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Gelelektrophoresen
(Ute Dechert)

Die Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld wird zur Trennung komplexer Gemische von Biomoleklen ausgenutzt. Die Trennmethoden werden unter dem Begriff Elektrophorese zusammengefasst.
Da die meisten Biomolekle Ladungen tragen, gehren Elektrophoresen zu den wichtigsten analytischen
Methoden. Fr die Untersuchung und Charakterisierung komplexer Mischungen sowie zur berprfung
ihrer Einheitlichkeit sind sie unentbehrlich. Die wesentlichen Unterschiede in den Trennungsmethoden
ergeben sich aus dem fr jedes Biomolekl charakteristischem Verhltnis von Ladung zu Masse bzw. aus
ihrer Moleklgre und -form.
Bei den Elektrophoresen unterscheidet man trgerfreie und trgergebundene Systeme. Dieses Kapitel
behandelt nur trgergebundene Systeme, sog. Gelelektrophoresen. Hier erfolgt die Separierung der einzelnen Substanzen nicht nur durch ihre Ladung, sondern zustzlich durch einen Siebeffekt des Gels (Trgermaterials) aufgrund von Gre und Gestalt der zu trennenden Molekle. Fr die meisten Trennprobleme
wird Celluloseacetat, Strke, Agarose oder Polyacrylamid als Trger verwendet.
Die elektrophoretische Beweglichkeit von geladenen Teilchen hngt ab von
der Gesamt-Nettoladung des Molekls
der Gre und Gestalt des Molekls
der Porengre des Trgers
pH-Wert, Temperatur und Ionenstrke des Puffers
der elektrischen Feldstrke.
Gelelektrophoresen knnen kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgefhrt werden. Beim letzteren
Verfahren, kurz Disk-Elektrophorese, ist das Trgermaterial in Bezug auf die Gelzusammensetzung
diskontinuierlich aufgebaut. Es erfolgt so eine Konzentrierung der Probe zu einer sehr schmalen Startbande.
Nachfolgend werden Polyacrylamid-Gelelektrophoresen fr Proteine (Abschn. 2.1), Nachweismethoden fr Proteine (Abschn. 2.2), Gelelektrophoresen fr Nucleinsuren (Abschn. 2.3), die Anfrbung
von Nucleinsuren in Gelen (Abschn. 2.4) und die Elution von Nucleinsuren aus Gelen (Abschn. 2.5)
behandelt.
Unabhngig von der verwendeten Gelelektrophorese erfolgt eine Grenanalyse/Quantifizierung der
aufgetrennten Makromolekle durch Vergleich mit im Gel aufgetragenen Standardproteinen bzw. Standard-DNA-Moleklen bekannter Menge/Gre. Diese Marker sind von verschiedenen Herstellern zu
beziehen und sollten immer mitgefhrt werden.

Literatur
Cooper, T.G. (1981): Biochemische Arbeitsmethoden. Walter de Gruyter, Berlin.
Lottspeich, F., Zorbas, H. (Hrsg.) (1998): Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.

2.1

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Das grundlegende Prinzip aller elektrophoretischen Trenntechniken fr Proteine ist deren Wanderung
in einem elektrischen Feld. Physikalische Effekte wie Konvektion und Diffusion werden durch die Ver-

