Extraccin de material gentico en Spinacia Oleracea.

MARYNS GUEZ V., MACKARENA HERRERA L., CRISTBAL VERGARA E.

Resumen
La experiencia de laboratorio consisti en extraer el material gentico de las espinacas, es decir, aislar el ADN vegetal.
Para esto, se licuaron hojas de espinaca con agua y sal por unos segundos hasta obtener un licuado homogneo. Este
licuado se traslad a tubos de ensayo para poder comparar el efecto de diferentes enzimas posteriormente, llenando 1/3
del tubo. A cada muestra se le agreg detergente con el fin de aislar los lpidos y protenas del ADN. Luego de esto, se le
agreg una pequea cantidad de enzimas a cada tubo y se agit para integrar. Posteriormente, para poder ver las hebras
del material gentico, fue necesario agregar alcohol a las muestras, con el fin de que el ADN se precipitara en esta capa
de menor densidad.

Introduccin
El ADN, abreviatura de cido desoxirribonuceico, es un cido nucleico que contiene la informacin gentica necesaria
para el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos, ya sean procariontes o eucariontes. Este cido
nucleico se encuentra disperso en el citoplasma celular en organismos procariontes, y en el ncleo celular en
eucariontes. El rol principal de esta molcula es el almacenamiento de informacin a largo plazo, permitiendo la
transmisin hereditaria de informacin a otras generaciones de seres vivos. Se compone por dos cadenas nucleotdicas
complementarias en sus bases nitrogenadas, que van en direccin contraria. Cada nucletido del ADN est compuesto
por una pentosa desoxirribosa, un grupo fosfato y bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina). Ambas
cadenas de nucletidos, llamadas tambin hlices, se unen gracias a puentes de hidrgeno, los que se dan entre
adenina-timina y citosina-guanina. Existen enzimas (biomolculas catalizadoras) capaces de separar estas hlices del
ADN, siendo un ejemplo la bromelina y papana, que rompen las protenas. Si bien ambas son fuertes, no desarman por
completo la cadena, ya que las separa entre ellas pero no deja nucletidos sueltos y dispersos, siendo solamente los
enlaces ms dbiles, como los puentes de hidrgeno, los nicos afectados aparte de las protenas. Esto se debe a que la
funcin de estas enzimas es exclusivamente proteocatalticas.
La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar es necesaria la ruptura de la pared celular y
la membrana plasmtica para as poder acceder al ncleo de la clula. Luego de esto, se debe romper la membrana
nuclear para poder dejar libre al ADN Durante el proceso de lisis las interacciones entre las molculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los cidos nucleicos se liberen[1] . En
esta ltima etapa, es necesario proteger la molcula de ADN de enzimas que puedan degradarlo, y para esto se debe
aislar, precipitndolo. Para el proceso de extraccin del ADN se pueden aprovechar algunas caractersticas de ste,
como su carga negativa y su alta polaridad, ya que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Esto se debe a los grupos fosfato, que tienden a repelerse,
haciendo que el ADN pueda disolverse en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula.
No obstante, al mezclarse con un alcohol, la capa se puede romper si se agita mucho y quedara el ADN expuesto, pero
aislado. Un dato til es que si se diera el caso de que entre las etapas de extraccin, las protenas quedaran libres, se
puede evitar que se unan al ADN al agregar sal a la muestra sobre la que se quiere trabajar.

Materiales y mtodo.
La extraccin del material gentico se hizo en el laboratorio de biologa de la Escuela Tcnico Profesional, utilizando los
instrumentos de laboratorio de ste e ingredientes como las espinacas y enzimas- comprados en supermercado.
Primero se tomaron las medidas de seguridad e higiene necesarias, como el lavado de manos y el uso de guantes y
bata, para luego reunir todo el material necesario para el procedimiento. Se comenz midiendo la cantidad de agua y
espinacas para hacer un batido, en el que se utiliz media taza de espinacas y 200 ml de agua fra. stos se licuaron
junto a una pizca de sal por quince segundos a mxima velocidad. Tras esto, se col la muestra y se midi cunto se
obtuvo en comparacin a las cantidades iniciales. El licuado obtenido se traslad inicialmente a dos tubos de ensayos,
rotulados como A y B, los que fueron llenados a 1/3 de su capacidad, sin embargo, se llenaron dos tubos ms de
manera experimental, los que fueron rotulados como A y B. A los tubos A y B se les agreg 30 ml de detergente
lavalozas lquido, se les tap y dej reposar por diez minutos en la gradilla de soporte, lo mismo se hizo con los tubos

