tolerante,
Jackson et al. (2003) realizaram uma comparao de meios de cultura
lquido suplementado com fontes de azoto complexas (hidrolisado cido
de casena ou extracto de levedura) obter altas concentraes de
blastosporos (1x109 blastosporos / ml, com 79-82% de sobrevivncia
aps a secagem) em produzidos em comparao com outras fontes de
nitrognio (12-50% de sobrevivncia aps a secagem).
Em relao toxicidade, Chong-Rodriguez et ai. (2011) em comparao com a
actividade biolgica de blastosporos secas produzidas em meio lquido
(sacarose e licor de infuso de milho), utilizando um fermentador com dois
impulsores Rushton tipo e formulados com terra de diatomceas, a uma
concentrao de 1x108blastosporas / ml de B. bassiana em larvas terceira fase
de desenvolvimento de Pluxtella xylostella (L.), o que causou 90% de
mortalidade de larvas, em comparao com dois outros meios de comunicao
utilizados. Outro exemplo a preparao comercial (estirpe I. fumosorosea
Apopka 97: 20%, 2x109 CFU / g) preparado com PreFeRal blastosporos e /
ou miclios-blastosporas, que usado na Blgica (Wraight et al, 2000; Chan.
Cupul et al., 2010).
Alm disso, Eyal et ai., (1994) I. propagao fungo miclio fumosorosea para
insectos activo, usando um fermentador de 20 litros com 16 litros de meio
composto de 60-80g / l de melao como fonte de carbono, obteno de 30-50 g
/ l de miclio filamentoso (peso seco) em 4 a 6 dias de fermentao com uma
agitao de 400 a 600 rpm e arejamento de 0,8 a 1.0vvm para 96-100h
processo. Garcia et ai. (2006) utilizaram o melao com extracto de levedura
para a produo em meio lquido do fungo Nomuraea rileyi (Farlow) Samson, a
obteno de uma quantidade de biomassa de trs vezes superior a outros
tratamentos (13.18 g / l), sendo a entrada de uma fonte importante rcio de
nitrognio (carbono-nitrognio
o tempo de mistura, o tempo para atingir o estado de homogeneidade maior
parte do lquido, aps a adio de um outro lquido (Kasat e Pandit, 2008),
normalmente a mais importante na determinao da eficincia de um
parmetro do sistema de agitao, a que principalmente depende das
caractersticas reolgicas do caldo de cultura, sistema de mistura e as
condies de fermentao. Sabe-se tambm que o impulsor axial obtida uma
melhor produo de blastosporos que os impulsores radiais, isto porque a
mistura do primeiro permite uma distribuio de temperaturas semelhantes em
todas as partes do lquido de fermentao (Manikowski et al., 1994;. Jaworski
et al, 1998; Sardeing et ai, 2004) ..
No entanto, pouca informao sobre o efeito combinado de tais promotores
para a produo de fungos entomopatognico, em particular na propagao
de B. bassiana para a produo de blastosporos com diferentes testes
nvel de meios de cultura a escala em fermentadores do aumento da carga
de trabalho. Neste estudo tambm de interesse a utilizao de melao de
cana de acar como
fonte de carbono, sendo um produto econmico que fornece nutrientes para o
fungo.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar as condies de mistura no

