Reaccin en Cadena de

Polimerasa (PCR)
Definicin
PCR son las siglas por las que se conoce a la reaccin en cadena de la polimerasa (en ingls
Polymerase Chain Reaction), una tcnica cientfica avanzada que fue inventada por el bioqumico
estadounidense Kary Mullis en 1985. Esta tcnica permite amplificar pequeas regiones especficas
del ADN en laboratorio. Es decir, consigue que un pequeo segmento de ADN que pasara
desapercibido en un anlisis cualquiera se multiplique millones de veces y as sea fcil de detectar.

Tipos de PCR
Nested PCR
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de amplificacin es utilizado como molde para
realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia
amplificada.
Ventajas: brinda alta sensibilidad y especificidad
Desventajas: no permite cuantificar la muestra

PCR multiplex
PCR en la cual se amplifica simultneamente dos o ms secuencias. Para lo cual se combinan dos o
ms pares de cebadores en el tubo de la mezcla junto con los dems reactivos.

RT- PCR
Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc)
usando la enzima Transcriptasa inversa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.

PCR in situ
Permite la deteccin de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con
tcnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de clulas.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa

Se aade un componente fluorescente que permite medir la luz. A ms luz, ms cantidad del ADN
detectado.

Cmo funciona el PCR?

La reaccin consta, por lo regular, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de
tres pasos: el primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrgeno del ADN para
desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un minuto. Este
paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocurre la hibridacin de las
cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados cebadores o iniciadores (ADN
sinttico de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases
nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADNs. Esta temperatura depende de la
temperatura de fusin de los iniciadores, la cual puede calcularse mediante una frmula, pero
generalmente oscila entre 50 y 60C. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la
polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el
orden que le va dictando la secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde.

Usos de la PCR
La PCR es una tcnica que ha encontrado varios usos en los distintos campos de la Medicina. As, por
ejemplo, en el de la Oncologa, la deteccin de translocaciones, mutaciones, deleciones, etc., aporta
un mtodo ms objetivo y sensible al establecer un diagnstico, dado que el estudio clsico de las
neoplasias se fundamenta en la identificacin histopatolgica de clulas malignas las cuales, sin
embargo, se reconocen slo si al menos 1%-10% de las clulas son neoplsicas. Por otra parte, el
diagnstico molecular puede ser til en la estadificacin de la neoplasia, en la evaluacin del
tratamiento al establecer la presencia o no de tumor residual, en el pronstico del tumor y tambin
puede identificar poblacin con un riesgo mayor de padecer neoplasias. Otra utilidad de la PCR es la
identificacin de ciertos genes asociados a diferentes enfermedades familiares como la fibrosis
qustica, la distrofia muscular de Duchenne y otras muchas, lo que ha permitido la opcin de facilitar
consejo gentico a aquellas familias portadoras de dichos genes. Frente a las limitaciones que
presentan mtodos diagnsticos convencionales como el cultivo, la serologa o el estudio
histopatolgico de las muestras, la amplificacin de cidos nucleicos por medio de la PCR aporta
grandes ventajas, como son una gran sensibilidad diagnstica, as como una elevada especificidad.
Asimismo, uno de sus puntos fuertes es la rapidez diagnstica, dado que permite obtener en minutos
u horas lo que antes precisaba das e incluso semanas. No obstante, no est exenta de
inconvenientes que no conviene olvidar a la hora de interpretar los resultados. Actualmente hay
disponible un amplio nmero de protocolos de PCR para la identificacin de diversos patgenos, pero
slo parte de ellos estn disponibles comercialmente como la PCR frente a virus del grupo herpes,
papovavirus, flavivirus, retrovirus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium
spp., Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma spp., Toxoplasma gondii y otros. Uno de los usos de la PCR
con mayor impacto en las enfermedades infecciosas es el diagnstico precoz de la tuberculosis. El
diagnstico definitivo viene dado por el aislamiento y posterior cultivo de la bacteria, pero esto
requiere varias semanas. En cambio, la sensibilidad de la PCR alcanza un 90%-98% y permite
adems un diagnstico muy precoz, lo que facilita instaurar tempranamente el tratamiento y
planificar acciones epidemiolgicas sobre el entorno del enfermo. El mayor inconveniente de la PCR
es su alto coste, no slo a causa de la tcnica en s y del carsimo equipamiento que exige, sino
tambin debido a la necesidad de una gran disponibilidad de espacio en el laboratorio, porque para
prevenir la contaminacin de la muestra es preciso que las distintas fases del proceso tengan lugar
en lugares fsicamente separados entre s.

Controles de la PCR
La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo.
Estos controles son necesarios para:

Comprobar que no exista contaminacin en la mix de reaccin (control negativo)

Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un desperfecto en la reaccin

(control positivo).

CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde

CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe tiene el sitio de pegado de primers.

Falsos Positivos y Negativos de la PCR

Causas de falsos positivos

CONTAMINACIN
Amplificacin inespecfica

Causas de falsos negativos

Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)

Extraccin del ADN defectuosa

Mutacin en el sitio de hibridacin del cebador
Baja concentracin o calidad del templado
Concentracin incorrecta de Mg2+ o primers

Como se analiza la PCR?

No es suficiente con detectar la amplificacin en tiempo real y capturar la fluorescencia de cada
muestra, el anlisis de la reaccin es el paso final para determinar la cuantificacin gnica. Para ello,
los termocicladores estn provedos de una PC con un software que generalmente son fciles de usar.
Este software genera una serie de grficas en donde se muestran todos los datos necesarios para
conocer si la reaccin fue exitosa. Una de estas grficas es la de amplificacin que muestra el curso y
el progreso de la reaccin, otra grfica es la curva de disociacin o curva melting que muestra
informacin sobre la especificidad de la reaccin. Otro paso importante del anlisis es elegir el tipo
de cuantificacin que se usar para determinar la amplificacin precisa del blanco gnico; este
procedimiento depende de los intereses del investigador. Para ello existen dos tipos de
cuantificacin: la absoluta y la relativa. La primera generalmente se utiliza para conocer el nmero
exacto de copias amplificadas del blanco o la concentracin precisa de cidos nucleicos en una
muestra. En la prctica, este tipo de cuantificacin se usa para medir la carga viral o bacteriana en
diferentes tejidos. La segunda se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la expresin de
genes en distintos estados fisiolgicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del gen
blanco comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su expresin a
pesar de que los estados fisiolgicos se modifiquen por diversas causas. Los datos son expresados
como relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el nmero de veces en el que
aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que
sea el tipo de cuantificacin que se elija, casi todos los software de los equipos estn posibilitados
para llevar a cabo los anlisis matemticos y estadsticos que se requieren en cada tipo de
cuantificacin.