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Phytothrapie

DOI 10.1007/s10298-015-0975-6

PHARMACOGNOSIE

tude de lactivit des extraits de feuilles de Punica granatum Linn


sur Candida albicans et Rhodotorula spp
Study of the activity of Punica granatum Linn. leaves extracts on Candida albicans
and Rhodotorula spp
K. Kanoun B. Abbouni S. Boudissa N. Bouhafs M. Seddiki
Lavoisier SAS 2015

Rsum Les plantes mdicinales ont t utilises pendant des


sicles comme des remdes pour les maladies humaines, en
raison de leur composants bioactifs vertus thrapeutiques
contenus dans leurs extraits. Parmi ces dernires on trouve
Punica granatum considre comme plante mdicinale alimentaire et ornementale, qui na pas encore dvoil tous ses
secrets. Le but de notre travail est dvaluer lactivit antifongique de deux extraits mthanolique et thanolique de feuilles
du grenadier. cet effet, les extraits ont t tests sur des
souches cliniques (C. albicans clinique (c), R. spp) et de rfrence C. albicans (IP444, ATCC1231), en utilisant la mthode
de diffusion en milieu glos. Lextrait thanolique a produit
des zones dinhibition plus grandes que celles obtenues avec
lextrait mthanolique ; dautres paramtres sont valuer
dans notre tude savoir la dtermination de la concentration
minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale fongicide (CMF) des souches testes.
Mots cls Punica granatum Activit antifongique
C. albicans R. spp CMI
Abstract Medicinal plants have been used for centuries as
remedies for human diseases, because of their bioactive
K. Kanoun (*) B. Abbouni
Laboratoire de microbiologie molculaire sant et protomique,
dpartement de biologie, Facult des Sciences de la Nature
et de la Vie, Universit Djillali Liabs de Sidi-Bel-Abbs,
BP 89, Sidi-Bel-Abbs, 22000 Algrie
e-mail : khedi20022002@yahoo.fr
S. Boudissa N. Bouhafs
Laboratoire de microbiologie gnrale, dpartement de biologie,
Facult des Sciences de la Nature et de la Vie,
universit Djillali Liabs de Sidi-Bel-Abbs, BP 89,
Sidi-Bel-Abbs, 22000 Algrie
M. Seddiki
Laboratoire AAPCSAB : Laboratoire antibiotique,
antifongique, physico-chimie, synthse, et Activit biologique
de lUniversit Abou Bekr Belkaid de Tlemcen, Algrie

components contained in therapeutic extracts. Among these


we find Punica granatum considered as food, medicinal
plant and as an ornamental, which has not yet revealed all
its secrets. The aim of our study was to evaluate the antifungal activity of two methanolic and ethanolic leaf extracts of
pomegranate. For this purpose, the extracts were tested on
clinical strains (. albicans clinical (c), R. spp) and reference
C. albicans (IP 444, ATCC 1231), using the agar diffusion
method. The ethanol extract produced greater inhibitions
zones than those obtained with the methanol extract; other
parameters are to be evaluated in our study namely the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC)
and minimum fungicidal concentration of inhibition zones
(MFC) of tested strains.
Keywords Punica granatum Antifungal Activity
C. albicans R. spp MIC

Introduction
Les produits naturels sont une source de molcules varies
prsentant des activits biologiques puissantes, et des profils
pharmacologiques intressants. Historiquement, les produits
naturels sont la source de nombreux mdicaments. Cest
ainsi que 60% des mdicaments contre le cancer et 75% des
mdicaments contre les maladies infectieuses sont des drivs de produits naturels [1]. Lacceptation de la mdecine
traditionnelle comme une forme alternative de traitement,
ainsi que le dveloppement de la rsistance microbienne
aux antibiotiques disponibles ont conduit les scientifiques
raliser des recherches sur lactivit antimicrobienne des
plantes mdicinales [2-5]. Toutefois, des donnes rcentes
de lindustrie pharmaceutique montrent que, pour certaines
maladies complexes, les produits naturels reprsentent toujours une source extrmement prcieuse pour la production
de nouvelles entits chimiques car ils reprsentent des structures privilgies choisies par les mcanismes dvolution

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sur une priode de millions dannes [6]. Aujourdhui nous


assistons au retour de lutilisation des plantes mdicinales
pour favoriser la sant [7]. La grenade a t choisie dans
notre tude en raison de son activit antifongique intressante contre plusieurs espces de Candida [8]. Selon nos
recherches bibliographiques, peu de travaux ont t raliss
sur lactivit antifongique des feuilles de grenade sur les souches du genre R. spp, cest la raison pour laquelle notre choix
sest port sur ce sujet.
Dorigine persane, la grenade est clbre dans les papyrus gyptiens, elle est cite dans le Coran et dans lAncien
Testament sous le nom de Rimmon, signale galement dans
la mythologie grecque et lhistoire romaine [9]. Ce fruit est
rpandu dans les pays situs autour de la mer mditerrane,
o il est trs cultiv (Algrie, Maroc, Tunisie, Proche-Orient,
Europe mridionale, etc.) [10]. La grenade est prescrite pour
le traitement des amygdalites, pharyngites, stomatites, gingivites, diarrhes, infections urinaires et vomissements [11].
Notre tude a port sur la valorisation des feuilles de Punica
granatum pour lvaluation du potentiel antifongique sur
quelques souches de levures pathognes slectionnes.