fermentador (agitao e aerao), utilizando uma combinao de trs
tipos de drivers para determinar os parmetros de fermentao
biotecnolgicos usando melao de cana como fonte de carbono, sulfato
de amnio como fonte de azoto e sais minerais na produo de
blastosporos de Beauveria bassiana.
Materiais e mtodos
Caracterizao dos fermentadores
trs fermentadores caracterizada: New Brunswick M-19 14 litros
Applikon biocontrolador 1035 7 litros New Brunswick Bioflo III 7 litros,
com um volume de trabalho de 10, 5 e 4 litros, respectivamente, que
foram definidas por coeficiente de transferncia de oxignio volumtrico
(ELK), gs de reteno (RG) e do tempo de mistura tM
coeficiente de transferncia de oxignio volumtrico (KLA)
Foi determinado pelo mtodo de sulfito (Rajesch et al., 2012), para o qual
o fermentador foi carregado com uma soluo 0.8N de sulfito de sdio foi
adicionado CuSO4.5H2O a uma concentrao de 1x103 M., com
arejamento de 0,5 vvm e agitao de 200 rpm, foram recolhidas amostras
em duplicado da soluo em frascos de 250 ml contendo uma soluo de
iodo 0,1 N, o excesso de iodo com tiossulfato de sdio 0,1 N e de amido
como indicador foi titulado; Esta operao foi repetida a intervalos de cinco
minutos e foi dado o tratamento anterior. a taxa de agitao a 400, 600, 800 e
1000 rpm, com arejamento de 1 a 1,5 vvm foi aumentada e as mesmas
operaes descritas foram realizadas. Todos os componentes das solues e
os meios foram obtidos a partir de Difco Laboratories Inc. (Detroit, MI, EUA).
gs de reteno (RG)
reteno de gs foi quantificada atravs de uma medio directa do nvel
de lquido no fermentador, o nvel de diferenciao antes de comear o
arejamento e agitao. Estes valores foram ento convertidos em volume
de lquido. As medies foram tomadas a metade das ondas de superfcie
(Junker et al., 1998).
Tempo de mistura (TM)
Tomou o tempo em segundos necessrios para tornar o lquido no tanque
fermentador era homognea em um nico ponto (Hadjiev et al., 2006),
como um indicador de fenolftalena foi adicionado NaOH 0,1 N com
(Nuez-Ramirez et ai., 2012 ). nveis de agitao foram de 400 e 500 rpm e
arejamento de 0,6 vvm e 0,5.
geometria fermentador
Nos trs fermentadores a distncia entre os condutores e os espaos entre a
parte inferior e os controladores tanque foi medida, em seguida, o tipo mais
adequado para o desenvolvimento do fungo fermentador foi seleccionado, com
base nos melhores valores de ELK RG e tM .
sistema de mistura
Para determinar o efeito das melhores condies de agitao e aerao foi
usada uma combinao de propulsores: Rushton, MaxFlo e Lighthin sob um
fatorial variveis de projeto experimental que eram 32; Trs tipos de impulsores
e duas posies: para cima e para baixo (Tabela 1).
Tabela 1. Posio dos drivers diferentes na determinao KLA RG e tM.

Transferncia volumtrica taxa de oxignio NA

Foi determinado pelo mtodo dinmico (Casas-Lopez et ai., 2006). Para
determinar a taxa de transferncia de oxignio volumtrica de NA (mg de O2 /
litro * horas), a concentrao de oxignio dissolvido era de 65-80% para os
valores subsequentemente arejamento e agitao foi cortado, leituras de
concentrao foram tomadas Dissolveu-se o oxignio em intervalos de 5 s
durante 1 min, des
depois a cada 15 s durante 2 min, em seguida, as condies de agitao e de
arejamento foram restauradas.
valores de oxignio dissolvido foram convertidos para gramas de oxignio e
representados graficamente contra o tempo para se obter uma curva de
consumo de oxignio, cuja inclinao corresponde taxa de transferncia de
oxignio volumtrica (NA).
delineamento experimental no fermentador
Sob estas condies foi determinada a produo de blastosporos duas
velocidades de agitao (400 a 500 rpm) e arejamento duas condies (0,5 e
1,0 vvm). Os dados de diferentes concentraes obtidas foram analisadas com
um pacote de anlise de varincia em Statistica (1993). DMS teste foi usada
para separar os meios de produo blastosporas.
Uma vez que o melhor fermentador, que neste caso foi Brunswick Bioflo III
Novos parmetros do sistema selecionados foram determinados misturando;
condies de aerao e agitao, com nfase na combinao de motoristas.
Para o efeito segue foi feita a propagao de B. bassiana:
Obteno de fungo entomopatognico
B. isolamento de estirpes de coleco usado BbPM chave bassiana CIIDIR IPN
Unidade Durango, que foi isolado a partir de insectos, fungos foram infestadas
encontrado em mas, que provou ser txico para o controlo de larvas de cinco
dias de desenvolvimento de Cydia pomonella ( L.) (Lepidoptera: Tortricidae)
com nveis de toxicidade de 96% s 72 horas (Solis-Soto et al, 2006) ..
Preparao do inoculo e propagao em fermentador
Isolamento de B. bassiana ocorreu em meio de cultura SDA a 30 C durante
15 dias at ao desenvolvimento ptimo, depois de uma suspenso com gua
destilada serviu para inocular frascos de 500 ml com 100 ml de meio de cultura
lquido foi preparado com melao como fonte de carbono, este meio foi
utilizado para inocular o fermentador. Os blastosporos foram produzidos num
fermentador Bioflo III. meio de cultura foi utilizado com a seguinte composio:
Melao 14,5 mL / L, (NH4) 2SO4 6 g / l, KH2PO4 3,5 g / l, MgSO4 0,5 g / l,
NaCl 0,1 g / l, CaCl 2 0,1 g / l, com um volume de trabalho de 4 litros de inoculo
e o tamanho de 10%, com uma concentrao inicial de blastosporos 1x106 /
ml, a uma temperatura de 30 C e pH 5,4. tempo
propagao foi de 4 dias (at que o fungo chegou a 80% da fase de
crescimento logartmica).
Determinao da biomassa
amostras de culturas de fungos foram tiradas a cada 24 horas para determinar
a biomassa produzida (blastosporos-miclio) atravs da determinao do peso
seco, filtrando as amostras atravs de um papel de filtro No. 42 WhatmanTM,
pr-seca a 75 C durante 24h. Subsequentemente, arrefeceu-se e pesados,
obtendo-se assim gramas por litro de meio de cultura (AOAC, 1990).
O consumo de acares redutores