A y B pero con mayor cantidad de lavalozas. Luego de los diez minutos de reposo, se agreg a cada tubo una
pequea cantidad de la solucin enzimtica escogida, en este caso se us ablandador de carne para los tubos A y jugo
de pia para los tubos B. Cuando cada tubo se encontraba con su respectiva enzima, se agitaron despacio para integrar
bien pero sin romper la molcula de ADN. Posterior a esto, se verti alcohol a cada tubo hasta llegar a 2/3 de su
capacidad total, procurando que se formaran dos capas de densidades diferentes. Para esto, fue necesario verter el
alcohol despacio, haciendo que cayera por las paredes del tubo y as no penetrara la capa del licuado. Se dej reposar
unos minutos para que el material gentico se precipitara en el alcohol, luego se observ y se anotaron las conclusiones.
Luego de este procedimiento se quiso observar bajo el microscopio el ADN que se precipit en alcohol, para esto se
utiliz un palito de madera para arrastrar el ADN que se encontraba en la capa de alcohol, se pusieron los filamentos de
material gentico en un portaobjetos y se observaron en el lente 1 del microscopio. Sin embargo, al momento de sacar
las hebras de material gentico que estaban en los tubos, esto no se hizo con mucho cuidado, al igual que al ponerlas
sobre el portaobjetos, lo que pudo haber influido en los resultados de la observacin.

Resultados
Los primeros cambios en el licuado inicial de espinaca se vieron al momento de agregar el detergente lquido a las
muestras, ya que cambiaron su coloracin y se pudo ver que apenas se les adicion el detergente, el licuado inicial
comenzaba a separarse, dejando ver cmo algunas partes de ste nadaban. Las muestras cambiaron la intensidad de
su coloracin de manera proporcional a la cantidad de detergente que se les agregaba, siendo los tubos A y B los
que quedaron con una solucin ms clara que los otros dos tubos que tenan menor cantidad de lavalozas. Adems del
detergente, las enzimas tambin variaron la coloracin de las muestras. Los tubos que contenan ablandador de carne
resultaron ser ms oscuros que los tubos que contenan jugo de pia. La comparacin descrita se puede apreciar
grficamente en la figura 1.

Figura 1. De izquierda a derecha: Tubo A (ablandador de carne), tubo B (jugo de pia), tubo A
(ablandador de carne, mayor cantidad de detergente), tubo B (jugo de pia, mayor cantidad de
detergente).

Al momento de verter el alcohol a los tubos de ensayo, se form una capa sobre la del licuado debido a las diferentes
densidades de ambos lquidos. Luego de dejar reposar las muestras, las hebras del material gentico comenzaron a
precipitarse sobre la capa de alcohol, hacindose visibles en forma de pequeos filamentos de color blanquecino, que al
agruparse luego de un perodo de tiempo, se vean como una sustancia viscosa y blanca. En los tubos A y B la
separacin entre capas se poda ver notoriamente y los filamentos de ADN tambin, en cambio en los tubos A y B se
vea muy turbio, aunque los filamentos de ADN se agruparon mucho ms, como se puede ver en la figura 2.

Figura 2. De izquierda a derecha: Tubo A, tubo B, tubo A, tubo B.

Cuando las muestras se observaron bajo el lente 1 del microscopio, los resultados fueron los mismos para cada uno de
los tubos. Se logr observar el ADN de las espinacas, pero como no se extrajo con mucho cuidado el ADN precipitado,
quiz no se logr ver en su totalidad. Los resultados tienen mnimas variaciones, que corresponden a la forma de colocar
el material gentico sobre el portaobjetos, ya que algunas secciones de ste quedaban ms concentradas que otras,
pero al fin y al cabo los resultados para cada muestra son casi idnticos, lo que se puede apreciar a continuacin.

Figura 3. Compilacin de imgenes de las diferentes muestras. Se obtienen los mismos

resultados en los cuatro casos.

Discusin
En la primera etapa del procedimiento, se debe tener en cuenta que el agua exceda los 60C
porque a partir de esta temperatura, las enzimas se desnaturalizan, y si llegara a los 80C o
ms, la molcula de ADN se desnaturaliza tambin. El agua con una pizca de sal es una mezcla isotnica, lo que permite
que lo que se extraiga de la muestra vegetal sufra o se altere lo menos posible.
Al momento de licuar las espinacas, se rompen sus hojas y las paredes celulares que hay en cada una de las clulas de
sta, rompiendo una de las barreras que nos separan del material gentico en cuestin. El detergente acta separando
los lpidos y protenas que constituyen las membranas que rodean el ncleo celular. Es por esto que se obtuvieron
resultados distintos en las diferentes muestras, pues a algunas se les agreg mayor cantidad de detergente que a otras.
De esto se puede deducir que los componentes del detergente, principalmente la enzima betana, son los que ayudan a