t agit par un agitateur automatique de type Keurostar


digital IKA laboratechnik pendant 48 heures une temprature ambiante et labri de la lumire avec une vitesse dagitation de 500 tours/minutes ; aprs dcantation de lchantillon, le surnageant a t filtr sous vide par filtre Laurent PratDumas N02.
Le marc humidifi dun volume de 1400 ml rcupr
aprs la dcantation, auquel il a t ajout 700 ml du mthanol pur 99% a t soumis une deuxime extraction, dans
les mmes conditions opratoires du dpart. Par la suite plusieurs extractions ont t effectues afin dobtenir des rendements infrieurs aux prcdents. Les surnageants rcuprs
ont t concentrs en petites fractions par vaporateur rotatif
(rotavapor du type Buchi R125 muni dune pompe Buchi
vaccum pump controller V 700-855) avec une pression de
270 millibars, une rotation de 100 rpm, une temprature du
bain rcipient de 41C et avec une temprature de la vapeur
de 36C 39C. Lextrait concentr a t marqu EMFG.

Matriels et mthodes

200 g de poudre de feuilles ont t introduits dans un erlenmeyer pour tre macrs avec 600 ml dthanol pur 95% et
mis sous agitation magntique pendant 24 heures la temprature du laboratoire et une vitesse de 500 tours/minutes.
Aprs dcantation de lchantillon, le surnageant a t filtr
sous vide.
Le marc humidifi dun volume de 700 ml rcupr aprs
la dcantation, auquel il a t ajout 700 ml dthanol pur
95%, a t soumis une deuxime extraction, dans les
mmes conditions opratoires du dpart. Par la suite plusieurs extractions ont t effectues afin dobtenir des rendements infrieurs aux prcdents. Les surnageants rcuprs
ont t concentrs en petites fractions par vaporateur rotatif.
Aprs filtration sur papier Whatman N03, le filtrat a t
concentr au rotavapor de type Laborota 4000 sous vide
la temprature de 70C et avec une rotation de 120 rpm,
lextrait concentr a t marqu EEFG [12].
Le rendement en (g) dextrait par rapport la masse du
matriel vgtal traiter a t calcul selon la formule suivante : R=m 100/m. O R est le rendement de lextrait brut
en pourcentage (%), m est la masse de lextrait brut obtenu
aprs extraction (g) et m est la masse du matriel vgtal (g)
[13]. Les extraits obtenus ont t conservs dans des tubes
couverts avec du papier aluminium et mis au conglateur
jusqu leur utilisation pour les essais biologiques.

Matriel vgtal
Les feuilles du grenadier Punica granatum ont t cueillies
durant le mois de mars 2009, dans la localit de SidiAli-Benyoub distante de 25 km au sud de la ville de SidiBel-Abbs, 450 km louest dAlger et 80 km au sud
dOran. Les feuilles ont t photographies pour authentification, le spcimen de rfrence de la plante a t achemin
au laboratoire de taxonomie vgtale pour identification par
le Pr Benhassaini du dpartement de lenvironnement de la
facult des sciences de la nature et de la vie de luniversit
Djillali Liabs de Sidi-Bel-Abbs (Algrie), o lchantillon
a t dpos et cod sous le NPGF2009. Les feuilles ont t
sches lombre pendant 15 jours sur une plaque en bois,
labri de lhumidit et de la lumire et temprature
ambiante. Aprs schage, les feuilles ont t concasses dans
un mortier traditionnel ensuite pulvrises au broyeur
manuel jusqu lobtention dune poudre trs fine, cette dernire a t conserve au rfrigrateur + 4C dans un rcipient hermtiquement ferm, cette poudre fine sera ultrieurement utilise pour la prparation des deux extraits [12].
Prparation des extraits vgtaux

Macration de feuilles de Punica granatum


dans lthanol froid

Macration des feuilles de Punica granatum


dans le mthanol froid

tude de lactivit antifongique

Cest ainsi que 323 g de la poudre de feuilles ont t solubiliss dans 750 ml de mthanol extra pur 99%. Le mlange a

Ltude antimicrobienne a consist dterminer des paramtres antifongiques (CMI et CMF) des deux extraits

