Guía de Virología

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

TECNOLOGA MDICA
DEPARTAMENTO ACADMICO DE
MICROBIOLOGA MDICA
GUA DE PRCTICA DE
VIROLOGA
(Cdigo: TO 4023)
AO ACADMICO: 2014-II

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL
DE TECNOLOGA MDICA
Profesora Responsable del Curso: Zila Patricia Caballero opo

Profesores que participaron en la elaboracin de la Gua de Prctica:
vila Arosemena, Julia Graciela
Caballero opo, Patricia
Cabezas Snchez, Cesar
Chvez Perez, Victor Manuel
Cuadra Koshansky, Ana Luisa
Espinoza Silva, Maximo Manuel
Garca Mendoza, Mara Paquita
Gonzlez Collantes, Sofa
Len Sandoval, Segundo
Marocho Chahuayo, Luis
Peralta Chirinos, Maril
Reyes Puma, Nora
Valencia Bazalar, Esther L.
Wong Chero, Paolo

DE TECNOLOGA MDICA
NDICE
PRCTICA 1.
VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS ...................................................................... 5
PRCTICA 2.
ESTERILIZACIN, DESINFECCIN Y ANTISEPSIA..................................................... 7
PRCTICA 3.
PREPARACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES.................................................... 9
PRCTICA 4.
ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES ................................................ 14
PRCTICA 5.
IDENTIFICACIN, CODIFICACIN, PRESERVACIN, CONSERVACIN Y

TRANSPORTE DE MUESTRAS ................................................................................. 16
PRCTICA 6.
SANGRADO DE ANIMALES ...................................................................................... 18
PRCTICA 7.
INOCULACIN DE ANIMALES .................................................................................. 21
PRCTICA 8.
HUEVO EMBRIONADO, ANATOMIA Y VIAS DE INOCULACION. ............................. 25
PRCTICA 9.
PREPARACIN DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO ................................................... 28
PRCTICA 10.
CULTIVO CELULAR SECUNDARIOS Y EFECTO CITOPTICO ..................................... 32
PRCTICA 11.
BIOLOGA MOLECULAR EN VIROLOGA .................................................................. 40
PRCTICA 12.
LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA ..................................................... 40
PRCTICA 13.
INMUNOFLUORESCENCIA ....................................................................................... 47
PRCTICA 14.
ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay) ................................................... 48
PRCTICA 15.
WESTERN BLOT ...................................................................................................... 52
PRCTICA 16.
HEMAGLUTINACIN VIRAL Y SU TITULACIN ....................................................... 55
PRCTICA 17.
PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN ............................................. 57
PRCTICA 18.
PAUL BURNELL - TITULACION ................................................................................. 59
PRCTICA 19.
INOCULACIN DE ENTEROVIRUS EN CULTIVOS DE CELULAS -
PRCTICA 20.
HEPATITIS VIRAL - DIAGNSTICO ........................................................................... 64

DE TECNOLOGA MDICA

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 1.
1.
VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS
INTRODUCCIN
Los virus son agentes infecciosos que miden de 20 a 300 nanmetros, en su genoma
contienen una clase de cido nucleco (ADN o ARN). Los virus son inertes en el medio
extracelular y se replican slo en clulas vivas, siendo parsitos obligados
Los virus han desarrollado mecanismos para sobrevivir en la naturaleza y transmitirse de

un husped a otro, e incluso pueden infectar durante el trabajo al personal de
laboratorio
En las clases prctica del captulo de virus se tratar de facilitar el aprendizaje de Algunas
tcnicas de laboratorio que permitan colaborar en el diagnstico de las enfermedades
causadas por las infecciones virales y en el desarrollo de trabajos de investigacin
Los mtodos y tcnicas se modifican de acuerdo con el avance de la ciencia, la biotecnologa ha logrado implementar nuevas tcnicas que ahorran material y tiempo en el
proceso del diagnstico, para determinar la presencia de antgenos virales y/o
anticuerpos antivirales
2.
LABORATORIO DE VIRUS
En un laboratorio de virus se deben seguir estrictamente las normas de bioseguridad,
para evitar las infecciones durante el trabajo
El laboratorio de virus debe indicar los procedimientos adecuados para la toma de
muestras y la forma como se debe enviar al laboratorio
Las muestras deben estar adecuadamente conservadas para evitar su deterioro
El personal debe estar bien instruido en el manejo y procesamiento de cada tipo de
muestras
En un laboratorio de virus el ambiente de desinfeccin, lavado, preparacin de material y
esterilizacin juega un rol importante en el trabajo virolgico. Este paso cada da se
simplifica con el uso de material descartable, pero todo el material no puede ser
descartable por lo que indispensable el buen lavado y esterilizacin

DE TECNOLOGA MDICA
3.
EQUIPOS INDISPENSABLES
Cabina estril, flujo laminar, centrfuga, centrfuga refrigerada, incubadoras, incubadoras
de CO2, Bao Mara, lector de ELISA con impresora, bomba de vaco, lavador automtico,
autoclave, horno estril, lavador de pipetas, destilador de agua, bidestilador,
potencimetro, balanza, refrigeradoras, congeladoras de -4 y -70 C, depsito de
nitrgeno lquido , filtros antibacterianos, etc.
4.
MATERIAL DE TRABAJO
De vidrio y/o descartable
5.
MATERIAL BIOLGICO
Cepas de clulas, cepas de virus, sueros normales, sueros inmunes, antibiticos,
vitaminas, aminocidos, medios de cultivo

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 2.
ESTERILIZACIN, DESINFECCIN Y ANTISEPSIA
ESTERILIZACIN
1. Introduccin
Comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y qumicos, que se emplean
para destruir grmenes patgenos. A travs de esta, los materiales quirrgicos y la piel
del enfermo alcanzan un estado de desinfeccin que evita la contaminacin operatoria.
Mtodos:
2.
Fsicos
Qumicos
Filtracin
Agentes esterilizantes y desinfectantes
Mtodos fsicos:
Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: el tiempo
2.1
de exposicin y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El
calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las
membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.
2.1.1
Calor seco
2.1.2
Mechero de bunsen
Estufas:
Calor Hmedo
Autoclave
Tindalizacin
Radiaciones:
Rayos Ultravioletas.
2.2

DE TECNOLOGA MDICA
3.
Rayos Gamma:
Mtodos Qumicos: Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los

microorganismos.
4.
Oxido de etileno:
.Aldehdos:
Glutaraldehdo
Formaldehdo
Esterilizacin por gas-plasma de Perxido de Hidrgeno
Filtracin: Este mtodo consiste en usar membranas filtrantes con poros de un tamao
determinado. El tamao del poro depender del uso al que se va a someter la muestra.
Tipos de Filtros
5.
a.
Filtros profundos o Filtros de profundidad
b.
Membranas filtrantes
c.
Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo)
Agentes esterilizantes y desinfectantes
5.1 Antispticos
Alcohol (etlico o isoproplico) 70-90%
Yodo 1-2 mg yodo libre en un L.
Agentes catinicos, aninicos y anfteros
rgano Mercuriales
Colorantes
5.2 Desinfectantes o Esterilizantes

Cloro y Compuestos clorados
Aldehdos
Oxido de Etileno
Compuestos Fenlicos
cidos y lcalis

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 3.
1.
PREPARACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES
PREPARACIN DE MATERIALES
En la preparacin de material hay que considerar las siguientes etapas:
1. La desinfeccin
2. El lavado
3. La preparacin
4. La esterilizacin
2. SOLUCIONES EMPLEADAS EN VIROLOGA

2.1 INTRODUCCIN
Para el aislamiento y mantenimiento de los virus en el laboratorio, se requiere hacer uso
de sistemas biolgicos, los cuales sufren cambios como expresin de la actividad viral
Las clulas cultivadas en el laboratorio sirven como un medio de estudio de agentes
virales de algunas enfermedades, el mantenimiento de las lneas celulares que se
emplean en el laboratorio de diagnstico virolgico debe hacerse bajo determinadas
condiciones de temperatura, humedad, aporte de nutrientes, concentracin de sales, pH
y debe estar libre de contaminacin en todo momento
Las soluciones que a continuacin se preparan sern de gran utilidad para conservar
in Vitro las lneas celulares en mencin
2.2
PROCEDIMIENTOS
2.2.1
INSUMOS
2.2.1.1
Qumicos
Ca Cl2
Ca Cl2. 2H2O
H2O
C6 H12 O6
KCl
KH2PO4
Mg SO4. 7 H2O.
Na HCO2
Na Cl
Na2 HPO4
Mg Cl 2 6H2O
Cloruro de Calcio anhidra

Cloruro de Calcio Hidratado
Agua Bidestilada
Glucosa anhidra
Cloruro de Potasio
Fosfato de Potasio
Sulfato de Magnesio
Bicarbonato de Sodio
Cloruro de Sodio
Sodio Fosfato dibsico
Hexahidrato de cloruro de Magnesio

DE TECNOLOGA MDICA
2.2.1.2
2.2.2
Indicadores
Rojo de fenol
SOLUCIONES
Pesar minuciosamente, la cantidad precisada para cada componente en las formulas
de las soluciones a preparar.
Realizar las combinaciones segn se especifica para cada solucin.
SOLUCION DE HANKS
Composicin de las soluciones madres:
Solucin A:
Solucin B:
Solucin C:
Solucin D:
Solucin E:
Na.Cl.
100 gr.
KCl
5 gr.
Mg SO4. 7 H2O.
2.5 gr.
Agua bidestilada c.s.p.
500 ml
KH2PO4
0,75 gr.
Na2 HPO4
0,75 gr.
Agua bidestilada c.s.p
200 mL.
Ca Cl2 anhidra
1,75 gr.
Ca Cl2. 2H2O
2,3 gr.
200 mL.
Agua bidestilada.
100 mL
Glucosa anhidra.
20 gr.
Na HCO2
1,4 gr.
Rojo de fenol
0,04 gr.
Agua bidestilada c.s.p.
100 mL
Las soluciones A,B,C, sern esterilizadas en autoclave a 110 C por 10 minutos.

