CAPÍTULO 18

U NA APROXIMACIÓN A LA G ENÓMICA 323

UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA

ANNIA FERRER MEDINA1 , MARCELO NAZABAL GALVEZ1 , LIDIA INES NOVOA PEREZ1
1
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

INTRODUCCIÓN
En toda aproximación a la era de la Genómica es necesario considerar el cami-
no transitado hasta el presente. Los principales logros de la genética y la
genómica, comenzando por el descubrimiento por Mendel de las leyes de la
heredabilidad1 , el reconocimiento del ADN como el material hereditario [2], la
determinación de su estructura [3], la elucidación del código genético [4], el
desarrollo de las tecnologías de ADN recombinante [5,6] y el establecimiento
de métodos automáticos de secuenciación de ADN [7,8,9] sentaron las bases
para el desarrollo del Proyecto del Genoma Humano, cuyos principales objeti-
vos [10] se alcanzaron recientemente y han revolucionado las ciencias biológi-
cas. Estos estaban dirigidos a desarrollar tecnologías de análisis, obtener el
mapa físico, genético y secuencias de genomas de organismos modelos y final-
mente del genoma humano.
Estos monumentales resultados han estado acompañados de un progreso igual-
mente grandioso en las investigaciones biomédicas y en las ciencias de la com-
putación. Los investigadores en las esferas biológicas están ahora bien
posicionados para realizar análisis globales de mutaciones genéticas
poblacionales, expresiones de genes, identidad y función de proteínas
(Proteómica) y de estructura tridimensionales de proteínas (Genómica estruc-
tural). La información resultante de estas investigaciones podría acelerar el
desarrollo de nuevas terapias dirigidas especialmente según el perfil genético
de cada individuo (Farmacogenómica). Por otra parte el enorme volumen de
información experimental ha requerido el desarrollo de bases de datos y soft-
ware que permitan el acceso a mega datos, así como su transferencia y mani-
pulación. De todo este desarrollo se han desprendido una serie de ramas de
estudio que como se ha visto comprende de manera general, la Genómica, la
Proteómica, la Farmacogenómica y la Bioinformática, formando una gran red
de interrelaciones y manteniendo objetivos particulares.
Durante este tiempo se han desarrollado nuevas estrategias para el diseño de
medicamentos, dentro de las cuales han estado la Genómica, la Química
 324 CAPÍTULO 18

combinatoria, el desarrollo de modelos moleculares y el pesquisaje de alto flujo.

La Genómica ha generado una enorme cantidad de posibles blancos para el
desarrollo de medicamentos. Para probar el concepto terapéutico y la valida-
ción del nuevo blanco, se utilizan animales modificados genéticamente y se
pesquisan cientos de miles de compuestos obtenidos mediante la combinatoria.
El descubrimiento de nuevos medicamentos por los métodos convencionales
de pesquisaje de compuestos naturales y sintéticos era complejo y costoso.
En la era del genoma humano la información sobre las proteínas y la obten-
ción de las estructuras tridimensionales de las mismas, ha aumentando cada
día más, y los medicamentos se pueden diseñar basándose en la estructura
tridimensional de los blancos. Y se pueden desarrollar teorías sobre el com-
portamiento de los mismos y su función, basándose en las características
estructurales y físicas de los mismos.
Las librerías combinatorias no solo utilizan la información proveniente de la
Genómica y todas la ramas de la biología que se derivan de esta, sino que
también participa en el desarrollo de las misma aportando información sobre el
comportamiento de receptores, ligandos y el desarrollo de conceptos de la fun-
ción y estructura de moléculas biológicas.
En la actualidad la Genómica y las librerías combinatorias forman un complejo
íntimamente relacionado que aporta información cada vez más precisa sobre la
estructura y función de las moléculas biológicas, que permitirán el diseño cada
vez más efectivo y personalizado de medicamentos en áreas tan importantes
como el cáncer, las enfermedades infecciosas, incluida el SIDA y los problemas
cardiovasculares y del sistema nervioso central.

GENÓMICA
El estudio de la estructura, función e interacción de los genes y sus complemen-
tos en las células vivas, se denomina Genómica. El estudio de las proteínas y
sus complementos en una célula se denomina Proteómica. Finalmente, el alma-
cenamiento a gran escala, la organización, estructuración y extracción de infor-
mación a partir de los datos obtenidos en los estudios biológicos se denomina
Bioinformática.
La nueva visión de la genómica esta formulada en tres temas fundamentales:
genómica para la biología, genómica para la salud, y la genómica para la socie-
dad [11]. Cada uno de estos temas requiere de grandes esfuerzos y se plantea
ambiciosos objetivos. En este capítulo nos referiremos a algunos aspectos de la
Genómica para la biología, que se centra en la elucidación de la estructura y la
función de los genes y comprende los siguientes elementos:
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 325