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obtenus. Pour sa ralisation, nous avons utilis la mthode


de la macro-dilution en milieu liquide [14].
Les micro-organismes tests
Les souches de levures utilises sont : (C. albicans clinique
c R. spp clinique), fournies par le laboratoire danalyses
microbiologiques du centre hospitalo-universitaire de SidiBel-Abbs et les souches de C. albicans (IP 444, ATCC
1231) fournies par le laboratoire (AAPCSAB) de luniversit de Tlemcen. Ces souches ont t conserves puis revivifies sur le milieu Sabouraud, le milieu Mueller Hinton Agar
(MHA) a t utilis pour la dtermination de leurs diamtres
des zones dinhibitions.
Test de lactivit antifongique
Mthode de diffusion de disque sur glose
Aprs le contrle de puret des levures testes, les suspensions de cellules vgtatives ont t prpares dans 10 ml de
solution de Tryptone-sel [15]. Elles ont t passes par la
suite au vortex pendant 3-5 min [16], la culture de 24 heures
obtenue par un ensemencement sur glose Sabouraud et
incubation 30C. Cette opration nous a permis de prlever
les colonies purifies rsultantes puis les remettre dans une
solution de Tryptone-sel afin de prparer la suspension fongique. Cette dernire a t bien homognise et son opacit
a t quivalente 0,5 Mc Farland (106 cellules/ml) une
transmission optique de 530 nm [17].
Pour la dtermination des zones dinhibitions, un ensemencement des souches testes a t effectu dans les
15 min qui ont suivi la prparation de linoculum par talement sur botes de Ptri, contenant au pralable 10 ml de la
glose Muller Hinton solidifie et sche (linoculum) pendant 10 min. Par la suite, et laide dune pince, des disques
en papier striles de 6 mm de diamtre [18] ont t imprgns avec 10 l (500 g/disque) de chaque extrait prpar
diffrentes concentrations selon une progression gomtrique raison de 2 [19] ; (50-25-12,5-6,25-3,125) mg/ml
partir dune solution mre de 50 mg/ml dans le DMSO
10% strilis travers un filtre millipore de 0,45 m de diamtre. Ces disques ont t dposs la surface de la glose
contenue dans des botes de Ptri, pendant 30 minutes la
temprature du laboratoire pour permettre une meilleure diffusion de lextrait avant lincubation 30C. Aprs 48 h, les
diamtres des zones dinhibitions de la croissance fongique
diffrentes concentrations ont t mesurs [20].
Les disques imprgns de DMSO 10% (10 l) servant
de tmoin ngatif, ont aussi t dposs sur la surface de la
glose inocule, chaque test a t rpt trois fois. Les botes
de cultures ensemences ont t incubes ltuve 30C
pendant 48 h [21].

Analyse statistique
Lanalyse statistique des rsultats a t effectue par lutilisation du programme XLSTA 2014. Le test est considr
comme significatif pour des valeurs de p<0,05. La moyenne
des diamtres dinhibitions des 3 essais pour chaque concentration a t calcule pour les deux extraits et pour chaque
souche de levure teste.

Dtermination de CMI et CMF


par la technique de macro-dilution
Un (1 ml) de Sabouraud liquide ensemenc par R. spp, C.
albicans ATCC1231, IP 444 et clinique (c) a t introduit
dans des tubes essai, 1 ml dextrait vgtal de diffrentes
concentrations de 50 mg/ml 0,195 mg/ml a t ajout. Un
des tubes recevra, en plus dun (1 ml) de Sabouraud, 1 ml
deau distille strile qui a servi de tmoin de croissance en
lieu et place de lextrait.
Ces tubes ensemencs ont t incubs 30C pendant
48 h ; le dnombrement des germes aprs 48 h dincubation
a t ralis directement en milieu Sabouraud liquide par la
mesure de la turbidit. Cette opration a t effectue en
faisant la diffrence entre la valeur de DO (densit optique)
releve avant et aprs lincubation pour chaque tube. Lvaluation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) a
consist dterminer la plus faible concentration dun agent
antimicrobien ncessaire pour inhiber totalement la croissance fongique. La CMI a t dtermine par lutilisation
dune gamme de dilution de lagent antimicrobien, additionne une srie de tubes dun milieu de culture Sabouraud
liquide. Sa dtermination sest effectue partir de la mesure
de la turbidit induite par la croissance des germes tudis,
linhibition stait traduite par labsence de culture visible
dans les tubes, par consquent cest le premier tube o la
valeur di tait gale df (di = df) avec (di : la valeur de DO
du tube exprimental avant incubation et df : la valeur de DO
du tube exprimental aprs incubation) [14]. Les concentrations minimales inhibitrices ont t exprimes en mg/ml.
La concentration minimale fongicide (CMF) est la
concentration de lantimicrobien qui laisse au plus 0,01%
de germes survivants, pour sa dtermination, le tube tmoin
a t dilu jusqu 10-4. Cette dilution qui a reprsent 0,01%
de survie a t repique par stries de 5 cm sur glose Mueller
Hinton puis incube 35C pendant 48 heures. Le nombre
de germes obtenu sur la strie de la dilution 10-4 a t compar
celui de chaque tube exprimental galement repiqu par
strie de 5 cm. Ainsi, le premier tube test dont le nombre de
germes prsent sur sa strie a t infrieur ou gal celui de la
dilution 10-4 a correspondu la CMF [14].