Las soluciones D y E sern esterilizadas por filtracin en filtros de Setz.
Las soluciones madres sern conservadas a temperatura de +4 grados centgrados.
Preparar en un litro de la solucin isotnica de Hanks mezclar:
Solucin A
40 mL
Solucin B
40 mL
Solucin C
20 mL
Solucin D
5 mL
Solucin E
20 a 25 mL
1000 mL
10

DE TECNOLOGA MDICA
SOLUCIN P.B.S (Phosphate Buffered Saline)

SOLUCIN S FOSFATO SALINA
Composicin de las soluciones madres:
Solucin A: Na Cl
KCl
Na2 HPO4
NH2 HPO4 .
Agua bidestilada c.s.p..
Solucin B: Ca Cl2 anhidra.
Ca Cl2. 2H2O .
Solucin C: Mg Cl 2 6H2O
8 gr.
0,2 gr.
1.15 gr.
0,2 gr.
800 mL
0,1 gr.
0,132 gr.
100 mL.
0,1 gr.
100 mL
Combinar las soluciones madres en el siguiente orden:

1.
2.
3.
4.
5.
2.2.3
Mezclar las soluciones A y C

Agregar lentamente la mezcla A + C a la solucin B y agitar
Esterilizar por filtracin en la buja de Chamberland
Autoclavar por separado las soluciones A, B y C a 100 C durante 10 minutos.
Conservar a + 4C
SOLUCIONES EMPLEADAS PARA FACILITAR EL DESPRENDIMIENTO CELULAR DE LA

SUPERFICIE DEL TUBO
Solucin de Tripsinas al 0.25 por 100
Tripsina
Solucin de Hanks (sin la solucin E)
2.5 gr.
1000 mL.
Preparar la solucin
Mantener en reposo durante 2 horas a +4 C hasta que clarifique.
Filtrar con el Filtro de Seitz y conservar a -20 C.
2.2.4
SOLUCIONES PARA AJUSTAR EL PH DEL MEDIO

Solucin de bicarbonato con rojo de fenol
Rojo de fenol
Bicarbonato de Sodio
Preparar la solucin
Filtrar en la membrana de Seitz
Conservar a temperatura ambiente
11
0,004 gr.
3,92 gr.
100 mL

DE TECNOLOGA MDICA
2.2.5
SUPLEMENTOS NUTRITIVOS
Solucin de glucosa al 9%
Glucosa
9 gr.
100 mL
Solucin de Tryptosa Phosphate Broth (TPB) a 3%

Caldo Triptosa Fosfato 3%
TPB
3 gr.
100 mL
Solucin de Bacto tryptosa al 10%
Bactotrytosa
10 gr.
100 mL
Solucin de Extracto de Levadura al 10%

Extracto de levadura
10 gr.
100 mL
Extracto embrionario
El extracto embrionario de pollo es preparado a partir de huevos de pollo incubado
durante 8 a 10 horas
Lquido Amnitico de Bovinos
Se recolecta lquido amnitico, se esteriliza y se mantiene en recipientes de 1 litro.
Suero animal
Se suele usar suero de aves
2.2.6
ANTIBIOTICOS
Penicilina (solucin de 100,000 U mililitro
Penicilina 1 000,000
UI
100 mL
La solucin habitualmente empleada es de 100 U.O por mililitro
Streptomicina (solucin de 200 000 ug por ml)
Estreptomicina
1 gr.
100 mL
La solucin habitualmente usada es de 50 ug por mililitro
Mycostatina
Micostatina
Propilenglicol
200 mg
10 mL
Se vierte un mililitro de esta solucin a 1000 mL de medio de cultivo al momento de

su preparacin
12

DE TECNOLOGA MDICA
13

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 4.
ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES
1.
INTRODUCCIN
1.1
De la descontaminacin
La descontaminacin, tiene como objetivo disminuir la carga microbiana de los
materiales de vidrio (placas, pipetas y otros ) dejndolos seguros para su manipulacin.
El trmino se aplica a artculos contaminados durante la atencin de pacientes o por
contacto con fluidos corporales o materia orgnica presente en artculos contaminados.
La descontaminacin se logra a travs de la eliminacin de la materia orgnica con
mtodos de limpieza estandarizados.
1.2
De la limpieza
La limpieza disminuye la carga microbiana por arrastre pero no destruye
microorganismos. Puede realizarse a travs de mtodos manuales o automticos. La
tendencia actual en las centrales de esterilizacin es la automatizacin de los procesos
de lavado con el fin de lograr mayor estandarizacin y disminuir los mrgenes de error.
1.3
De la Desinfeccin
Es la destruccin de formas vegetativas de microorganismos en objetos inanimados y no
necesariamente esporas. Se realiza por mtodos qumicos o fsicos. La desinfeccin de
alto nivel implica la eliminacin total de toda forma de vida microbiana excluyendo slo
las esporas bacterianas. Existen agentes desinfectantes que no tienen capacidad para la
destruccin completa de todos los microorganismos vegetativos, en este caso la
desinfeccin que se obtiene se califica como de nivel intermedio o bajo. Estos ltimos
niveles de desinfeccin tienen muy poca aplicacin prctica en la actualidad.
1.4
De la Esterilizacin
Es la eliminacin completa de toda forma de vida microbiana de objetos inanimados
incluyendo esporas. Puede conseguirse a travs de mtodos fsicos, qumicos o
gaseosos.
14

DE TECNOLOGA MDICA
1.5
Del Almacenamiento
Proceso a travs del cual, los artculos son conservados hasta su uso. Las condiciones de
almacenamiento deben asegurar la esterilidad o desinfeccin del artculo al momento
del uso.
1.6
De la Preparacin/empaque
Etapa en que los materiales son preparados y empaquetados en condiciones que se
facilite su uso y se eviten daos y deterioro del material.
15

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 5.
IDENTIFICACIN, CODIFICACIN, PRESERVACIN, CONSERVACIN
TRANSPORTE DE MUESTRAS
1.
MUESTRAS PARA DIAGNSTICO POR AISLAMIENTO VIRAL

Los virus son muy frgiles, son agentes intracelulares obligados y por lo tanto no pueden
sobrevivir sino es dentro de una clula viva
Fuera del husped los virus se inactivan rpidamente por la luz UV, agentes qumicos,
pH y temperatura
Las muestras para diagnstico de virus deben de manejarse aspticamente a fin de
prevenir la contaminacin bacteriana
2.
MUESTRAS PARA DIAGNSTICO SEROLGICO

Componentes del suero de la sangre recogida durante la fase aguda para demostrar
clases especficas de anticuerpos Ig M, para diagnstico presuntivo
Componentes del suero de la sangre recogidas durante la fase aguda y de convalecencia
de la enfermedad, para demostrar el incremento en el ttulo de anticuerpos especficos
para el virus, o la seroconversin, lo que nos da un diagnstico concluyente
3.
PRESERVACIN DE MUESTRAS DE SUERO PARA DIAGNSTICO DE INFECCIN VIRAL

El suero debe mantenerse refrigerado hasta que pueda ser almacenado a -20 C para el
anlisis de anticuerpos
4.
ETIQUETADO DE MUESTRAS
Usar etiquetas generadas por computadoras, lpiz de cera, o tinta indeleble, para
asegurarse que la etiqueta no se manchar cuando sea sometida a la humedad
El almacenamiento de muestras debe realizarse en cajas para viales, las cuales estarn
adecuadamente rotuladas con el tipo de muestra, cdigos y tipo de estudio
Debe haber un mapa en el banco de sueros para localizar las muestras en el congelador
5.
PREPARACIN DE MUESTRAS PARA ANLISIS DE VIRUS Y ANTICUERPOS
16

DE TECNOLOGA MDICA
La muestra para el aislamiento viral debe ser diluida en una solucin salina y balanceada
(1/5) complementada con suero animal (similar al suero de feto de carnero) y
antibiticos
El suero es comnmente diluido a 1/10 en una solucin salina balanceada,
complementada con una baja concentracin de suero animal y antibiticos para anlisis
de anticuerpos
El suero debe ser calentado a 56 C por 30 minutos para inactivar reactantes no
especficos para anlisis de anticuerpos
6.
MEDIO DE TRANSPORTE
Composicin:
E-MEM con Sales Hanks
10 gr.
Suero bovino Fetal
20 mL.
Solucin Antibitico, antimictico
10 mL
Agua Bidestilada estril
970 mL
Procedimiento:
Se disuelve el E-MEM con sales de Hanks con el agua bidestilada y finalmente
se agrega el suero bovino fetal y la solucin de antibitico antimictico.
Se filtra toda la solucin
Se dispensa 2,5 mL en un vial de 5 mL de capacidad
Se controla por 24 hs. A 37 C
Finalmente se almacena a -20 C.
Existen en el mercado Sistemas de obtencin y transporte de muestras comerciales.
17