1. Comprensión e identificación de la estructura y función de los componentes

codificados por el genoma humano
A pesar de que la molécula de ADN es relativamente simple, la estructura
del genoma humano es extraordinariamente compleja y su función casi des-
conocida. Sólo el 1-2 % de las bases codifican proteínas [12], y la mayoría
de las secuencias no codificantes aún no han sido establecidas. Menos aún
se conoce sobre la función de casi la mitad del genoma que consiste en
secuencias altamente repetitivas. La siguiente fase de la genómica consiste
en catalogar, caracterizar y comprender la totalidad de los elementos funcio-
nales codificados por el genoma humano y de otras especies.
La comparación de secuencias genómicas de diversas especies (genómica
comparativa), ha emergido como una poderosa herramienta para identificar
funcionalmente importantes elementos genómicos. Esto ha dado lugar a sig-
nificativos avances en la comprensión de la importancia funcional de las
regiones conservadas y la definición de la función de algunas secuencias.
2. Elucidación de la organización de las redes genéticas y las vías metabólicas
de las proteínas y establecimiento de su contribución a los fenotipos célulares
y a nivel de organismo.
Los genes y los productos de estos no funcionan independientemente, sino
formando complejos, redes, sistemas moleculares que permiten la formación
de células, tejidos, órganos y organismos. La definición de estos sistemas y
sus propiedades es de vital importancia para comprender el funcionamiento
de los sistemas biológicos. Para esto es necesario integrar información a
diferentes niveles. A nivel genético, es necesario identificar la interacciones
reguladoras en diferentes tipos celulares para lo cual se necesitan métodos
de monitoreo simultáneo de la expresión de todos los genes en las células
[13]. A nivel del producto génico se necesitan similares métodos de medición
in vivo y en tiempo real de los niveles de expresión, localización, modifica-
ción y actividad/cinética. También es importante desarrollar, escalar y mejo-
rar las técnicas de modulación de la expresión de genes, como los métodos
convencionales de knockout de genes [14] para establecer los patrones de
expresión celular y temporal de proteínas individuales y determinar su función.
3. Conocimiento exhaustivo de las variaciones heredables en el genoma humano.
Lograr una comprensión de las variaciones genéticas tanto en humanos como
en otros organismos modelos podría facilitar los estudios que permiten esta-
blecer relaciones entre los genotipos y las funciones biológicas. El estudio de
variaciones particulares y de como estas afectan el funcionamiento de pro-
teínas especificas y sus vías metabólicas puede brindar nuevos aportes en
 326 CAPÍTULO 18

los procesos fisiológicos tanto en el estado normal como de enfermedad. La

posibilidad actual de incorporar información sobre las variaciones genéticas
en los diversos estudios abre una nueva era para la investigación de las
bases genéticas de las enfermedades humanas y la respuesta a drogas.
La genómica constituye una poderosa herramienta para el desarrollo de nuevos
fármacos, mejores alimentos, diagnósticos más personalizados y certeros y para
el diseño de productos industriales, mediante la aplicación de una vasta gama
de técnicas que incluyen procedimientos básicos de biología molecular, tanto en
sus formatos originales como desarrollando tecnologías de alto flujo.
A continuación revisaremos algunas de estas tecnicas:
Métodos de laboratorio relacionados con los estudios de Genómica:

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

El PCR constituye una tecnica de amplia aplicación en los estudios de genomica
y consiste en la replicación in vitro de cantidades relativamente pequeñas de
secuencias de ADN en millones de copias durante un breve periodo de tiempo.
Una reacción típica de PCR requiere de: primero, dos oligonucleótidos cebadores,
de aproximadamente 20pb complementarios a la secuencia de ADN que flanquea
la secuencia de ADN de interés; segundo una enzima ADN polimerasa
termoestable y tercero, un exceso de deoxynucleotidos libres y una pequeña can-
tidad de ADN molde que contiene la secuencia de interés, que será amplificada.
Al inicio de la reacción, el ADN molde es calentado a temperaturas mayores de
90 o C para separar las cadenas de ADN (desnaturalización). A continuación, la
temperatura de la mezcla de reacción se lleva hasta aproximadamente 40 o C en
presencia de un exceso de oligonucleotidos cebadores para permitir la hibrida-
ción de ellos a su secuencia complementaria en el ADN molde. Inmediatamen-
te después comienza la extensión de esta cadena incorporando los nucleótidos
presentes en la mezcla de reacción y usando como molde la cadena de ADN
original. Este paso de extensión ocurre a temperaturas de aproximadamente 70 o C
y en la presencia de la ADN polimerasa termoestable. Después de este primer
ciclo el mismo proceso se repite de 20 a 30 veces con una amplificación teórica
final de aproximadamente un millón de veces.
Diferentes modificaciones pueden realizarse a esta reacción para potenciar su
especificidad y extender su aplicabilidad. Por ejemplo, la especificidad del PCR
puede aumentarse sometiendo el producto del primer PCR a otro proceso de
amplificación usando un segundo par de oligos cebadores con secuencias inter-
nas del primer par, estos son llamados cebadores anidados y la reacción nested
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 327

PCR. En otra modificación, más de una secuencia de ADN de interés puede

ser empleada en una misma reacción de PCR usando múltiples oligos cebadores
y este tipo de reacción es conocida como multiplex PCR. Esta última variante
de PCR promete desempeñar un importante papel en el diagnóstico de enfer-
medades infecciosas.
Debido a la rapidez de este ensayo y a su particularmente alta sensibilidad, que
permite amplificar cantidades en el orden de los nanogramos, el PCR es un
método extremadamente útil y eficiente en los pesquisajes genéticos, en el diag-
nóstico de enfermedades, en el monitoreo de la respuesta a tratamientos, en la
tipificación de tejidos [15,16,17,18] y es precisamente en esta reacción que se
basan la mayoría de los métodos específicos utilizados en los estudios de genómica
que describiremos mas adelante (DOP-PCR, PEP-PCR, Pyrosequencing).
Sin embargo, la extrema sensibilidad del PCR lo hace vulnerable a la posibilidad
de resultados falsos positivos debido a que se amplifican cantidades ínfimas de
contaminantes. Esto constituye un reto para la aplicación de estas técnicas en
los métodos propios de la genómica.