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Rsultats et discussion

Test de lactivit antifongique

Les rendements de diffrents extraits de feuilles de Punica


granatum obtenus ont t respectivement de 28% pour
lextrait thanolique de feuilles de grenade (EEFG) et de
35,86% pour lextrait mthanolique de feuilles de grenade
(EMFG) (Tableau 1, Fig. 1). Les deux extraits taient sous
forme de pte de couleur verte fonce avec une odeur spcifique caractristique de la plante. Notre extraction a abouti
des rendements diffrents, selon la mthode, le solvant et les
conditions dans lesquelles lextraction a t effectue. Ce
rsultat pourrait sexpliquer par la diffrence de solubilit
des lments constituant les extraits vgtaux bruts. La
variabilit des rendements dextraction dune plante une
autre et pour la mme plante, dun organe un autre sexpliquerait par le fait que le rendement dextraction des composs organiques des vgtaux est fonction de la famille
botanique laquelle appartient lespce considre comme
signal par [22].

Les diamtres des zones dinhibitions mesurs en mm


des diffrents extraits obtenus sont prsents dans les
Tableaux 2, 3, et les Figs 5, 6. Ces valeurs sont exprimes
en moyenne des trois essais cart type. Lvaluation de
lactivit antifongique des extraits des feuilles de Punica
granatum sur la croissance in vitro de quatre levures par la
mthode de diffusion en milieu glos a t ralise en mesurant les diamtres des zones dinhibitions de la croissance
fongique (Figs 5, 6). Lessai dinhibition sur milieu solide
a montr que les extraits ont une activit antifongique certaine, dune efficacit plus ou moins variable selon la nature
de lextrait test et les souches testes. Lutilisation du
tmoin DMSO a montr que ce dernier na exerc aucune
activit inhibitrice. Par ailleurs, nous avons constat que
les concentrations croissantes en extrait vgtal (3,1256,25-12,5-25-50 mg/ml) avaient provoqu une augmentation
progressive des diamtres des zones dinhibitions ; nos
rsultats ont concord avec ceux obtenus par [23], qui ont
montr une activit anticandidasique des diffrents extraits
de Punica granatum.
On a remarqu aussi quil ny avait pas de grande variation dans lintervalle de lactivit antifongique dans les
deux extraits, ce qui pourrait suggrer que le solvant thanol et mthanol ont extrait diffrentes substances antimicrobiennes de la mme plante, nos rsultats taient comparables ceux obtenus par [24]. La pousse de toutes les
souches fongiques a t positive sur les disques tmoins,
et assez affecte autour des disques contenant les extraits
tests partir de 3,125 mg/ml jusqu 50 mg/ml o on a
remarqu que plus la concentration de lEMFG ou de
lEEFG tait leve plus le diamtre de la zone dinhibition avait augment. Ceci a t confirm par le calcul de
la covariance pour chaque essai (Tableaux 2, 3), dont la
valeur tait suprieure 0 pour les 4 levures, ce qui signifie
quil existait une corrlation positive.
Nous avons aussi calcul le coefficient de dtermination
partir de la ligne de rgression de leffet des diffrentes
concentrations des deux extraits sur le diamtre de la zone
dinhibition des 4 levures testes (Figs 2, 3), o on a constat que le coefficient de dtermination R2 est suprieur

Tableau 1 Rendement des deux extraits de feuilles de grenade


exprim en (moyenne cart type).
Extraits

Rendement %

EMFG
EEFG

35,860,17
280

Fig. 1 Reprsentation graphique des rendements dextractions


dEEFG et dEMEG

Tableau 2 Diamtres des zones dinhibitions de la croissance fongique obtenus par lextrait des feuilles de la grenade EMFG
(moyenne cart type).
EMFG (mg/ml)

3,125

6,25

12,5

25

50

Covariance

R.spp
C. albicans ATCC
1231
C. albicans IP 444
C. albicans (c)

110
180

170
190

200
200

220
230

230
24,331,56

57,75
39,02

140
120

150
150

160
170

190
180

22,12
210

49,86
47,13

Phytothrapie

Tableau 3 Diamtres des zones dinhibitions de la croissance fongique obtenus par lextrait des feuilles de grenade EEFG
(moyenne cart type).
EEFG (mg/ml)

3,125

6,25

12,5

25

50

Covariance

R. spp
C. albicans ATCC
1231
C. albicans IP 444
C. albicans (c)

150
150

190
16,50,5

22,160,29
19,50,5

23,50,5
22,50,5

24,50,5
25,50,5

47,41
62,63

18,160,29
150

19,50,5
170

21,50,5
17,761,36

23,331,53
18,50,5

24,50,5
200

36,54
25,52

Fig. 2 Corrlation linaire entre les diamtres des zones dinhibitions de la croissance des 4 levures et la concentration de lextrait
EMFG (p0,05)