Quantificao de sacarose, glicose e frutose, a partir de melao foi realizada

por cromatografia lquida de alta resoluo usando uma marca Wyatt HPLC
com um Pak Shodex OH (39x300 mm), de acordo com a metodologia descrita
por Matissek et ai . (1998). Pesou-se 0,75 g 1,0 g melao e transferida para um
balo volumtrico de 100 ml para a diluio e depois a amostra foi
homogeneizada, esta foi filtrada por uma membrana de 0,45 micra fornecida
com uma Sep-Pak ele prefiltered injectvel coluna, dependendo da geometria
dos hidroxilos de
diferentes acares. Para a preparao da fase mvel 1000 ml de soluo de
EDTA (sal de clcio) de 50 ppm foram preparadas, esta membrana filtrada e
desgaseificada. calibrao externa normas solues de 100 ml foram
preparadas, gravar o peso exato usado na preparao. As concentraes dos
padres de calibrao foram: 5 ppm de sacarose, glicose e frutose 0,5 ppm a
0,5 ppm.
Condies de operao de HPLC foram: taxa da fase mvel: 0,5 a 0,6 ml / min,
em eluio isocrtica, psi 1300 presso, temperatura de 80 a 85 C e um
volume de injeco de 20 ul de amostras. O teste foi realizado em cada 24
horas.
Resultados e discusso
Caracterizao e geometria dos fermentadores
A caracterizao dos fermentadores em termos KLa, TM e RG e geometria
valores tanque mostrado nas Tabelas 2 e 3, que mostra que o fermentador
Bioflo III teve a melhor relao dI / dt = 0,43 (o KLa aumenta mais elevados
vezes a relao dI / dt e mais curtos de mistura), um KLa = 9.5-208 h-1 e tm
= 1,0-3,0 s, em comparao com o fermentador New Brunswick M-19, que teve
a menor proporo
DI / DT, bem como KLa os valores mais baixos e os mais elevados em termos
de tempo de mistura. Em relao a este resultado Mehta e Sharma (1971)
constataram que uma relao DI / DT 0,4-0,5 so adequadas para conseguir
um contacto eficaz de gs-lquido num tanque com agitao, estes valores so
semelhantes aos encontrados no nosso estudo, bem como os valores relatados
por Junker et ai., (1998) DI / dt = 0,34-,47 para a produo de Streptomyces
usando impulsores Rushton e MaxFlo separadamente.
O dimetro das foras motrizes para o fermentador Bioflo III foi de 7,3 cm, para
Applikon 6,0 cm e 7,3 cm para a M-19, enquanto o valor das RG foi de 15%
para Bioflo III, e para os outros dois fermentadores 7 e 9%, respectivamente.
Junker et ai., (1998) relataram valores mais baixos de RG (gua a 12%, e mais
baixa para o glicerol, 5%) com o aumento do dimetro do impulsor. No entanto,
no presente estudo o dimetro do impulsor permaneceu constante, o que
permitiu que o meio de cultura mantido homogneo e que uma melhor
disperso do mesmo, permitindo assim o desenvolvimento apropriado de
blastosporos do fungo, este atribudo ao tipo fluxo axial e radial gerado com
diferentes tipos de empregados fermentadores.
O tempo de mistura
Tempos de mistura dos trs fermentadores foram geralmente baixa, embora
outros autores relatam tempo mnimo de mistura de 12 segundos a dois
impulsores, 400 rpm e utilizando gua (Oniscu et al., 2002). Esta diferena
pode ser devido principalmente ao mtodo utilizado para a determinao do