(RT)-PCR
Existen diversos métodos para la detección y cuantificación de ARNm a partir
de muestras biológicas, entre los que se incluye Northern blotting, ensayos de
protección de nucleasa y PCR por trascripción inversa (RT)-PCR. Todos estos
métodos comienzan con la adquisición de la muestra biológica fresca (sangre,
médula ósea, material de biopsia, líneas celulares, etc.) que permite la extrac-
ción del ARN total, o el ARNm purificado [19].
En el (RT)-PCR, la reacción en cadena de la polimerasa tradicional se combina
con la trascripción inversa para amplificar el ARNm. En esta última reacción el
ARNm de la muestra es convertido a cADN de simple cadena en una reacción
mediada por la enzima reverso transcriptasa. Este cADN sintetizado represen-
ta sólo los exones del correspondiente ADN genómico. El subsiguiente método
de amplificación es llamado (RT)-PCR para distinguirlo del PCR estándar usa-
do para amplificar ADN genómico. Esta reacción es una herramienta extrema-
damente potente y sensible para detectar y cuantificar ARNm a partir de
pequeñas cantidades de muestras y en los estudios de genómica tiene su uso
mayoritariamente en los ensayos de expresión y cuantificación de genes así
como en el diagnóstico genético. Entre las aplicaciones recientes del (RT)-PCR
se incluyen la detección de micrometastasis de nódulos linfáticos en cáncer de
próstata [20], de contaminación de la médula ósea con tumores de mamas y
monitoreo de residuos mínimos de enfermedad en la leucemia aguda [21].
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PCR A TIEMPO REAL (RT-PCR)

En el RT-PCR el nivel gradual del ARNm es estimado indirectamente a partir
de los niveles del correspondiente producto amplificado. Esta cuantificacion se
realiza usualmente una vez que la reacción es completada. Alternativamente, la
presencia y cantidad del producto del PCR puede ser monitoreado en “tiempo
real” mientras la reacción progresa. Monitoreando la abundancia del producto
de PCR en múltiples ciclos del PCR permite obtener valores en un rango diná-
mico que son más informativos que los obtenidos al final de la reacción [22] .
Durante los ciclos iniciales del proceso la amplificación es exponencial debido a
la presencia de un exceso de oligos cebadores en la reacción que minimiza la
renaturalización de las cadenas complementarias del ADN molde. Cuando la
concentración del producto amplificado aumenta la posibilidad de renaturalización
también aumenta, y como resultado los grados de amplificación disminuyen,
como consecuencia se produce una fase estacionaria. El punto de transición
desde la fase exponencial a la estacionaria, puede variar marcadamente de una
muestra a otra. Resulta evidente la conveniencia de cuantificar el producto del
PCR del ARNm específico durante la fase exponencial de la amplificación con
lo que se aumenta la precisión del ensayo.
Las aplicaciones potenciales del PCR en tiempo-real incluyen el diagnóstico y
monitoreo de enfermedades [23,24,25,26], el pesquisaje de estabilidad genética y
bioseguridad [27] , el seguimiento de la exposición a radiaciones [28], la detección
de mutaciones [29], la cuantificación de los perfiles de citocinas en células inmu-
nes o tejidos inflamados [22]y las imágenes in vivo de procesos celulares [30].

ELECTROFORESIS Y BLOTTING
El ADN, el ARN o las proteínas pueden ser separados por su peso molecular
mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. El ADN y ARN
están uniformemente cargados negativamente y su separación en geles de
agarosa se realiza en función de su peso molecular y su conformación.
En el caso del ADN y ARN las técnicas de blotting más usadas se basan en
la transferencia a un soporte sólido, como nitrocelulosa, y la posterior hibrida-
ción empleando sondas de ácidos nucleicos específicas según el caso y puede
ir precedidos de reacciones en cadena de la polimerasa como veremos en
algunos ejemplos más adelante. Estos métodos de hibridación se han extendi-
do ampliamente en el campo de la genómica y cada compañía desarrolla una
metodología propia empleando diferentes sondas o marcadores que definen
las particularidades de cada método particular. Estos métodos de hibridación,
juntos a los de secuenciación conforman las tecnologías más comunes en los
estudios de genómica.
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 329

Para el ADN y el ARN se emplean las técnicas Southern blotting y Nothern

blotting respectivamente. En el Southern blotting el ADN es primero escindi-
do en fragmentos empleando endonucleasas de restricción, y luego los frag-
mentos obtenidos son sometidos a electroforesis en geles de agarosa. Los
fragmentos de ADN de doble cadena en el gel son desnaturalizados y conver-
tidos en simple cadena y transferidos a una membrana que permita la unión del
ADN (nitrocelulosa o nylon) para hacer una copia permanente del ADN de
simple cadena. Después le siguen un paso de hibridación seguido de una auto-
radiografía con sondas marcadas radiactivamente [31]. Además de la identifi-
cación de blancos específicos y su cuantificación, el Southern blotting permite
la detección de mutaciones que dan como resultado alteraciones en la talla de
los fragmentos de restricción lo cual es conocido como detección de
polimorfismos de fragmentos de restricción (RFLPs). El Nothern blotting es
empleado para identificar ARNs específicos [32], de manera similar a como se
hace con el Southern blotting.