0,5. Par consquent, la relation entre le diamtre de la zone


dinhibition des levures et la concentration des extraits tait
trs forte, particulirement pour C. albicans ATCC 1231 et
C. albicans IP444 en prsence de lEMFG avec un R2> 0,90
et C. albicans ATCC 1231, C. albicans (c) et C. albicans IP
444 en prsence de lEEFG avec un R2> 0,80.
Pour pouvoir comparer leffet inhibiteur des deux extraits,
nous avons trac des histogrammes (Fig. 4), chacun montre

leffet des deux extraits sur la mme levure. Par la suite


nous avons remarqu que lextrait EEFG a un effet plus
important sur toutes les souches de levures testes par rapport lextrait EMFG avec une diffrence non significative
(p>0,05).
Les caractres de souches rsistantes (R), intermdiaires
(I) ou sensibles (S) taient dtermins selon les diamtres
obtenus et selon la formule suivante : SD, Rd, d ID

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Fig. 3 Corrlation linaire entre les diamtres des zones dinhibitions de la croissance des 4 levures et la concentration de lextrait EEFG
(p0,05)

(D, d sont respectivement des valeurs critiques de diamtres


dinhibitions suprieurs et infrieurs dans le test) [25].
Cest ainsi que les rsultats obtenus ont montr que C.
albicans ATCC 1231 tait la souche la plus sensible
50 mg/ml de lextrait EMFG en produisant la plus grande
zone dinhibition (24,331,53). Toutes les autres souches
testes ont dvelopp le caractre dintermdiarit vis--vis
du mme extrait, sauf pour R. spp qui a dvelopp un caractre de rsistance 3,125 mg/ml du mme extrait.
Par ailleurs, nous avons observ aussi que C. albicans
ATCC 1231, R. spp et C. albicans IP 444 taient les souches
les plus sensibles aux extraits tests avec des diamtres dinhibition respectivement de 24,331,53 mm, 230 mm et
22,12 mm (pour lEMFG) et 25,50,5 mm, 24,50,5 mm
et 24,50,5 (pour lEEFG) 50 mg/ml dextrait test
(Tableaux 2, 3, Figs 5, 6).
Pour la souche C. albicans (c) la plus rsistante, elle a
prsent respectivement des diamtres dinhibition de 21
0 mm et 200 mm pour lEMFG et lEEFG 50 mg/ml

dextrait test (Tableaux 2, 3). Nos rsultats taient comparables ceux mens par [26], o le test de lextrait aqueux
des feuilles de la grenade sur C. albicans (MTCC 3017), a
produit une zone dinhibition de 240,81 mm et ceux mens
par [27] dont lextrait aqueux dcorces de la grenade a
donn une zone dinhibition de 19 mm test sur la souche
C. albicans MTCC 3018.
Nos rsultats ont correspondu aussi ceux trouvs par
[28] o ils ont test six varits de grenade sur diffrents
micro-organismes parmi eux Rhodotorula rubra. La valeur
maximale de la zone dinhibition tait de 22 mm teste avec
la varit Eksi, par contre sur C. albicans une zone maximale
dinhibition de 23,7 mm tait observe avec la mme varit.
Ces variations dactivit taient peut-tre lies aux diffrentes mthodes dextraction employes qui ont pu affecter lactivit antimicrobienne des matires vgtales et/ou en fonction des diffrentes souches de germes testes [24,29].
Nous avons remarqu galement quil y a une activit inhibitrice trs prononce par rapport au pouvoir

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Fig. 4 Effet des deux extraits EMFG et EEFG sur linhibition de la croissance des 4 levures : R. spp, C. albicans ATCC 1231, C. albicans IP 444 et C. albicans (c)

antifongique induit par lextrait thanolique pour la plupart


des micro-organismes tests (Tableaux 2, 3). Des hypothses
peuvent tre mises pour expliquer cette meilleure activit
dune part par le fait que les substances antifongiques de
lextrait thanolique sont importantes et leurs activits meilleures ; dautre part par le fait que celles qui sont prsentes
dans lextrait mthanolique ne correspondraient pas celles
possdant des proprits antifongiques importantes.
Ces rsultats ont suggr aussi que lactivit antifongique
des extraits nest pas fonction du rendement dextraction.
Lextrait thanolique ayant prsent le rendement le plus
faible, mais le meilleur inhibiteur par production des zones
dinhibitions importantes compar lextrait mthanolique,
ayant prsent le meilleur rendement mais le plus faible
inhibiteur.
Dtermination de la CMI et CMF des extraits tudis
Lanalyse des donnes exprimentales a montr que comparativement aux tmoins de contrle de la croissance fongique dans le test de la dtermination de la concentration

minimale fongicide, il y a une diminution du nombre de


colonies de ces germes sur les stries repiqus au fur et
mesure que la concentration de lextrait augmente. Ainsi,
nos rsultats ont montr que les deux extraits taient actifs
divers degrs et ont manifest une activit antifongique en
inhibant la croissance in vitro des souches testes selon une
relation dose-rponse.
Nous avons ralis des repiquages afin de comparer le
nombre de germes ports par les stries des diffrents tubes,
avec le nombre de germes ports par les stries de la dilution
10-4 de leur tube tmoin de croissance correspondant une
survie de 0,01%. Le tube qui, de par son repiquage par strie,
a donn un nombre de colonies infrieur ou gal celui
obtenu avec la dilution 10-4 du tube tmoin, tait considr
comme le tube partir duquel la concentration de lextrait a
abouti dtruire presque la totalit des germes tests
(concentration minimale fongicide CMF).
A lissue de ces travaux, lextrait thanolique tait le plus
actif contre la souche C. albicans ATCC 1231, avec la valeur
la plus leve enregistre (ce qui tait confirm par des CMIs
et CMFs rduites 0,39 mg/mlCMI0,195 mg/ml et

Phytothrapie

Fig. 5 Zones dinhibitions obtenues avec lextrait thanolique des feuilles de Punica granatum (EEFG) sur les 4 levures testes

CMF0,39 mg/ml). Cette efficacit serait lie au pouvoir du


solvant solubiliser un ou plusieurs composs chimiques
contenus dans le broyat de la plante [30].
Les valeurs de CMIs et CMFs de lextrait thanolique
obtenues dans notre tude taient pour :

C. albicans IP444 (1,56 mg/mlCMI0,78 mg/ml,


CMF1,56 mg/ml)
R. spp (0,39 mg/ml CMI0,195 mg/ml, CMF 0,39 mg/
ml)
C. albicans clinique (c) (3,125 mg/ml CMI1,56 mg/ml,
CMF 3,125 mg/ml) (Tableau 4, Fig. 7.)

Pour lextrait mthanolique, la CMI et CMF de C. albicans (c) taient respectivement 1,56 mg/ml CMI0,78 mg/
ml et CMF 1,56 mg/ml.
Ces valeurs taient moins leves compares celles
trouves par [31], qui ont test lextrait thanolique de feuilles de grenade sur C. albicans (NCPF 3153), la CMI et la

CMF obtenues taient respectivement de 15,62 mg/ml et


7,81 mg/ml.
La prsence des flavonodes et des tanins comme les gallotanins, 1,2,4-tri-O-galloyl--glucopyranose et 1,3,4-tri-Ogalloyl--glucopyranose dans les feuilles de Punica granatum peut tre responsable de diffrentes activits biologiques
comme lactivit antifongique [32].
Par ailleurs plusieurs mtabolites de diffrentes espces
de plantes, y compris les alcalodes, les tanins et les strols,
sont responsables des activits antimicrobiennes [33]. Toutefois, dans leur mode daction, les tannins peuvent saccrocher sur la membrane cellulaire des micro-organismes grce
leur capacit de prcipiter les protines [34].
Ces activits antifongiques des diffrents extraits peuvent
sexpliquer par lexistence des composs biologiquement
actifs. Les feuilles de grenade contiennent, entre autres des
flavonodes, des flavanes, des saponines et des anthocyanes.
Ces composs ont t identifis comme produits antimycotoxiques et/ou antifongiques. En effet les saponines se sont

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Fig. 6 Zones dinhibitions obtenues avec lextrait mthanolique des feuilles de Punica granatum (EMFG) sur les quatre levures testes

Tableau 4 Valeurs de CMIs et CMFs des souches testes avec les extraits tudis de feuilles de Punica granatum.
Micro-organismes

Extraits

CMI (mg/ml)

CMF (mg/ml)

R. spp

EMFG
EEFG
EMFG
EEFG
EMFG
EEFG
EMFG
EEFG

0,39CMI0,195
0,39CMI0,195
0,39CMI0,195
0,39CMI0,195
1,56CMI0,78
1,56CMI0,78
3,125CMI1,56
1,56CMI0,78

0,39
0,39
0,39
0,39
1,56
1,56
3,125
1,56

C. albicans ATCC 1231


C. albicans (IP 444)
C. albicans (c)

10

Phytothrapie

Fig. 7 Dtermination de concentrations minimales fongicides de lextrait thanolique des feuilles de Punica granatum (EEFG) Les
stries des dilutions des tubes tmoins TT / Les stries des tubes exprimentaux La CMF est en couleur rouge en mg/ml (sur la bote
droite =3,125 mg /ml) chez C. albicans (c) en prsence dEMFG. Les stries des dilutions des tubes tmoins TT / Les stries des tubes
exprimentaux La CMF est en couleur rouge en mg/ml (sur la bote droite =1,56 mg/ml) chez C. albicans IP 444 en prsence dEEFG
10-1,10-2,10-3,10-4 (correspondent respectivement : 10%,1%,0,1% et 0,01% de survie)

montres galement capables dinhiber la croissance fongique [35].


Le mcanisme de rsistance des levures aux antifongiques que sont, dans ce cas, les extraits est d gnralement
lergostrole, principal constituant de la membrane fongique. Par contre leurs sensibilits taient dues :

la formation des complexes insolubles


laltration de la permabilit cellulaire
linhibition de la synthse protique par incorporation de
lARN
linhibition de la synthse dADN [36].

Ces perturbations cellulaires conduisent laltration de


la paroi du filament fongique [37]. Tout cela pourra vraisemblablement expliquer la sensibilit des souches de C. albicans, R. spp testes.
Lefficacit dun extrait dpend de sa concentration, de la
plante partir de laquelle il est issu et de la souche teste

[38,39]. Lactivit dune substance vgtale dpend de plusieurs facteurs dont le mode dextraction et la concentration
en principe actif [40]. Lactivit antimicrobienne de nos
extraits pourrait sexpliquer par la prsence dun/ou plusieurs
constituants bioactifs limage des phnols, acide phnolique, tanins, quinones, flavonodes et coumarines [41].

Conclusion et perspectives
A partir de cette tude analytique qui consistait valuer
lactivit antifongique des extraits des feuilles de Punica
granatum ; nous pouvons conclure que toutes les souches
fongiques taient sensibles nos extraits. Cette sensibilit
tait diffrente selon les souches (trs sensibles ou moyennement sensibles) et selon le solvant dextraction utilis. Cest
ainsi que C. albicans ATCC 1231 et R. spp ont t les souches les plus sensibles aux deux extraits. Par ailleurs lextrait

Phytothrapie

ethanolique a t le plus actif sur C. albicans ATCC 1231,


lensemble de ces rsultats obtenus in vitro ne constitue
quune premire tape dans la recherche de substances de
source naturelle biologiquement active. Des essais complmentaires seront ncessaires et devront pouvoir confirmer
les performances mises en vidence afin dvaluer lapplicabilit de ces substances et leurs limites dans le domaine
infectieux. Ces rsultats restent prliminaires, il serait donc
intressant de poursuivre les investigations sur cette plante.
De plus, des tudes approfondies concernant lidentification
des composs par des mthodes plus performantes seront
ncessaires. Pour mieux valuer lactivit antifongique,
dautres tudes in vitro et in vivo seraient intressantes, il
serait souhaitable de faire une tude dans le domaine toxicologique afin de mettre la disposition des populations une
plante active avec des posologies prcises.
Remerciements Les remerciements sadressent au Pr Pascal
Sonnet et au Dr Viviane Silva-Pires du laboratoire des glucides, quipe chimie thrapeutique de la facult de pharmacie
de luniversit Jules vernes dAmiens Picardie (France) pour
leur aide la ralisation de quelques extractions chimiques,
sans oublier le Dr Y. Merrad et Mr A. Harrachi du laboratoire
danalyses microbiologiques du centre hospitalo-universitaire
de Sidi-Bel-Abbs (Algrie) pour leurs aides prcieuses et
conseils. Nos vifs remerciements sadressent galement au
Dr K. Zemri pour ses contributions dans la partie statistique.
Liens dintrts : les auteurs dclarent ne pas avoir de liens
dintrts.

Rfrences
1. Newman DJ, Cragg GM, Snader KM (2003) Natural products as
sources of new drugs over the period 1981-2002. J Nat Prod
66:102237
2. Bisignano G, Germano MP, Nostro A, et al (1996) Drugs used in
Africa as dyes: antimicrobial activities. Phytother Res 9 : 34650
3. Lis-Balchin M, Deans SG (1996) Antimicrobial effects of hydrophilic extracts of Pelargonium species (Geraniacee). Lett Appl
Microbiol 23: 2057
4. Maoz M, Neeman I (1998) Antimicrobial effects of aqueous plant
extracts on the fungi Microsporum canis and Trichophyton rubrum
and on three bacterial species. Lett Appl Microbiol 26: 613
5. Hammer KA, Carson CF, Riley TV (1999) Antimicrobial activity
of essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 86:
98590
6. Boldi AM (2004) Libraries from natural product-like scaffolds.
Curr Op Chem Biol 8: 2816
7. Bruneton J (1999) Pharmacognosie, phytochimie, plantes mdicinales (3e dition) Tec & Doc Lavoisier, Paris, 1120 p
8. Johann S, Silva D, Martins CB, et al (2008) Inhibitory effect of
extracts from Brazilian medicinal plants on the adhesion of
C.albicans to buccal epithelial cells. W J Microbiol Biotechnol
24:245964

11
9. Storey T (2007) La grenade : le fruit mdicament. Magazine
Nexus Sant, France, 51 : 4654
10. At Youssef M (2006) Plantes mdicinales de Kabylie, Ibis Press,
Paris, Prface du docteur Jean-Philippe Brette, 349 p
11. Lima EO, Freira KRL, Farias NMP (2002) Avaliaca oda atividade antimicrobiana do extrato aquoso de Punica granatum L.
(Punicaceae). Infarma 14:469
12. Kanoun K, Abbouni B, Bnine ML, et al (2014) Etude de lefficacit de lextrait thanolique dcorces de Punica granatum. linn
sur deux souches phytopathognes: Ascocyhta rabiei (pass.) labr.
et Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici. Eur Sci J 10
(12) : 30115
13. Caree P (1953) Prcis de technologie et de chimie industrielle. Ed
Ballire JB et fils, 238 p
14. Moroh JLA, Bahi C, Dje K, et al (2008) tude de lactivit antibactrienne de lextrait actatique (EAC) de Morinda morindoides
(Baker) milne-redheat (Rubiaceae) sur la croissance in vitro des
souches dEscherichia coli. Bull Soc Roy Sci Lige 77: 4461
15. De Billerbeck VG, Roques C, Vanire P, et al (2002) Activit
antibactrienne et antifongique de produits base dhuiles essentielles. Hygines 10 :24851
16. Ponnusamy K, Petchiammal C, Mohankumar R, et al (2010) In
vitro antifungal activity of indirubin isolated from a South Indian
ethnomedicinal plant Wrightia tinctoria R. Br J Ethnopharmacol
132(1) 28: 349-54
17. Amoo SO, Ndhlala AR, Finnie JF (2009) Antibacterial, antifungal and anti-inflammatory properties of Burchellia bubaline.
S Afr J Bot 75 (1): 603
18. KirbyBauer (1996) Antimicrobial sensitivity testing by agar diffusion method. African Journal of Clinical Pathology. Published
by Fibiger United Kingdom 44:493
19. Berahou A, Auhmani AN, Fdil A, et al (2007) Antibacterial activity of Quercus ilex barks extracts. J Ethnopharmacol 112
(3):4269
20. Al-Zoreky NS (2009) Antimicrobial activity of pomegranate
(Punica granatum L.) fruit peels. Int J Food Microbiol 134: 2448
21. Hammer KA, Carson CF, Ridley CV (1999) Antimicrobial activity of essential oils and other plants extract. J Appl Microbiol
86:98590
22. Ciulei I (1980) Methodology for Analysis of Vegetable Drugs.
Practical manual on the industrial utilization of medicinal and
aromatic plants. Arta Grafica, Bucharest, Romania, 420 p
23. Hfling JF, Anibal PC, Obando-Pereda GA, et al (2010) Antimicrobial potential of some plant extracts against Candida species
Braz J Biol 70(4): 10658
24. Pesewu GA, Cutler RR, Humber DP (2008) Antibacterial activity
of plants used in traditional medicines of Ghana with particular
reference to MRSA. J Ethnopharmacol 116 :10211
25. EUCAST (2013) The European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing. Dtermination de la sensibilit aux antibiotiques Mthode EUCAST de diffusion en glose Version 3.0,
19 p
26. Jain P, Nafis G (2011) Antifungal activity and phytochemical
analysis of aqueous extracts of Ricinus communis and Punica
granatum. J Pharm Res 4(1):1289
27. Singla S, Gupta R, Puri A, et al (2013) Comparison of anticandidal activity of Punica granatum (Pomegranate) and Lawsonia
inermis (Henna leaves): An in vitro study. Internat J Dental Res
1 (1): 813
28. Duman AD, Ozgen M, Dayisoylu KS, et al (2009) Antimicrobial
activity of six pomegranate (Punica granatum L.) varieties and
their relation to some of their pomological and phytonutrient characteristics. Molecules 14(5): 180817
29. Eloff JN (1998)Which extractant should be used for the screening
and isolation of antimicrobial components from plants? J Ethnopharmacol 60: 18

12
30. Senhaji O, Faid M, Elyachioui M, et al (2005) Antifungal activity
of different cinnamon extracts. J Mycol Md 15: 2209
31. Shafighi M, Amjad L, Madani M (2012) In vitro antifungal activity of methanolic extract of various parts of Punica granatum L.
Internat J Scient Engine Res 3(12) : 22295518
32. Hussein SM, Barakat HH, Merfort I, et al (1997) Tannins from
the leaves of Punica granatum. Phytochemisto 45 (4): 81923
33. Leven MD, Vanden BDA, Marten T, et al (1979) Screening of
higher plants for biological activity. Planta Medica 36: 3112
34. Vasconcelos LCS, Sampaio MCC, Sampaio FCS, et al (2003)
Use of Punica granatum as an antifungal agent against candidosis associated with denture stomatitis. Mycoses 46:1926
35. Turner RB, Lindsey DL, Bishop RD (1975) Isolation and identification of 5,7 dimethoxyisoflavone. An inhibitor of Aspergillus
flavus from peanuts. Mycopathol 57: 3940

Phytothrapie
36. Boiron P (1996) Organisation et Biologie des Champignons. Collection et ditions Nathan, 128p
37. Epstein WL, Shah P, Riegelman S (1972) Griseofulvin Levels in
Stratum Corneum Study After Oral Administration in Man. Arch
Dermatol 106 (3):3448
38. Klervi LL (2005) Connaissance chimiotaxonomique du genre
Turbinaria et tude des composs de dfense de diffrentes espces de Sargassaces des les Salmon (Pacific sud), 210 p
39. Kalemba D, Kunicka A (2003) Antibacterial and Antifungal Properties of Essential Oils. Curr Med Chem (17) 10:81329
40. Wagner H, Bladt S, Rickl V (1996) Plant Drug Analysis. A Thin
Layer Chromatography Atlas. Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co.K 2nd ed. 384 p
41. Das K, Tiwari RKS, Shrivastava DK (2010) Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Current methods and future trends. J Med Plants Res 4 (2): 10411