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 6.
1.
SANGRADO DE ANIMALES
INTRODUCCIN
La toma de sangre en los animales de experimentacin puede ser de la cartida, esta
operacin se practica cuando hay que recoger gran cantidad de sangre o la totalidad. El
conejo se inmoviliza sobre la mesa con el vientre hacia arriba mientras que de la vena
marginal del conejo se obtiene una pequea cantidad de sangre. Tambin pequeas
cantidades de sangre se pueden obtener de un ratn, se le corta la punta de la cola y se
recoge la sangre que sale. En algunas ocasiones se requiere una cantidad considerable de
suero de Cobayo (complemento), entonces se recurre a la sangra total del animal que
puede ser por decapitaci6n que es ms rpida que por extraccin desde la cartida. Se
afeita el pelo que circula el cuello del cobayo y se desinfecta bien la piel, para luego
decapitarlo; la sangre que emana es recogida en embudos con tubos estriles. Para
practicar esta operacin el animal debe estar en ayunas.
2.
MATERIALES
1
1
2
1
1
1
conejo joven de aproximadamente 2 Kg

jeringa hipodrmica de 10 mL con aguja N* 21 o 22 x 1,5.
tubos de 13 x 100 o 16 x 150, estriles.
fco con Xilol, ter.
bolsa colectora con anticoagulante (comercial de aproximadamente 50 mL) o
Erlenmeyer estril de 250 mL de capacidad con citrato de sodio al 3.8 %, 60 mL para 50 mL de
sangre.
2 tijeras.
3.
PROCEDIMIENTO
Los materiales usados para el sangrado deben ser estriles con la precaucin necesaria
de proteger al operador y al material que se est obteniendo.
3.1
De la vena marginal de la oreja del conejo
Colocar al conejo de manera que no se mueva libremente, y con la oreja extendida.
Transiluminar la oreja y limpiarla con alcohol al 70%. Suavemente presionar la oreja

con los dedos de manera que los vasos se dilaten.
18

DE TECNOLOGA MDICA
Hacer un corte de aproximadamente 0,5 cm. de longitud con una hoja estril
hasta que se produzca la coagulacin espontnea. No se debe sangrar ms de 20
mL x kg peso x semana. Tambin puede obtenerse un menor volumen de sangre
usando una jeringa con aguja delgada.
3.2
Del corazn del conejo
Colocar al animal sobre una mesa y agarrarlo de manera que no pueda moverse.
Darle una ligera anestesia con ter.
Ubicar el rea del corazn (donde se perciben mejor los latidos cardiacos).
Desinfectar con solucin yodada.
Introducir la aguja, conectada a una jeringa estril, en el punto de mayor latido
El ingreso de sangre en la jeringa indicar que se est en la cavidad cardiaca.
Extraer lentamente 10 a 20 mL de sangre.
Traspasar a un tubo estril para la separacin del suero.
Retirar la aguja despus de la extraccin y hacer presin con un algodn en la zona

por algunos minutos. Si es necesario colocar al animal con la cabeza hacia abajo
hasta que se recupere.
Existe el riesgo que el animal muera durante el
procedimiento sobre todo si es hecho por personal con poca experiencia.
3.3
De la vena yugular en carneros
Inmovilizar al carnero en posicin de pie o echado lateralmente, nivelar la cabeza

hasta que la nariz y el centro del cuello formen una lnea recta. voltear la cabeza
ligeramente y separar, eliminar la lana del rea de puntura. Puede ser necesario
cortar la lana.
Aplicar presin digital por sobre la clavcula para producir dilatacin de la vena
yugular externa. Esterilizar el rea donde se localiza la vena, con solucin yodada
dbil o alcohol al 70%
Aplicar presin digital debajo del punto donde se har la puntura e insertar la aguja
estril dentro de la piel y luego dentro de la vena. Portar el frasco recolector
continuamente durante la coleccin de sangre y por 5 minutos despus de la
extraccin para prevenir la formacin de cogulos.
19

DE TECNOLOGA MDICA
Dejar enfriar la sangre a temperatura ambiente. Dispensar la sangre aspticamente

en tubos o frascos estriles y guardar en refrigeracin hasta su uso.
20
Despus de retirar la aguja presionar la zona con un algodn por unos minutos.

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 7.
1.
INOCULACIN DE ANIMALES
INTRODUCCIN
La inoculacin de muestras problema sospechosas de etiologa viral, en animales de
laboratorio, nos sirven para el aislamiento de los virus. Los virus que no se logran
cultivar en medios artificiales, se cultivan rpidamente en animales de laboratorio. En
algunos casos se observan los efectos que produce en el animal inoculado, en otros
casos despus de un cierto tiempo muere el animal al cual se estudia para evidenciar la
enfermedad (a partir de diferentes rganos se preparan frotices, se realizan cultivos y se
realizan estudios macro y microscpicos), en otros casos el animal no muere, pero se le
realiza un examen de sangre y de otros lquidos corporales tomndolos a diferentes
tiempos para observar los cambios que se producen
Otra utilidad es para la preparacin de antgenos, titulacin de virus, produccin de

sueros inmunes, obtencin de glbulos rojos de carnero necesario para algunas pruebas
de laboratorio (hemaglutinacin)
Los animales de laboratorio ms conocidos son: conejos, cobayos, ratones, ratas blancas
y hmsteres
A los conejos se les utiliza para producir antisueros contra los virus y cuando se necesita
en grandes cantidades a veces se utilizan caballos y ovejas
2.
MATERIALES
2 ratones de 8 a 12 semanas de edad respectivas jaulas.
1 tubo de suero fisiolgico estril.
2 pares de guantes descartables.
1 frasco con algod6n.
1 frasco con alcohol de 70% o alcohol yodado
1 marcador
1 contenedor para descartar el material con solucin desinfectante.
2 hojas de bisturi estriles.
21

DE TECNOLOGA MDICA
3.
PROCEDIMIENTO
Desinfectar con alcohol de 70% o alcohol yodado el sitio de la inyeccin, la mayor

parte de las veces se necesita rasurar esta rea.
Con los guantes puestos, coger al ratn por la cola y con ayuda de la otra mano agarrar
de la parte posterior del cuello de manera que finalmente quede inmovilizado con una
sola mano y con la otra se proceda a la inoculacin.
Inocular 0,2 mL de suero fisiolgico estril por todas las vas citadas.
Marcar los animales inoculados y controles con algn colorante y colocar en sus jaulas
adecuadamente rotuladas.
Colocar los materiales usados en recipientes con desinfectante.
Autoclavar y se descartar los materiales usados.
Es necesario conocer las vas de inoculacin dependiendo del virus y del animal a ser
usado. Tambin es importante la edad del animal de acuerdo a los requerimientos, por
ejemplo ciertos virus requieren de ratones lactantes para su replicacin y posterior
aislamiento, en cambio para casos de inmunizacin se prefiere conejos de 24 meses
Las vas de inoculacin ms comunes son:
3.1
Epidrmica.- Se escoge una parte del cuerpo que cl animal no pueda rascar o lamer: la
piel de la espalda o de la parte posterior de la oreja. Afeitada o desinfectada la zona de
la piel, se practican con el bistur escarificaciones lineales muy superficiales, de medio
centmetro de longitud, tambin se puede usar un papel de lija, se lleva a la parte as
preparada la sustancia o virus que se debe inocular. Se unta y se hace penetrar por
friccin.
3.2
Intracardiaca.- Se inyecta en el rea del corazn donde se perciben los latidos.
3.3
Intracraneana.- Para esta va se inocula 0,03 ml en la fontanela del ratn. La aguja

debe ser fina, de preferencia curva, se introduce verticalmente a travs de la pared
craneal evitando daar la corteza cerebral. Se puede clavar primero la aguja, luego
cuando se ha comprobado que la aguja est bien, se adapta con cuidado la jeringa que
contiene el lquido que hay que inyectar.
22

DE TECNOLOGA MDICA
3.4
Intradrmica.- Se clava la aguja, que debe ser finsima, en la dermis, teniendo cuidado
de no pasar de ella y se inyecta el lquido Intramuscular: Se introduce la aguja casi
perpendicularmente en la masa muscular del muslo o sobre la masa muscular de la raz
de la cola del ratn
3.5
Intraperitoneal: El animal se debe poner en una posicin oblicua en que la masa

intestinal se coloca en la parte superior de la cavidad abdominal, la pared abdominal
debe estar hacia el operador. Se inyecta en la parte baja del vientre en forma oblicua
de 4 a 5 mm, se atraviesa la piel y se siente una sensacin de caer en cavidad libre. No
hay as riesgo de herir los rganos internos.
3.6
Intravenosa: Para el caso de ratones y ratas se inyecta en la vena de la cola. En el caso

de conejos puede hacerse en la vena marginal externa de la oreja, generalmente se
usa para ste ltimo aguja calibre 25. La aguja debe insertarse en la direccin del flujo
de la vena, hacia la base de la oreja, colocando la inyeccin inicial cerca del extremo y
las posteriores cada vez ms cerca de la base para evitar la cicatrizacin del tejido dado que en general las muestras de sangre se toman tambin de la oreja, debe
utilizarse una oreja para las inyecciones y la otra para extraer las muestras-. La oreja se
sostiene con la mano izquierda, y se apoya la aguja en el pulgar en el punto de
introduccin durante la inyeccin. La aguja se coloca con el bisel hacia arriba con un
ngulo no menor a 45 hacia la superficie de la oreja. A medida que se introduce el
lquido, la vena se dilata en forma evidente. Cualquier resistencia en el flujo indica que
la aguja no est insertada en la vena. De ser as, no se debe aplicar una mayor presin,
pues el lquido penetrar en el tejido perivascular y estropear la oreja.
3.7
Retroocular.- Se clava la jeringa provista de una aguja muy curvada en el ngulo

externo del ojo. La concavidad de la aguja se desliza por la pared sea de la rbita,
pasando por delante de la glndula lacrimal. Para inyectar cantidades de lquidos
superiores a 0,5 cc la inyeccin ser bilateral, la absorcin es por lo dems rpida.
23

DE TECNOLOGA MDICA
3.8
Subcutnea: La aguja puede ser introducida tangencialmente a la piel (bajo la piel,

observndose la formacin de una ampolla en el punto de la inoculacin, la punta de la
aguja debe correr hacia los costados pero no debe atravesar los msculos
24