BIBLIOTECAS
El ADN cromosómico aislado directamente de la células es llamado ADN
genómico, mientras que el obtenido mediante trascripción inversa es llamado
ADN complementario (cADN). Por otra parte, un grupo de clones obtenidos
a partir de ADN de una fuente particular es conocido como biblioteca de
ADN, esta puede ser de ADN genómico, o de cADN en dependencia de la
fuente. Para preparar una biblioteca de ADN humana, el ADN genómico, es
primeramente digerido con enzimas de restricción y los fragmentos de res-
tricción son recombinados con un vector similarmente digerido. Esta pobla-
ción de moléculas ADN recombinantes con diferentes insertos de ADN
humano es entonces clonada en un hospedero bacteriano siendo esta colec-
ción de vectores con insertos de ADN humano lo que representa una bibliote-
ca de ADN humano.
Las bibliotecas de ADN complementario tienen la ventaja de portar sólo los
exones (regiones codificantes de los genes para proteínas) y pueden ser mo-
dificadas flanqueando los extremos con fragmentos de señales de trascripción
y traslación conformando así vectores de expresión que permiten el pesquisaje
de las proteínas codificadas. Los clones de ADN complementario de genes
conocidos o no, pueden ser parcialmente secuenciados para generar colas de
secuencias expresadas (ESTs). Estas secuencias permiten, aunque de mane-
ra incompleta, disponer de una representación de las secuencias expresadas
en la célula de interés y determinar la localización del gen dentro de la se-
cuencia de ADN genómico.
 330 CAPÍTULO 18

SECUENCIACIÓN
Este método consiste en la lectura de la cadena de nucleótidos de una región de
ADN de interés. Se realiza a partir de suficiente cantidad de la región de ADN
blanco proveniente de fragmentos clonados en bacteria o amplificados por PCR.
Este método emplea un pequeño oligonucleótido cebador de ADN para sintetizar
la cadena complementaria del ADN molde que será secuenciado, y análogos
químicos específicos de los nucleótidos (dideoxinucleótidos) que son capaces de
terminar la extensión de la cadena en la base específica que analogan. Como
resultado se obtienen fragmentos de longitud variable que difieren en un nucleótido.
Este grupo de fragmentos que están marcados radiactivamente o con fluoróforos,
pueden ser separados por electroforesis en gel y se obtiene como resultado un
patrón que permite la determinación del nucleótido específico presente al final de
cada fragmento. Actualmente se usan métodos de detección automática
computadorizada mediante sistemas de láser que agilizan la obtención de la infor-
mación. La mayoría de los métodos de detección de polimorfismos genéticos
emplean métodos que combinan diferentes variantes de PCR con variantes de
secuenciación, ejemplos de los cuales serán mostrados más adelante

MAPEO DE GENES
El mapeo genético humano comprende:
• La localización o mapeo de los genes de cada uno de los 23 pares de
cromosomas.
• La determinación del orden y espacio entre genes en el cromosoma particu-
lar [33].
El mapeo de genes puede ser realizado en dos sentidos:
Mapeo físico: que se basa en estimar la distancia física entre genes medidos
en pares de base (pb).
Mapeo de ligamiento genético: que se basa en la frecuencia de entrecruza-
miento meiótico observado entre dos loci de un cromosoma. La distancia de
ligamiento se mide en centiMorgans (cM)
El mapeo físico de genes puede realizarse por diferentes métodos con diversos
niveles de resolución que varían desde el cromosoma entero hasta un simple
par de bases. Los métodos de baja resolución incluyen: cariotipaje, hibridación
con fluorescencia in situ (FISH) y la hibridación de células somáticas.
Los cromosomas humanos pueden ser identificados por talla y por distintos
patrones de bandas observados bajo el microscopio y teñidos con colorantes
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 331

especiales de unión a ADN [34]. Este método de visualización cromosómica es

llamado cariotipaje y da como resultado una foto en la metafase de los 22 pares
de cromosomas autosómicos homólogos y 1 par adicional de cromosomas sexua-
les alineados por tallas. Estas fotos permiten identificar las anomalías más ge-
nerales como: deleciones, duplicaciones y translocaciones de cromosomas, que
pueden ser asociadas con un fenotipo particular de enfermedad. Como resulta-
do, el gen relacionado con la enfermedad puede ser físicamente mapeado en la
vecindad de una lesión cariotípica anormal.
En el método conocido como FISH se requiere un conocimiento previo de la
secuencia ADN específica del gen o en su lugar es necesario conocer un mar-
cador cercano al gen de interés. La secuencia específica es clonada con colas
fluorescentes formando sondas marcadas que son preparadas para localizar el
gen de interés en un cromosoma particular, exponiendo los cromosomas en
interfase o metafase con la sonda marcada [35].
En la hibridación celular somática, células humanas y no humanas son fundidas
bajo condiciones experimentales específicas [36]. Posteriormente, las células
híbridas son inducidas a replicarse bajo condiciones especificas en las cuales
comienzan a perder un número variable de cromosomas humanos [37]. Even-
tualmente las células híbridas que retienen 1 o 2 cromosomas humanos especí-
ficos son seleccionadas y se les practica un cariotipo mediante el cual es posible
distinguir los cromosomas humanos de los no humanos y por tanto identificar
los cromosomas humanos específicos que son retenidos en la célula híbrida.
Posteriormente se realizan experimentos adicionales para observar la presen-
cia o ausencia de secuencias especificas de ADN o productos proteicos en la
célula híbrida seleccionada y esto permite finalmente la asociación del gen con
un producto proteico particular para el cromosoma específico. Este método
puede tener mayor resolución si se usan cromosomas dañados con radiaciones
y también cuando se combinan la hibridación de células somáticas con las téc-
nicas de FISH.
Mapeo de ligamiento genético: Durante la meiosis los genes que están loca-
lizados en cromosomas diferentes son segregados independientemente. En otras
palabras 2 genes en 2 cromosomas diferentes tienen un 50 % de posibilidades
de ser heredados juntos en una célula hija. En contraste, los genes que se en-
cuentran en el mismo cromosoma tienen una tendencia a heredarse juntos (es-
tán genéticamente unidos) [14] . Sin embargo, la posibilidad de segregarse juntos
no es de 100 % debido al fenómeno de recombinación [38,39,40,41]. Durante la
recombinación, el intercambio natural que ocurre entre cromosomas homólogos
tiene lugar durante la meiosis 42 . Por lo tanto, la posibilidad de que el evento de
recombinación ocurra depende de la distancia entre los dos genes en el mismo
 332 CAPÍTULO 18

