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Índice
1.Resumo 4
2.INTRODUÇÃO 4
2.1CARACTERISTICAS DA E.COLI 5
2.2CARACTERISTICAS DOS FAGOS 5
2.3FAGOS COMO ALTERNETIVA AOS ANTIBIÓTICOS 6
2.4 PORQUE É QUE USAMOS ÁGUA DO RIO PELHE? 6
3.O TRABALHO EXPERIMENTAL 7
4.Actividade 1- Preparação do material e dos meios 9
4.1Objectivos 10
4.2Resultados 10
5.Actividade 2-Isolamento e purificação de E. coli de amostras de águas. 11
5.1Objectivos. 12
5.2Método: 12
5.3 Resultados: 13
5.4Interpretação dos resultados 14
5.5 Conclusão. 15
6.Actividade 3- Isolamento e purificação de fagos de E. coli. 16
6.1 Objectivo 17
6.2Método 17
6.3 Resultados 18
6.4Interpretação dos resultados 19
6.5 Conclusão 20
7.Actividade 4“Host Range” do fago isolado 21
7.1 Objectivo 22
7.2Método 22
7.3 Resultados 22
7.4Interpretação dos resultados/Conclusão 24
8. CONCLUSÕES FINAIS 24
9.Anexos 25
9.1 Cuidados a ter durante a elaboração da experiência 25
10.BIBLIOGRAFIA 26
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1.Resumo:
A Echerichia coli é uma bactéria que pode ser encontrada no intestino de animais
homeotérmicos ou de sangue quente. A maioria das estirpes é inofensiva, no entanto,
algumas podem causar graves intoxicações alimentares em humanos.
A actividade experimental, realizada no âmbito do
Projecto Ciência Viva, teve como principal objectivo analisar a
actuação dos fagos patogénicos para Echerichia coli sobre
estirpes diferentes de Echerichia coli e verificar se serão ou
não uma alternativa à utilização de antibióticos.
Foi possível constatar que caso os antibióticos não funcionem, os fagos podem ser
utilizados como “magic bullets” e substituir totalmente os antibióticos se for isolado
fagos específicos para determinadas estirpes Se o EOP for elevado.
2. Introdução
Com esta actividade experimental, no âmbito da disciplina de Biologia 12º e do
Projecto Ciência Viva, pretendeu-se isolar bactérias e fagos presentes em água
recolhida no Rio Pelhe, e, de seguida, promover o contacto entre fagos e diferentes
estirpes de bactérias de modo a saber se são uma alternativa aos antibióticos.
Para cumprir os objectivos propostos pelo Projecto Ciência Viva, realizaram-se
actividades experimentais como:
- Preparação dos meios
- Recolha e selecção de amostras de água do Rio Pelhe
- Verificar se existem bactérias Echerichia coli na amostra de água recolhida e
proceder ao seu isolamento
- Isolamento a partir da amostra, de água recolhida
no rio, os fagos
- Colocação de fagos em contacto com estirpes de
Echerichia coli isoladas a partir da amostra de água do
rio e cedidas pelo Projecto Ciência Viva.
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2.1 CARACTERÍSTICAS DA E.COLI
1
Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: “E quando os antibióticos
não funcionam” (Página 1)
2
Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: “E quando os antibióticos
não funcionam” (Página 2)
4
“São o grupo de “organismos” mais abundante e versátil existente na Terra. Os
evoluíram com as próprias bactérias.”3
fagos co-evoluíram
3
Informação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: “E quando os antibióticos
não funcionam” (Página 2)
4
Informação
rmação extraída do Protocolo fornecido pelo projecto Ciência Viva: “E quando os antibióticos
não funcionam” (Página 19)
5
2.4 POR QUE É QUE SE USOU A ÁGUA DO RIO PELHE?
6
3.O TRABALHO EXPERIMENTAL:
7
único fago. No entanto, na maior parte dos casos, a sua concentração é tão baixa que é
necessário um passo prévio de enriquecimento, de forma a aumentar o seu número.
Neste caso, a maior parte das bactérias na amostra deverá ser removida, sendo
posteriormente incubada durante um ou mais dias, à temperatura ideal para a
bactéria, com nutrientes concentrados e diferentes bactérias hospedeiras. Após a
amplificação, a cultura deverá ser plaqueada com cada uma das estirpes bacterianas
utilizadas como hospedeira.