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 8.
1.
HUEVO EMBRIONADO, ANATOMIA Y VIAS DE INOCULACION.
INTRODUCCIN
Muchos de los virus y rickettsias patgenas para el hombre y los animales pueden
propagarse en clulas vivas
Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio
embrin.
2.
ANATOMIA
Anatmicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura las
siguientes partes:
3.
VIAS DE INOCULACIN
Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar, depende del agente (virus o
rickettsias) que va a ser inoculado
Con el objeto de visualizar las cavidades se inocular un colorante por va alantoidea y

otro por va amnitica. Tambin se inocular por va del saco de yema o saco vitelino
25

DE TECNOLOGA MDICA
Descripcin de las reas en el huevo embrionado: 1 embrin 2. Cavidad Amnitica 3. Saco

Vitelino (yema) 4 Albumina (clara) 5. Cavidad Alantoidea 6. Membrana corioalantoidea 7.
Membrana externa 8. Cascara y 9 saco de aire
4.
4.1
PROCEDIMIENTO
Materiales
Huevos embrionados de 7 a 8 das y de 10 a 12 das
Alcohol yodado
Pinzas de diseccin
Jeringas de tuberculina con aguja
Punzones de acero
Tijeras curvas
Fucsina al 1 % en agua destilada
Azul de metileno al 1 % en agua destilada
Placas de petri
Solucin fisiolgica
Ovoscopio
Cinta adhesiva
4.2
Procedimiento
4.2.1
Inoculacin por va alantoidea

En huevos embrionados de 10 a 12 das, determinar mediante el ovoscopio el
lmite de la cmara de aire y colorear una marca entre dos vasos sanguneos de
la membrana corioalantoidea, esta estara aproximadamente a 1 cm. por
debajo de la cmara de aire
Desinfectar la cscara con alcohol yodado sobre la cmara de aire
26

DE TECNOLOGA MDICA
Usando un punzn estril hacer un pequeo agujero con cuidado en las zonas
marcadas
Introducir la aguja de jeringa de 1ml. cargada con fucsina (aproximadamente
de la aguja) en un ngulo de 45 grados, e inocular 0,2 ml del colorante
Cortar con tijeras la cscara siguiendo la marca que seala la cmara de aire,
levantar la membrana corioalantoidea y observar el lquido alantoideo
coloreado, el cual se elimina vertindolo en un petr con cuidado
4.2.2
Inoculacin por va amnitica

En un huevo de 10 a 12 das, marcar mediante el ovoscopio el embrin y la
cmara de aire
Limpiar con alcohol yodado un rea de la cmara de aire por encima del
embrin
Hacer una perforacin rectangular de 0,5 cm2
Dejar caer una gota de solucin fisiolgica estril
Con unas pinzas curvas introducir a travs de sta rea dentro de la cavidad
alantoidea, cogiendo al membrana amnitica hacia arriba, formar una
pequea tienda en cuya base se inyecta 0,2 ml de un colorante o del inculo
problema
Se tapa la abertura con cinta adhesiva
4.2.3
Cosecha
Con tijeras cortar la cscara a nivel del lmite de la cmara de aire
Se descarga el lquido alantoideo luego con pipeta Pasteur se extrae el lquido
amnitico. En caso de no haber lquido, hacer un lavado con suero fisiolgico
estril (1ml) y luego se colecta este lquido
27

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 9.
1.
PREPARACIN DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO
INTRODUCCIN
Los diferentes tipos de clulas tienen diferentes requerimientos de crecimiento, pero en
todos los casos el medio que las rodea debe suministrar todos los nutrientes esenciales.
La temperatura, pH, osmolaridad y humedad deben ser mantenidos dentro de ciertos
lmites. Adems sustancias txicas o inhibitorias no deben estar presentes o permitir que
se acumulen. La adicin de suero al medio basal como fuente de factores de crecimiento
macromoleculares es esencial para el crecimiento de muchos tipos celulares. Las clulas
dependientes de anclaje (unin firme) requieren de una superficie para fijarse que no sea
txica y biolgicamente inerte.
Despus de colocar una semilla en un recipiente para cultivo nuevo y fijado a la

superficie, las clulas entran a la fase de regazo durante la cual no hay aumento en el
nmero de clulas. Posteriormente sta es seguida de una fase logartmica de
crecimiento, con un aumento exponencial en el nmero de clulas y actividad
metablica. La duracin de la fase logartmica vara entre los tipos celulares ya que los
diferentes tipos de celulares ya que los diferentes tipos de clulas se dividen a diferentes
ndices (tiempo de generacin). Se alcanza una fase estacionaria cuando los nutrientes se
agotan y los desechos o productos txicos se acumulan. El nmero de clulas permanece
constante, esto a menudo sucede cuando se alcanza la confluencia. El cultivo celular se
denomina confluente cuando las clulas ocupan toda el rea de crecimiento disponible.
Algunas clulas son sensibles a la inhibicin por contacto (inhibicin de la proliferacin
debido al contacto de clula a clula resultante de la confluencia) mientras otros tipos,
como las clulas tumorgenas no son sensibles. Las clulas se afectan desfavorablemente
y de manera eventual morirn si se permite la acumulacin de productos de desecho. Las
clulas son pasadas (subcultivadas) para mantener la viabilidad y condiciones de cultivo
celular ptimos. El nmero de pasajes se refiere al nmero de veces que las clulas se
han subcultivado o transferido desde que se obtuvo el cultivo celular
28

DE TECNOLOGA MDICA
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

1.1
Cultivos Primarios
Son aquellas clulas recientemente aisladas a partir de tejidos u rganos y suelen
tener una duracin limitada en cultivos llamados cultivos celulares finitos.
- Tejidos fetales, adultos normales

- Tejidos tumorales
- Primer cultivo: Fibroblastos, epiteliales u otras clulas
1.2
Cultivo de Lneas Celulares
1.2.1
Semicontinuas (Clulas diploides): son subcultivos sub- siguientes de cultivo de

clulas primarias de tejidos diploides normales. Puede cultivarse hasta 50
generaciones, poseen el cariotipo normal; diploide, se usa para producir vacunas y
para diagnstico (HDCS, MRC-9, WI.38)
1.2.2
Continuas:
Son clulas aneuploides transformadas o de tejidos tumorales, se
mantienen in vitro por tiempo prolongado por medio de cultivos repetidos

(propagacin indefinida). No se usan para vacunas.
Cultivo de Linfocitos: Linfocitos B inmortalizacin (Virus EB), Linfocitos T Interleukina2
2.
1
CULTIVOS
Cultivos Primarios
Caja de Instrumentos:
1 tijera curva
1 1 pinza diente de ratn
1 1 pinza de diseccin
8 Alfileres
1 soporte de diseccin
29

DE TECNOLOGA MDICA
Material de vidrio y otros

2 placas petri pequeas con papel filtro
1 beaker de 50 Ml
1 Erlenmeyer con barra magntica de 50 mL
1 embudo con gasa
1 tubo de centrfuga
10 mL de tripsina 0.25 %
1 lamina porta objeto
1 pipeta pasteur
1 frasco de colorante, cristal vileta o azul de Tripn
1 frasco con ter
1 frasco con medio de lavado (PBS)
1 frasco con medio de cultivo
2.1.1
Procedimiento
1
Sacrificar al ratn o hmster, usando una campana con ter.
Extraer los riones con asepsia y adecuada tcnica quirrgica inmediatamente

despus de la muerte.
Colocar en la placa petri con el medio de lavado hasta cubrir.
Hacer un corte transversal, seleccionar trozos de corteza eliminar la mdula y

lpidos.
Pasar a la otra placa petri y lavar con PBS.
Pasar al Beaker cortar hasta un tamao de 2-3 mm.
Lavar con PBS.
Colocar en el Erlenmeyer con magneto el tejido triturado luego agregar 3

volmenes de tripsina pre calentados a 37 C por volumen de tejido
Llevar al agitador por 30 minutos, no debe formarse espuma.
10
Descartar el sobrenadante y reemplace por un volumen igual de tripsina

nueva.
30

DE TECNOLOGA MDICA
31
11
Llevar nuevamente al agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente.
12
Filtrar con el embudo y gasa.
13
Centrifugar a 600-700 rpm por 10 minutos
14
Descartar el sobrenadante
15
Observar viabilidad, contar 4 x 106 cel/mL
16
Resuspender 1 mL de las clulas en 9 mL de medio de cultivo celular.
17
Observar el cultivo diariamente.