cromosoma [43]. Mientras más cerca estén uno del otro mayor posibilidad ha-
brá de que ocurra el evento de recombinación y viceversa.
El ligamiento genético se define como la tendencia de los genes del mismo
cromosoma de mantenerse juntos durante la meiosis. La fortaleza de este ligamiento
es usada como unidad de medida (Morgan) de la distancia entre 2 genes unidos
[44]. Un centiMorgan denota un evento de recombinación del 1 % (lo que signi-
fica que los genes en cuestión se mantienen unidos el 99 % del tiempo durante la
meiosis). Una distancia genética de 1 cM se refiere a dos genes que están relati-
vamente cerca uno del otro. De acuerdo a lo anterior un mapa de ligamiento
genético puede ser percibido como un mapa de un cromosoma con genes o mar-
cadores de ADN que están alineados según distancias que reflejan la frecuencia
de recombinación entre los genes adyacentes o marcadores [38]. La distancia
total del genoma humano esta estimada a 3000 cM, por tanto 1 cM corresponde
aproximadamente a 1 millón de pb, aunque hay que tener en cuenta que esa es
una unidad de medida relativa, no es constante en el genoma.
Debe tenerse en cuenta que las regiones cromosómicas que se evalúan para los
análisis de ligamiento pueden no estar asociadas necesariamente con caracte-
res fenotípicos aparentes. Por ejemplo: el color del pelo es un carácter fenotípico
aparente, y la variación de la secuencia de ADN responsable del color del pelo
se refleja en una variación en el color del pelo. En contraste, una variación
genética en la secuencia de ADN de un marcador genético fenotipicamente
silente es revelada mediante técnicas moleculares que explotan la presencia o
ausencia de sitios específicos de corte de enzimas de restricción (RFLPs) y
variaciones en el número de VNTRs en regiones cromosomales especificas
que son los llamados marcadores genéticos [45]. Independientemente de si los
marcadores del estudio sean fenotipicamente aparentes o no, los estudios de
ligamiento requieren que exista heterocigosidad en los loci de los genes y de los
marcadores genéticos [46].
Teniendo en cuenta que uno de los objetivos fundamentales de la genómica es
la búsqueda de los genes asociados a enfermedades, el mapeo genético consti-
tuye uno de los pasos imprescindibles en este proceso, debido a que la localiza-
ción de estos genes dentro del genoma humano es el primer paso que permite el
posterior clonaje del gen especifico.

LOCALIZACIÓN PRECISA Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DE INTERÉS

La aberración genética causal de muchas enfermedades no es aún conocida.
Como se describe anteriormente, los análisis de ligamiento se emplean para
asociar el supuesto gen relacionado con la enfermedad con una localización
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 333

cromosómica. Una vez que se ha determinado la posición más general, se puede

aplicar el clonaje posicional para la identificación más precisa y secuenciar el gen.
El clonaje posicional comienza con la selección de los clones de vectores de
una biblioteca genómica que porten las secuencias de ADN que sobrelapen la
del marcador genético ligado. Luego se seleccionan estas secuencias que se
sobrelaparon y se emplean como sondas, para encontrar entonces otras se-
cuencias que se sobrelapen, y asi se continua hasta que el gen relacionado con
la enfermedad en cuestión es identificado, a este proceso se le llama chromosome
walking [47] . Estos clones identificados por las sondas, pueden ser
individualmente mapeados mediante la búsqueda de sitios complementarios con
las ESTs. Se determina la EST que se co-segregue con el gen de interés y se
secuencia y determina el marco de lectura abierto (ORF). Finalmente, el gen
candidato es identificado por análisis mutacionales que comparan los ORFs de
bibliotecas de ADN derivadas de pacientes, con aquellas obtenidas a partir de
personas no afectadas.

POLIMORFISMO
El genoma humano es grandemente afectado por las variaciones de su secuen-
cia [48]. Si tomamos dos individuos al azar y comparamos sus secuencias de
ADN genómico podremos comprobar que el 99,9 % de sus secuencias son
idénticas. En el 0,1 % restante se encuentran las diferencias que determinan la
suceptibilidad a enfermedades, la respuesta diversa al ambiente, el metabolis-
mo diferencial ante drogas o medicamentos, así como un número importante de
diferencias entre individuos
Cuando el grado de variación en un punto específico del ADN da como resulta-
do una variante que está presente en más del 1 % de la población estamos en
presencia de un polimorfismo. Si la incidencia de esta variante es menor del 1%
entonces lo llamamos mutación. Sin embargo algunas definiciones son impreci-
sas debido a que en algunas poblaciones lo que llamamos mutación en otra la
encontramos como polimorfismo.
Los polimorfismos genéticos pueden ser revelados mediante digestión con
enzimas de restricción lo que da como resultado fragmentos de restricción de
tallas variables, este es el fenómeno visto anteriormente y conocido como RFLP.
Estos RFLPs generalmente no tienen efecto fenotípico ya que usualmente ocu-
rren en las regiones intergénicas. Algunas regiones del ADN son altamente
polimórficas debido a la presencia de pequeñas secuencias repetitivas en tandem
de número variable (VNTRs). Las variaciones en el número y la talla de estas
secuencias en los individuos pueden ser determinadas mediante RFLPs inducidos
por enzimas de restriccion que cortan en los límites de las secuencias repetitivas.
 334 CAPÍTULO 18