38

2 Gelelektrophoresen

wendung von polymeren Matrizes umgangen. Polyacrylamid als Trgermaterial fr die Gelelektrophorese besitzt das hchste Auflsungsvermgen. Dies gilt nicht nur fr DNA-Fragmente, sondern auch fr
Proteine, zu deren Analyse es heute nahezu ausschlielich verwendet wird. Lediglich Proteine mit einem
Molekulargewicht ber 500 kDa, z.B. Immunglobuline, werden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Das dreidimensionale Netzwerk des Polyacrylamids wird durch die radikalische Polymerisation des
monomeren Acrylamids und eines quervernetzenden bifunktionellen Reagenzes aufgebaut. Meist kommt
dafr N,N'-Methylenbisacrylsureamid zum Einsatz.
Die Porengre ist in einem weiten Bereich variabel. Die Acrylamidkonzentration kann zwischen 2 %
und 30 % (w/v) variieren. Im Netzwerk des Polyacrylamids werden groe Molekle strker retardiert als
kleine (grenabhngige Trennung). Bei niedrigen Acrylamidkonzentrationen ist der molekulare Siebeffekt gering. So berwiegt eine Trennung aufgrund des Verhltnisses von Masse zu Ladung.
Techniken, die sich die Ladung des Polypeptids fr eine Trennung zunutze machen, finden nur bei der
isoelektrischen Fokussierung Anwendung (Abschn. 2.1.6). Durch extreme pH-Werte in den kathodischen
bzw. anodischen Pufferreservoirs sowie einen pH-Gradienten innerhalb der Gelmatrix wandern die sauren und basischen Proteine nicht aus dem Gel heraus. Die Proteine bewegen sich innerhalb des Gels bei
einer variablen Wanderungsgeschwindigkeit abhngig von ihrem eigentlichen Verhltnis von Ladung zu
Masse. Die Ladung des Proteins vermindert sich whrend des Laufes, da das Molekl Zonen erreicht, in
denen sich der pH-Wert im Gel dem pI-Wert des Proteins annhert. Am isoelektrischen Punkt pI ist die
Nettoladung null, da das Polypeptid bei diesem Wert gleich viele negative und positive Ladungen aufweist.
Diese Methoden trennen die Proteine unter nativen Bedingungen. Das kann eventuell Aufschlu ber
eine spezifische, elektrophoretisch getrennte Komponente mit biologischer Aktivitt geben.
Bei der denaturierenden isoelektrischen Fokussierung werden die Proteine in einem speziellen Probenpuffer denaturiert und in einem harnstoffhaltigen Polyacrylamidgel getrennt. Hierdurch werden die
Seitenketten der Aminosuren, die zum pI-Wert eines Proteins beisteuern, maximal exponiert. Proteine,
deren pI-Wert oberhalb des pH-Wertes des Gels liegt, knnen im Kathodenpuffer verloren gehen und
somit nicht getrennt werden. Dies wird durch einen Zusatz von geladenen Substanzen, wie z.B. SDS (Natriumdodecylsulfat), behoben. Durch dieses Detergenz werden die Proteine solubilisiert und denaturiert.
Unabhngig vom ursprnglichen sauren oder basischen pI-Wert des Polypeptides wird eine negative
Gesamtladung eingefhrt. So besitzt das Polypeptid ein einheitliches Verhltnis von Ladung zu Masse. Dadurch hngt die elektrophoretische Beweglichkeit allein von der Gre des Molekls und der Porengre
des Gels ab.
Fr Proteine gibt es keine allgemeine Wanderungsrichtung, da sie nicht negativ geladen sind wie z.B.
DNA-Molekle. Durch Zusatz des negativ geladenen Detergenz SDS erhalten alle Proteine die gleiche negative Ladung. Die Wanderungsrichtung ist dann zur Anode hin.
Die Porengre eines Gels wird durch das Verhltnis der Konzentrationen von Acrylamidmonomer
und Quervernetzungsreagenz bestimmt. Hufig entspricht die Angabe einfach dem Gehalt an Acrylamid
in Gewichtsprozent. Die Gele enthalten zwischen 3 % und 30 % (w/v) Acrylamid, was etwa einer Porengre zwischen 0,5 und 0,2 nm Durchmesser entspricht. Niederprozentige Acrylamidgele haben also
weite Poren und setzen der Wanderung groer Molekle wenig Widerstand entgegen. Durch kontinuierliche Vernderung der Acrylamidkonzentration in der Polymerisationslsung erhlt man so genannte
Porengradientengele. Sie dienen z.B. zur Ermittlung der Molekldurchmesser von nativen Proteinen oder
zur Auftrennung von komplexen Proteingemischen mit groen Molekulargewichtsbereichen.
Liegen die elektrophoretischen Beweglichkeiten der Proteine in einem engen Bereich, so kann durch
Verwendung unterschiedlicher Puffersysteme in Kathodenpuffer und Gelpuffer vor der eigentlichen Trennung im Trenngel eine Konzentrierung im Sammelgel erfolgen. Man erzielt eine scharfe Bande nahezu
unabhngig vom Volumen der aufgetragenen Probe. Diese Technik wird als diskontinuierliche Gelelektrophorese bezeichnet. Die Diskontinuitt bezieht sich auf vier Parameter: Gelstruktur, pH-Wert und Ionenstrke der Puffer sowie Art der Ionen im Gel- und Elektrodenpuffer.
Bei der sich durch Anwendungsbreite und Einfachheit auszeichnenden kontinuierlichen Gelelektrophorese wird sowohl bei der Herstellung des Gels als auch bei der Elektrophorese der gleiche Puffer

2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

39

verwendet. Dadurch sind nicht zwei unterschiedliche Gele (Sammel- und Trenngel) erforderlich. Zudem
werden bei der kontinuierlichen Gelelektrophorese weniger Artefakte beobachtet. Das trifft insbesondere
fr Proteine zu, die zuvor quervernetzt wurden. Im Vergleich zur diskontinuierlichen Gelelektrophorese
kann jedoch keine vergleichbar hohe Auflsung der Proteinbanden erzielt werden.

Trouble Shooting
Die folgenden Punkte gelten fr alle Protein-Gelelektrophoresen. Spezielle Probleme sind bei den einzelnen Elektrophoresen aufgefhrt.