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 10.
CULTIVO CELULAR SECUNDARIOS Y EFECTO CITOPTICO
LINEAS CELULARES CONTINUAS

1
Materiales
2 tubos de cultivos de clulas
Procedimiento
Observar al microscopio la botella de cultivo con el objetivo de ver si el
monoestrato celular es continuo y uniforme.
Frascos de Cultivo Celular
Clula cultivada
32
Cultivo Celular Normal

DE TECNOLOGA MDICA
Cultivo de fibroblastos
Monocapa epitelial del embrin o de rin
de mono verde africano.
Cultivo de clulas VERO sanas
33
Efecto citoptico 48 horas despus de la

inoculacin de virus sarampin

DE TECNOLOGA MDICA
34

DE TECNOLOGA MDICA
Se denomina efecto citoptico a las alteraciones que sufre la clula por la infeccin viral.
Los cuerpos de inclusin son la presencia de cuerpos anormales intracelulares asociados a
algunas enfermedades humanas y de animales.
Estas estructuras pueden encontrarse en el ncleo o en el citoplasma y su localizacin y

sus caractersticas tintoriales son generalmente especficas para una enfermedad viral.
Acerca de la naturaleza de estos cuerpos de inclusin, se consideran en algunos casos

como conglomerados de virus infecciosos asociados a productos de reaccin de la clula
infectada.
Cuerpos de inclusin pueden observarse en muestras tomadas directamente del paciente

o en cultivos de clulas infectadas.
Cuerpos de Inclusin
VIRUS
NOMBRE
LOCALIZACIN
CARACTERISTICAS
TINTORIAL
Viruela
Guarniere
citoplasma
acidfilaeosinfila (rosado)
Rabia
Negri
citoplasma
Acidfila
Fiebre Amarilla
Margarino Torres
ncleo
Acidfila
Herpes simplex
Lipschutz
ncleo
Acidfila
ncleo
basfila (azulado)
ncleo
Basfila
Citoplasma- ncleo
Acidfila
Adenovirus
Citomegalovirus
Sarampin
35
Ojos de lechuza

DE TECNOLOGA MDICA
CULTIVO DE CLULAS NORMAL
Con coloracin de Hematoxilina eosina (H/E).
El citoplasma se tie de rosado.y ncleo

azulado
RABIA
En corte histolgico de cerebro, con coloracin de H/E. Se observan inclusiones
intracitoplasmticas denominadas Corpsculos de Negri.
Virus Rabia:
Neuronas con corpsculos
de Negri en su interior
ENTEROVIRUS
Virus Polio Virus ECHO Virus Coxsakie
En cultivo de clulas humanas (HEP-2), se observa redondeamiento y degeneracin celular,
picnosis nuclear y desplazamiento del ncleo hacia el borde de la clula.
36

DE TECNOLOGA MDICA
Enterovirus:
Virus Coxsakie
HERPESVIRUS
Se observan clulas gigantes multinucleadas, inclusiones eosinoflicas intranucleares
denominadas Cuerpos de Lipschutz.
Herpesvirus :
Cuerpos de Lipschutz
HERPESVIRUS
Tzank Test
CITOMEGALOVIRUS
En sedimento de orina se observa inclusiones nucleares basfilas (azuladas) en Ojos de
Lechuza rodeada de un halo claro con citoplasma basfilo.
37

DE TECNOLOGA MDICA
Citomegalovirus:
Inclusiones en Ojo de Lechuza
Se realizara una prctica de

Citomegalovirus
38

DE TECNOLOGA MDICA
ADENOVIRUS
Cultivo de Clulas Hep 2. Se observa agrupacin de clulas en racimo e inclusiones basfilas
intranucleares.
FIEBRE AMARILLA
Cuerpos de Councilman
Necrosis heptica e inclusiones
citoplasmticas acidfilas llamadas cuerpos
de Councilman y descritas en un principio
en la fiebre amarilla
39

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 11.
BIOLOGA MOLECULAR EN VIROLOGA
PRCTICA 12.
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
1
1.1
INTRODUCCIN
Breve revisin de la historia de la Biologa Molecular
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR: Polymerase Chain Reaction) es un mtodo
que forma parte de las herramientas de la biologa molecular, ciencia que surge como
producto de la unin de la gentica y la bioqumica.
Es importante resaltar que antes del descubrimiento de la PCR ya se estudiaba el ADN
mediante diferentes mtodos como se observa en el cuadro siguiente.
Cuadro 1. Breve revisin histrica de la biologa molecular

AO
1869
1953
1972
1973
1977
1986
DESCUBRIMIENTO
Descubrimiento del ADN
Estructura del ADN
ADN recombinante In Vitro
ADN se clona en un plsmido
Secuenciamiento rpido de ADN
PCR
CIENTIFICO(s)
F. Miescher
Watson, Crick, Franklin, Wilkins
P. Berg
H. Boyer y S.Cohen
F. Sanger y W. Gilbert
K. Mullis y col.
1.2 Mtodos Moleculares empleados en Virologa

El impacto del uso los mtodos moleculares ha sido mayor en microbiologa,
especialmente en el diagnstico, seguimiento o monitoreo de los pacientes, as como
genotipificacin, deteccin de genes de resistencia entre otros. En Virologa se emplean
varios mtodos moleculares como vemos en el siguiente cuadro:
Cuadro 2. Principales Mtodos Moleculares empleados en Virologa
MTODO
PCR y variantes
Secuenciamiento
Clonacin en vectores
40
USO
Diagnstico como:
Carga Viral (Viral load- VL) aplicados en VIH, HCV, HBV,
etc.
Tipificacin como:
Deteccin de mutaciones, deleciones, inserciones, etc
Genotipificacin y deteccin de mutaciones, deleciones,
inserciones.
Desarrollo de vacunas
Investigacin bsica

DE TECNOLOGA MDICA
1.3
Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Mtodo desarrollado por Mullis et al, utiliz una enzima capaz de resistir a los cambios
de temperatura. Pero para poder entender mejor la secuencia de trabajo en el
desarrollo de la tcnica de PCR revisaremos el siguiente esquema:
1.3.1
Esquema de Trabajo para el desarrollo de una PCR convencional

Es comn, en el aprendizaje del procedimiento de PCR, considerar solo el concepto
de la amplificacin de hebras de ADN molde con el uso de reactivos y la obtencin de
millones de copias; sin embargo existen dos procesos alrededor de la amplificacin.
El primero incluye la preparacin de reactivos y se denomina Pre-Amplificacin, en
condiciones ideales se trabaja en un rea libre de ADN y ARN. El segundo proceso se
lleva acabo luego de la amplificacin y busca visualizar el producto amplificado,
usualmente se utiliza la electroforesis horizontal en agarosa (Esquema 1). Por lo
antes mencionado en los laboratorios de biologa molecular encontramos reas de
trabajo denominados como: pre-amplificacin, amplificacin y post amplificacin,
pero esto no constituye una regla estndar y va a depender del diseo del
laboratorio y del tipo de material biolgico empleado, por ejemplo se puede incluir
un rea exclusiva para la extraccin de ADN/ARN (no incluida en el Esquema 1).
Esquema 1. Esquema de Trabajo de una PCR
PRE-AMPLIFICACIN
PREPARACIN DE REACTIVOS
AMPLIFICACIN
DESARROLLO DE LA PCR-USO TERMOCICLADOR
POST-AMPLIFICACIN
ELECTROFORESIS - VISUALIZACION DEL PRODUCTO
1.3.2
Componentes de la PCR-Amplificacin
La finalidad de este mtodo es lograr obtener millones de copias a partir de un
segmento de acido nucleco. Para ello se requiere contar reactivos que permitan la
amplificacin del ADN molde:
41

DE TECNOLOGA MDICA
a. Tampon o Buffer PCR: Contiene KCl, NaCl, Tris-HCl, BSA y detergentes no inicos.
La finalidad del uso del tampn es brindar estabilidad a la enzima ADN
polimerasa, asegurar un pH apropiado en la reaccin.
b. Desoxirribonucletidos trifosfatos - dNTP: Constituyen las unidades que,

agregadas, permitirn la formacin de hebras nuevas de ADN, se debe buscar una
concentracin equimolar de dATP, dTTP, dGTP y dCTP. Las concentraciones de
trabajo de dNTP en la PCR, vara entre 20-200 uM para cada uno.
c. Magnesio: Ion de Magnesio divalente (Mg2+) es necesario para la actividad de la
enzima de amplificacin, ADN polimerasa. Para estandarizar los PCR se
recomienda determinar la concentracin apropiada de Mg2+
d. Oligonucleotico o cebador: Conocido como primer permite reconocer el

segmento de amplificacin usualmente se trabaja con 2 set de oligonucletidos y
brindan la especificidad al sistema
e. Enzima de amplificacin: La ms conocida es la Taq polimerasa obtenida de la

bacteria Thermus aquaticus, pero existen otras enzimas de mayor versatilidad
especialmente para la amplificacin de grandes segmentos de ADN como Pfu
entre otros.
f. Agua PCR o Agua MilliQ esteril: Se puede utilizar agua altamente pura sea
tridestilada, desionizada, comercialmente se le conoce como agua PCR
g. ADN
molde:
Puede
ser
extrado
de
diferentes
muestras
biolgicas,
microorganismos aislados, entre otros.
1.3.3
Etapas de la Amplificacin- PCR

La PCR tiene tres etapas en base a la programacin de temperatura lo que asegura
mayor actividad o eficacia de los componentes de reaccin:
42

DE TECNOLOGA MDICA
a. Denaturacin inicial: el principio es que a altas temperaturas por encima de 90C

se busca abrir la doble hebra de ADN. La mayora de laboratorios programa esta
etapa entre 94 95 C con un tiempo entre 2 a 10 minutos, pero el rango
permitido es entre 92 96 C.
b. Ciclaje: La programacin vara entre 20 a 40 ciclos
Denaturacin: Usualmente entre 94 95 C por 20 a 60 segundos busca

denaturar la molcula de ADN
Hibridacin: Etapa de unin de los cebadores o primer a la hebra molde,

la programacin vara de acuerdo a la temperatura de hibridacin.
Extensin: La ADN polimerasa agrega los nucletidos. Aunque el tiempo

depende de la longitud del ADN, la temperatura ptima de actividad de la
ADN polimerasa es 72C.
c. Extensin final: Temperatura programada 72C. Tiempo entre 5 a 10 min.
1.3.4
Tipos o Variantes de la PCR

Los mtodos moleculares han evolucionado a travs del tiempo lo que nos permite
contar incluso con sistemas automatizados. Los principales tipos de PCR de acuerdo a
su aplicacin: PCR convencional o estndar, PCR Hot Start, RT PCR (Reverse
Transcription PCR), Long PCR, Nested PCR, PCR en Tiempo Real, entre los modelos
automatizados comerciales tenemos: Taq Man 48 Roche, m2000 Abbott, etc.
1.3.5
Electroforesis
Para verificar el producto de amplificacin se utilizan mtodos como electroforesis
horizontal con el uso de un soporte como agarosa, tampn de electroforesis, buffer
de corrida y marcador de peso molecular. El porcentaje de agarosa utilizado depende
del tamao del producto amplificado.
43