El grado de polimorfismo de los VNTRs es suficientemente alto como para

permitir la realización de fingerprinting para generar el patrón de los fragmentos
de restricción que es único para cada individuo [49].
Muchos de los polimorfismos encontrados se catalogan como SNP (polimorfismo
de nucleótido simple) y constituyen sustituciones de un sólo par de bases en
cualquier lugar del genoma. Por ejemplo en la posición 11, 294, 479 en el
cromosoma 7, algunas personas tienen una A mientras otras tienen una G. Como
promedio los SNPs están separados cada 300 bases a través de todo el genoma
humano y se han estimado en alrededor de 10 millones. Ellos constituyen la
referencia genómica por excelencia que los investigadores emplean para mar-
car la localización de genes responsables o involucrados en las enfermedades y
los caracteres heredables.
Una gran parte de los SNPs residen fuera de las regiones codificantes, por lo
que tienen una elevada influencia en la regulación y expresión de los genes.
Muchos investigadores los valoran actualmente para su uso en los estudios de
asociación de genes y en los mapeos de desequilibrio de ligamiento. En este tipo
de análisis los mapas de los polimorfismos más comunes y diseminados en el
genoma son usados para determinar variaciones asociadas a las condiciones
clínicas de los individuos pero que no son causas de su estado.
Algunos polimorfismos ocurren en las regiones codificantes de proteínas (cSNP)
y pueden contribuir directamente a la susceptibilidad a enfermedades y al me-
tabolismo de drogas por alteración de la función de los genes. Se estima que
existen en el genoma humano alrededor de 200,000 cSNP [50]. Es por esto que
se hacen grandes esfuerzos en la comunidad científica para lograr obtener la
mayor cantidad de información referente a los SNP. Para esto se necesitan
métodos y tecnologías de genotipaje de alto flujo (High-throughput genotyping
technologies) que permitan el genotipaje completo de 10 millones de SNPs.
No obstante el desarrollo de estas tecnologías de alto flujo, continúa siendo un
gran problema el genotipaje de 10 millones de SNPs, y se conoce que la canti-
dad de SNP conocida seguirá aumentando. Por tanto la identificación de los
genotipos y su correlación con los fenotipos se convierte en una tarea suma-
mente difícil. Afortunadamente la naturaleza ha hecho este proceso más simple
que lo esperado si se tiene en cuenta el numero de SNP que se conocen. Estu-
dios recientes han dado cuenta que los SNPs se heredan en grupos que se
encuentran estrechamente relacionados en el ADN, en contraste con la tesis
sostenida hasta el momento, en la que se planteaba la segregación al azar de-
bido a la recombinación genética [51]. A este grupo de SNPs que se heredan en
bloque, se le ha denominado haplotipos.
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 335

En octubre del año 2002 comenzó un nuevo proyecto similar al Proyecto del
Genoma Humano, al cual se le denominó Proyecto Internacional HapMap en el
que participan 9 grupos de investigación de los 5 continentes [52]. Su objetivo
fundamental es la determinación del haplotipo a partir de los patrones genéticos
que se identifiquen en muestras de sangre de 200-400 personas de diferente
origen étnico. Este proyecto, que culmina en tres años, se espera que tenga un
costo de 100 millones de dólares y será patrocinado por organizaciones públicas
y privadas. Cuando sean completados los haplotipos podrán ser accesibles en
bases de datos públicas.
En una definición más general, un haplotipo es simplemente el genotipo de un
cromosoma simple o de un grupo haploide de cromosomas. Actualmente el
haplotipo comienza a ser la nueva unidad funcional de la genómica, y en este
sentido se reconoce como un arreglo lineal de alelos en una cadena simple de
ADN. Se conoce que mas de 10 000 nucleótidos se heredan en bloque, y debido
a la cantidad de SNP que se conoce que hay en el genoma humano, pues deben
haber en este bloque muchos SNPs. Estos SNPs que están presentes en un
haplotipo pueden encontrarse en la secuencia de un gen o en la de múltiples
genes pero lo que si esta claro es que el haplotipo permite determinar el contex-
to en el cual actúan los genes. Un estimado reciente sugiere que entre el 65-85 %
del genoma humano puede estar contenido en los bloques de haplotipos [52].
La principal implicación que ha tenido el tema de los haplotipos es la reducción
del número potencial de diferentes genotipos. Además existe ahora la posibili-
dad de identificar lo rasgos heredables que comprenden múltiples variantes de
SNP, detectando sólo un SNP. Esto reduce el trabajo necesario para descubrir
las relaciones entre una enfermedad y uno o más polimorfismos. Este trabajo se
hace típicamente mediante estudios de ligamientos, donde son genotipados los
grupos de pacientes con una enfermedad (ya sea agrupados en familia, o pobla-
ción no relacionada entre si) y un grupo adecuado de control y en el grupo de
datos obtenidos buscan correlaciones entre el genotipo y el diagnóstico. Cuan-
do no se conoce el gen asociado, esta aproximación requiere de un volumen
grande de estudios de genotipaje. Sin embargo, si un SNP está siempre presen-
te en el contexto de un haplotipo especifico, la secuencia completa de ADN
puede ser inferida con un esfuerzo mínimo.
El haplotipo podría comenzar también a ser una herramienta de gran valor en
la medicina evolutiva. Mediante análisis de variaciones específicas y patro-
nes de herencia como los efectos de la heterocigosidad y el desequilibrio de
ligamiento (una secuencia genética que es heredada como un bloque y que no
puede ser disuelta mediante los eventos de recombinación natural, lo que indi-
ca una formación relativamente reciente de ese alelo) los antropólogos,
 336 CAPÍTULO 18