Materialien
Ammoniumperoxodisulfatlsung (APS) sollte stets frisch angesetzt werden. Mit einer alten Lsung tritt
eventuell keine oder nur eine verzgerte Polymerisation ein.
Acrylamidstammlsungen sollten nach der Zubereitung lichtgeschtzt bei 4 C aufbewahrt werden,
um eine Polymerisation zu vermeiden. Acrylamidlsungen hydrolysieren langsam unter Bildung von
Acrylsure und Ammoniak und sollten somit nicht lnger als 30 Tage aufbewahrt werden.
Da es sich bei dem Acrylamidmonomer um ein starkes Neurotoxin handelt, mssen bei der Herstellung
von Stamm- wie auch Arbeitslsungen entsprechende Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Es
sollte ganz auf den Umgang mit festem Acrylamid verzichtet und auf handelsbliche fertige Stammlsungen zurckgegriffen werden.
Die Lsungen zur Herstellung von Trenn- und Sammelgel sowie eventuell die SDS-Lsung sollten vor
der Zugabe der Reaktionsstarter (APS, TEMED) im Wasserstrahlvakuum vorsichtig entgast werden.
Zuviel gelster Luftsauerstoff verzgert ebenfalls eine Polymerisierung.
Auch bei SDS sollte auf handelsbliche, fertige 10 %ige Stammlsungen zurckgegriffen werden, da es
sich bei festem, feinpulvrigem SDS um eine gesundheitsschdliche Substanz handelt.
Bei der Herstellung von Stamm- und Arbeitslsungen sollten entsprechende Sicherheitsvorkehrungen
getroffen werden.

Durchfhrung
Das Gel polymerisiert nicht: Bei der Gelzubereitung wurde TEMED oder APS weggelassen; die verwendete APS-Lsung war zu alt (neu angesetzte APS-Lsung verwenden; eventuell APS-Konzentration
erhhen); die Lsungen fr die Gelzubereitung enthalten zuviel gelsten Sauerstoff (s.o., lnger entgasen, besonders wenn kalte Lsungen verwendet wurden).
Das Gel polymerisiert zu schnell oder es reit whrend der Polymerisation (meist bei Gelen mit hoher
Acrylamidkonzentration): APS-Menge verringern oder kalte Lsungen fr die Gelzubereitung verwenden.
Das Gel lst sich von den Platten: In der Regel wurden die Glasplatten nicht ausreichend gesubert.
Die Proteine wandern nicht in das Sammelgel ein: Die Polaritt der Elektroden wurde verwechselt oder
das Gelsystem ist fr die Proteine ungeeignet.
Die Proteinbanden sind diffus: Die Probe enthlt zuviel Salz oder der Trenngelpuffer bzw. das Trenngel
wurden falsch angesetzt.
Gleiche Proteinbanden treten in allen Spuren auf, auch in solchen, die nicht mit Probenmaterial beladen wurden: Proben- und/oder Elektrodenpuffer sind kontaminiert.
Smiling-Effekt: Proteinproben in den ueren Gelspuren wandern langsamer als Proben in der Mitte
des Gels. Dies wird von einer ungleichmigen Erwrmung des Gels verursacht und kann z.B. durch
eine erhhte Wrmeableitung verhindert werden, indem die untere Pufferkammer vollstndig mit
Laufpuffer gefllt wird (je nach verwendetem Apparatesystem), die Elektrophorese zwischen 10 C
und 20 C betrieben bzw. der untere Puffer mittels Magnetrhrer gerhrt wird. Des Weiteren kann die
Wrmeentwicklung durch eine Elektrophorese bei verminderter Stromstrke reduziert werden.
Proteinbanden zeigen vertikale Streifen: Probenmenge reduzieren oder die Elektrophorese bei geringerer Stromstrke (ca. 25 %) durchfhren. Die Streifen knnen auch durch przipitiertes Protein verursacht werden, das durch Zentrifugation der Proben vor dem Auftrag entfernt werden kann.

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2 Gelelektrophoresen

Das Tragen von Handschuhen ist besonders empfehlenswert, wenn geringe Proteinmengen mittels Silberfrbung nachgewiesen werden sollen. Durch Keratine knnen artifizielle Proteinspots (pH-Bereich
58, Molekulargewichtsbereich 5065 kDa) hervorgerufen werden.

Literatur
Coligan, J.E., Dunn, B.M., Ploegh, H.L., Speicher, D.W., Wingfield, P.T. (Hrsg.) (1995, 1996): Current Protocols in
Protein Science. John Wiley & Sons, New York.
Hames, B.D., Rickwood, D. (Hrsg.) (1990): Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach. IRL Press at
OUP, Oxford.
Kellner, R., Lottspeich, F., Meyer, H.E. (Hrsg.) (1999): Microcharacterization of Proteins. VCH, Weinheim.