DE TECNOLOGA MDICA
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

En la presente practica requerimos contar con los
2.1
Materiales
Cabina de bioseguridad
Cabina de esterilizacin PCR biologa molecular
Micropipeta digital rango 100-1000 uL
Micropipeta digital rango 0.5-10 uL
Sistema de Electroforesis Horizontal
Sistema de documentacin de geles
Microcentrifuga 14,000 rpm
Microondas
Refrigeradora
Termociclador
Congelador vertical -20C
2.2
Reactivos
Taq DNA Polymerasa
dNTP's
ClMg
Cebadores u oligonucleotidos
1 Kb o 100 pb DNA Ladder
Agua PCR
Reactivo para electroforesis
Buffer TAE o TBE
Bromuro de etidio
ADN
Agarosa
Leja 10%
44

DE TECNOLOGA MDICA
Alcohol 70%
2.3
Materiales
Guantes descartables sin talco

Tips o punteras con filtro de 0.1-10 l, 2-200 l, 100-1000 l,
Microtubo cnico PCR 0.2 mL
Microtubo cnico 1.5 ml
Caja para almacenamiento 81, 9x9
Paos absorbentes
Contenedor de bioseguridad
Bolsas autoclave
Gradilla de polipropileno
Papel toalla descartable
Plumn marcador
Hoja de trabajo para PCR
Pizetas
3
PROCEDIMIENTO
PRIMERA PARTE: Duracin del procedimiento 2 horas aproximadamente
3.1
Protocolo PCR
a.
Prepare el protocolo de trabajo, en la hoja de trabajo, calcule el volumen de

reactivos para la PCR de acuerdo al nmero de muestras a amplificar.
b.
Siguiendo las pautas de las medidas de bioseguridad en cada ambiente de trabajo,

realice la limpieza de los equipos y prepare el material siguiendo las pautas
descritas en el procedimiento de limpieza de ambientes de trabajo de laboratorio.
c.
Pre-Amplificacin:
Utilice el siguiente cuadro para el clculo total de volumen de reactivos a utilizar en
su PCR. La mezcla de reactivos se realiza en la sala A sin ADN/ARN y la adicin de
ADN se realiza en la sala B.
45

DE TECNOLOGA MDICA
Master Mix componentes

Buffer 10X
Cl2Mg
Primer forward
Primer reverse (10 uM)
dNTP
Agua PCR o MilliQ esteril
Taq
ADN
Volumen
d.
Concentracin
50 mM
10 uM
10 uM
10 mM
5 U/uL
0.05 -0.1ug
Volumen
2,5 uL
1,5 uL
1,5 uL
1,5 uL
0,75 uL
16,05 uL
0,2 uL
1 uL
25 uL
Amplificacin
Utilice el siguiente protocolo para la amplificacin programando el uso del
termociclador
Protocolo PCR
T C
Denaturacin inicial
95 C
Denaturacin
95 C
Hibridacin
55/51 C
Extensin
72 C
Extensin final
72 C
Tiempo
Ciclos
5 min
1 min
1 min
1 min
10 min
35 ciclos
SEGUNDA PARTE: Duracin del procedimiento 2 horas aproximadamente

e.
Post Amplificacin
Prepare agarosa al 2% en la cmara de electroforesis con el uso de peines
Mezcle 1 uL de buffer muestra con 5 uL de producto de PCR
Encienda el equipo de electroforesis entre 80 a 100 V por 45 minutos
Retire la agarosa y colquelo en la bandeja con bromuro de etidio 1 ug/mL
durante 1 minutos
Enjuague el gel
Coloque el gel de agarosa sobre el transiluminador en el equipo de
documentacin, realice la toma fotogrfica
f.
Interpretacin de resultados
Evale los productos de amplificacin en la fotografa, verifique el tamao del
producto y revise la pureza de amplificacin.
46

DE TECNOLOGA MDICA
Interprete el resultado y realice el reporte respectivo.
PRCTICA 13.
47
TCNICA DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 14th.
ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay)
Para la deteccin de anticuerpos del virus por tcnica de ELISA son de dos tipos, para:
- Inmunoglobulina ( Ig) M
- Inmunoglobulina ( Ig) G
1. ELISA = Prueba de inmunoadsorvencia ligada a enzima

2. Esta tcnica nos permite poner de manifiesto la inmunoglobulina M y G
3. El ELISA para Ig M es el procedimiento ms til para la determinacin de una infeccin
reciente
4. Un resultado Ig M no reactivo e Ig G reactivo nos indica una infeccin antigua
5. Las muestras tomadas dentro de los primeros 6 das desde el inicio de la enfermedad
tienen un porcentaje variable de falsos negativos debido al tiempo insuficiente para la
deteccin de anticuerpo detectable
6. Lo recomendable es el estudio de muestras pareadas o sea una muestra de la fase
aguda y otra muestra del perodo convaleciente (con una diferencia de 7 a 10 das
entre una y otra muestra )
7. Cuando se tienen muestras pareadas se deben hacer titulaciones de la muestra y su
incremento, el que se mantenga estable o una cada de la titulacin puede indicarnos
de forma ms segura el tiempo de la infeccin
8. Su resultado se informa como reactivo o no reactivo
9. Es fcil de realizar
10. Los antgenos son derivados de virus lisados o producidos por recombinacin
gentica o sinttica
11. Los antgenos se encuentran fijados a la fase slida (superf. de plastico, microplacas o
perlas)
12. Es una reaccin inmunoenzimatica en la que la unin antgeno-anticuerpo, se pone de
manifiesto a travs de la accin de un enzima ligada a un anticuerpo
antiinmunoglobulina, y con el substrato especifico, da una coloracin cuya intensidad
esta en relacin a la cantidad de anticuerpos presentes
48

DE TECNOLOGA MDICA
13. La intensidad del color se mide a una longitud de onda determinada, con el
espectofotometro y se convierte en unidades de densidad optica (DO)
14. Se trabaja en cada ensayo con controles positivos y negativos que vienen e los kits
Placa de ELISA
ELISA PARA Ig M (Ampliacin de un pocillo)
Sustrato.
Anti Ig M Ligado a Enzima

Anticuerpo viral
Antgeno
Ig M (suero del paciente)
Ac. Anti Ig M humano (cabra)
49

DE TECNOLOGA MDICA
ELISA PARA Ig G (Ampliacin de un pocillo)
Sustrato
Anti- Ig G
ligado a enzima
Anticuerpo Ig G (suero del

paciente)
Antgeno viral
50

DE TECNOLOGA MDICA
DIAGNSTICO DE VIH - ELISA

SIDA
Son las siglas del sindrome de innunodeficiencia humana, que se presenta en el ltimo estadio
de la infeccion viral por el virus de la innunodeficiencia humana VIH
El VIH se transmite por fluidos corporales
Las pruebas para la deteccin de anticuerpos del virus son:
A
B
ELISA
Western Blot
ELISA (enzyme linked inmunoabsorbent assay)
Prueba de tamizaje, para el diagnstico preliminar
Su resultado se informa como reactivo o no reactivo
Es fcil de realizar
Alta sensibilidad
Especificidad, da falsos positivos
Sus resultados son inconcluyentes
Los antgenos son derivados de virus lisados o producidos por recombinacin
gentica o sinttica
Los antgenos se encuentran fijados a la fase slida (superficie de plstico, microplacas

o perlas)
Es una reaccin inmunoenzimtica en la que la unin antigeno-anticuerpo, se pone de

manifiesto a travs de la accin de un enzima ligada a un anticuerpo
antiinmunoglobulina, y con el substrato especifico, da una coloracin cuya intensidad
esta en relacin a la cantidad de anticuerpos presentes
La intensidad del color se mide a una longitud de onda determinada, con el

espectofotometro y se convierte en unidades de densidad ptica (DO)
51
Se trabaja en cada ensayo con controles positivos y negativos que vienen en los kits

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 15.
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
Prueba de diagnstico concluyente
Su resultado se informa como negativo o positivo a la infeccin
Es ms laboriosa
Alta sensibilidad
Muy especifico
Es costosa
Emplea antgeno relativamente puro
Las protenas que son codificadas por genes estructurales del VIH, son
separadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida
El peso molecular (PM) de las protenas difiere, por lo que migran a diferentes
sitios en el gel
Las protenas separadas en poliacrilamida son electrotransferidas a un papel de

nitrocelulosa, el cual es cortado en tiras para el uso en el ensayo, estas tiras se
incluyen en los kits de WB comercial
Esta prueba detecta anticuerpos contra cada uno de estos antgenos
Si hay anticuerpos contra el VIH presentes en el espcimen, la enzima estar

disponible para reaccionar con el substrato para producir bandas oscuras en los
sitios particulares donde los anticuerpos estan enlazados a los antgenos virales
La presencia o ausencia de estas bandas son la base para la interpretacin de

los resultados del examen
La prueba NO es exclusiva para el diagnstico del VIH
INTERPRETACION DEL WESTERN BLOT (segn casas comerciales)
CDC - positivo:
DUPONT- positivo: p 24, p 31 + gp 41 gp l60
52
p 24 + gp 41
p 24 + gp l20/l60