genetistas poblacionales e investigadores biomédicos podrían colectar infor-

mación sobre la selección natural y las adaptaciones que relacionan los patógenos
antiguos y modernos.
El conocimiento básico que pueden proveer las investigaciones de medicina
evolutiva y la determinación de los haplotipos será de gran valor para las com-
pañías farmacéuticas. Han emergido evidencias de que los haplotipos son mas
relevantes clínicamente que los simples genotipos de SNP, debido a que el
haplotipo puede reflejar la presencia de sitios de mutaciones no identificadas
adicionales, que pueden estar relacionados con la enfermedad. También los
haplotipos pueden reflejar dos o más sitios de mutaciones que pueden actuar
juntos para causar una enfermedad, aunque son menos dañinos cuando están
presentes en cromosomas separados.
El haplotipaje puede dar como resultado una mejor comprensión de la influencia
de la genética y la transmisión de la información genética por los cromosomas
dentro de poblaciones especificas. Así como un mayor entendimiento del pro-
nóstico de enfermedades, y la interrelación entre los genes que afectan el des-
encadenamiento fenotipico, que tambien puede incluir influencias ambientales.
Se espera que todo esto sea mucho más exacto que usando sólo el genotipaje
de SNP debido a que la combinación especifica de múltiples polimorfismos pue-
den tener efectos aditivos o substractivos dirigidos a un rasgo particular que no
puede predecirse mediante el genotipaje simple de SNP [53].
Desafortunadamente, el conocimiento de los haplotipos y la composición de
SNP esta aún muy incipiente. Los científicos están actualmente desarrollando
medios para identificar las relaciones de los SNP, y colocarlos en los mapas de
haplotipos. Hasta el momento para aplicaciones como la determinación de pa-
ternidad o los estudios forenses, se han empleado técnicas de microsatélites o
STR (repeticiones de fragmentos pequeños) para detectar algunos haplotipos
conocidos. La posibilidad de detectar los haplotipos usando SNPs tiene la ven-
taja de que pueden ser empleadas nuevas herramientas de alto flujo.
Los SNPs pueden ser detectados empleando una gama enorme de tecnologías
entre las que se cuentan: la secuenciación, microarray, PCR en tiempo-real,
hibridación.
Algunos Métodos de Alto Flujo para el genotipaje de SNPs:

PYROSECUENCING
Es un método muy exacto de análisis de un gran número de secuencias ADN
de tamaño medio o pequeño.
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 337

Paso 1
Hibridar un oligonucleótido cebador a una secuencia de ADN molde simple
cadena amplificada por PCR e incubar con las enzimas ADN polimerasa, ATP
sulforilasa, luciferasa y apirasa, y los sustratos, adenosina 5’ fosfosulfato (APS)
y luciferina.
Paso 2
Añadir el primer dNTP a la reacción. La ADN polimerasa cataliza la incorpora-
ción del dNTP a la cadena de ADN, si es complementaria con la base presente
en la cadena molde. Cada evento de incorporación es acompañado de la libera-
ción de pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar con la cantidad de nucleótido
incorporado (ver Figura 18.1).

Figura 18.1.
 338 CAPÍTULO 18

Paso 3
La ATP sulforilasa convierte cuantitativamente PPi a ATP en presencia de
adenosina 5’fosfosulfato. Este ATP conduce la conversión de luciferina a
oxiluciferina mediada por la luciferasa, lo cual genera luz visible en una canti-
dad que es proporcional a la cantidad de ATP. La luz producida en esta reacción
es detectada por una cámara acoplada y se observa un pico en el pyrodiagrama.
La altura de este pico es proporcional al número de nucleótidos incorporados
(ver Figura 18.1).
Paso 4
La apirasa es una enzima que degrada nucleótidos por lo que degrada
contínuamente el ATP y los dNTPs que no son incorporados. Esto elimina la
señal de luz y regenera la solución de reacción. Entonces se adiciona el próxi-
mo dNTP (ver Figura 18.1).
Paso 5
La adición de dNTPs es de uno en uno. Este proceso continúa igual que el
anterior y de esta forma, al final se obtiene la secuencia de nucleótidos a partir
del diagrama de picos obtenidos (ver Figura 18.1).