quitar por completo cualquier resto de membrana y de la pared celular, pues su funcin principal es dispersar y por eso
se utiliza habitualmente en la limpieza. Es por esta razn que en algunos tubos aclaraba ms la solucin, mientras que
en otros no se apreciaba muy bien -adems de ser ms lento el proceso en estos casos- debido a la cantidad de grumos
que quedaban flotando. Sin embargo, el color era ms claro mientras mayor fuese la cantidad de detergente, as que se
supuso que la membrana no era lo nico que desapareca con ste, lo que se puede apreciar en la figura 4.

Figura 4. Comparacin de color y nitidez entre las cuatro muestras.

Los catalizadores (enzimas), al igual que el detergente, contribuyen a cortar las protenas de las membranas o a eliminar
las que puedan contaminar al ADN. Una vez que estas membranas se han roto, el ADN es liberado de la clula. En este
caso, las enzimas utilizadas fueron distintas en cada par de tubos: en uno se utiliz ablandador de carne, y en el otro,
jugo de pia. Los resultados no se condicionaron tanto por esto, puesto que las propiedades catalizadoras de las
enzimas son similares, siendo el principal requisito que contengan bromelina, para que as se separe el ADN. Sin
embargo, el par de tubos en los que se utiliz jugo de pia, el tono cambi, adems de que en el tubo de este par que
tena mayor cantidad de detergente (tubo B) la reaccin result ser ms visible que en las dems pero no ms rpida-,
como se ve en la figura 5.

Figura 5. De izquierda a derecha: Tubo A, tubo B, tubo A, tubo B.

Adems, cabe destacar que el alcohol ayud a aislar el ADN, pues recin cuando se agreg la reaccin comenz a
separarse. Entonces podemos decir que el alcohol consigue separar el ADN del filtrado inicial, ya que el ADN tiene ms
afinidad con el alcohol que con el agua. Adems de slo permitirnos ver el ADN, el alcohol lo separa de otros
componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa o filtrado.
En resumen, aunque el detergente quit las barreras que lo contenan, y las enzimas lo dejaron libre y disperso, fue el
alcohol quien consigui agruparlo, ya que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las precipita [2].
Donde se aprecia ms claramente es en el tubo A (figura 6), que tena la cantidad equilibrada de detergente y
ablandador de carne.

Figura 6. Tubo A y gran agrupacin de fibras de ADN.

Conclusin
El ADN contiene la informacin hereditaria correspondiente a la especie y su importancia recae en que es la molcula
encargada de mantener, a travs del cdigo gentico, la informacin gentica necesaria para crear un ser vivo similar a
aquel del que proviene exceptuando los casos de mutaciones gnicas-, manteniendo as la poblacin de una especie.
Como hemos comentado anteriormente, el ADN es el portador de la informacin gentica necesaria para el
funcionamiento y desarrollo del ser vivo, por lo tanto es el elemento ms indispensable para que un ser vivo exista. Poder
reconocer esta molcula sirve en muchos mbitos, siendo un ejemplo de esto, identificar enfermedades hereditarias.
A partir de los resultados obtenidos en la experiencia de laboratorio, se puede concluir que el objetivo principal planteado
se logr satisfactoriamente. La extraccin del material gentico o ADN resulta exitosa si se sigue correctamente la
estructura que se indic en un comienzo, ya que se trata de una molcula sumamente frgil y cada una de esas etapas
tiene un fin en particular y si se pasara por alto alguna de stas, probablemente lo que observaramos bajo el
microscopio sera material proteico/membranoso.
Durante la experiencia se pudo comprobar la utilidad de cada uno de los materiales utilizados en el procedimiento de
extraccin, pudiendo llegar a un resumen de la funcin de cada elemento y a conocer datos que pudieron haber influido
en los resultados de la experiencia, como por ejemplo la temperatura del agua o la intensidad de agitacin de las
muestras. Adems de esto, se concluye que las cantidades de agente dispersador (detergente) y enzimas no influyen
mucho en el resultado final, que es la observacin del ADN bajo el microscopio, pero s influye el trato que se le d a la
muestra antes de observarla.

Literatura citada
[1] Alejos Velzquez, L.P, Aragn Martnez, M.C., Cornejo Romero, A. Herramientas moleculares aplicadas en ecologa:
Extraccin y purificacin de ADN.10.
[2]http://biologocalentano.blogspot.cl/2012/03/practica-de-extraccion-y-separacion-de.html.-Herrera Jurez, M. Extraccin
y separacin de ADN.