DE TECNOLOGA MDICA
53
OTROS positivos: p 24 + p 55 gp 41

DE TECNOLOGA MDICA
ESQUEMA DEL PRINCIPIO DE LA PRUEBA DE WESTERN BLOT
Sustrato
Enzima
Anticuerpo anti IgG
Anticuerpo IgG anti VIH
Antgenos VIH separados

gp120
gp41
p24
REPRESENTACION DE LOS RESULTADOS DE WESTERN BLOT

A
B
C
Resultado Positivo: Reactivo a todos los antgenos del VIH

Controles: Negativa y Positiva
Muestras: Negativa Positiva - Indeterminada
A
54

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL
DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 16.
1.
HEMAGLUTINACIN VIRAL Y SU TITULACIN
INTRODUCCIN
Algunos virus producen aglutininas que en presencia de glbulos rojos producen
hemoaglutinacin por poseer estos glbulos receptores especficos: as el virus de la
influenza es capaz de aglutinar los hemates del ganso entre otros.
La importancia de la hemaglutinacin es constatar rpidamente la presencia del virus,

titular al virus, ejecutar pruebas diagnsticas de valor clnico y estudiar las
interrelaciones entre virus y clulas.
2.
MATERIALES
-Lquido alantoideo cosechado de los huevos embrionados inoculados con virus
influenza.
-Suero fisiolgico
-Suspensin de glbulos rojos de ganso al 0.5 % en suero fisiolgico.
-Gradilla metlica con tubos de 13 x 100
-Pipetas de 10 Ml
-Pipetas de 5 mL
-Pipetas de 1 mL
3. PROCEDIMIENTO
Distribuir el material segn el siguiente esquema:
Tubo No 1
10
Sol. Salina
0.9
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Virus
0.1
Suspensin de
Glbulos
Rojos al 0.5%
0.5
del mL anterior, tomar 0.5 y pasar al siguiente tubo, mezclar y repetir

hasta el 9 Despus de mezclar el tubo 9 descartar 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
No
recibe
0.5
Agitar bien y dejar en reposos a temperatura ambiente durante 2 horas o a 4o C durante la

noche.
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 55

DE TECNOLOGA MDICA
RESULTADOS
TITULOS
1 / 10
1 / 20
1 / 40
1 / 80
1 / 160
1 / 320
1 / 640
ETC.
LECTURA
Lectura transparente con botn rojo de contorno bien definido en el fondo: NEGATIVO (-)
-Lquido turbio en el fondo del tubo y los hemates formando anillo:
DUDOSO (+/-)
-Lquido claro, hemates depositados en grupos sobre el fondo del tubo:
POSITIVO (+)
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 56

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 17.
1.
PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN
INTRODUCCIN
Los pacientes con Influenza o los animales experimentalmente inoculados con el virus de
la Influenza desarrollan anticuerpos especficos los cuales pueden ser detectados por
pruebas serolgicas dentro de las cuales la ms sencilla es la prueba de la inhibicin de
la hemaglutinacin (IH).
Si el virus hemaglutinante es expuesto a anticuerpos homlogos antes de entrar en

contacto con los hemates, el fenmeno de la hemaglutinacin es inhibido. Es te test se
usa en el diagnstico serolgico de la Influenza para medir el ttulo de anticuerpos.
Para esta prueba el suero es diluido y se le aade cuatro veces la cantidad mnima del
virus pre-titulado
que da aglutinacin positiva, es
decir cuatro
unidades
hemaglutinantes.
El ttulo de anticuerpos es la dilucin ms alta del suero que inhibe la aglutinacin de los
hemates.
2.
MATERIALES
un tubo con 3 mL de lquido alantoideo infectado con virus de Influenza tipo A en
dilucin que contenga 4 unidades hemaglutinantes en 0.25 de volumen.
suero colectado en la prctica anterior, inactivado a 56 C por 30 minutos.
solucin salina (NaCl 0.85 % en agua destilada), un frasco con 10 mL
suspensin de glbulos rojos de ganso al 0.5 % un frasco con 10 mL
una gradilla con 20 tubos de 13 x 100
una pipeta de 5 mL y 4 pipetas de 1 mL
un beaker con hielo
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 57

DE TECNOLOGA MDICA
3.
PROCEDIMIENTO
Distribuir el material segn el siguiente esquema:

Tubo No 1
10
Sol. Salina
0.4
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
Suero Inmune
0.1
Del mL anterior, tomar 0.25, mezclar y pasar al siguiente tubo, No

repetir hasta el 9. Despus de mezclar el tubo 9 descartar 0.25 recibe
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
Virus con 4U. 0.2

hemaglutinante 5
Dejar a temperatura ambiente por 30 minutos
Suspensin de 0.5
globulos rojos
al 0.5%
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agitar bien y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 1 o 2 horas.
4.
RESULTADOS
Ttulos
1/5
Gua de prctica
Virologa Mdica
1 / 10
1 / 20
1 / 40
1 / 80
1 / 160
1 / 320
1 / 640
1/ 1280
Control
Pgina 58

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 18.
PAUL BURNELL - TITULACION
1. INTRODUCCIN
Es una prueba inespecfica que detecta anticuerpos heterfilos y es positiva en cualquier
momento de la infeccin por el virus de Epstein - Barr
2. MATERIALES
2.1 Biolgicos
1. suero problema inactivado
1. suero control positivo inactivado
1. suero negativo
1. solucin de glbulos rojos de carnero al 2 %
2.2 Material de vidrio
10 tubos de 13 x 100
1. pipetas de 1
1. pipeta 5 ml
2.3 otros materiales
1. jeringa de 5 cc descartable
1. canastillas para los tubos
1. algodn
1. alcohol
3. PROCEDIMIENTO
Numerar los tubos del 1 al 8
Colocar en el tubo 1: 0,1 de suero problema inactivado
Aadir al tubo 1: 0,4 de suero fisiolgico y 0,25 a los dems tubos
Iniciar las diluciones: tomando 0,25 del tubo 1, pasarlo al tubo 2 y as sucesivamente
hasta el tubo 7
El tubo 8 es control de glbulos rojos
Aadir de la solucin de glbulos rojos de carnero 0,1 a cada tubo
Incubar a temperatura ambiente por 2 horas
Realizar la lectura
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 59

DE TECNOLOGA MDICA
Tubo No
Suero
Fisiolgico
Suero Problema
Inactivado
0.4
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.1
Del 0,5 mL anterior, tomar 0.25 y pasar al siguiente tubo,

hasta el 8. Despus de mezclar el tubo 8 descartar 0.25
Solucin
de
Glbulos rojos
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
de Carnero al
2%
Agitar la gradilla y dejar incubar a temperatura ambiente por 2 horas
0.1
No recibe
0.1
RESULTADOS
TITULOS
1/7
Gua de prctica
Virologa Mdica
1 / 14
1 / 28
1 / 56
1 / 112
1 / 224
1 / 448
CONTROL
Pgina 60

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 19.
1.
INOCULACIN DE ENTEROVIRUS EN CULTIVOS DE CELULAS - VIRUS POLIO
INTRODUCCIN
La infeccin de las clulas por virus es evidenciada por una serie de cambios en la clula,
denominado efecto citopatognico. Por ejemplo las clulas He - La infectadas con virus
polio adquieren una forma redondeada, contrada, presentando picnosis nuclear y
marcada granulacin citoplasmtica. Estas clulas en el transcurso de 1 a 3 das se
desprenden de la pared del tuvo de cultivo y cesan de metabolizar. Este efecto es
neutralizado por el suero inmune antipoliomielitis. En general no todas las clulas de
cultivo, son suceptibles a ser infectadas por todos los virus, hay cierta especificidad, por
ejemplo el virus polio slo se propaga en clulas provenientes de rganos de primates
PACIENTE CON SOSPECHA CLINICA DE POLIOMIELITIS
Hisopo de faringe
y/o
Heces
Transportar en bao de hielo
Procesamiento para eliminar bacterias
Sangre 5 ml
Fase Aguda
Fase Convaleciente
Bsqueda de aumento de ttulo

de anticuerpo por prueba de
neutralizacin con virus conocidos
Suspensin de secrecin farngea o

heces libres de bacterias y hongos
Inoculacin en cultivo de clulas de

rin humano - fetal o Hep - 2
Efecto cito patognico
Tipificacin por neutralizacin con

sueros inmunes especficos conocidos
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 61

DE TECNOLOGA MDICA
PARA DEMOSTRAR : Inoculacin de la misma suspensin en cultivo de clulas de fibroblastos

de embrin de pollo. NO HAY EFECTO CITOPATICO
2.
MATERIALES
2 tubos de cultivo de clulas de rion de humano fetal de 4 a 5 das de procesado, con

medio de mantenimiento
2 tubos de cultivo con clulas Hep-2 de 5 a 7 das con medio de mantenimiento
2 tubos de cultivo con clulas de fibroblastos de embrin de pollo de 2 a 3 das, con

medio de mantenimiento
1 pipeta de 1 ml. graduada 1/100
1 beaker con hielo
1 gradilla metlica
1 portatubos de metal
1 microscopio
tubos con cultivo de clulas inoculadas dos das antes y en los que se observar el
efecto citopatognico
3.
4.
PROCEDIMIENTO
Observar los cultivos de clulas al microscopio con lente de pequeo aumento
Rotular un tubo de cada tipo de clulas para ser infectado y otro control
Usar tcnica asptica
Tomar con una pipeta de 1 mL virus
Inocular 1 mL de virus polio en los tubos rotulados correspondientes
Colocar los tubos en una gradilla inclinada, con la capa de clulas hacia abajo
Incubar a 37 C por 48 horas
Observar el efecto citoptico y anotar

PROTOCOLO
Cultivo de clula
Efecto citoptico
Gua de prctica
Virologa Mdica
Fibroblastos de embrin
de pollo
Hep -2
Muestra
Control
Muestra
Control
Pgina 62