TECNOLOGÍA MIP (MOLECULAR INVERSION PROBE TECHNOLOGY)

Esta tecnología obvia la necesidad de realizar PCRs separados por cada mar-
cador (SNP) que es estudiado, como lo hacen la mayoría de las tecnologías de
SNP. Mediante el uso de los ensayos con sondas de inversión molecular (MIP)
es posible la detección de 10 000 SNP en paralelo en una sola reacción em-
pleando menos de 1ng ADN molde/SNP.
Una sonda de inversión molecular (MIP) es un oligonucleótido no modificado
de 110-140 bases que contiene los siguientes segmentos estructurales
• Dos secuencias homólogas de los sitios adyacentes al SNP de interés. Estos
sitios son únicos para cada sonda (H1 Y H2 en la Figura 18.2).
• Dos secuencias que unan oligonucleótidos cebadores comunes de todas las
sondas MIP. Se usan para amplificar todas las sondas MIP exitosamente
hibridizadas (P1 y P2 en la Figura 18.2).
• Una secuencia universal específica que permita que sea hibridizada la sonda
amplificada en un arreglo como el Affymetrix GeneChip Tag array (Tag en
la Figura 18.2).
• Un sitio de corte común para todas las sondas que permite la liberación de la
sonda circularizada del ADN genómico (X1 en la Figura 18.2).
 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 339

Figura 18.2.

Una misma sonda es empleada para detectar ambos alelos de cada SNP.
El genotipaje se realiza empleando una serie de enzimas que funcionan como se
explica a continuación:
Paso 1
Se desnaturaliza y se lleva a la temperatura de hibridación a una mezcla del
ADN genómico, más de 10 000 sondas, la ligasa y la polimerasa termoestables.
Las dos secuencias localizadas en los extremos de las sondas hibridan con sus
respectivos sitios complementarios en el genoma, formando un lazo circular con
un espacio vacío entre los extremos de la sonda (ver Figura 18.3a).

Figura 18.3a. Paso 1 de la tecnología MIP.

Paso 2
Se adicionan los dNTP, uno a cada tubo de reacción (4 tubos por ensayo). La
polimerasa adiciona el nucleótido en la reacción donde el nucleótido adicionado
es complementario a la base que está siendo estudiada (ver Figura 18.3b).

Figura 18.3b. Paso 2 de la tecnología MIP.

Paso 3
La ADN ligasa cierra el espacio vacío para formar una molécula circular
covalentemente cerrada que encierra la cadena genómica a la cual fue hibridizada
(ver Figura 18.3c).
 340 CAPÍTULO 18

Figura 18.3c. Paso 3 de la tecnología MIP.

Paso 4
Se adicionan las exonucleasas que digieren las sondas lineales que se forman
donde el nucleótido añadido no fue complementario con la base a completar en
la sonda. Posteriomente las reacciones son calentadas para inactivar las
exonucleasas. (ver Figura 18.3d).

Figura 18.3d. Paso 4 de la tecnología MIP.

Paso 5
Las sondas son cortadas para liberarlas del ADN genómico (ver Figura 18.3e).

Figura 18.3e. Paso 5 de la tecnología MIP.

Paso 6
Las sondas son entonces amplificadas y marcadas usando los oligonucleótidos
cebadores comunes para todas las sondas (ver Figura 18.3f).

Figura 18.3f. Paso 6 de la tecnología MIP.

 UNA APROXIMACIÓN A LA GENÓMICA 341

Paso 7
Se hibridizan las 4 reacciones a un arreglo de oligonucleótidos universales.
Paso 8
La incorporación de la base es medida mediante una señal fluorescente usando
el sitio complementario en el arreglo de ADN.
Se generan 4 valores para cada sonda: Los dos valores de las bases alelos
esperados se comparan para determinar si el individuo es homocigótico o
heterocigótico para el SNP en cuestión, las dos bases no alelos se comparan
con las bases alelos para señalar el fondo de la medición como un procedimien-
to de control de calidad.

ENSAYO HME (H OMOGENEOUS MASSEXTEND A SSAY)

Es un método de genotipaje que usa como tecnología base la espectrometría de
masa.
Es un proceso muy simple que consiste en:
Paso 1
Una primera amplificación de 2.5 ng del ADN genómico que contiene el SNP
de interés en 5ul de volumen final.
Paso 2
Ocurre una defosforilación de los nucleótidos residuales.
Paso 3
Se adicionan los oligonucleótidos cebadores MassEXTEND, la ADN polimerasa
y una mezcla de dNTPs y ddNTPs para iniciar la reacción de extensión hME.
Esta reacción genera productos que son generalmente de 1-4 bases mayores
que los oligonucleótidos cebadores MassEXTEND.
Paso 4
Se eliminan los residuos de sales que pueden interferir el analisis con MALDI-TOF.
Paso 5
El SpectroCHIP es colocado dentro del MALDI-TOF y se determinan la masa
y la correlación de genotipos en tiempo real con el programa MassARRAY RT.

CONCLUSIONES
El conocimiento del genoma humano se seguirá ampliando en los próximos años
con la identificación y clasificación de todos los genes humanos y la mejoría y
 342 CAPÍTULO 18

expansión de las tecnologías asociadas al proyecto del genoma humano. Estas

nuevas tecnologías permitirán la mejor clasificación de las enfermedades, el
diseño de drogas más efectivas y personalizadas y la predicción de la respuesta
a cada droga en cada paciente, así como la reducción de los efectos secunda-
rios. Estos avances provocaran un cambio fundamental en la forma en que se
diseñan y como se administran los medicamentos. En un futuro no lejano nues-
tros genes serán monitoreados y así se sabrá nuestro verdadero esta de salud.
El próximo gran paso de avance en las ciencias biologías será la integración de
la Genómica, la Proteómica y la Bioinformática.
Junto con todo este desarrollo de la Genómica se perfeccionará la química
combinatoria y su impacto en el desarrollo y diseño de nuevos medicamentos
será mayor. La relación sinérgica entre ambas ramas de la ciencia será cada
vez más importante, permitiendo una interacción más directa entre ambas y así
el desarrollo de medicamentos será más racional, más eficiente, más efectivo y
menos costoso.

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