tempo de mistura. A posio correta dos motoristas, representando um fator

determinante para a eficincia de mistura. A distncia ideal entre dois
impulsores de 1-2 vezes o dimetro, a posio errada pode causar uma m
mistura (Karimi et al., 2013). A separao dos impulsores empregadas era uma
vez o seu dimetro. Oniscu et al., (2002) obtiveram uma distncia ptima entre
1,5 condutores. Se a distncia entre os impulsores 1,5 aumentada, pode ser
reduzido o tempo de mistura nos fermentadores aqui caracterizadas e
aumentar a eficincia de transferncia de oxignio. Neste estudo o tempo de
mistura diminuiu de forma significativa com a velocidade do rotor, que tende a
um valor constante atingiu 400 a 600 rpm, resultados semelhantes foram
relatados por Nuez-Ramirez et ai., (2012), que verificaram que a taxa de
agitao foi melhor a 300 rpm a 800 rpm ou 100, obtendo-se tempos de mistura
curtos, pois a estabilidade mecnica, tornando
um fluido homogneo na avaliao do comportamento reolgico de B. bassiana
em rotores Rushton fermentador-MaxFlo.
taxa de transferncia de oxignio volumtrico (NA)
O melhor valor do NA foi obtida com a combinao dos condutores RushtonMaxFlo (170 mg de O2 / L * h). Nesta, Mavituna (1983) encontraram uma
fngica NA 100-250 mg O2 / l * h, mostrando que os resultados apresentados
neste artigo so os melhores valores KLa para a mesma combinao de
condutores e que o volume de teor de gs no fermentador adequado,
permitindo um bom crescimento de tais fungos; Resultados semelhantes foram
obtidos por Doran (1995). No entanto, no presente estudo os valores de NA
foram baixos, o que atribudo aos problemas encontrados no elctrodo de
oxignio membrana. Em todos os ensaios, mascarando a diminuio da
concentrao de oxignio no caldo de fermentao, tanto a concentrao de
biomassa como a reologia do caldo de cultura foi apresentado. Houve diferena
estatstica significativa entre as condies de arejamento e agitao do
experimento (F = 10.324, p 0,0123). As melhores condies destes
parmetros
no sistema de mistura eram: agitao de 400 rpm e arejamento de 1,0 vvm de
(DMS = 0,585) (Tabela 4).
cintica de crescimento de Beauveria bassiana
O B. bassiana fase de adaptao foi de 24 h, o tempo de duplicao (td) de 31
h e a taxa de crescimento especfica de 0022 h-1. Humphreys et al. (1990)
obteve 0,19 e 0,21 h-1 a B. bassiana, utilizando glucose como fonte de
carbono. Estas taxas de crescimento so 10 vezes maiores que os obtidos no
presente estudo, usando o melao. No entanto, o principal objetivo era
conseguir bons rendimentos de esporos (1x108 blastsporos / ml);
colateralmente biomassa miclio formado pode ser utilizado como ingrediente
activo (Eyal et ai., 1994).
O maior valor de u (0,0321 h-1) foi apresentado na combinao de drivers de
Rushton-MaxFlo, ou seja, uma melhor mistura tido e, portanto, melhor
transferncia de oxignio, permitindo o desenvolvimento adequado do
organismo
O melhor desempenho foi 1.2x109 blastosporos blastosporos / ml, para iniciar a
fase estacionria de crescimento em 4 dias (Figura 1). este desempenho

na gama definida para a produo de insecticidas biolgicos, em fermentao

lquida (1x108 blastosporos / ml) (Riaz et al., 2013).
B. bassiana consumido 2,48 g / l de acares redutores totais para o
desenvolvimento (4 dias), o que significa que os nveis mais elevados de
concentrao de acares possvel aumentar a concentrao de biomassa
para atingir os nveis de produo mais elevados (Figura 1) (biomassa produziu
= 3,65 g / l). Estes resultados foram mais baixos do que os valores relatados
por Eyal et al., (1994), Li et al., (2010), Nuez-Ramirez et ai. (2012) para
fungos entomopatognicos, que obtidos rendimentos elevados de biomassa
(10,06-50 g / l).
concluses
O fermentador Bioflo III apresentou o melhor coeficiente volumtrico de
transferncia de oxignio, ao longo dos outros fermentadores, bem como
tempos de mistura mais curtos eo melhor valor de RG no sistema de
fermentao. Essas condies permitiram o crescimento e obter uma boa
concentrao de blastosporos de Beauveria bassiana por meio do melao
como substrato.
Com a combinao dos impulsores Rushton-MaxFlo, a agitao de 400 rpm e
arejamento de 1,0 vvm de, foram obtidos 1.2x109 blastosporos / ml. Estas
condies levou ao crescimento adequado de blastosporos fngicas devido ao
tipo de fluxo axial e radial gerado. A quantidade de blastosporos, biomassa e
substrato consumo eram aceitveis e esto dentro dos padres para a
produo de um bioinseticida.
Biotech estudados os parmetros e as condies do sistema de mistura gerada
neste trabalho podem ser aplicadas no processo de descamao e optimizao
no fermentador para a produo de blastosporos do fungo entomopatognico
B. bassiana a nvel laboratorial.
.