2.1.1 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese

Bei der eindimensionalen Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli (1970)
werden die Proteine in Gegenwart von 0,1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgrund ihres Molekulargewichtes in Richtung Anode getrennt. Die Polypeptide werden bei der Probenvorbereitung in SDSProbenpuffer hitzedenaturiert. Durch den Zusatz des anionischen Detergenz wird die Eigenladung der
Proteine so effektiv berdeckt, dass anionische Mizellen mit konstanter Nettoladung pro Masseneinheit
entstehen (ca. 1,4 g SDS pro g Protein). Niedermolekulare Thiole wie -Mercaptoethanol (-ME) oder
Dithiothreitol (DTT) im Probenpuffer bewirken eine Reduzierung von Disulfidbrcken in den Polypeptidketten. Hufig schtzt man diese reduzierten SH-Gruppen noch durch eine darauffolgende Alkylierung
mit Iodacetamid oder Iodessigsure.
Diese Elektrophorese eignet sich zur Ermittlung der molekularen Masse von Proteinen, da sich bei der
Trennung im restriktiven Polyacrylamidgel eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts und der relativen Wanderungsstrecke einer SDS-Polypeptid-Mizelle ergibt.
Mithilfe von Markerproteinen lassen sich ber eine Eichkurve die Molekulargewichte der Proteine
ermitteln. Bei der berprfung der Proteine auf Einheitlichkeit muss beachtet werden, dass Oligomere
durch die Denaturierungsbedingungen in ihre konstituierenden Polypeptidketten getrennt werden. Da
diese Polypeptidketten unterschiedliche molekulare Massen aufweisen knnen, sind Verunreinigungen
der Proteine in solchen Fllen nur vorgetuscht.
Im diskontinuierlichen System passiert die Probe zunchst ein Sammelgel mit groer PolyacrylamidPorenweite. Der Sammelgelpuffer enthlt Chloridionen, deren elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit grer ist als die der Proteinprobe. Der Elektrophoresepuffer hingegen enthlt Glycinionen, deren
elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit geringer ist. Die Proteine stapeln sich entsprechend
ihrer Geschwindigkeit im Feldstrkegradienten zwischen Ionen mit einer niedrigen (Glycinionen) und
einer hohen Mobilitt (Chloridionen). Dieses Nettoresultat wird als stacking-Effekt bezeichnet. Somit wird
eine Vortrennung und Aufkonzentrierung erreicht, was sich in einer scharfen Proteinbande uert. Das
Trenngel besitzt eine geringere Porenweite, eine hhere Salzkonzentration sowie einen hheren pH-Wert
im Vergleich zum Sammelgel. Beim Einwandern der Proben in das Trenngel tritt eine weitere Verschrfung der Zone ein. Die groen Proteine werden an dieser Gelgrenze zunchst zurckgehalten, sodass die
Glycinionen passieren knnen. Im Puffersystem des Trenngels lst sich dann der Proteinstapel auf und die
Proteine werden aufgrund ihrer molekularen Gre getrennt.
Diverse Hersteller (z.B. Bio-Rad, Invitrogen GmbH) bieten bereits fertige (pre-cast) Minigele zur Vertikal-Gelelektrophorese an. Neben Tris-HCl-Systemen finden Bis-Tris-, Tris-Acetat-, Tris-Glycin- wie auch
Tricine-Puffersysteme eine verstrkte Anwendung. Neben pre-cast Gelsystemen mit einer einheitlichen
Polyacrylamidkonzentration im Trenngel (z.B. 6, 8, 10, 12 und 18 %), stehen z.B. lineare Gradientengele
zur Verfgung, die Bereiche von 38 %, 412 % oder 1020 % Polyacrylamid abdecken. Diese groe
Systemvielfalt ermglicht somit die Wahl eines spezifischen Lsungsansatzes fr das jeweilige Analysepro-

41

2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

blem. Trotz begrenzter Haltbarkeit (einige Wochen bis zu einem Jahr) und vergleichsweise hohen Kosten
(ca. 18 pro Gel) zeigen diese Fertiggele eindeutige Vorteile hinsichtlich Zeitaufwand und Reproduzierbarkeit, insbesondere bei einem hohen Durchsatz an zu analysierenden Proben.
Das folgende Protokoll gilt fr vertikale Plattengele.

Materialien
Fr alle folgenden Protokolle sollte Milli-Q-gereinigtes Wasser (Milli-Q-H2O oder quivalente Qualitt) verwendet werden. 15 ml Trenngel bzw. 5 ml Sammelgel sind ausreichend fr Geldimensionen von
0,75 mm 16 cm 16 cm (Vertikal-Gelelektrophoreseapparatur: Protean II 16 cm, Bio-Rad; SE 400 Vertical Unit oder SE 600 Ruby, GE Healthcare); fr dickere Gele und fr Minigele mssen die Volumina und
die angelegten Stromstrken entsprechend angepasst werden (bei gleicher Spannung fliet bei dickeren
Gelen nach dem Ohmschen Gesetzt weniger Strom V= I R); Minigele (z.B. Mini-Protean II, Bio-Rad; SE
250/260, GE Healthcare) werden vermehrt eingesetzt, da hierbei eine Kombination von Geschwindigkeit
der Trennung und hohem Auflsungsvermgen auftritt; die in Tab. 21 in Klammern angegebenen Mengen sind fr Minigele der Dimension 0,75 mm 7,3 cm 8,3 cm berechnet.
30 % (w/v) Acrylamid: 30 g Acrylamid, 0,8 g N,N-Methylenbisacrylamid (2 crystallized Grade) ad
100 ml H2O
Trenngelpuffer: 1 M Tris-HCl, pH 8,8
Sammelgelpuffer: 1 M Tris-HCl, pH 6,8
10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS): 0,2 g APS ad 2 ml H2O
10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS): 10 g SDS ad 100 ml H2O
TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin)
10 Elektrodenpuffer: 144 g Glycin, 30 g Tris-Base, 10 g SDS ad 1 l H2O; ergibt nach dem Auffllen
mit Wasser pH 8,9
Bromphenolblau: gesttigt, in 0,1 % Ethanol
Isopropanol
optional: Ethanol
3 Probenauftragspuffer: 1,75 ml Sammelgelpuffer, 1,5 ml Glycerin, 5 ml 10 % (w/v) SDS, 0,5 ml
-Mercaptoethanol, 1,25 ml Bromphenolblau
Vertikal-Gelelektrophorese-Apparatur mit Glasplatten, Abstandhaltern sowie Taschenschablonen
Stromgeber
In Tab. 21 ist die Zusammensetzung des Sammelgels sowie von Trenngelen mit unterschiedlicher Acrylamidkonzentration aufgefhrt. Mit diesen Gelen wird ein groer Trennbereich (12200 kDa) abgedeckt;
fr spezielle Auflsungen kann die optimale Gelkonzentration ausgewhlt werden. Anhaltspunkte fr die
Trennbereiche der Gele sind Tab. 22 zu entnehmen.

Tab. 21: Zusammensetzung von Gelen unterschiedlicher Acrylamidkonzentration fr die diskontinuierliche

SDS-Gelelektrophorese. Die in Klammern angegebenen Mengen sind fr Minigele der Dimension 0,75 mm 7,3 cm
8,3 cm berechnet
Gelzusammensetzung

30% Acrylamid [ml]

Trenngelpuffer [ml]
H2O [ml]
10% SDS [l]
10% APS [l]
TEMED [l]

Acrylamidkonzentration
Sammelgel
5%

Trenngel
7,5%

10%

12,5%

15%

0,833 (0,333)
0,625 (0,250)
3,462 (1,385)
50 (20)
25 (10)
5 (2)

3,750 (1,250)
5,625 (1,875)
5,343 (1,781)
150 (50)
120 (40)
12 (4)

5,000 (1,667)
5,625 (1,875)
4,093 (1,364)
150 (50)
120 (40)
12 (4)

6,250 (2,083)
5,625 (1,875)
2,843 (0,948)
150 (50)
120 (40)
12 (4)

7,500 (2,500)
5,625 (1,875)
1,593 (0,531)
150 (50)
120 (40)
12 (4)

42

2 Gelelektrophoresen

Tab. 22: Trennbereiche von Polyacrylamidgelen

fr SDS-denaturierte Proteine
Acrylamidkonzentration [%]

Molekularmasse
[kDa]

5
10
15

60 200
16 70
12 45

Durchfhrung
Herstellung des Polyacrylamidgels
Zwei Glasplatten grndlich reinigen, mit Wasser splen und die dem Gel zugewandten Plattenseiten
mit einem in Ethanol getrnkten, fusselfreien, weichen Tuch (Kimwipe o..) entfetten
gem den Angaben des Herstellers der Elektrophoreseapparatur die Glasplatten mit den 0,75 mmAbstandhaltern zu einem Sandwich zusammenbauen und in die vorgesehene Halterung zum Gieen
des Gels einklemmen
Dichtigkeit der Gelkassette durch Einfllen von Wasser berprfen; anschlieend das Wasser wieder
vollstndig aus der Kammer entfernen (letzte Tropfen lassen sich mithilfe von Filterpapieren entfernen)
Taschenschablone in die Gelkassette einsetzen und auf der vorderen Glasplatte den unteren Rand der
Probentaschen mit einem Filzschreiber markieren, anschlieend die Schablone wieder entfernen
fr das Trenngel Gellsung vorbereiten (Tab. 21); hierfr Acrylamidlsung, Trenngelpuffer sowie
Wasser in einem 25 ml-Erlenmeyerkolben mit Vakuumausgang zusammengeben und unter Rhren
vorsichtig im Wasserstrahlvakuum entgasen; dann SDS, APS sowie TEMED zugeben und die Lsung
vorsichtig mischen
Trenngellsung mit einer Pasteur-Pipette luftblasenfrei in die Gelkassette einfllen, sodass die Hhe
der Lsung zwischen den Glasplatten ca. 12 cm unterhalb der Probentaschenmarkierung liegt
Trenngellsung vorsichtig mit Wasser oder Isopropanol berschichten (ca. 1 cm dick), damit sich eine
flache Grenzflche whrend der Polymerisation ausbilden kann
Trenngellsung bei Raumtemperatur 3060 min polymerisieren lassen; die Grenzschicht zwischen dem
Gel und der berschichteten Lsung muss deutlich sichtbar sein
ber dem Gel stehende Flssigkeit abgieen, mit Wasser aussplen und Flssigkeitsreste mittels Filterpapier entfernen
das fertige Trenngel kann kurzfristig gelagert werden (4 C); hierbei sollte es mit dem im Gel verwendeten Puffer berschichtet werden; das Sammelgel sollte jeweils kurz vor Durchfhrung der Elektrophorese erstellt werden, da ansonsten eine graduelle, durch Diffusion verursachte Vermischung der Puffer
zwischen den beiden Gelen zu beobachten ist; die Auflsung wird beeintrchtigt
Sammelgellsung gem Tab. 21 zubereiten, dabei, wie bereits fr die Trenngellsung beschrieben,
SDS, APS und TEMED erst nach Entgasen zugeben
Sammelgellsung mit einer Pasteur-Pipette bis zum oberen Rand der Gelkassette einfllen und sofort
die Schablone fr die Probentaschen einsetzen; wenn ntig noch Sammelgellsung nachfllen, damit
die Freirume vollstndig ausgefllt werden; beim Gieen des Sammelgels Luftblasenbildung an den
unteren Enden der Probentaschen vermeiden, da diese nach der Polymerisierung kleine, zirkulre Depressionen in den Taschen verursachen und whrend der Trennung Verzerrungen in den Proteinbanden entstehen
Sammelgellsung bei Raumtemperatur 3045 min polymerisieren lassen; eine optische Diskontinuitt
um die Probentaschen herum wird nach erfolgter Polymerisierung deutlich sichtbar.

2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

43

Probenvorbereitung
3 Teile zu analysierende Proteinlsung mit 1 Teil 3 Probenauftragspuffer mischen und sofort 35 min
bei 100 C hitzedenaturieren; die denaturierten Proben knnen bei 20 C aufbewahrt werden
sobald die Proben mit 3 Probenauftragspuffer versetzt wurden, sollte vermieden werden, sie ohne
Hitzedenaturierung bei Raumtemperatur aufzubewahren, da z.B. endogene Proteasen, die in SDSPuffer sehr aktiv sein knnen, schwerwiegende Degradationen hervorrufen knnen
handelt es sich bei den Proben um Lyophilisate, die Sedimente in 50100 l Probenauftragspuffer resuspendieren und 35 min bei 100 C denaturieren
die Proben drfen keine Kaliumionen enthalten, da diese ein unlsliches Salz mit Dodecylsulfat bilden
um eine mglichst groe Auflsung zu erzielen, sollten die Proteinproben vor der Denaturierung bei
0 C gekhlt werden
fr eine komplexe Proteinmischung wird empfohlen, 2550 g Gesamtprotein in weniger als 20 l aufzutragen, wenn sich eine Frbung des Gels mit Coomassie Blau anschliet (Abschn. 2.2.1); von Proben,
die nur ein oder wenige Proteine enthalten, sollten 110 g Gesamtprotein aufgetragen werden; bei
einer anschlieenden Silberfrbung kann je nach Komplexitt der Proben 10100-fach weniger Gesamtprotein (0,015 g in weniger als 20 l) eingesetzt werden (Abschn. 2.2.2)
das maximal aufzutragende Volumen richtet sich nach der Dicke der verwendeten Abstandhalter/
Schablonen, nach der Anzahl der Probentaschen pro Schablone sowie nach der Vollstndigkeit der
ausgebildeten Probentaschen, d.h. wie hoch die Stege zwischen den Taschen auspolymerisiert sind; fr
ein Minigel (Bio-Rad Mini Protean II) kann mit 0,75 mm dicken Abstandhaltern/Schablonen sowie 15
Taschen pro Schablone ca. 14 l Probe pro Tasche aufgetragen werden
hitzedenaturierte Proben vor dem Auftragen auf das Gel 5 min bei 10.000 g zentrifugieren, um unlsliche Bestandteile abzutrennen
als Kontrolle bzw. Molekulargewichtsvergleich sollte pro Gel mindestens in einer Spur eine Standardproteinmischung (z.B. von Bio-Rad Laboratories, Sigma-Aldrich, GE Healthcare, Invitrogen GmbH;
in verschiedenen Molekulargewichtsbereichen erhltlich) aufgetragen werden; Auftragsmenge und
Probenvorbereitung sind den Herstellerangaben zu entnehmen; farbstoffmarkierte Proteinmischungen
(z.B. ECL Plex Fluorescent Rainbow Marker, GE Healthcare) erlauben zum einen eine Laufkontrolle
whrend der Elektrophorese und zum anderen eine einfache Identifizierung der Standardproteine nach
erfolgter Elektrophorese; sie sind besonders empfehlenswert, falls nach erfolgter Elektrophorese die
aufgetrennten Proteine weiterbearbeitet werden und z.B. ein Elektroblot mit anschlieender Immunodetektion (Kap. 10) durchgefhrt werden soll.

Elektrophorese
Schablone aus dem auspolymerisierten Gel vorsichtig entfernen; dabei vermeiden, dass die Stege zwischen den Probentaschen zerstrt werden
Probentaschen sorgfltig mit Elektrodenpuffer splen, um nicht polymerisiertes Acrylamid zu entfernen; es knnte nach Entfernen der Schablone weiter polymerisieren und ungleichmige Probentaschen verursachen
Gelkassette nach Herstellerangaben in die Elektrophoreseapparatur einbauen
beide Elektrodenkammern mit Elektrodenpuffer fllen und Luftblasen in den Probentaschen bzw. am
unteren Rand der Gelkassette mit einer Spritze (mit gebogener Kanle) entfernen
Proben durch den Elektrodenpuffer hindurch mit einer Hamiltonspritze oder mittels Pipetten mit Einmalspitzen auf den Boden der Taschen eintragen; bei Verwendung einer Hamiltonspritze diese sorgfltig zwischen den einzelnen Probenauftragungen mit Elektrodenpuffer, Wasser oder Ethanol splen
in allen Taschen sollten mglichst gleiche Volumina eingetragen werden, um Verzerrungen whrend
der Elektrophorese zu verhindern
nicht bentigte Probentaschen sollten mit gleichem Volumen Probenauftragspuffer beladen werden,
um ein Ausbreiten der Proben benachbarter Spuren zu verhindern
Elektroden mit dem Stromgeber verbinden, Polaritt oben (), unten (+)

44

2 Gelelektrophoresen

Elektrophorese zunchst bei konstantem Strom von 10 mA (gilt fr ein 0,75 mm dickes Gel) durchfhren, bis die Bromphenolblau-Front das Trenngel erreicht hat, anschlieend den Strom auf 15 mA erhhen; die Elektrophorese eines Standard-16cm-Gelsandwiches, 0,75 mm dick, bentigt bei konstantem
Strom von 4 mA ca. 15 h (mit 15 mA 45 h); 0,75 mm dicke Minigele dauern 11,5 h
Elektrophorese beenden, sobald die Bromphenolblau-Front den unteren Gelrand erreicht hat
Gel aus der Kammer entnehmen und die Proteine mit gewnschter Methode, z.B. Coomassie Blau
(Abschn. 2.2.1) oder Silberfrbung (Abschn. 2.2.2) nachweisen oder Gele zum Transfer der Proteine auf
Membranen verwenden (Kap. 10).

Trouble Shooting
Die Proteine wandern nicht oder nur geringfgig in das Trenngel ein: Die gewhlte Acrylamidkonzentration ist zu hoch; Gel mit geringerer Acrylamidkonzentration verwenden.
Das Polypeptid wandert mit oder kurz hinter der Bromphenolblau-Front: Die Acrylamidkonzentration
ist zu gering; bei sehr komplexen Proteinlsungen Gradientengele verwenden (Abschn. 2.1.4).
Die Referenzproteine wandern ins Gel, die Proteine aus den Proben jedoch nicht oder nur geringfgig:
Die Beladung der Proteine mit SDS ist nicht ausreichend. In der Regel rhrt dies von einem zu kleinen
Volumenverhltnis von Probenlsung und Probenauftragspuffer her oder der pH-Wert des Denaturierungsansatzes liegt im sauren Bereich (Bromphenolblau-Farbe beachten).

Literatur
Gallagher, S.R. (1995) in: Coligan, J.E., Dunn, B.M., Ploegh, H.L., Speicher, D.W., Wingfield, P.T. (Hrsg.): OneDimensional SDS Gel Electrophoresis of Proteins. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons,
New York.
Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.
Nature 227, 680685.

2.1.2 Gelelektrophorese in Tris-Tricin-Puffersystemen

Die Trennung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten unter 1015 kDa ist mit dem diskontinuierlichen
Gelsystem nach Laemmli (Abschn. 2.1.1) nicht immer befriedigend. Die Beeintrchtigung der Auflsung
begrndet sich in der gleichen Wanderungsgeschwindigkeit von kleinen Proteinen und SDS.
Das folgende Protokoll nach Schgger und von Jagow (1987) bedient sich zur Auftrennung kleiner
Proteine eines anderen Puffersystems fr die Gelelektrophorese. Bereits fertige Tricin-Gelsysteme werden
von diversen Herstellern angeboten (Bio-Rad, Novex Invitrogen GmbH). Gradientengele kommen zum
Einsatz, falls ein grerer Molekulargewichtsbereich abgedeckt werden muss. Sind jedoch keine Proteine
oberhalb von 100 kDa oder 70 kDa zu analysieren, wird die Tricin-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
mit uniformen Gelen empfohlen. Hinweise auf eine Auswahl von Geltyp und Trennsystem bei entsprechenden Trennproblemen sind in Tab. 23 gegeben, bzw. knnen bei den jeweiligen Herstellern von fertigen Gelsystemen eingesehen werden.

Materialien
Die in Tab. 24 angegebenen Mengen fr 30 ml Trenn- und 12,5 ml Sammelgellsung sind ausreichend
fr zwei Gele mit den Dimensionen von 0,75 mm 16 cm 16 cm (Protean II 16-cm, Bio-Rad; SE
400/600, GE Healthcare).
30 % (w/v) Acrylamid (Abschn. 2.1.1)
Trenn- und Sammelgelpuffer: 3 M Tris-HCl, pH 8,45
10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS): 0,2 g APS ad 2 ml H2O
10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS): 10 g SDS ad 100 ml H2O

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2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin)
Kathodenpuffer: 12,11 g Tris-Base, 17,92 g Tricin, 10 ml 10 % (w/v) SDS ad 1 l H2O, den pH-Wert nicht
einstellen, bei 4 C bis zu 1 Monat lagerfhig
Anodenpuffer: 0,2 M Tris-HCl, pH 8,9
2 Tricin-Probenauftragspuffer: 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,8 g Natriumdodecylsulfat (SDS), 2,4 ml
(3 g) Glycerin, 0,31 g Dithiothreitol (DTT), 2 mg Coomassie Blau G-250 ad 10 ml H2O
Vertikal-Gelelektrophorese-Apparatur mit Glasplatten, Abstandhaltern sowie Taschenschablonen
Stromgeber

Durchfhrung
Herstellung des Polyacrylamidgels
Glasplatten sowie Gelkammer vorbereiten und Polyacrylamidgel herstellen wie in Abschn. 2.1.1 beschrieben; Trenn- und Sammelgellsung nach Tab. 24 zubereiten.

Probenvorbereitung
Zu analysierende Proteinproben 1:1 mit 2 Tricin-Probenauftragspuffer versetzen
vor dem Gelauftrag die Proben 3060 min bei 40 C behandeln; falls Proteaseaktivitt in den Proben
vorhanden ist, wird empfohlen, die Proben 35 min bei 100 C zu denaturieren.

Elektrophorese
Analog Abschn. 2.1.1 verfahren, jedoch die obere Pufferkammer mit Kathodenpuffer fllen, whrend in
der unteren Pufferkammer der Anodenpuffer eingefllt wird.

Tab. 23: Geltyp und Trennsystem

Gesamtbereich [kDa]

Geltyp

Trennsystem

6 bis grer 250

2100
170

816% Gradient
10% einheitlich
16,5%

Laemmli
Schgger
Schgger

Optimaler Bereich [kDa]

50100
2060
550
230
120

8%
13%
10%
16,5%
16,5% (H)

Laemmli
Laemmli
Schgger
Schgger
Schgger

(H): Hohe Konzentration an Quervernetzungsagenz

(Nach: Kellner et al. (1994): Microcharacterization of Proteins, VCH, Weinheim)

Tab. 24: Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel fr die Tris-Tricin-Gelelektrophorese

Stammlsungen

Sammelgel 10%

Trenngel 4%

30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid

Trenn- und Sammelgelpuffer
10% SDS
H2O
Glycerin
10% APS
TEMED

1,62 ml
3,10 ml
0,094 ml
7,656 ml

25 ml
5 ml

9,8 ml
10 ml
0,30 ml
6,73 ml
4 g (3,17 ml)
50 ml
10 ml

46

2 Gelelektrophoresen

Literatur
Gallagher, S.R. (1995) in: Coligan, J.E., Dunn, B.M., Ploegh, H.L., Speicher, D.W., Wingfield, P.T. (Hrsg.): OneDimensional SDS Gel Electrophoresis of Proteins. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons,
New York.
Schgger, H., von Jagow, G. (1987): Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the
Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368379.

2.1.3 Kontinuierliche SDS-Gelelektrophorese

Die kontinuierliche Gelelektrophorese zeichnet sich durch Einfachheit und Schnelligkeit aus, da hier sowohl zur Herstellung des Trenngels wie auch des Elektrophoresepuffers nur ein Puffer verwendet wird.
Im Gegensatz zur diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese werden jedoch eine geringere Auflsung
und Bandenschrfe erzielt.

Materialien
Die in Tab. 25 angegebenen Mengen von 15 ml Trenngellsung sind ausreichend fr ein Gel der Dimensionen 0,75 mm 16 cm 16 cm (Protean II 16 cm, Bio-Rad; SE 400/600, GE Healthcare)
30 % (w/v) Acrylamid (Abschn. 2.1.1)
10 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS): 20 g SDS ad 200 ml H2O
Trenngelpuffer (0,4 M Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,4 % (w/v) SDS): 46,8 g NaH2PO4 H2O, 231,6 g
Na2HPO4 H2O, 120 ml 10 % (w/v) SDS ad 3 l H2O
10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS): 0,2 g APS ad 2 ml H2O
TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin)
Elektrodenpuffer (0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,1 % (w/v) SDS): 500 ml Trenngelpuffer ad 2 l H2O
2 Probenauftragspuffer: 0,5 ml Trenngelpuffer, 2 ml 10 % (w/v) SDS, 0,1 mg Bromphenolblau, 0,31 g
DTT, 2 ml Glycerin, ad 10 ml H2O
Vertikal-Gelelektrophorese-Apparatur mit entsprechenden Glasplatten, Abstandhaltern sowie Taschenschablonen
Stromgeber

Durchfhrung
Herstellung des Polyacrylamidgels
Vorbereitung von Glasplatten und Gelkammer, bzw. Herstellung des Polyacrylamidgels wie in Abschn.
2.1.1, jedoch das Trenngel nach Tab. 25 herstellen; die Trenngellsung bis zur oberen Begrenzung einfllen, die Schablone fr die Probentaschen einsetzen und das Gel 3060 min bei Raumtemperatur polymerisieren lassen.

Probenvorbereitung
Zu analysierende Proben 1:1 mit 2 Probenauftragspuffer versetzen
Proben anschlieend 2 min bei 100 C denaturieren.

Elektrophorese
Wie in Abschn. 2.1.1 beschrieben verfahren; nachdem die Elektrophoresekammern mit Elektrodenpuffer gefllt sind, die Proben in die Taschen eintragen und leere Taschen mit Probenauftragspuffer
fllen
Elektrophorese zunchst bei 15 mA durchfhren bis der Blaumarker in das Gel eingetreten ist, dann
den Stromfluss auf 30 mA hochregeln (0,75 mm 16 cm 16 cm Gele)

http://www.springer.com/978-3-8274-2429-7