A Actividade 4 tem como título: “Host Range” e “EOP” dos fagos isolados e o
seu objectivo foi determinar o painel de hospedeiros que cada fago e a sua eficiência
de plaqueamento.
Após seguir as etapas necessárias desta actividade plaqueou-se os tubos, contendo o
"LB Top" com a bactéria e o fago na respectiva placa de petri e depois da incubação a
37 ºC observou-se qual o fago que atingiu o maior número de estirpes bacterianas, e o
que se encontra em maior concentração.
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4. Actividade 1
4.1 Objectivos:
Com esta actividade, pretendeu-se proceder à preparação do material e
dos meios de cultura e reagentes necessários ao desenrolar das
actividades, assim, fez-se a preparação de:
- Soro fisiológico,
-TBX,
- LB Broth,
- LB agar,
-LB-10x,
-LB Top
- Tampão de conservação
9
4.2 Resultados:
Fig.6 Tampão de
conservação
Fig.5 LB-Broth
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5. Actividade 2
5.1 Objectivos:
11
5.2 Método:
Feitas as diluições, o conteúdo dos tubos deve ser pipetado com 0.1mL e colocado
e espalhado em placas com meio TBX, devidamente identificadas( este meio permite
que as colónias de E.coli apresentem uma tonalidade verde, possibilitando a
repicagem). Posteriormente ao plaqueamento as placas, vão a encobar até se verificar
crescimento bacteriano.
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5.3 Resultados:
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5.4 Interpretação dos resultados:
Tal como é possível observar na figura 10 nas placas em meio TBX com água
proveniente do rio Pelhe em diluições até 10-4, detectámos a presença de colónias
amarelas em todas as placas e colónias verdes na placa de diluição 10-4, ou seja,
colónias de E. coli. Com as diluições, vimos que o crescimento bacteriano se deu em
todas as placas tendo proliferado as verdes na diluição 10-1 o que demonstra que a
água continha E. coli, mas à medida que a diluição vai aumentando o número de
colónias diminui, pois a quantidade de bactérias vai diminuindo. Posto isto, vemos a
diluição da amostra como uma forma de purificar a mesma. Na fig.12, observa-se a
primeira repicagem elaborada a partir das colónias de cor verde, feita com o objectivo
de obter colónias de E. coli individualizadas.
5.5 Conclusão
Tal permitiu-nos inferir que, na Fig.13 Rio Pelhe – zona dos Moutados (local de
recolha da amostra ultilizada).
zona do matadouro Moutados, o Rio
Pelhe é vítima de poluição orgânica, constituindo um problema para a saúde pública.
Considera-se uma água própria para consumo quando esta não tem presentes
qualquer estirpe de E.coli, pois apesar de esta não ser patogénica para o Homem
coexiste simultaneamente com bactérias patogénicas, logo a existência de E.coli marca
a presença de bactérias patogénicas, daí a sua presença aconselhável na água para
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consumo ser zero. O objectivo calcular os CFU/mL de cada água, ou seja, o número de
unidades de colónias formadas por mL da amostra não foi cumprido.
São várias as razões para contaminação da água com E.coli, sendo as mais
perigosas e prejudiciais as fontes difusas ou pontuais, isto é, descargas dos sistemas de
tratamento de águas residuais, tanques sépticos, enxurradas ou ainda populações de
animais naturais.
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6. Actividade 3
6.1 Objectivo
Uma amostra pode possuir fagos numa concentração suficiente para ser plaqueada
directamente, ou então, os fagos podem estar em concentrações elevadas, sendo
necessário diluir a amostra antes de plaquear. No entanto, na maior parte dos casos, a
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sua concentração é tão baixa que é necessário um passo prévio de enriquecimento, de
forma a aumentar o seu número. Neste caso, a maior parte das bactérias na amostra
deverá ser removida, sendo posteriormente incubada durante um ou mais dias, à
temperatura ideal para a bactéria, com nutrientes concentrados e diferentes bactérias
hospedeiras. Após a amplificação, será plaqueada com cada uma das estirpes
bacterianas utilizadas como hospedeira.
6.2 Método
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6.3 Resultados
Placa de lise
pequena (P1)
Placa de lise
grande (P2)
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Fig.15 Placas de petri contendo placas de lise pequenas e grandes em meio de LB-A
-6
(diluição de 10 )
Fig.16. Placa de petri em diluição 10-3 , Fig.17 Placa de petri em diluição 10-4 ,
resultante da placa de lise grande (P2) resultante da placa de lise grande (P1)
Oservando as placas de petri em meio LB-A das diferentes diluições (fig 14),
verificámos que estas continham placas de lise de diferentes dimensões, as quais
designámos de grandes (P2) e pequenas (P1). Seleccionámos a placa de diluição 10-6
pelo facto de nesta as placas de lise se encontrarem com uma melhor visibilidade (em
algumas das placas de petri não era possível garantir a existêcia de placas de lise).
Na fig. 16, onde se encontram as placas de lise obtidas a partir da placa de lise
grande seleccionada (P2), observa-se uma grande abundância de placas de lise em
relação à figura 17 onde se encontavam as placas de lise obtidas a partir da placa de
lise pequena seleccionada (P1).
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6.5 Conclusão
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7. Actividade 4
7.1 Objectivos
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7.2 Método
7.3 Resultados
Placas de E.coli isoladas na água do
rio Pelhe mais fagos
Diluições Existência de
placas de lise
10-1 X
10-2
10-3 X
10-4 X
10-5
10-6 X
10-7 X
10-8 X
Fig.19 Placas de E.coli isoladas na água do rio 10-9
-1
Pelhe mais fagos diluição de 10
10-10 X
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Placas de E.coli fornecidas pelo Ciência Viva mais fagos
Diluições Existência de
placas de lise
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Fig.20 Placas de E.coli isoladas na água do rio 10-10
-1
Pelhe mais fagos diluição de 10
Por outro lado, as nossas placas foram contaminadas por outras espécies de
bactérias, que não foram afectadas pelos fagos, apenas as colónias de E.coli o foram.
Isto comprova a especificidade dos fagos
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8. CONCLUSÕES FINAIS
Uma das vantagens do uso de fagos é que estes não “possuem” substâncias
químicas potencialmente perigosas, ao contrário dos antibióticos. No entanto, tal
como estas substâncias, os fagos possuem uma desvantagem: quando usados
massivamente, as bactérias podem aumentar a resistência à contaminação por eles
provocada. O uso de várias estirpes de fagos com Host Range’s diferentes permitem
aos fagos o tratamento de infecções bacterianas múltiplas, quer em seres vivos como
em cursos de água.
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Da aplicação dos fagos isolados a partir da amostra de água do rio Pelhe sobre
estirpe de E.coli B fornecido pelo Projecto Ciência Viva e sobre a estirpe de E.coli
presente no rio Pelhe, podemos concluir, a partir dos dados obtidos na última
actividade, que podemos estar perante estirpes de bactérias diferentes. Isto porque a
eficiência de plaqueamento dos fagos sobre as amostras não foi igual demonstrando
que os fagos têm tendência a apresentar especificidade na sua actuação.
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9. Anexos
Fig. 23- Placas de petri com o conteúdo elaborado durante uma das actividades a serem colocadas na
estufa a incubar a 37ºC
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estufa. As pipetas de vidro devem ser colocadas em recipientes de vidro ou de metal
fechados com papel de alumínio ou agrupados e embalados em pacotes de papel.
Os meios de cultura líquidos devem ser esterilizados em autoclave durante 15 minutos
a 1 atmosfera. Caso não haja acesso a uma autoclave, os meios de cultura podem ser
“esterilizados” por ebulição numa estufa ou num forno a 180 °C durante 2 horas. No
entanto, esta ebulição não irá ter como resultado a esterilidade completa, devendo,
contudo, ser suficiente para as actividades propostas.
BIBLIOGRAFIA
http://www.cienciaviva.pt/rede/oceanos/2desafio/fagos.
pdf
http://pt.wikipedia.org/wiki/Fago
http://pt.wikipedia.org/wiki/Antibi%C3%B3tico
http://olhares.aeiou.pt/rio_pelhe_devesa_2_foto256838
8.html
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