DE TECNOLOGA MDICA
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 63

DE TECNOLOGA MDICA
PRCTICA 20.
HEPATITIS VIRAL - DIAGNSTICO
VIRUS DE LA HEPATITIS B.- HBV

1.
INTRODUCCIN
El virus de la Hepatitis B infecta slo a los seres humanos y son estos el nico reservorio
conocido. Las infecciones primarias pueden ser autolimitadas y resolverse o volverse
persistentes y continuar por muchos aos a menudo por el resto de la vida del individuo
infectado. Las infecciones agudas y crnicas casi siempre estn acompaadas por
Antgeno viral detectable y virus infeccioso en la sangre
Los individuos ms expuestos, son los drogadictos por via intravenosa, los pacientes que
reciben transfusiones sanguneas, u otros derivados de sangre, pacientes en
hemodilisis, personal de laboratorio que trabaja con sangre o sus productos,
homosexuales y personas con contactos sexuales con diferentes parejas, personal
mdico y odontolgico expuesto al contacto con sangre
El virus de la Hepatitis B posee los siguientes antgenos y anticuerpos de utilidad para su
identificacin en el laboratorio
Antigeno de Superficie
(HBs Ag)
Anticuerpos contra el Antigeno de Superficie
(anti HBs)
Anticuerpos Ig M contra el Ag Core
(anti HBc IgM)
Anticuerpos lg G contra el Ag Core
(anti HBc lgG)
Antigeno E
(HBe Ag)
Anticuerpos contra el Antigeno E
(anti HBe).
La deteccin del HBsAg se puede hacer en la primera o segunda semana hasta las 11
12 semanas despus de la exposici6n y significa infeccin activa. El Anti-HBs se detecta
durante la recuperacin y sus ttulos se elevan 6 - 12 meses despus de la desaparicin
de HBsAg
El HBeAg es otro marcador que aparece casi al mismo tiempo que el HBsAg en casi todas
las infecciones y su titulo se eleva y desaparece paralelamente con el HBsAg. Declina a
las 10 semanas del inicio de los sntomas, de continuar los ttulos indica persistencia de
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 64

DE TECNOLOGA MDICA
replicacin viral. El Anti-HBe aparece cuando el HBeAg se hace indetectable persistiendo

durante 1 - 2 aos despus de la resolucin de la infeccin.
Otro marcador importante que aparece antes del inicio de la lesi6n hepatica es el
anticore-HB, anticuerpo dirigido contra cl antigeno interno de los viriones, de dos tipos
Ig M e Ig G. Detectable de la terecra a quinta semana despus del HBsAg. El Ig M se
encuentra en la etapa aguda y sus titulos declinan rpidamente despus de la
desaparicin del HBsAg. La IgG se detecta despus de la Ig M
2.
TEST DE ELISA PARA LA DETECCIN DE ANTIGENO DE SUPERFICIE DE

LA HEPATITIS B (HBsAg) EN SUERO HUMANO
Es un mtodo enzimtico directo de tipo 'sandwich' en el que se emplean los pocillos de
una placa de microtitulacin recubierto con anticuerpos de cobayo anti-HBs que actua
como captura empleando como conjugado Ac de cabra anti-HBs marcado con
peroxidasa. Se incuban el suero del paciente en los micropocillos, si contiene HBsAg se
fija al Ac anti-HBs en la placa. Se lava para extraer el material no fijado, aadir Ac de
cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa reaccionando con el complejo Ag-Ac de la
primera incubacin. Un segundo lavado y se procede aadir sustrato enzimtico y del
cromgeno dando la aparicin de color si la muestra es positiva HBsAg.
3.
REACTIVOS
Placa de microtitulaci6n con micropocillo con Ac de cobayo anti-HBs.
Conjugado concentrado: Ac. de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa.

Diluir 1:51
Diluyente del conjugado.
Tampn sustrato.
Cromgeno (TMB).
Solucin de lavado concentrado 10 X.
Control positivo.
Control negativo.
Solucin de parada (H2S04 IN).
Lminas adhesivas.
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 65

DE TECNOLOGA MDICA
4.
MATERIALES
Agua destilada.
Micropipetas de 100 ul.
Sistema de lavado manual.
Lector de microplacas con filtro 450 nm.
5.
REALIZACIN DE LA PRUEBA
Transferir 100 ul de suero, control positivo y negativo en los pocillos y uno
para el
blanco
Cubrir la placa con la lmina adhesiva
Incubar 1 hora a 37'C.
Desechar la lmina y proceder a lavar. Aspirar el contenido y agregar 300 ul solucin

lavado previamente preparada (solucin lavado concentrada 100 ml y agua destilada
100 ml). Aspirar nuevamente. Repetir el lavado por tres veces ms.
Aadir 100 ul conjugado diluido a cada pocillo menos al blanco. Preparacin

conjugado: 1 ml y conjugado concentrado 20 ul.
Cubrir la placa con lmina adhesiva
Incubar 30 minutos a 37'C
Lavar como en paso 4.
Aadir sustrato TMB a cada pocillo 100 ul. Preparacin del sustrato: Tampn sustrato
1 ml y solucin cromgeno 20 ul. Se prepara 10 minutos antes de terminar la segunda
incubacin.
Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
Detener la reaccin de color aadiendo 100 ul de H2S04 IN.
Leer la absorvencia con filtro de 450 nm. Si es bicromtica usar 620 nm. Ajustar a cero
el lector con el pocillo blanco.
6.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 66

DE TECNOLOGA MDICA
Un resultado repetidamente positivo de HBsAg es indicativo de la existencia de infeccin

por el HBV. Para determinar si la infeccin es aguda o crnica deber analizarse otros
marcadores serolgicos y paralelamente estudiar el cuadro clnico.
VIRUS DE LA HEPATITIS C - HCV

Las pruebas diagnsticas se basan en la deteccin de anticuerpos reactivos con protenas
recombinantes o pptidos sintticos
El ELISA es el mtodo ms usado para detectar anticuerpos contra HCV, el cual consiste en
la deteccin de anticuerpos IgM e IgG. Hay que tener en cuenta que la seroconversin de
los anticuerpos es tardia pudiendo ocurrir despus de los seis meses de la infeccin por el
virus
Otra tcnica actualmente til es la determinacin de la carga viral del virus de la hepatitis C
VIRUS DE LA HEPATITIS E - HEV

Es un virus que al igual HAV est incluido dentro del grupo de infeccin por transmisin
fecal-oral. Tiene tendencia a producir hepatitis fulminante y fatal en mujeres que se
infectan en el primer trimestre del embarazo
La HVE puede diagnosticarse por deteccin de IgM anti-HVE o por demostracin de titulos
significativamente combinantes de anticuerpos IgG, la capacidad para diagnosticar esta
infeccin es limitada por falta de pruebas facilmente disponibles. Se emplea una estrategia
diagnstica alternativa y es el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), pero su
uso esta limitado a laboratorios referenciales con fines de investigacin.
VIRUS DE LA HEPATITIS A - HAV

El virus de la hepatitis A (HAV) puede diagnosticarse por la deteccin de anticuerpos de tipo
Ig M e Ig G contra el virus, los cuales son de aparicin temprana durante el perodo agudo
se la enfermedad. La Ig M nos indica la fase aguda de la enfermedad y cuando sta se
negativiza y slo persiste la Ig G positiva nos indica memoria o antecedente de haber tenido
hepatitis A
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 67

DE TECNOLOGA MDICA
BIBLIOGRAFA
Gua de prctica
Virologa Mdica
Pgina 68

Guía de Virología

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Guía de Virología

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Profesora Responsable del Curso: Zila Patricia Caballero opo

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS ...................................................................... 5

ESTERILIZACIN, DESINFECCIN Y ANTISEPSIA..................................................... 7

PREPARACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES.................................................... 9

ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES ................................................ 14

IDENTIFICACIN, CODIFICACIN, PRESERVACIN, CONSERVACIN Y

SANGRADO DE ANIMALES ...................................................................................... 18

INOCULACIN DE ANIMALES .................................................................................. 21

HUEVO EMBRIONADO, ANATOMIA Y VIAS DE INOCULACION. ............................. 25

PREPARACIN DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO ................................................... 28

CULTIVO CELULAR SECUNDARIOS Y EFECTO CITOPTICO ..................................... 32

BIOLOGA MOLECULAR EN VIROLOGA .................................................................. 40

LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA ..................................................... 40

ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay) ................................................... 48

WESTERN BLOT ...................................................................................................... 52

HEMAGLUTINACIN VIRAL Y SU TITULACIN ....................................................... 55

PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN ............................................. 57

PAUL BURNELL - TITULACION ................................................................................. 59

INOCULACIN DE ENTEROVIRUS EN CULTIVOS DE CELULAS -

HEPATITIS VIRAL - DIAGNSTICO ........................................................................... 64

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS

Los virus han desarrollado mecanismos para sobrevivir en la naturaleza y transmitirse de

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

ESTERILIZACIN, DESINFECCIN Y ANTISEPSIA

Agentes esterilizantes y desinfectantes

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Mtodos Qumicos: Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los

Esterilizacin por gas-plasma de Perxido de Hidrgeno

Filtros profundos o Filtros de profundidad

Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo)

Agentes esterilizantes y desinfectantes

5.2 Desinfectantes o Esterilizantes

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

PREPARACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES

2. SOLUCIONES EMPLEADAS EN VIROLOGA

Cloruro de Calcio anhidra

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Agua bidestilada c.s.p.

Agua bidestilada c.s.p

Agua bidestilada c.s.p

Agua bidestilada c.s.p.

Las soluciones A,B,C, sern esterilizadas en autoclave a 110 C por 10 minutos.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

SOLUCIN P.B.S (Phosphate Buffered Saline)

Combinar las soluciones madres en el siguiente orden:

Mezclar las soluciones A y C

SOLUCIONES EMPLEADAS PARA FACILITAR EL DESPRENDIMIENTO CELULAR DE LA

SOLUCIONES PARA AJUSTAR EL PH DEL MEDIO

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Solucin de Tryptosa Phosphate Broth (TPB) a 3%

Solucin de Extracto de Levadura al 10%

Se vierte un mililitro de esta solucin a 1000 mL de medio de cultivo al momento de

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y SOLUCIONES

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS