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Cuenca, 2005
TESIS DOCTORAL
Ciudad Real, 2001
CERTIFICA:
V B
En este momento, en el que est por concluir este trabajo de investigacin, quiero
dar las gracias a todos aquellos que me han ayudado a llegar a este momento.
Al Dr. D. Juan Jos Berzas Nevado por depositar su confianza en m para formar
parte de su equipo investigador y por darme apoyo de una manera decidida y constante
durante todo este perodo.
Al Dr. D. Gregorio Castaeda Pealvo por haberse dedicado con una paciencia y
una entrega encomiables a mi formacin en el mbito cientfico y por haberme ofrecido su
amistad sincera desde el primer momento.
A mi familia y a Mari Luz, que siempre han estado muy prximos a m y han hecho
suyos mis anhelos, ilusiones y contrariedades, brindndome su calor y ayudndome a
superar los momentos ms difciles.
A mis amigos, Agustn, Justo y ngel, con quienes he vivido unos aos plagados de
gratsimas experiencias que, por supuesto, siempre quedarn entre nosotros cuatro.
A mis compaeros del rea de Qumica Analtica por haberme ofrecido un
compaerismo y afecto que tanto he disfrutado, y tambin a mis compaeros de la
Facultad de Ciencias del Medio Ambiente, con quienes tantas veces he arreglado el mundo
mientras tombamos una taza de caf.
A todos aquellos que, de alguna u otra manera, han contribuido a que esta tesis
llegara a buen puerto.
A todos ellos, muchas gracias.
OBJETO DE LA TESIS
Introduccin
NH2
H2N
N N
SO2
NH2
H2N
NH2
NH2
SO2
NH2
NH2
Prontosil Rubrum
Sulfanilamida
Figura 1. Reduccin del Prontosil Rubrum
Introduccin
leprostticos
bencenodisulfonamidas,
(sulfonas),
tiacidas),
diurticos
hipoglucemiantes
(sulfonamidas
heterocclicas,
(sulfonilureas),
antimalricos
O
H2N
NH2
Introduccin
Introduccin
OCH3
H2N
NH2
OCH3
OCH3
Trimetoprim
NH2
N
NH2
Cl
Pirimetamina
Introduccin
efecto bacteriano sinrgico debido a que, como las sulfonamidas, bloquean la misma ruta
metablica. La combinacin de la sulfamida con estos potenciadores produce, as, una
respuesta supra aditiva; es ms eficaz contra un gran nmero de microorganismos y es
menos probable que permita la formacin de resistencia bacteriana. El trimetoprim se
suele asociar, en proporcin 1:5 (TMP:sulfamida), con sulfametoxazol, sulfadoxina y
sulfadiacina, mientras que la pirimetamina se suele asociar con sulfaquinoxalina (SQX) en
proporciones 1:3 (PMT:SQX).
Conviene destacar las sulfamidas de accin general que, cuando se administran por
la boca, se absorben por el intestino, pasan a la circulacin y se reparten por todos los
tejidos y lquidos del organismo. Asimismo, pueden franquear ciertas placentas. Pero,
segn la naturaleza de la sulfamida, se observa que algunas se concentran ms
particularmente en la bilis y la orina. En la sangre, la sulfamida se combina con las
protenas del plasma, pero esta combinacin es lbil y la sulfamida activa se libera
progresivamente.
Estas sulfamidas se eliminan por la orina, en su mayor parte, libres o combinadas.
La eliminacin es, por lo tanto, menos rpida cuando el porcentaje de la asociacin de tipo
sulfamida-protena es ms elevado en la sangre.
Las sulfamidas pasan en parte a la orina en forma de derivados acetilados (la
acetilacin tiene lugar en el hgado), los cuales son inactivos y, adems, sobre todo para
ciertas sulfamidas, cristalizan dentro de los canales urinarios, provocando as grandes
problemas. Se puede contrarrestar este inconveniente bebiendo abundante agua y
administrando al mismo tiempo que la sulfamida, la vitamina PP (amida o cido
nicotnico) o tambin administrando mezclas de tres o cuatro sulfamidas. As, la
solubilidad respectiva de cada derivado acetilado no cambia mientras que las actividades
10
Introduccin
de los productos se suman, con lo cual, para un efecto global idntico, se disminuyen los
riesgos de bloqueo renal.
CLASIFICACIN DE SULFAMIDAS
sulfafurazol,
trisulfapiridinas.
sulfameracina,
sulfametizol,
sulfametoxazol
las
lentamente. Su vida media es de 35 a 40 horas, debido a lo cual deben usarse con sumo
cuidado pues pueden alcanzar una concentracin peligrosa en la sangre. Las ms utilizadas
son:
sulfadimetoxina,
sulfadoxina,
sulfaleno,
sulfameter,
sulfametoxidiacina,
Introduccin
11
3
(4)
RHN
O
1
(1)
R'
12
Introduccin
Siglas
Sulfacetamida
SCM
Sulfapiridina
Sulfadiacina
SPR
SDC
Sulfameracina
Sulfametacina
(sulfadimidina)
Sulfacloropiridacina
Sulfametizol
SMR
SMT
SCP
SMTZ
Sulfametoxazol
Sulfaetidol
SMX
SED
Sulfisoxazol
(diolamina)
SSX
Sulfametoxipiridacina
SMP
Sulfaleno
Sulfameter
Sulfadoxina
SFL
SME
SDX
Sulfadimetoxina
Sulfamonometoxina
Sulfaclomida
Sulfacitina
SDM
SMM
SCL
SCT
Sulfasimacina
Acetilsulfisoxazol
SSM
Sulfasalacina
(Salazosulfapiridina)
Ftalilsulfacetamida
Ftalilsulfatiazol
Succinilsulfatiazol
Mafenida
SSC
MAF
Tabla 1. Sulfamidas
Nombre
registrado
Nombre qumico
Cetamide
Sulamyd
Dagenan
Coco-Diazine
Microsulfon
Pyrimal
N-sulfanilacetamida
Sonilyn
Thiosulfil
Ultrasul
Gantanol
Sul-Spansion
Sul-Spantab
Gantrisin
SK-Soxazol
Sodizole
Sosol
Soxomide
Sulfisocon
Kynex
Midicel
Kelficinz
Sulfa
Fanasil
Fanasulf
Madribon
N1-(6-cloro-3-piridacinil)-sulfanilamida
N1-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
Renoquid
Gantrisin
Acetyl
Azulfidina
Sulfatalidina
Sulfasuxidina
Sulfamylon
N1-2-piridilsulfanilamida
N1-2-pirimidinilsulfanilamida
N1-(4-metil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(5-metil-3-isoxazolil)-sulfanilamida
N1-(5-etil-1,3,4- tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
N1-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-sulfanilamida,
2,2-imino-bis(etanol)
con
N1-(6-metoxi-3-piridacinil)-sulfanilamida
N1-(3-metoxi-2-piracinil)-sulfanilamida
N1-(5-metoxi-2-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(5,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(2,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(6-metoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(5-cloro-2,6-dimetil-4-pirimidinil)-sulfanilamida
N1-(1-etil-1,2-dihidro-2-oxo-4-pirimidinil)sulfanilamida
N1-(4,6-dietil-s-triacin-2-il)-sulfanilamida
N-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-N-sulfanilacetamida
cido 5-[p-(2-piridilsulfamoil)-fenilazo]-saliclico
N1-acetil-N4-ftalilsulfanilamida
cido 4-(2-tiazolilsulfamoil)-ftalanlico
cido 4-(2-tiazolilsulfamoil)-succinanlico
-amino-p-toluensulfonamida
Introduccin
13
ANLISIS DE SULFAMIDAS
14
Introduccin
Introduccin
15
mezcla ternaria formada por SQX-SMT-PMT (24). En todos los casos citados se
resolvieron las diferentes mezclas de sulfamidas y potenciadores utilizando los tres
mtodos. Se obtuvieron mejores resultados en trminos de reproducibilidad y
recuperaciones cuando se utilizaron espectros cocientes que cuando se realizaron las
determinaciones por espectrofotometra derivada con medida en el punto de corte.
En bibliografa se recogen numerosos trabajos de HPLC en los que se lleva a cabo
la separacin e identificacin de varias sulfamidas a la vez, en presencia o no de sus
productos de degradacin, partiendo de distintos tipos de matrices como son: mezclas
sintticas, productos farmacuticos, fluidos biolgicos, carnes, pescados etc.
R. Cross (25) y J. Wieling y col. (26) han propuesto mtodos para la separacin y
determinacin conjunta de un gran nmero de sulfamidas en muestras sintticas. El
primero de ellos consigue separar e identificar una mezcla de 22 sulfamidas utilizando una
columna C18 y deteccin a 270 nm, mientras que el segundo consigue separar e identificar
doce sulfamidas utilizando HPLC de fase reversa con una columna C18.
M. De Smet y col. (27), A.R. Long y col. (28) y F.M. El Anwar y col. (29),
propusieron diferentes mtodos para la separacin y determinacin de 4, 7 y 3 sulfamidas,
respectivamente, en productos de uso farmacutico y veterinario, usando en todos los casos
deteccin UV.
16
Introduccin
facilit que estas tcnicas se abriesen camino rpidamente dentro de los mtodos de
separacin.
Como inconveniente, hay que decir que las separaciones por electroforesis
capilar son menos sensibles que las de HPLC, debido a que los capilares tienen un paso
ptico muy reducido (entre 50 y 75 m de dimetro interno), por lo que es necesario
modificarlos. Los capilares de burbuja y las clulas de flujo son los ejemplos ms
comunes.
Tambin, en la actualidad se vienen desarrollando nuevas tcnicas
electroforticas, como es la de amplificacin de campo, que utiliza capilares
convencionales en las separaciones. En esta modalidad se practica una inyeccin de
larga duracin y una posterior concentracin de la muestra dentro del mismo capilar
antes de efectuar la separacin.
El uso de la electroforesis capilar en zona (CZE) para la separacin de
sulfamidas y/o sus potenciadores ha sido extenso desde la implantacin de esta tcnica a
nivel mundial. En lo que concierne a los sistemas de deteccin, la bibliografa recoge
una amplsima mayora de trabajos donde se utiliza la espectrofotometra ultravioletavisible con una gran variedad de finalidades, desde la investigacin bsica, es decir, el
estudio de la naturaleza de la separacin electrofortica y los factores que le afectan,
hasta la determinacin de estos compuestos en productos farmacuticos y en medio
biolgico.
Los primeros trabajos en separacin de sulfamidas y compuestos asociados por
CZE datan de 1993. Ricci y Cross (30) compararon en trminos operacionales la nueva
tcnica con la celebrrima HPLC. Este trabajo, aunque meramente descriptivo, aporta
como ejemplo la separacin de un grupo de sulfamidas y sus compuestos asociados por
las dos tcnicas. La separacin electrofortica result ser claramente mejor que la
Introduccin
17
magnitud
del
flujo
electrosmtico.
Esta
limitacin
fue
comprobada
18
Introduccin
es bajo, una situacin que lleva a tiempos de anlisis largos, o bien a que la ionizacin
no es suficiente para la separacin entre las sulfamidas y las molculas neutras. Las
limitaciones que se manifiestan a pH altos se deben, bien a que el flujo electroosmtico
es muy elevado y, por lo tanto, no hay suficiente tiempo para la separacin, o bien a que
los grados de ionizacin de los diferentes analitos son muy similares, lo que hace que se
pierda selectividad por razn de la carga.
En 1994, Yao y Li (33) se fijaron como objetivo evaluar y comparar tres
mtodos para determinar coeficientes de difusin por CZE, utilizando como modelo una
mezcla de cinco sulfamidas. La conveniencia de utilizar uno cualquiera de los tres
mtodos frente a los otros dos se evalu en funcin de la precisin, expresada en
trminos de desviacin estndar relativa y de la sencillez del procedimiento
experimental.
Un ao ms tarde, Jing y Cross (34) establecieron la correlacin entre la
movilidad electrofortica y la relacin cargaradio inico (Z/r), utilizando una mezcla
de 8 DHFRI, entre los cuales se encontraban PMT y TMP. La separacin se realiz
aplicando un voltaje de 13 kV y utilizando tampn fosfato de concentracin 250 mM
ajustado a pH 2.1. As demostraron la naturaleza electrosttica de la separacin
electrofortica. Adems, a partir de los datos obtenidos, calcularon los pKa de los
compuestos en estudio, lo cual es indicativo de la gran influencia que ejerce el pH sobre
la carga de los analitos.
Los mismos autores (35) utilizaron la separacin de nueve sulfamidas para
proponer, terica y empricamente, una ecuacin que relacionaba la movilidad
electrofortica (ef) con la inversa del cuadrado del radio hidrodinmico, cuando,
frecuentemente, la movilidad electrofortica aparece como funcin de la inversa de ste
y no de la inversa de su cuadrado.
Introduccin
19
20
Introduccin
hace que mejore el espacio de separacin. Este efecto es superado progresivamente por
el efecto Joule incrementando las movilidades electroforticas de los analitos que
migran lejos del detector.
En 1999 (39) clasificaron las sulfamidas en tres grupos, segn sus equilibrios de
ionizacin: el grupo cuya ionizacin es como la del cido sulfanlico, el grupo que
forma aniones con doble carga y el resto de las sulfamidas, que siguen la ionizacin de
la manera habitual (figura 5)
Un mtodo basado en diseo de experiencias para la determinacin de
sulfadiacina y pirimetamina, entre otras drogas antimalricas, fue propuesto por Ng y
Toh (40). El planteamiento del esquema, denominado por sus autores overlapping
resolution mapping (ORM), obedeca a que se asuma que las variables qumicas que
influan en la separacin eran tan solo dos: pH y concentracin de bromuro de tetrabutilamonio (TBA), que se utiliza para evitar la adsorcin de los analitos cargados
positivamente por formacin de pares inicos con las cargas negativas de las paredes
del capilar. Las experiencias se llevaron a cabo aplicando un potencial de 15 kV y
utilizando mezcla de tampones fosfato y borato de concentraciones 0.05 M y 0.025 M
respectivamente. As, se prepar un diseo factorial de 9 experiencias conforme con el
esquema citado variando simultneamente el pH y la concentracin de tampn. Estas
experiencias determinaron que las condiciones ptimas para la separacin eran pH 7.50
y 9 mM de TBA. Posteriormente se comprob la validez de la prediccin realizando la
separacin bajo las condiciones seleccionadas como ptimas.
Introduccin
21
a)
H
+
H N H
H
+
H N H
H
N
Ka,1
Ka,2
ROOH
c)
O
R
S
N
N
R
Ka,2
N
H
ROO
-N
Ka,1
O
R
H
+
H N H
N
H
Ka,2
S
O-
ROO
Ka,1
O-
O H
b)
O
R
22
Introduccin
Introduccin
23
pH
10.6
con
cido
3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfnico
de
concentracin 0.06 M. A este pH, estos diurticos son aninicos. El potencial aplicado
fue 25 kV y la temperatura fue de 20 C. Los resultados fueron validados frente a un
mtodo de CG-MS. Este trabajo no se refiere a separacin de sulfamidas como tales,
24
Introduccin
Introduccin
25
26
Introduccin
Introduccin
27
28
Introduccin
Introduccin
29
30
Introduccin
determinado por el pKa y por las constantes de formacin de las asociaciones sulfamidamicela.
Tambin se han utilizado ciclodextrinas en el anlisis de sulfamidas con la
misma finalidad que se utiliza el SDS en MEKC. Las ciclodextrinas (64) son unas
dextrinas obtenidas a partir del almidn mediante la accin de un enzima procedente de
microorganismos
del
gnero
Bacillus.
Estos
enzimas
son
las
Introduccin
31
32
Introduccin
Introduccin
33
matriz, por lo que se indica que se podra aplicar este mtodo para el anlisis de estas
sulfamidas en leche. Sin embargo, no se dan datos cuantitativos al respecto.
34
Introduccin
Introduccin
35
36
Introduccin
Introduccin
37
38
Introduccin
Introduccin
39
Los
N4-acetilderivados
fueron
sintetizados
basndose
en
el
procedimiento descrito por Vree y col. (89). La pureza de los productos se comprob
por espectroscopia infrarroja y resonancia magntica nuclear y tambin por HPLC y
deteccin visible-ultravioleta. En este caso, el pretratamiento de la muestra es ms
sencillo que en los casos anteriores, aunque igualmente necesario. Las muestras de
suero u orina se mezclaban con tampn fosfato 0.2 M de pH 3.0, y se hacan pasar por
una columna Extrelut 1, eluyendo con diclorometano. El extracto se evapor hasta
40
Introduccin
lquida
deteccin
ultravioleta-visible
utilizando
el
mismo
Introduccin
41
Compuestos
TMP y productos de degradacin
SMT
SMT y N-Acetil y aminometabolito
SQX
SQX y N-Acetilmetabolito
SMX
SMX y metabolitos
SMT y N4-acetilmetabolito
Muestra
Orina
Alimentos para animales
Tejidos animales
Alimentos
Plasma y orina
Sangre
Sangre
82
Sulfamidas y N4-Acetilmetabolitos
83
84
85
86
SMX y N-Acetilmetabolito
SMX, SMT y N-Acetilmetabolitos
SSC, SPR e hidroxi y acetil metabolitos
SMM, SDM, SQX, SDC, SMX y
N4-Acetilmetabolitos
SMM, SDM y N4-Acetilmetabolitos
Orina
Suero
Fluidos biolgicos
Tejidos de pollo
87
88
90
91
Sulfamidas y N4-Acetilmetabolitos
STZ, SDC, SMR, SMT y
N4-Acetilmetabolitos
TMP, SMX y Acetil-SMX
Columna
RP-18
C18
C18
C18
C18
C18
C18
RP-18 y
RP-18
capilar
RP-18 y
Nucleosil
5SA
C18
RP C18
C18
C18
Deteccin
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
UV-Vis
Amperom.
UV-Vis y
Masas
42
Introduccin
Introduccin
43
esta
tcnica,
Matusik
col.
(96)
determinaron
44
Introduccin
Introduccin
45
Chromarods S II como fase estacionaria y deteccin por ionizacin en llama. Las fases
mviles utilizadas fueron cido actico al 1%-metanol (4:1) para la separacin de
trimetoprim y sulfametoxazol y diclorometano-metanol-amonaco (80:19:1) para la
separacin de sulfametoxazol y 3,4,5-trimetoxibenzaldehdo. Se dan los valores de RF.
Por otra parte, Cho y Gemperline (98) utilizaron un mtodo de reconocimiento
por espectroscopia en el infrarrojo cercano, que aplicaron a sulfametoxazol y a mezclas
de ste con sus principales productos de degradacin.
Moore y Brouwer (99) monitorizaron por HPLC la estabilidad de
sulfametoxazol y trimetoprim en suero analizando la influencia de la temperatura en un
amplio intervalo, de 20 a 37 C.
Bergh y Breytenbach centraron su estudio en la degradacin de trimetoprim
(100). As, idearon un mtodo por HPLC y deteccin ultravioleta-visible para la
separacin de ste y cinco de sus principales productos de degradacin en tabletas, con
el fin de monitorizar la estabilidad del trimetoprim. La degradacin del trimetoprim se
consigui calentando la materia prima a reflujo en medio cido o exponiendo
suspensiones de trimetoprim en varias disoluciones reguladoras a la luz directa del sol.
Estas tabletas se disolvieron en etanol al 95 %, se filtr la disolucin y se diluy. La
disolucin resultante se inyect en el sistema cromatogrfico. Se utiliz como fase
mvil una mezcla de agua-tetrahidrofurano-propanol-metanol-acetonitrilo-cido actico
(31:25:20:15:5:1) y la deteccin se realiz a 271 nm. Con este procedimiento se separ
el TMP de cinco de sus principales productos de degradacin, sin que otros compuestos
habitualmente
presentes
en
estas
tabletas
interfirieran,
como
por
ejemplo
46
Introduccin
Introduccin
47
48
Introduccin
fase
mvil
estaba
compuesta
por
isooctano:diclorometano:2-
Introduccin
49
por hidrlisis en medio cido. Segn se indica, esto se conseguira incrementando las
proporciones de 2-propanol y de acetonitrilo de la fase mvil en un 50 %, por ejemplo,
un incremento desde 5 partes hasta 7.5 u 8 partes de cada uno. Bajo estas condiciones,
el tiempo de retencin de la sulfanilamida es de 20 minutos, aunque con ligera prdida
de resolucin para la separacin del compuesto principal y del estndar interno.
En el trabajo de Li (105) se propone un mtodo para la determinacin de
sulfametoxazol, sulfadiacina y trimetoprim por HPLC en fase inversa, utilizando
sulfanilamida como patrn interno. El mtodo se aplic en preparados farmacuticos de
amplio uso. Se utiliz una fase mvil compuesta por tampn fosfato de pH 7 y
concentracin 50 mM y metanol en proporcin 102:33 (v:v). el caudal de fase mvil era
1 mL/min y la deteccin se realizaba a 240 nm. Las recuperaciones estuvieron en todos
los casos cercanas al 100 %.
Una de las reacciones ms caractersticas de las sulfamidas que, adems, se ha
utilizado para su determinacin es la reaccin de diazotacin y posterior acoplamiento
con el reactivo de Bratton-Marshall, es decir, el dihidrocloruro de N-(1naftil)etilendiamia (NED). Esta reaccin, combinada con deteccin espectrofotomtrica
ha sido uno de los procedimientos ms populares (figura 7)
NH2
N N
NaNO2
NH CH2
CH2
NH2
NED
pH = 1
SO2
SO2
NH
NH
N N
SO2 NH R
50
Introduccin
Introduccin
51
de la cual eluir los analitos de inters de una manera selectiva. Basndose en este
principio, propusieron la primera aplicacin de la metodologa de dispersin en fase
slida de la matriz (MSPD) para la extraccin rpida de un grupo de sulfamidas en
muestras de leche, su posterior separacin por HPLC y su cuantificacin con detector de
barra de diodos en lnea (111). Entre esas sulfamidas se encontraban sulfametoxazol y
sulfanilamida. En este trabajo, las muestras de leche se ponan en contacto con el
material C18 en un simple mortero, donde se agitaba todo hasta su completa
homogeneizacin y se adicionaba sulfameracina como patrn interno. La matriz
resultante se meta en una jeringa y se comprima hasta alcanzar un volumen de 4.5 mL.
Esta columna resultante se lav primero con 8 mL de hexano. Seguidamente, las
sulfamidas se eluyeron con 8 mL de diclorometano. Este extracto se llev a sequedad y
posteriormente se volvi a disolver en metanol:cido fosfrico 17 mM (1:4, v:v). Tras 5
minutos en ultrasonidos, la disolucin se centrifug a 13600 g durante 5 minutos y se
filtr el sobrenadante para su inyeccin en el sistema cromatogrfico. Se utiliz una
columna derivatizada con octadecilsilano y una fase mvil compuesta por cido
fosfrico 17 mM y acetonitrilo en una proporcin 90:10 (v:v). El caudal de fase mvil
cambi de 1 a 2 mL/min a partir de t = 5 min. Los lmites de deteccin estuvieron entre
31.25 y 62.5 ng/mL, segn la sulfamida. Sin embargo, las recuperaciones obtenidas
fueron algo bajas, 73.1 y 89.4 % para sulfanilamida y sulfametoxazol, respectivamente.
52
Introduccin
Introduccin
53
54
Introduccin
Introduccin
55
56
Introduccin
Yao y col. (123) aprovecharon la buena respuesta que dan las sulfamidas en su
forma de sal cuaternaria como especies electroactivas frente a los electrodos de
membrana para la determinacin de algunas de ellas. En lo que concierne al
sulfametoxazol, el lmite de deteccin se estim en 10 M.
Mann y col. (124) emplearon la espectroscopia Raman para la determinacin de
componentes minoritarios en slidos incoloros de alta pureza. Muestras de
sulfametoxazol que contenan cido sulfanlico y sulfanilamida como impurezas se
utilizaron como tests. Los lmites de deteccin encontrados fueron estimados en torno a
1 g/kg.
Por ltimo, en 1992, Nie y col. (125) realizaron la determinacin de
sulfanilamida, sulfacetamida, sulfadiacina y sulfametoxazol mediante un sensor
piezoelctrico. El mtodo se aplic en tabletas y en soluciones oftlmicas, estando los
resultados de acuerdo con los proporcionados por los mtodos de la farmacopea.
Introduccin
57
58
Introduccin
Introduccin
59
60
Introduccin
Introduccin
61
TEORA DE LA ELECTROFORESIS
Debido a que el ion se encuentra en un medio acuoso, que tiene una viscosidad
(), la fuerza de rozamiento (Fr) que se opone a su movimiento depender de una
constante (k), de la viscosidad del medio () y de la velocidad de migracin del ion en
el medio (vi).
Fr = k vi
De acuerdo con la ley de Stokes la constante k puede ser sustituida por 6r para
una partcula esfrica. Para partculas no esfricas y pequeos iones, el valor numrico
es inferior a 6.
Fr = 6ri vi
62
Introduccin
q
E
6r
proporcional
al
campo
elctrico
aplicado.
este
factor
de
Introduccin
63
movilidad efectiva que depende no slo de la viscosidad del medio sino tambin de las
interacciones inicas que ocurren en disolucin.
Como consecuencia, la movilidad efectiva ser siempre inferior a la movilidad
absoluta calculada anteriormente.
Para determinar la movilidad electrofortica es necesario conocer el tiempo que
tarda la molcula desde que es introducida en el capilar hasta su llegada al detector. A
este tiempo se le llama tiempo de migracin y depende directamente de la longitud del
capilar e inversamente de la movilidad electrofortica y del campo elctrico aplicado.
Si slo se considerase la movilidad electrofortica, no se explicara
completamente el comportamiento migratorio dentro del capilar, ya que dicho
comportamiento depende tambin del flujo electroosmtico (143-145).
64
Introduccin
compensar el defecto de cargas. Se forma as, segn el modelo de Stern, una doble capa
rgida de iones adsorbidos y a la que se superpone una doble capa difusa de iones.
Este sistema de doble capa origina un potencial elctrico en la interfase entre la
pared y la disolucin de electrolito. El potencial de la doble capa rgida decrece
linealmente con la distancia, mientras que el potencial de la doble capa difusa, conocido
como potencial zeta, lo hace exponencialmente.
Cuando se aplica una diferencia de potencial a lo largo del capilar, los cationes
que forman parte de la doble capa difusa son atrados hacia el ctodo y como stos estn
solvatados, arrastran en su movimiento al resto de la disolucin que hay en el capilar
hacia el ctodo. Si bien el punto exacto de la ionizacin de la slice fundida es difcil de
determinar, se ha observado que el flujo electroosmtico comienza a tener un valor
significativo a partir de pH 4.
E; v FEO = FEO E
4
: potencial zeta
: viscosidad de la disolucin
Introduccin
65
a) Perfil plano
b) Perfil laminar
66
Introduccin
Una vez estudiados los principios tericos de la electroforesis, as como los del
FEO y los factores de que depende, vamos a suponer un sistema constituido por dos
electrodos y un capilar de slice fundida relleno de electrolito de pH bsico (9.2) y en el
cual se ha introducido, en el extremo en contacto con el nodo, una muestra constituida
por cationes, aniones y especies neutras.
Si se aplica una diferencia de potencial entre nodo y ctodo, los iones migrarn
a lo largo del capilar con una determinada velocidad electrofortica que depender de la
relacin q/r de cada ion, obtenindose finalmente un electroferograma como el que se
muestra en la figura 10.
Introduccin
67
FEO
Se
a
Tiempo de migracin
Figura 10. Electroferograma tipo para una disolucin que contiene aniones,
cationes y especies neutras
Los aniones de menor tamao tienen mayor velocidad electrofortica que los de
mayor tamao, por eso oponen mayor resistencia al FEO y tardan ms tiempo en eluir.
Los compuestos neutros avanzan todos juntos a igual velocidad electrofortica que es la
velocidad del FEO. Los cationes se ven impulsados por el FEO y como los ms
pequeos son los que tienen mayor velocidad electrofortica sern los primeros en salir
y los mayores los ltimos en salir. As, el tiempo necesario para ser eluido un ion viene
determinado por su movilidad y por la del FEO.
La movilidad aparente de un ion se define como
A = i + FEO
y puede ser obtenida a partir de su tiempo de migracin y otros parmetros
experimentales.
A =
VA
l
lL
=
=
E t m E t mV
V: voltaje aplicado
68
Introduccin
i = A FEO
Tambin se puede poner en funcin de los tiempos de migracin como:
1
1 L
li =
t m t mm V
El tampn de separacin
Introduccin
69
corriente que atraviesa el capilar y, por lo tanto, en el calor generado por efecto Joule.
Por ello hay que seleccionar tampones cuyos iones presenten baja conductividad, como
Tris, borato, histidina, cido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfnico (CAPS), cuyos
iones son voluminosos y como consecuencia pueden ser usados en altas concentraciones
sin generar corrientes demasiado altas aunque presentan la desventaja de que estos
tampones suelen presentar fuerte absorcin en el UV.
Para aumentar la selectividad del sistema, se puede aadir al tampn una serie de
aditivos tales como disolventes orgnicos, que aadidos al electrolito alteran la
polaridad y la viscosidad de la fase mvil. Como consecuencia, se modifica la
movilidad electroosmtica de los iones y la movilidad del FEO. La adicin al tampn de
surfactantes, selectores quirales o agentes formadores de complejos puede alterar
tambin la selectividad y el tiempo de anlisis.
tm =
lL
( l + FEO )V
70
Introduccin
t
l ( e + FEO )V
N = 5.54 m ; N =
2 DL
w1 / 2
t m 2 t mFEO
t m1 t mFEO
Nos indica lo bien separados que estn dos compuestos. Se puede calcular a partir del
electroferograma usando la ecuacin:
R=
2(t m 2 t m1 )
w1 + w2
V
R = 0.177
D + EOF
2 l
L
Introduccin
71
De esta ecuacin podemos deducir que la resolucin aumenta con el voltaje pero
no aumenta tanto como lo hace la eficiencia que es directamente proporcional al voltaje.
As, hemos de usar voltajes lo ms altos posibles para llevar a cabo la separacin ya que
produce separaciones ms rpidas, con altas eficiencias.
En cuanto a la movilidad del FEO, hemos de destacar que altas movilidades que
antes producan altas eficiencias, ahora producen bajas resoluciones. La mayor
resolucin se obtendr cuando la movilidad del FEO sea igual y en sentido contrario a la
movilidad electrofortica media de los iones pero si tenemos en cuenta el tm (medio):
t m (medio) =
lL
+ FEO
Si
= FEO
entonces el tm tendera a infinito, lo cual no es prctico. Por lo tanto, se debe mantener
un FEO que d tiempos de anlisis lo ms pequeos posible siempre que exista una
resolucin entre los picos.
La resolucin depende tambin de las movilidades electroforticas de los
analitos y ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre ellas. Esta diferencia se
puede aumentar al optimizar el pH del electrolito de separacin o bien mediante la
adicin de modificadores orgnicos al electrolito de separacin, lo cual puede causar
diferencias en las movilidades y, por lo tanto, aumentar la resolucin y la selectividad
del sistema.
72
Introduccin
2t = 2D + 2A + 2J + 2E + 2I + 2W + O2
D: difusin
I: inyeccin
A: adsorcin
J: efecto Joule
O: otros.
E: electrodispersin
Introduccin
73
obtener picos asimtricos, o bien, puede ser que exista una total adsorcin del analito en
las paredes, en cuyo caso no se obtendran picos.
Efecto Joule. Cuando una corriente pasa a lo largo del capilar, parte de la energa
elctrica es convertida en calor. Como consecuencia de este calor, aumenta la
temperatura dentro del capilar, crendose un gradiente de temperatura desde el centro
hacia la pared del capilar y que es eliminada a travs de las paredes de ste.
Matemticamente, puede ser descrito por la siguiente ecuacin:
Qr12
TT =
2
1 r2
ln
K 1 r1
1 r3 1 1
+
ln +
K 2 r2 r3 h
74
Introduccin
Introduccin
75
ASPECTOS
INSTRUMENTALES
OPERACIONALES
DE
LA
ELECTROFORESIS CAPILAR.
Inyeccin de la muestra
76
Introduccin
vaco sobre el extremo final del capilar, o bien, por gravedad elevando el vial que
contiene la muestra unos centmetros por encima del vial de salida.
Introduccin
77
78
Introduccin
Capilar
Introduccin
79
Sistemas de deteccin
80
Introduccin
LOD* (M)
Ventajas e inconvenientes
Absorcin UV-Vis
10-5 10-8
Fluorescencia
10-7 10-9
-Universal
-La batera de diodos en lnea ofrece
informacin espectral
-Sensibilidad
-Requiere, en general, derivatizacin
10-14 10-16
Amperometra
10-10 10-11
Conductividad
10-7 10-8
Espectrometra de masas
10-8 10-9
Mtodos indirectos
10 100 veces
-Muy sensible
-Caro
-Requiere, en general, derivatizacin
-Sensible
-Selectivo, pero suele usarse con analitos
electroactivos
-Requiere modificaciones electrnicas y en
el capilar
-Universal
-Requiere modificaciones electrnicas y en
el capilar
-Alta sensibilidad e informacin estructural
-Acoplamiento EC-MS complicado
-Universal
-Menor sensibilidad que los directos
menos que un
mtodo directo
Radiactividad, ndice de refraccin, dicrosmo circular, Raman...
Otros
* LOD: Lmite de deteccin
Introduccin
81
Isoelectroenfoque (IEF).
82
Introduccin
Introduccin
83
agregacin al nmero de la molculas de ste que constituye una micela y depende del
tipo de surfactante.
84
Introduccin
1 FEO
t mc
N 1 K '2
Rs =
4 1 + K ' 2 t FEO
K '1
1 + t
mc
1/ 2
Introduccin
85
86
Introduccin
Introduccin
87
88
Introduccin
Principios bsicos
Introduccin
89
Retencin cromatogrfica
KD =
90
Introduccin
Sistemas de bombeo
Introduccin
91
Sistema de inyeccin
Columna cromatogrfica
Detector
92
Introduccin
Integrador o procesador
Introduccin
93
PARMETROS CROMATOGRFICOS
tR t 0 t R
=
t0
t0
94
Introduccin
1 / 2 =
tR 2 K 2
=
tR1 K 1
Rs =
tR 2 tR1
(Wb1 + Wb 2) / 2
Donde Wb1 y Wb2 son los anchos de banda de ambos picos. En una separacin
considerada satisfactoria es normalmente aceptado un valor de RS de 1, correspondiente
a una separacin entre picos del orden del 94 % aunque para que exista una resolucin
prcticamente total (resolucin a lnea base), RS debe ser superior a 1.5.
Introduccin
95
Particin
Adsorcin
Cambio inico
Afinidad
96
Introduccin
1. Fase estacionaria
En el tipo de cromatografa utilizado en esta Memoria (particin en fase
reversa), dependiendo de la relacin entre el soporte slido inerte y la fase estacionaria
activa podemos distinguir dos tipos bsicos:
-
Introduccin
97
relacin con el tipo de soluto se fundamenta, por lo tanto, en el hecho de que todas las
molculas orgnicas tienen regiones hidrofbicas ms o menos amplias en su estructura
y son capaces de interaccionar con la fase estacionaria.
La columna que hemos utilizado tiene un tamao de partcula de 3 m de
dimetro, 0.46 cm de dimetro interno y 15 cm de longitud.
2. Fase mvil
La naturaleza de la fase mvil es el factor clave para la discriminacin entre
solutos en HPLC, como ocurre con la temperatura en cromatografa de gases.
Las propiedades bsicas que nos interesan de la fase mvil son la fuerza o
capacidad de desplazamiento de los solutos y su selectividad, basadas en las
interacciones especficas entre el soluto y la fase mvil, ya sea de tipo polar, de
formacin de enlaces de hidrgeno, o mediante equilibrios secundarios provocados al
variar su composicin (cido base, formacin de complejos o pares inicos, adicin de
complejos metal ligando o reactivos quirales para separar ismeros pticos, etc).
En cromatografa de fase invertida, dado que la retencin de los solutos en la
fase estacionaria ocurre fundamentalmente a travs de su zona no polar, la relacin entre
fuerza o capacidad de desplazamiento y polaridad de la fase mvil es inversa. As, el
agua es el eluyente con mnimo poder de elucin y debe mezclarse con disolventes
menos polares para eluir solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria no polar.
En general, la estrategia en las separaciones cromatogrficas consiste, bien en ajustar la
fuerza de la fase mvil a un nivel constante para que la retencin de los solutos en la
fase estacionaria y su tiempo de permanencia en la columna sea el adecuado, o bien en
modificar la composicin de la fase mvil hasta conseguir la selectividad necesaria para
lograr la discriminacin entre solutos requerida.
98
Introduccin
2.
Supresin inica
Para separar compuestos inicos, caracterizados por poseer retenciones muy
bajas, modificar el pH de la fase acuosa mediante un amortiguador podra ser una
solucin para aumentar l retencin del soluto en la fase estacionaria. Ajustando el pH en
la fase mvil de forma que ste inhiba, total o parcialmente, la disociacin de los grupos
cidos o bsicos de estos compuestos podramos aumentar la afinidad de los solutos por
la fase estacionaria.
El valor de pH adecuado depender en gran parte de los valores de pKa de los
grupos ionizables.
Introduccin
99
Supresin de la solubilidad
Otra forma de separar cromatogrficamente compuestos inicos, como se ha
dicho anteriormente, es controlar la solubilidad del soluto en la fase mvil mediante el
conocido efecto salino. Dicho fenmeno consiste en favorecer la extraccin de un
determinado soluto por adicin de sales a la fase acuosa, es decir aumentando la fuerza
inica de la misma. Dicho efecto aplicado a una tcnica como la cromatografa lquidolquido con fases ligadas se basa en que al aumentar la fuerza inica de la fase mvil,
disminuye la solubilidad del soluto en la misma y aumenta en la fase estacionaria, de
forma que conseguimos aumentar la retencin de los compuestos inicos.
100
Introduccin
La seleccin de los mismos depende del tipo de analito. Es preferible que sea
univalente, aprtico, soluble en la fase mvil, que no participe en equilibrios adicionales
y no corrosivo para el sistema cromatogrfico. Los ms empleados son:
a)
ii.
b)
ii.
cido perclrico
iii.
Introduccin
101
x=
xi
i =1
s=
( xi x ) 2
i =1
n 1
102
Introduccin
s
100
x
= xt
s
n
(x )
s
n
Si el valor absoluto de tcal es menor que un cierto valor crtico, que es el valor de
t tabulado para (n 1) grados de libertad y a un nivel de significacin , entonces se
acepta la hiptesis nula, esto es, se concluye que al nivel de significacin escogido y
con ese tamao de muestra, no existen diferencias estadsticamente significativas entre
el valor medio calculado y el valor verdadero, . En el caso de la ordenada en el origen,
Introduccin
103
Mtodos de correlacin
r=
[(xi x )(yi y )]
1/ 2
2
2
xi x y i y
104
Introduccin
variables. Resulta as una matriz cuadrada con igual nmero de filas que de columnas e
igual nmero de variables, donde los elementos de la diagonal son todos 1 mientras que
los elementos de fuera de la diagonal tienen valores entre 1 y +1.
i = 1, 2,..., n
Introduccin
105
ei 2 = [yi (a + bxi )]
b=
(xi x )(yi y )
2
(xi x )
a = y bx
106
Introduccin
xi 2
Sa = S y / x
2
n ( xi x)
Sy/x
Sb =
1/ 2
( xi x ) 2
donde x es la media aritmtica de los valores del eje de abscisas y Sy/x es la estimacin
de la desviacin estndar de los errores de las respuestas o residuos:
1/ 2
Sy/x
( y i y i ) 2
=
n2
Introduccin
107
S b1 2
Sb2 2
Este valor experimental de F se compara con un valor terico (Ft) que es calculado para
un nmero adecuado de grados de libertad (n1-1 y n2-1) para un nivel de confianza dado.
Si F es menor que Ft no hay una diferencia estadsticamente significativa entre las
varianzas estimadas de los residuos de ambas lneas.
El test se realiza calculando una varianza estimada conjunta de las pendientes de
las dos rectas de calibrado, Sb1,22, a travs de la siguiente ecuacin:
S b1, 2
(n 2) S b1 + (n2 2) S b 2
= 1
n1 + n2 4
b1 b2
1
1
S b1, 2 2
+
2
2
(
x
x
)
(
x
x
)
1
i 2 2
i1
1/ 2
108
Introduccin
t=
b1 b2
( S b1 2 + S b 2 2 )1 / 2
siendo b1, b2, Sb12 y Sb22 las pendientes de las respectivas rectas de calibrado y sus
respectivas varianzas. En este ltimo caso, el valor de tcalculado se compara con el valor
terico de t:
t=
t1 S b12 + t 2 S b 2 2
S b1 2 + S b 2 2
donde t1 y t2 son los valores tericos, obtenidos a partir de las tablas para un nivel de
significacin elegido y n1-2 y n2-2 son los grados de libertad respectivos. Si tcalculado es
menor que t no existen diferencias estadsticamente significativas entre las pendientes.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL Y DISOLUCIONES
Material y disoluciones
113
INSTRUMENTACIN UTILIZADA
1. Equipo Beckman P/ACE 5500 con detector de diodos en lnea, controlado por
un ordenador equipado con el programa Beckman P/ACE para el registro y tratamiento
de los datos.
2. Equipo Beckman MDQ con detector de diodos en lnea, controlado por un
ordenador con el programa Beckman MDQ para el registro y tratamiento de los datos.
En estos equipos se utilizan capilares Beckman de slice fundida de 50 cm de
longitud efectiva, cuyos dimetros interno y externo son, respectivamente, 75 y 375 m,
alojados en una carcasa con una ventana de deteccin de 800 100 m.
Equipos de HPLC
114
Material y disoluciones
Medidas de pH
Balanzas
Material y disoluciones
115
DISOLUCIONES UTILIZADAS
Disoluciones de analitos
Compuesto
Procedencia
Disolvente
Concentracin (mg/L)
Sulfametacina sdica
Sigma
H2O
100
Sulfaquinoxalina sdica
Sigma
100
Menadiona
Merck
100
Pirimetamina
Sigma
EtOH
100
Trimetoprim
Sigma
100
Sulfametoxipiridacina
Sigma
HCl 1M + H2O
100
Sulfametoxazol
Sigma
100
Sulfadimetoxina sdica
Sigma
H2O
100
Bromhexina, clorhidrato
Sigma
100
Sulfadiacina sdica
Vorqumica
H2O
100
Guayacol potsico
Sigma
H2O
100
cido trimetoxibenzico
Sigma
150
Sulfanilamida
Sigma
150
cido sulfanlico
Sigma
H2O
150
Trimetoprim-1-xido
Roche
220
Trimetoprim-3-xido
Roche
210
N4-acetil-sulfametoxazol
Roche
210
116
Material y disoluciones
Disoluciones reguladoras
CAPTULO I
DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA
EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS
POR CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR
Captulo I
I.1.
119
INTRODUCCIN
120
Captulo I
CH3
N
H2N
SO2NH
CH3
H2N
SO2NH
N
SMT
SQX
O
N
Cl
CH3
NH2
N
H2N
PMT
O
MEN
La estabilidad de las disoluciones de SQX, SMT y PMT y el efecto del pH sobre sus
espectros de absorcin ha sido ampliamente estudiado en nuestros laboratorios. A modo de
resumen, se comentan a continuacin algunos aspectos en cuanto a estabilidad de las
disoluciones y clculo de pKa por mtodos espectrofotomtricos, ya realizados en nuestros
laboratorios.
Captulo I
121
122
Captulo I
minutos durante aproximadamente dos horas. Se pudo observar que, para el espacio de tiempo
estudiado, los espectros de absorcin permanecan invariables o bien no mostraban cambios
apreciables.
3. Estabilidad de las disoluciones de pirimetamina
Se prepararon disoluciones de concentracin 10-3 M de PMT en etanol-agua al 10, 50 y
96%, a las que se les estudi la estabilidad diariamente haciendo diluciones 1:25 y registrando
posteriormente su espectro de absorcin UV-VIS. Se observ que los espectros obtenidos para
las muestras con 10 y 50 % de etanol mostraban modificaciones apreciables al segundo da,
mientras que la disolucin preparada en 96 % de etanol presentaba espectros que no
mostraban variaciones apreciables al menos durante 18 das.
Se estudi la estabilidad de las disoluciones diluidas de PMT (410-5 M) con un
contenido en etanol del 10 % (v:v) a diferentes valores de pH. Para ellose registraron los
espectros de absorcin de cada una de las muestras cada 15 minutos y se comprob que en
todos los casos, los espectros no presentaron variaciones apreciables durante al menos una
hora.
4. Estudio de la estabilidad de las disoluciones de menadiona
Se prepar una disolucin en etanol al 96 % de MEN (100 mg/L) a la que se le estudi
la estabilidad aprovechando las separaciones electroforticas que se iban efectuando da a da.
Las muestras, que se preparaban por dilucin 1:5 a partir de la disolucin madre, se inyectaban
en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en lnea, se iban
almacenando diariamente los espectros de absorcin UV-VIS correspondientes a MEN. Se
observ que durante un perodo de un mes las disoluciones preparadas a partir de la disolucin
madre de MEN presentaban espectros de absorcin invariables.
Captulo I
123
124
Captulo I
Wilson y Lester
Bibliografa
SQX
6.70
6.68
6.7
SMT
7.56
7.56
7.4
PMT
6.66
6.66
7.0
Captulo I
I.2.
125
PMT
MEN
SMT
SQX
1
11
13
pH
forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
Figura I.2. Esquema de la ionizacin de SMT, SQX, MEN y PMT en funcin del pH
126
Captulo I
Debido a los diferentes valores de pKa de las molculas en estudio (Tabla I.1), no se
pudo encontrar ningn pH al cual todas ellas estuviesen ionizadas, bien como cationes, bien
como aniones (Figura I.2). Las sulfamidas, SQX y SMT, se encuentran en su forma
aninica a los valores de pH superiores a sus pKa. Por el contrario, PMT se encuentra en su
forma neutra por encima de su pKa, ya que ste corresponde a la desprotonacin de los
grupos amino cuaternarios. En cuanto a MEN, se puede afirmar que permanece en su forma
neutra a lo largo de toda la escala de pH, ya que es totalmente insoluble en agua, y que no
presenta en su estructura ningn grupo qumico con caractersticas de tipo cido-base.
Por esta razn se tuvo que acudir al empleo de la tcnica de MEKC para plantear la
separacin, de manera que los analitos ionizados se separasen de acuerdo a su relacin
carga/radio y que los analitos neutros se separasen en funcin de sus constantes de afinidad
con un agente micelar. En el caso que nos ocupa, se seleccion el dodecilsulfato sdico
(SDS) como agente micelar por ser el que se utiliza comnmente en MEKC.
Como se ha comentado anteriormente, se necesita un pH bsico para que las
sulfamidas se desprotonen y adquieran carga negativa. Debido a su pKa1 = 9.2, el tampn
borato proporciona un pH suficientemente bsico para este fin, por lo que fue seleccionado
inicialmente para fijar el pH. As, las separaciones preliminares fueron efectuadas
utilizando tampn borato ajustado a pH 9.2, lo cual asegura que su capacidad reguladora es
mxima. Adems, el borato es un tampn recomendado para EC porque genera baja
corriente.
Captulo I
127
128
Captulo I
Adems, los picos de PMT y MEN aparecan bien separados y sus anchos
disminuan considerablemente. Asimismo, se observ que al aumentar el contenido en
disolvente orgnico, los tiempos de migracin de los analitos aumentaban, tanto en
presencia de metanol como de acetonitrilo. Este comportamiento puede explicarse porque
un aumento del disolvente orgnico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de
separacin, disminuyendo considerablemente la velocidad del flujo electroosmtico, lo que
origina que los tiempos de migracin de los compuestos sean mayores, de manera que
aumentan los tiempos de anlisis. En cuanto a los anchos de pico, la disminucin de las
movilidades de los analitos como consecuencia de la adicin de un disolvente orgnico
conlleva, a su vez, un aumento de la dispersin del analito por difusin, por lo que
aumentan los anchos de pico. Este efecto es ms acusado en presencia de etanol que en
presencia de acetonitrilo.
Teniendo en cuenta tiempos de migracin, anchos de pico y forma de los
electroferogramas se seleccion como ptima una concentracin de acetonitrilo del 6 % en
el electrolito de separacin ya que, trabajando en estas condiciones, se conseguan buenas
resoluciones entre SMT y SQX en un corto tiempo de anlisis.
Captulo I
129
FEO
SMT
SQX
MEN
PMT
12
15
EtOH
3.870
4.284
4.850
6.014
6.198
7.113
MeCN
3.870
4.120
4.409
4.630
4.933
5.249
EtOH
5.434
6.018
6.968
8.455
9.265
10960
MeCN
5.434
5.829
6.319
6.801
7.452
8.202
EtOH
5.480
6.094
7.063
8.562
9.369
11.066
MeCN
5.480
5.896
6.398
6.891
7.552
8.328
EtOH
7.614
8.104
9.155
10.631
11.314
12.777
MeCN
7.614
7.970
8.426
8.698
8.828
8.923
EtOH
9.769
11.139
13.445
>15
>15
>15
MeCN
9.769
11.038
12.453
13.491
13.861
14.117
30
6 % Acetonitrilo
SQX
25
6 % Etanol
SQX
mAu
20
15
SMT
SMT
10
5
0
6.0
6.5
7.0
Tiempo de migracin (min)
7.5
130
Captulo I
Captulo I
131
132
Captulo I
SMT
SQX
MEN
PMT
4.008
5.730
5.730
4.008
4.008
15
4.301
6.158
6.242
6.387
10.367
30
4.496
6.517
6.600
8.750
13.296
40
4.600
6.708
6.796
10.021
14.721
50
4.712
6.933
7.025
11.296
16.246
60
4.676
7.196
7.300
12.821
18.146
70
4.710
7.383
7.496
14.075
19.675
80
4.740
7.463
7.604
15.512
>20
20.00
FEO
SMT
SQX
MEN
PMT
15.00
10.00
5.00
0.00
0.00
20.00
40.00
60.00
Concentracin de SDS (mM)
80.00
Captulo I
133
134
Captulo I
20
30
40
FEO
tm
4.325
4.554
4.821
5.046
SMT
tm
6.050
6.637
7.225
7.767
Ancho
0.030
0.030
0.031
0.055
tm
6.117
6.725
7.333
7.912
Rs
1.123
1.516
1.792
1.282
Ancho
0.029
0.029
0.031
0.034
tm
8.879
9.863
10.946
12.067
Rs
20.877
14.381
9.417
14.682
Ancho
0.037
0.044
0.051
0.059
tm
12.488
14.337
16.667
19.413
Rs
51.093
55.664
58.847
87.060
Ancho
0.042
0.051
0.061
0.078
SQX
MEN
PMT
Captulo I
135
136
Captulo I
Captulo I
137
25
30
35
40
FEO
tm
5.549
4.950
4.517
4.117
3.737
SMT
tm
7.871
6.954
6.275
5.692
5.200
Ancho
0.032
0.029
0.027
0.025
0.023
tm
7.988
7.054
6.363
5.771
5.267
Rs
1.908
1.746
1.690
1.604
1.340
Ancho
0.032
0.029
0.027
0.025
0.024
tm
12.233
10.321
8.921
7.767
6.804
Rs
13.284
15.736
17.055
9.868
3.398
Ancho
0.059
0.051
0.046
0.043
0.040
tm
18.146
15.321
13.225
11.467
10.042
Rs
54.06
15.558
52.100
71.769
72.854
Ancho
0.066
0.055
0.047
0.040
0.033
MEN
PMT
20.00
SQX
FEO
SMT
SQX
MEN
PMT
15.00
10.00
5.00
0.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Temperatura de separacion (C)
40.00
138
Captulo I
Captulo I
139
linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la
figura I.6.
100.00
Corriente (microamperios)
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0
10
20
Voltaje (kV)
30
El criterio de optimizacin del voltaje aplicado fue la resolucin entre SQX y SMT,
siendo a 20 kV (en 0.4 minutos) cuando sta es mxima, segn se indica en la tabla I.6.
En cuanto a la rampa de voltaje, se realizaron separaciones a 20 kV con diferentes
rampas en un intervalo comprendido entre 0.2 y 0.8 minutos. La rampa de voltaje que
proporcion mayor resolucin fue la de 0.4 minutos y por ello fue seleccionada como
ptima (Tabla I.7).
140
Captulo I
10
15
20
25
1.526
1.589
2.920
1.294
0.2
0.4
0.6
0.8
1.484
2.818
1.720
1.639
Captulo I
141
142
Captulo I
Voltaje
Detector
Ventana deteccin
800 100 m
Captulo I
143
30.0
SQX
25.0
MEN
mAu
20.0
15.0
SMT
PMT
10.0
5.0
0.0
-5.0
0.0
2.0
4.0
6.0
Tiempo de migracin (min)
8.0
10.0
30.0
SQX
25.0
mAu
20.0
SMT
15.0
10.0
5.0
0.0
-5.0
5.6
5.8
6.0
Tiempo de migracin (min)
6.2
144
I.3.
Captulo I
ASPECTOS CUANTITATIVOS
Captulo I
145
146
Captulo I
Captulo I
147
lnea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco a lo largo de un intervalo
de tiempo equivalente a diez veces el ancho de pico. As, el LOD se obtuvo como la
concentracin de muestra que produjo un ancho de pico tres veces la fluctuacin de la lnea
base y el LOQ se calcul como la concentracin de muestra que produjo un ancho de pico
diez veces la fluctuacin de la lnea base. As, se obtuvieron lmites de deteccin y
cuantificacin en torno a 300 g/L y 1 mg/L, respectivamente, para cada uno de los
componentes.
148
Captulo I
SQX, MEN y PMT, respectivamente. Para seleccionar esta longitud de onda se utilizaron
los espectros de absorcin UV-Visible obtenidos con el detector de diodos en lnea.
El estudio de la linealidad se realiz inyectando muestras de SMT, SQX, MEN y
PMT disueltas en agua (conteniendo 12 % de etanol) en un rango de concentraciones entre
2 y 80 mg/L con un tiempo de inyeccin constante de 5 segundos
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y rea de pico corregida y tambin que las ordenadas en el origen resultaron
ser despreciables, segn el estadstico t de Student para un nivel de significacin de 0.05.
En la figura I.9 se representan las reas corregidas de los compuestos frente a las
concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mnimos cuadrados se
muestran en la tabla I.9 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y que
las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.
Area corregida
15000
SMT
SQX
MEN
PMT
10000
5000
0
0
15
30
45
60
75
Concentracion (mg/L)
90
Captulo I
149
r2
SMT
0.9998
2 80
SQX
0.9995
2 80
MEN
0.9998
2 80
PMT
0.9997
2 45
150
Captulo I
Serie 2
% DER
% DER
S12/S22
F (0.05)
SMT
1737
19
1.1
2201
12
0.54
2.5
3.717
SQX
8025
30
0.37
7862
22
0.28
1.8
3.717
MEN
10816
88
0.81
10130
56
0.55
2.5
3.717
PMT
17669
95
0.54
16206
88
0.54
1.2
3.717
I.4.
APLICACIONES
Captulo I
151
152
Captulo I
CM1 = AM1/F
F: factor de respuesta; A: rea corregida; P: patrn; C: concentracin; M: muestra
Captulo I
153
Cocichemical
Coccilina
Coccirex
Coccivet
Quinoxipra-P
Encontrado
Recuperacin
SQX
50
28.71 0.31
57.5
PMT
15
8.32 0.20
55.3
SQX
50
29.62 0.84
59.1
PMT
15
0.0
0.0
SQX
39
3.13 0.10
80.3
PMT
1.3
0.913 0.043
68.2
SMT
0.8018 0.0057
0.0
SQX
44
42.01 0.86
95.4
PMT
12
10.20 0.36
85.2
SQX
36
32.32 0.64
89.8
PMT
8.31 0.12
92.1
MEN
50
0.0
0.0
SQX
50
48.71 0.89
97.4
PMT
15
14.20 0.42
94.6
Como puede observarse, en muchos casos las recuperaciones estn muy alejadas de
lo indicado en las etiquetas de los productos comerciales. A continuacin se destacan
algunos aspectos que pueden aclarar el porqu de estas bajas recuperaciones:
1.
154
2.
Captulo I
Captulo I
155
20.00
mAu
MEN
Muestra
Patrn
10.00
0.00
7.00
7.20
7.40
7.60
Tiempo (minutos)
7.80
Figura I.11. Detalle del pico de MEN obtenido en el anlisis cuantitativo de Coccivet.
15.00
Muestra
Patrn
10.00
mAu
PMT
5.00
0.00
9.60
9.80
10.00
10.20
Tiempo (minutos)
10.40
Figura I.12. Detalle del pico de PMT obtenido en el anlisis cuantitativo de Cocichemical
156
Captulo I
20.00
SQX
Muestra
mAu
Patrn
10.00
SMT
0.00
5.60
5.80
6.00
Tiempo (minutos)
6.20
Figura I.13. Detalle de los picos de SMT y SQX obtenidos en el anlisis cuantitativo de
Coccilina
CAPTULO II
DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA Y PIRIMETAMINA
EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS
POR CROMATOGRAFA LQUIDA
Captulo II
II.1.
159
INTRODUCCIN
160
II.2.
Captulo II
Nuestro
grupo
de
investigacin
public
recientemente
un
mtodo
Captulo II
161
162
Captulo II
y SMT (pKa = 7.4) no presentan carga a este pH, por lo que no les afectan estas
interacciones electrostticas.
PMT
SQX
SMT
pH
forma
neutra
forma
aninica
forma
catinica
Captulo II
163
Sentadas estas bases, se tom como fase mvil tampn fosfato de pH 3, conteniendo
ClO4- y acetonitrilo, con un caudal de 1.5 mL/min como condiciones iniciales para la
posterior optimizacin de la separacin de la mezcla Z.
En esta modalidad cromatogrfica la fase mvil est compuesta por una fraccin
acuosa convenientemente tamponada y un disolvente orgnico para establecer el equilibrio
de particin hasta conseguir la resolucin apropiada sin que el tiempo de desarrollo del
cromatograma sea excesivo.
Por tanto, es necesario optimizar el valor de pH, la concentracin de perclorato, la
concentracin de tampn y la proporcin de disolvente orgnico en la misma.
Para optimizar este parmetro, se prepar por dilucin directa de las disoluciones
madre, una disolucin tipo Z que contena un 10 % (v:v) de fase mvil. Se inyectaron
alcuotas en el sistema cromatogrfico, obtenindose los correspondientes cromatogramas
con fases mviles constituidas por una fraccin acuosa tamponada con fosfato de
concentracin 0.1 M a distintos valores de pH, conteniendo 10 mM de perclorato sdico y
una fraccin orgnica, constituida por acetonitrilo en proporcin 70:30 (v:v). Todos los
cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase mvil constante de 1.5
mL/min y midiendo como seal analtica la absorbancia a las longitudes de onda de
mxima absorcin de cada uno de los compuestos.
A partir de los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retencin para
los distintos valores de pH.
164
Captulo II
En la tabla II.1 se resumen los resultados obtenidos. Se puede observar que a los
cuatro valores de pH estudiados, los tiempos de retencin no sufren variaciones apreciables,
siendo el tiempo de anlisis siempre inferior a 6 minutos.
SMT
PMT
SQX
2.348
4.098
5.693
2.373
4.110
5.694
2.373
4.259
5.563
2.326
4.819
4.820
6.0
5.0
4.0
SMT
PMT
SQX
3.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
pH
Figura II.2. Influencia del pH en los tiempos de retencin.
Captulo II
165
166
Captulo II
Captulo II
167
a)
60
PMT
50
mAu
40
30
SQX
20
SMT
10
0
0
2
4
6
Tiempo de retencin (min)
b)
40
PMT
30
mAu
SQX
20
SMT
10
0
-10
0
2
4
6
Tiempo de retencin (min)
168
Captulo II
Captulo II
169
PMT
SQX
2.328
2.974
5.607
10
2.348
4.098
5.693
20
2.327
4.804
5.548
30
2.325
5.614
5.614
40
2.319
6.352
5.556
50
2.303
6.865
5.472
8.0
SMT
PMT
SQX
6.0
4.0
2.0
0
10
20
30
40
50
Concentracion de perclorato sdico (mM)
170
Captulo II
Captulo II
171
172
Captulo II
Tiempos de retencin
SMT
PMT
SQX
20
2.265
5.257
5.381
40
2.259
4.672
5.362
60
2.292
4.469
5.443
80
2.301
4.256
5.466
100
2.303
4.098
5.472
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
SMT
PMT
SQX
1.0
0.0
20
40
60
80
Concentracion de fosfato (mM)
100
Captulo II
173
174
Captulo II
onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos. Los datos obtenidos se
muestran en la tabla II.4.
PMT
SQX
30
2.315
4.812
5.654
35
1.975
3.081
3.798
40
1.727
1.940
2.809
6.0
5.0
SMT
PMT
SQX
4.0
3.0
2.0
1.0
30
35
40
Porcentaje de acetonitrilo
Figura II.5. Influencia del porcentaje de acetonitrilo en la fase mvil en los tiempos
de retencin.
Captulo II
175
176
Captulo II
Las caractersticas cinticas del proceso son claves para definir el ensanchamiento de
banda o ancho de pico que es el que determina, en definitiva, la eficacia del sistema
cromatogrfico. En general, los trminos que contribuyen a sta corresponden a la difusin
por remolino, difusin longitudinal y a la resistencia a la transferencia de materia en la fase
mvil y estacionaria que, a su vez, van a depender de la velocidad de flujo o del caudal de
la fase mvil a travs de la fase estacionaria.
Con objeto de elegir el caudal de la fase mvil ms apropiado, se ha estudiado cmo
influye esta variable en la eficacia del sistema cromatogrfico para los tres compuestos
estudiados, reflejado en la resolucin y en el tiempo de anlisis.
Para la optimizacin de este parmetro, se prepar una muestra de la forma habitual y
se insert en el sistema cromatogrfico manteniendo las condiciones optimizadas en
apartados anteriores, en las que nicamente se variaba el flujo de la fase mvil entre 1 y 2
ml/min. No se tuvieron en cuenta mayores caudales debido a que las altas presiones
alcanzadas en el sistema cromatogrfico podran llegar a disparar los sistemas de seguridad,
parndose de este modo el equipo.
Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla II.5. Como era de esperar, los
tiempos de retencin disminuan al aumentar el caudal de fase mvil. Sin embargo, al
disminuir el tiempo de retencin de los tres compuestos, la resolucin entre PMT y SMT
disminuy considerablemente.
Teniendo en cuenta estos resultados y con el fin de mantener buenas resoluciones
entre picos, se seleccion como ptimo un caudal de 1.5 mL/min, con el cual la separacin
se completa en menos de cuatro minutos.
Captulo II
177
Tabla II.5. Influencia del caudal de fase mvil en los tiempos de retencin.
Caudal (mL/min)
PMT
SQX
1.0
2.964
3.966
5.692
1.5
2.086
3.182
3.904
2.0
1.494
1.990
2.863
Kromasil C18
40 mM fosfato (pH 3.0), 10 mM ClO4- : Acetonitrilo (65:35)
1.5 mL/min
20 L
Barra de diodos en lnea
178
Captulo II
10.00
SMT
8.00
mAu
6.00
SQX
4.00
PMT
2.00
0.00
-2.00
0.0
1.0
2.0
3.0
Time (min)
4.0
5.0
Figura II.6. Cromatograma de una muestra de 2 mg/L de SQX, SMT y PMT registrado a
270 nm.
Captulo II
II.3.
179
ASPECTOS CUANTITATIVOS
180
Captulo II
SQX
PMT
LOD
0.048
0.054
0.051
LOQ
0.16
0.18
0.17
Captulo II
181
Tabla II.8. Rectas de calibrado. Concentraciones (en mg/L) frente a alturas (H)
y reas de pico (A).
Ecuacin
r2
Intervalo lineal
(mg/L)
SMT
PMT
SQX
0.9991
0.2 11.5
0.9994
0.2 11.5
0.9985
0.2 4.0
0.9992
0.2 2.0
0.9992
0.2 4.4
0.9986
0.2 4.4
182
Captulo II
(a)
SMT
PMT
SQX
100000
Altura
75000
50000
25000
0
0.0
(b)
2.0
4.0
6.0
8.0 10.0
Concentracin (mg/L)
12.0
1000000
PMT
SQX
SMT
800000
Area
600000
400000
200000
0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0 10.0
Concentracin (mg/L)
12.0
Figura II.7. Rectas de calibrado en funcin de las alturas (a) y de las reas de pico (b)
Captulo II
183
184
Captulo II
Da 2
% DER
%DER
S12/S22
F (0.05)
Altura
SMT
29125
337
1.1
28952
566
1.9
2.8
3.717
SQX
44361
1119
2.5
43377
977
2.2
1.3
3.717
PMT
54781
1750
3.2
50299
1846
3.7
2.1
3.717
rea
SMT
2122142
7282
3.43
212527
5754
2.71
1.60
3.717
SQX
245653
8213
3.34
248598
6690
2.69
1.51
3.717
PMT
435598
45892
10.53
407289
27136
6.66
2.86
3.717
1.969
0.005
0.26
1.960
0.003
0.17
2.8
3.717
SQX
3.053
0.011
0.36
3.040
0.006
0.18
3.36
3.717
PMT
3.862
0.008
0.20
3.850
0.010
0.27
1.56
3.717
Captulo II
II.4.
185
APLICACIONES
186
Captulo II
Captulo II
187
Cocciamin
Cocichemical
Coccilina*
Coccirex
Coccivet
Quinoxipra-P
Encontrado (g/L)
Recuperacin (%)
Directa
A. E.
Directa
A.E. MEKC
SQX 50
25.50 0.91
26.71 0.89
51.1
53.4
57.5
PMT 15
9.11 0.34
9.16 0.39
60.9
60.8
55.3
SQX 50
28.42 0.91
28.78 0.91
56.8
57.8
59.1
PMT 15
SQX 3.9
3.01 0.12
3.12 0.15
77.4
80.0
80.3
PMT 1.3
1.021 0.052
0.897 0.055
73.8
72.5
68.2
SMT 0
0.7013 0.0061
0.7105 0.0062
SQX 44
42.9 1.6
44.19 0.96
97.6
100.2
95.4
PMT 12
11.32 0.43
11.06 0.41
94.6
91.4
85.2
SQX 50
31.32 0.75
30.14 0.68
87.0
85.7
89.8
PMT 15
8.122 0.089
7.53 0.11
89.3
83.5
92.1
MEN 50
SQX 50
47.9 1.1
46.43 0.98
95.9
93.3
97.4
PMT 15
14.12 0.34
14.15 0.42
94.0
93.6
94.6
188
Captulo II
Tambin se puede observar que estos resultados son comparables con los obtenidos
en el captulo I, en el que se propuso un mtodo para la determinacin de estos mismos
productos utilizando la electroforesis capilar en su modalidad de cromatografa micelar.
Atendiendo a estas observaciones podemos concluir que:
1. Los mtodos propuestos en los captulos I y II son adecuados para la
determinacin de SQX, SMT y PMT en productos comerciales, dado que las
recuperaciones obtenidas son comparables cuando se aplican a las mismas muestras.
2. Se confirman definitivamente las discordancias entre concentraciones etiquetadas
y contenidos reales en los productos analizados.
CAPTULO III
Captulo III
191
III.1. INTRODUCCIN
sulfamidas
con
parecidas
caractersticas
farmacocinticas,
tales
como
192
Captulo III
CH3
O
H2N
NH
N
O
H2N
OCH3
SMP
OCH3
O
S
NH
SMX
H2N
N N
OCH3
N
NH
H2N
CH2
OCH3
N
OCH3
OCH3
TMP
SDM
H2N
Br
N CH2
CH3
Br
BRO
Captulo III
III.1.1. Estabilidad
193
de
las
disoluciones
de
sulfametoxazol,
sulfadimetoxina,
194
Captulo III
Captulo III
195
Tabla III.1. Valores de pKa para SMX, TMP, SMP, SDM y BRO.
Stenstrom y Goldsmith
Wilson y Lester
Bibliografa
SMX
6.0
5.9
5.9
SDM
6.2
SMP
7.2
7.2
6.7
TMP
7.1
7.1
6.6
BRO
196
Captulo III
Captulo III
197
198
Captulo III
pH
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
1.838
2.464
3.600
4.432
5.460
1.811
2.422
3.455
4.268
13.806
1.808
2.411
3.293
4.128
>15
1.824
2.360
2.636
3.445
>15
15
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
10
0
3.0
4.0
5.0
6.0
pH
Figura III.2. Influencia del pH en los tiempos de retencin.
Tambin se puede ver que los tiempos de retencin de TMP y SMP no se ven
afectados por el cambio del pH dentro del intervalo estudiado. El TMP se encuentra en
su forma catinica en el intervalo de pH estudiado y por tener esta carga positiva en su
Captulo III
199
BRO
TMP
SMP
SDM
SMX
2
pH
forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
200
Captulo III
Este estudio se realiz con el fin de comprobar cmo influye la fuerza inica de
la fraccin acuosa de la fase mvil en la retencin de los compuestos estudiados.
Para estudiar la influencia de la concentracin del tampn de la fase mvil sobre
los tiempos de retencin, se prepararon disoluciones de tampn fosfato de
concentraciones comprendidas entre 10 y 80 mM, ajustadas a pH 3.0, que se mezclaron
en el equipo con acetonitrilo en proporcin 60:40 (v:v; tampn:acetonitrilo). Se
inyectaron alcuotas de la disolucin C en el sistema cromatogrfico y se registraron
los correspondientes cromatogramas. La influencia del pH en la retencin de los
compuestos se muestra en la tabla III.3 y en la figura III.4.
Como era de esperar, debido al efecto salino, un aumento de la concentracin del
tampn en la fase mvil supuso un aumento de los tiempos de retencin, si bien ste
solamente result ser significativo en el caso de BRO. Como conclusin, se seleccion
como ptima una concentracin de 10 mM porque muestra suficiente capacidad
reguladora y porque, dado que es la concentracin ms baja del intervalo estudiado, es
la que presenta menor tiempo de anlisis.
Captulo III
201
Conc. (mM)
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
10
1.809
2.459
3.584
4.432
5.607
20
1.809
2.459
3.584
4.432
5.705
40
1.837
2.461
3.596
4.438
5.792
60
1.826
2.468
3.613
4.452
6.012
80
1.846
2.476
3.639
4.478
6.116
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
0
0
20
40
60
Concentracin de tampn (mM)
80
202
Captulo III
Captulo III
203
2.
204
Captulo III
% Acuosa*
% CH3OH
0 min.
69
31
4 min.
31
69
14 min.
31
69
16 min.
69
31
Captulo III
205
Este estudio se realiz con la finalidad de ver cmo influye este parmetro
instrumental en la eficacia del sistema cromatogrfico seleccionado, para la separacin
de los compuestos en estudio, reflejada en el ancho de pico que presentan, as como en
los tiempos de retencin.
Para estudiar la influencia del caudal de fase mvil, se utiliz una disolucin de
tampn citrato pH 3.0 de concentracin 10 mM, que se mezcl en el equipo con
acetonitrilo segn el gradiente optimizado. Se inyectaron alcuotas de la disolucin C
en el sistema cromatogrfico y se registraron los correspondientes cromatogramas. La
influencia del pH en la retencin de los compuestos se muestra en la tabla III.4.
En ella podemos observar que, en el intervalo de valores ensayados, el aumento
del caudal hace disminuir notablemente los tiempos de retencin, como era de esperar.
Asimismo, se observa que el aumento del caudal de fase mvil conlleva una ligera
disminucin de los anchos de pico. Este comportamiento se debe a que la dispersin es
menor cuanto mayor es el caudal de fase mvil, segn se explic con detalle en el
apartado II.2.6 de esta Memoria.
Sin embargo, se observ que la estabilidad de la lnea base era mejor cuando las
separaciones se llevaban a cabo con un caudal de 1 mL/min.
206
Captulo III
Caudal (ml/min)
1.0
1.5
TMP
SMP
SQX
SDM
BRO
Tr (min)
4.125
5.217
6.850
9.017
12.240
Ancho (min)
0.616
0.867
1.088
0.633
0.820
Tr (min)
2.742
3.500
4.608
7.142
8.160
Ancho (min)
0.458
0.508
0.950
0.550
0.555
Captulo III
207
250
255
260
TMP
SMP
SQX
SDM
BRO
W (min)
0.542
0.792
0.850
0.508
0.690
A(mvols)
59643
157961
108793
116471
85814
W (min)
0.567
0.667
0.908
0.500
0.680
A(mvols)
53254
181922
159652
157371
66333
W (min)
0.617
0.700
1.384
0.542
0.670
A(mvols)
46775
187524
193498
168841
36604
En ella podemos observar que, mientras que los anchos de pico en el intervalo de
valores ensayado no varan significativamente, las reas de pico s que varan con la
longitud de onda. Esto es lgico, puesto que la absortividad molar de los diferentes
compuestos en estudio vara con la longitud de onda. Aunque las longitudes de onda de
mxima absorcin de TMP y BRO son 210 y 213 nm, respectivamente, la absorbancia
de estos compuestos en el intervalo de longitudes de onda estudiado es suficiente para
realizar su cuantificacin. Las reas de pico son mayores para TMP y BRO cuando la
208
Captulo III
deteccin se hace a 250 nm, mientras que para SMP, SMX y SDM, lo son cuando se
mide a 260 nm. As, las mayores reas no coincidieron en una sola longitud de onda.
Otro parmetro a tener en cuenta fue la perturbacin de la lnea base por efecto
del gradiente. sta es menos acusada cuando se realiza la deteccin a 255 nm que
cuando se realiza a otra longitud de onda.
Teniendo en cuenta todo lo expuesto anteriormente, se decidi seleccionar 255
nm como ptima, como solucin de compromiso entre la absorcin de los distintos
compuestos y el ruido de la lnea base, consiguiendo as la mejor relacin seal/ruido
para el conjunto de los compuestos a analizar.
Captulo III
209
Kromasil C18
Fase mvil
Caudal
1 mL/min
Volumen inyectado
20 L
Deteccin
UV/VIS: 255 nm
0.25
SDM
Absorbancia
0.20
0.15
SMP
SMX
0.10
BRO
TMP
0.05
0.00
0.00
4.00
8.00
12.00
Tiempo de retencin (min)
16.00
Figura III.5. Cromatograma de una disolucin de 16 mg/L de SMX, SDM, SMP, TMP y
BRO, registrado a 255 nm
210
Captulo III
SMP
SMX
SDM
BRO
LOD
0.30
0.11
0.13
0.05
0.34
LOQ
1.0
0.4
0.4
0.2
1.1
Captulo III
211
1600000
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
Area
1200000
800000
400000
0
0.0
5.0
10.0
15.0
Concentracin (mg/L)
20.0
212
Captulo III
r2
Intervalo lineal
TMP
0.9995
1-16
SMP
0.9999
1-16
SMX
0.9999
1-16
SDM
0.9995
1-16
BRO
0.9995
1-18
Captulo III
213
variaciones entre las series de diferentes das son significativamente diferentes. As, se
encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un intervalo de
confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentaje de desviacin estndar relativa (% DER) se muestran en la tabla III.9.
Serie 2
% DER S12/ S22
% DER
TMP
11657
2581
2.2
114744
1452
1.3
3.1
4.026
SMP
386286
7065
1.8
381377
3878
1.0
3.3
4.026
SMX
305511
4505
1.5
301005
2709
0.9
2.8
4.026
SDM
385400
6292
1.6
385383
3229
0.8
3.8
4.026
BRO
112891
1707
1.5
110316
1309
1.2
1.7
4.026
F0.05
III.4. APLICACIONES
Una vez ms hay que resear que dada la alta viscosidad de los productos
comerciales en los que se encuentran los compuestos qumicos de nuestro inters, no se
puede tomar un volumen exacto con una pipeta. As, se decidi trabajar de modo similar
al de los captulos anteriores. Se tom una cierta cantidad con una jeringa y se llen con
ella un matraz de 10 mL hasta la marca. Seguidamente, estos 10 mL se transfirieron a
un matraz de 100 mL, lavando varias veces con etanol el matraz de 10 mL con el fin de
214
Captulo III
Figura III.7. Esquema para la preparacin de las muestras a partir de los productos
comerciales.
Captulo III
215
Hiprasulfa TS
Sulfamiven
Totaprim
Metazaries
Etiquetado (g/L)
Encontrado (g/L)
Recuperacin (%)
SMX 200
TMP 40
SMP 200
117.9 1.7
59.0
TMP 40
15.61 0.25
39.0
SMP 200
162.6 4.8
81.3
TMP 40
32.3 4.1
80.9
BRO 2
2.01 0.10
100.1
SMX 200
116.59 0.71
58.3
216
Captulo III
0.07
Muestra
Patrn
0.06
Absorbancia
SMP
0.05
0.04
TMP
0.03
0.02
0.0
1.5
3.0
4.5
Tiempo (min)
6.0
7.5
Captulo III
217
CAPTULO IV
Captulo IV
221
IV.1. INTRODUCCIN
222
Captulo IV
CH3
O
H2N
NH
N
O
H2N
N
SDC
OCH3
Br
N
H2N
N CH2
CH3
NH
SMX
H2N
CH2
OCH3
N
OCH3
Br
TMP
BRO
OH
OCH3
GUA
Figura IV.1. Estructuras qumicas de los compuestos en estudio.
Captulo IV
223
224
Captulo IV
Debido a que la SDC mostr una gran estabilidad en agua, se utiliz este medio para
preparar las disoluciones madres de la sulfamida.
2. Estabilidad de las disoluciones de guayacol
Se prepar una disolucin acuosa de GUA (100 mg/L) a la que se le estudi la
estabilidad, aprovechando las separaciones electroforticas que se iban efectuando da a
da. Las muestras, que se preparaban por dilucin directa a partir de la disolucin madre, se
inyectaban en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en lnea, se
iban almacenando diariamente los espectros de absorcin UV-VIS correspondientes a
GUA. Se observ que durante un perodo de un mes, las disoluciones preparadas a partir
de la disolucin madre de GUA presentaban espectros de absorcin invariables.
Captulo IV
225
SDC
Stenstrom y Goldsmith
Wilson y Lester
Bibliografa
6.5
6.5
6.5
226
Captulo IV
lquido el capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de deteccin de
100800 m.
Inicialmente se utiliz la electroforesis capilar en zona para separar los
compuestos en estudio. En esta modalidad, es posible separar cationes y aniones,
coincidiendo el tiempo de migracin de las molculas neutras con el del flujo
electroosmtico. De esta manera, la variable crtica en la separacin ser el pH, ya que
ste condicionar la ionizacin de las especies qumicas segn sea su pKa (figura IV.2).
BRO
GUA
SDC
TMP
SMX
4
10
pH
Forma
catinica
Forma
neutra
Forma
aninica
Figura IV.2. Esquema de la ionizacin de SMX, TMP, SDC, GUA y BRO en funcin del
pH
Captulo IV
227
tambin se observ que a pH 6.5 el pico de BRO empezaba a perder intensidad, lo que
sugiere que empieza la precipitacin de este compuesto (figura IV.3).
a)
10
TMP
SMX
SDC
mAu
6
4
GUA
BRO
2
0
-2
0
b)
10
2
3
4
Tiempo de migracin (min)
TMP
8
SMX
mAu
SDC
GUA
4
BRO
2
0
-2
0
2
3
4
Tiempo de migracin (min)
228
Captulo IV
Captulo IV
229
pH
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
5.0
3.36
2.42
2.42
3.36
3.59
7.17
5.5
3.11
2.35
2.35
3.26
3.66
5.84
6.0
2.85
2.19
2.28
3.28
3.81
4.94
6.5
2.82
2.19
2.43
3.79
4.13
4.89
8.00
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
5.00
5.50
6.00
6.50
pH
Figura IV.4. Influencia del pH en los tiempos de migracin.
230
Captulo IV
Captulo IV
231
por su pKa, sino por el aumento de la velocidad del FEO cuando aumenta el pH, lo que
conlleva una disminucin en su tiempo de migracin.
As, a pH 6.5 se obtienen buenas resoluciones para todos los picos, sin embargo
el pico de BRO empieza a perder intensidad, por lo que, finalmente, se seleccion como
ptimo el pH 6.2 porque los picos aparecen bien resueltos, sin que BRO precipite.
232
Captulo IV
15
20
30
FEO
tm
2.58
2.79
2.96
3.22
BRO
tm
2.02
2.16
2.25
2.41
Ancho
0.025
0.027
0.025
0.028
tm
2.13
2.27
2.40
2.59
Rs
2.308
2.597
3.365
3.709
Ancho
0.025
0.027
0.028
0.030
tm
3.05
3.35
3.62
3.91
Rs
18.861
20.585
24.199
26.819
Ancho
0.031
0.034
0.035
0.037
tm
3.47
3.87
4.26
4.47
8.848
11.208
13.731
TMP
SDC
SMX
Rs
GUA
Ancho
0.028
0.035
0.035
0.039
tm
4.18
4.78
5.36
6.39
Rs
9.288
10.167
12.633
14.715
Ancho
0.058
0.070
0.071
0.093
Captulo IV
233
2.
3.
234
Captulo IV
70.00
Corriente (microamperios)
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00
10.00
20.00
Potencial (kV)
30.00
Captulo IV
235
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
15
6.49
4.93
5.22
8.13
9.65
12.52
20
4.71
3.60
3.80
5.83
6.86
8.81
25
3.69
2.82
2.98
4.55
5.32
6.86
30
2.97
2.27
2.41
3.63
4.24
5.45
14.00
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
15.00
20.00
25.00
Potencial (kV)
30.00
236
Captulo IV
Captulo IV
237
25
30
35
FEO
tm
3.339
2.983
2.701
2.496
BRO
tm
2.53
2.27
2.05
1.89
Ancho
0.032
0.031
0.031
0.030
tm
2.64
2.39
2.19
2.03
Rs
2.114
2.335
2.314
2.911
Ancho
0.034
0.033
0.032
0.028
tm
3.99
3.60
3.26
3.03
Rs
20.052
18.652
17.486
18.990
Ancho
0.042
0.040
0.039
0.032
tm
4.66
4.19
3.78
3.52
Rs
9.070
8.441
7.876
8.359
Ancho
0.038
0.035
0.035
0.032
tm
6.03
5.38
4.85
4.47
Rs
11.405
10.711
10.134
9.970
Ancho
0.098
0.091
0.085
0.073
TMP
SDC
SMX
GUA
238
Captulo IV
8.00
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
6.00
4.00
2.00
0.00
20.00
25.00
30.00
Temperatura (C)
35.00
Captulo IV
239
Capilar
Electrolito
Temperatura
25 C
Rampa de voltaje
Detector
Ventana deteccin
8000
TMP
6000
SDC SMX
mAu
4000
BRO
2000
GUA
0
-2000
0
2
3
4
Tiempo de migracin (min)
240
Captulo IV
TMP
SDC
SMX
GUA
LOD
0.3
0.1
0.3
0.2
0.2
LOQ
1.1
0.4
1.0
0.6
0.7
Captulo IV
241
R2
BRO
0.9987
1.2 24
TMP
0.9970
1.2 24
SDC
0.9964
1.2 25
SMX
0.9972
1.3 26
GUA
0.9954
1.1 23
242
Captulo IV
a)
rea corregida
15000
BRO
TMP
GUA
10000
5000
0
0
b)
10
20
Concentracin (mg/L)
30
10
20
Concentracin (mg/L)
30
5000
SDC
SMX
rea corregida
4000
3000
2000
1000
0
0
Captulo IV
243
Serie 2
% DER
% DER
S12/S22
F (0.05)
BRO
3151
103
3.3
3101
108
3.5
1.084
3.717
TMP
8624
232
2.7
8744
306
3.5
1.739
3.717
SDC
3094
97
3.1
3171
88
2.8
1.203
3.717
SMX
3187
105
3.3
3070
82
2.7
1.625
3.717
GUA
6183
201
3.2
6225
182
2.9
1.227
3.717
244
Captulo IV
IV.4. APLICACIONES
Captulo IV
245
246
Captulo IV
TRIGLOBE
BALSOPRIM
PULMOSTERN
EDUPRIM
SEPTRN
Encontrado
Recuperacin
SMX
400
404.0 9.3
101.0
TMP
80
81.6 1.9
102.1
SDC
820
811 17
99.3
TMP
180
178.8 8.6
98.9
SMX
400
386.9 8.2
97.7
TMP
80
78.3 2.6
97.9
BRO
4.91 0.19
98.2
SMX
400
394.9 3.5
98.7
TMP
80
79.9 1.4
99.9
BRO
5.148 0.043
102.9
SMX
400
390 10
97.6
TMP
80
78.1 2.5
97.6
SMX
400
410 14
102.5
TMP
80
81.5 2.5
101.9
Captulo IV
247
Como puede observarse, las recuperaciones son satisfactorias en todos los casos
y estn de acuerdo con lo esperado segn las etiquetas de los distintos productos
farmacuticos analizados. En este sentido es de destacar que los productos
farmacuticos basados en la accin de la mezcla SMXTMP presentan recuperaciones
prximas al 100 % mientras que los productos veterinarios basados en la accin de la
misma combinacin presentan recuperaciones muy lejanas del 100 %, como se vio en el
captulo III.
CAPTULO V
Captulo V
V.1.
251
INTRODUCCIN
252
Captulo V
CH3
O
H2N
NH
H2N
SO2NH2
SAM
SMX
OCH3
N
H2N
CH2
OCH3
H2N
N
TMP
OCH3
ASU
COOH
H3CO
SO3 H
OCH3
OCH3
ATMB
Captulo V
V.2.
253
254
Captulo V
Tabla V.1. Valores de pKa para SMX, TMP, ASU, SAM y ATBM
pKa
SMX
TMP
ASU
SAM
ATMB
5.6
7.2
3.2
2.4; 10.4
4.7
ATMB
TMP
ASU
SAM
SMX
1
11
13
pH
zwitterion
forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
Captulo V
255
25
ATMB
20
TMP
mAu
15
SMX
ASU
10
5
FEO
0
4
6
8
Tiempo de migracin (min)
10
256
Captulo V
Captulo V
257
258
Captulo V
25
ATMB
20
mAu
15
SMX
10
SAM
ASU
TMP
FEO
5
0
-5
0
4
6
8
10
Tiempo de migracin (min)
12
14
Captulo V
259
Para optimizar este parmetro se prepar una disolucin de tipo E por dilucin
directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose los
correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato 10
mM de pH 12.6 pero con cantidades variables de SDS. Se mantuvo siempre una presin
de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz la
separacin a 25 C, aplicando una diferencia de potencial de 25 kV .
A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de
migracin para los distintos valores de concentracin de SDS.
A la vista de los resultados (tabla V.2 y figura V.5) se puede observar que el
nico componente cuyo tiempo de migracin se ve afectado por la presencia de micelas
es TMP, que no presenta carga a este pH, por lo que, a medida que la concentracin de
SDS aumenta, tambin lo hace el tiempo de migracin del TMP.
As, se seleccion como ptima una concentracin de SDS 20 mM porque
proporcionaba una separacin con buenas resoluciones y un tiempo de anlisis de 7
minutos.
Sin embargo tambin se observa que el pico de TMP presenta un hombro en
estas condiciones (figura V.6). Este comportamiento debe atribuirse a que este
compuesto no es suficientemente soluble en el electrolito. Para salvar esta dificultad, se
puede adicionar algn modificador orgnico al electrolito de separacin que favorezca
la disolucin de TMP en ste.
260
Captulo V
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP
10
3.41
5.28
5.36
5.80
6.77
5.02
20
3.49
5.35
5.44
5.88
6.89
6.70
30
3.43
5.13
5.21
5.61
6.52
7.26
40
3.49
5.24
5.32
5.73
6.68
8.14
50
3.62
5.49
5.56
5.99
7.03
9.23
60
3.65
5.47
5.55
6.00
7.03
9.72
10
FEO
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP
2
10
20
30
40
50
Concentracin de SDS (mM)
60
Captulo V
261
20
ATMB
SMX SAM
mAu
10
FEO
TMP ASU
4
6
Tiempo de migracin (min)
262
Captulo V
Captulo V
263
ATMB
mAu
20.00
SMX SAM
10.00
TMP
FEO
ASU
0.00
0.00
2.00
4.00
6.00
Tiempo de migracin (min)
8.00
264
Captulo V
Para optimizar este parmetro se prepar una disolucin de tipo E por dilucin
directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose los
correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato de
pH 12.6 de concentraciones variables (entre 5 y 30 mM) y 20 mM de SDS, en presencia
de un 5 % de acetonitrilo. Se mantuvo siempre una presin de 0.5 psi y un tiempo de 5
segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz la deteccin simultnea a las
longitudes de onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos. Las
separaciones se llevaron a cabo a 25 kV y 25 C.
A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de
migracin, las resoluciones y los anchos de pico medidos al 50 % de altura, para los
distintos valores de concentracin de tampn (tabla V.3).
En lo concerniente a los tiempos de migracin y a las resoluciones, stos
aumentan con la concentracin del tampn en todos los casos.
Por el contrario los anchos de pico aumentan significativamente, tambin en
todos los casos, a partir de una concentracin de 10 mM, lo cual es debido a que cuanto
mayor es la concentracin del tampn, mayor ser la corriente generada y mayor ser el
calor generado por efecto Joule. Esto tiene como consecuencia un ensanchamiento de
los picos. En el caso del TMP, este efecto es tan acusado para una concentracin de 30
mM de tampn que su pico correspondiente aparece como una perturbacin de la lnea
base. Por esta razn no figura en la tabla su ancho de pico ni la resolucin de SMX con
respecto a TMP.
La ligera disminucin que se registra en los anchos de pico de SMX y ATMB
hasta 10 mM se debe a que en esas concentraciones de tampn predomina el efecto de
Captulo V
265
10
20
30
FEO
tm
3.404
3.750
4.342
4.697
TMP
tm
4.904
5.535
6.718
7.578
Ancho
0.107
0.098
0.143
tm
5.108
5.914
7.579
8.925
Rs
1.722
3.582
6.164
12.913
Ancho
0.039
0.032
0.040
0.050
tm
5.165
5.995
7.709
9.133
Rs
0.411
1.339
1.870
2.739
Ancho
0.031
0.030
0.040
0.050
tm
5.299
6.453
8.799
10.933
Rs
2.360
7.638
13.351
17.263
Ancho
0.032
0.035
0.052
0.070
tm
6.263
7.653
10.892
>12
Rs
15.243
17.074
20.254
Ancho
0.037
0.042
0.067
SMX
ATMB
SAM
ASU
266
Captulo V
Corriente (microAmperios)
100.00
75.00
50.00
25.00
0.00
0
10
15
20
Voltaje (kV)
25
30
Captulo V
267
TMP
SMX
ATMB
SAM
ASU
15
6.619
10.21
10.55
10.67
11.55
13.90
20
4.940
7.52
7.92
8.02
8.76
10.46
25
3.911
5.88
6.23
6.31
6.86
8.19
30
3.075
4.15
4.90
4.96
5.37
6.44
15
FEO
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP
12
0
15
20
25
Voltaje (kV)
30
268
Captulo V
Observando los datos de la tabla V.4 y la figura V.9 se puede ver que un
aumento del potencial de separacin acorta los tiempos de migracin en todos los casos,
como era de esperar. Merece la pena comentar que, cuando se realiza la separacin a 20
kV, el tiempo de anlisis es superior en 5 minutos al que se obtiene con 25 kV, pero la
resolucin es similar en ambos casos. Anlogamente, cuando se realiza la separacin a
30 kV el tiempo de anlisis es menor pero, por el contrario, la resolucin disminuye y la
corriente generada aumenta demasiado.
Como conclusin, se seleccion 25 kV como voltaje ptimo porque se consigue
un tiempo de anlisis razonable y adems la resolucin entre los picos de SMX y
ATMB es mxima. La corriente generada bajo estas condiciones es de 80 A.
Captulo V
269
25
30
35
FEO
tm
4.285
3.785
3.323
3.060
TMP
tm
6.581
5.583
4.665
4.133
Ancho
0.080
0.114
tm
6.677
5.952
5.075
4.656
Rs
3.979
3.426
0.244
Ancho
0.036
0.029
0.027
tm
6.754
6.025
5.131
4.710
Rs
1.243
1.187
1.168
1.148
Ancho
0.033
0.032
0.026
0.024
tm
7.367
6.490
5.412
4.919
Rs
9.278
7.236
5.616
4.382
Ancho
0.041
0.039
0.030
0.028
tm
8.648
7.681
6.381
5.808
Rs
16.593
15.981
15.515
15.216
Ancho
0.046
0.045
0.035
0.033
SMX
ATMB
SAM
ASU
270
Captulo V
Captulo V
271
Electrolito
Rampa de voltaje
Temperatura
Detector
Ventana de deteccin
272
Captulo V
20
SMX
ATMB
10
mAu
TMP
SAM
ASU
4
6
Tiempo de migracin (min)
10
Figura V.10. Electroferograma de una muestra que contena 24 mg/L de SMX, 4.8
mg/L de TMP, 5.6 mg/L de ATMB, 7.9 mg/L de SAM y 6.4 mg/L de ASU utilizando el
mtodo optimizado y registrado a 214 nnm.
20
mAu
SMX
ATMB
10
6.4
6.6
6.8
Tiempo de migracin (min)
Figura V.11. Detalle de la resolucin entre cido 3,4,5-trimetoxibenzoico y
sulfametoxazol
Captulo V
V.3.
273
ASPECTOS CUANTITATIVOS
Para el anlisis cualitativo del problema analtico del que nos ocupamos en este
captulo, hemos realizado las separaciones en medio acuoso, es decir, simplemente
disolviendo nuestros compuestos en agua. Hemos trabajado con disoluciones de 20
mg/L en medio acuoso, es decir con concentraciones de sulfamida y potenciador hasta
20 veces menores que las que existen en los productos farmacuticos. Si realizramos
las separaciones en muestras reales a estas concentraciones, la matriz tambin quedara
diluida por igual y su influencia no sera apreciable. Sin embargo, por la propia
naturaleza de los compuestos con los que trabajamos, stos siempre aparecern en el
seno de un producto comercial, es decir, en el seno de una matriz.
Por esta razn se han abordado los aspectos cuantitativos concernientes a la
determinacin de los productos de degradacin de sulfametoxazol y trimetoprim en
productos farmacuticos realizando las correspondientes separaciones en la matriz en la
que estn presentes.
En este captulo, se ha abordado como problema analtico la determinacin de
los productos de degradacin en una concentracin del 1 % con respecto a los productos
principales y en presencia de stos. Sin embargo, para la determinacin de los productos
principales, es decir, SMX y TMP, se propone el mtodo de electroforesis capilar en
zona descrito en el captulo IV de esta Memoria.
274
Captulo V
El problema analtico que nos ocupa presenta la peculiaridad de que no todos los
componentes de la mezcla estn en proporciones parecidas en el seno de la muestra real,
sino todo lo contrario. Esto significa que hay que determinar unos compuestos, los
productos de degradacin, en concentraciones muy pequeas, en presencia de otros, los
principios activos, cuyas concentraciones son mucho mayores.
En este sentido, se realizaron experiencias para ver si se podan determinar los
productos de degradacin en una concentracin equivalente al 1 % de la de los
principios activos. Esta experiencia se realiz disolviendo una tableta de uno de los
productos farmacuticos (Septrn) en medio hidroalcohlico (50:50, v:v) y
adicionando cantidades de SAM y ASU equivalentes a un 1 % de la concentracin de
SMX y de ATMB equivalente a un 1 % de la concentracin de TMP. Finalmente se
llev esta disolucin a un volumen final de 1 L. Se realiz la separacin de esta
disolucin bajo el procedimiento optimizado y se registr el electroferograma
correspondiente, que se muestra en la figura V.14.
En el electroferograma se observa que los productos de degradacin del
sulfametoxazol (cido sulfanlico y sulfanilamida) se encuentran suficientemente
resueltos para su determinacin, tanto cualitativa como cuantitativa, mientras que el
producto de degradacin del TMP, el ATMB queda parcialmente solapado por el pico
del SMX, cuya concentracin es 500 veces mayor, por lo que el ATMB se puede
detectar, pero es muy difcil su cuantificacin. Para la determinacin cuantitativa de
ATBM, en la actualidad se est desarrollando en nuestro laboratorio un mtodo basado
en las condiciones en las que se obtuvo el electroferograma de la figura V.3, aunque an
no se tiene optimizado.
Captulo V
275
20
SMX
15
TMP
mAu
10
SAM
ASU
0
-5
2
4
6
8
Tiempo de migracin (min)
10
ASU
LOD
0.6
1.26
LOQ
2.0
4.2
276
Captulo V
Captulo V
277
r2
ASU
3.2 13
SAM
3.9 16
r2
ASU
3.2 13
SAM
3.9 16
278
Captulo V
Pendientes
ASU
Fexperimental = 1.336
Ftabulado = 19.00
texperimental = 0.737
ttabulado = 2.78
SAM
Fexperimental = 52.7
Ftabulado = 19.00
texperimental = 1.046
tcalculado = 4.303
Captulo V
279
variaciones entre las series de diferentes das son significativamente diferentes. As, se
encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un intervalo de
confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentajes de desviacin estndar relativa ( %DER) se muestran en la tabla V.11.
Serie 2
Fexp
Ftab
%DER
%DER
SAM
745
24
3.3
660
19
2.9
1.67
3.717
ASU
460
12
2.7
418
14
3.4
1.26
3.717
280
Captulo V
Matriz
Fexp
Ftab
%DER
%DER
SAM
745
24
3.3
727
24
3.3
1.0
3.717
ASU
460
12
2.7
575
19
3.2
2.2
3.717
Como se desprende de los datos de esta tabla, las repetibilidades entre series
fueron comparables y nunca superiores al 3.3 %. Adems, la comparacin de las
varianzas por medio del estadstico F de Snedecor para un nivel de confianza del 95 %
revel que no existan diferencias significativas entre las dos series.
Al finalizar este estudio podemos concluir que se puede realizar la
determinacin cuantitativa de los compuestos de degradacin del sulfametoxazol (cido
sulfanlico y sulfanilamida) sin necesidad de trabajar en presencia de la matriz.
V.4.
APLICACIONES
Captulo V
281
282
Captulo V
Concentracin (mg/L)
Recuperacin (%)
SAM
ASU
SAM
ASU
1:1
3.436
3.124
97.8
101.2
2:1
6.872
3.124
97.9
96.9
3:1
10.308
3.124
100.9
99.1
4:1
13.744
3.124
103.4
97.2
1:2
3.436
6.248
103.0
104.5
1:3
3.436
9.372
102.5
103.1
1:4
3.436
12.496
99.0
100.1
CAPTULO VI
Captulo VI
285
VI.1. INTRODUCCIN
286
Captulo VI
Captulo VI
287
288
Captulo VI
1. Se toman 500 L de suero con una micropipeta, una vez descongelado, y se ponen
en un tubo de centrfuga de 5 mL.
2. Se aade 1 mL de acetonitrilo.
3. Se centrifuga a 582 g durante 10 minutos y posteriormente se separa el
sobrenadante con una pipeta Pasteur.
4. En el mismo tubo de centrfuga, al precipitado se le aaden 500 L de acetonitrilo y
se agitan con una varilla de vidrio fina hasta la generacin de una suspensin.
5. Se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones, se separa el sobrenadante y
ste se une con el obtenido en la etapa 3.
6. Se toman 800 L del sobrenadante y se evaporan a 80 C en una estufa hasta llevar
a sequedad.
7. Se disuelve el residuo obtenido en 400 L de agua y 100 L de electrolito de
separacin.
8. De esta ltima disolucin, se toman 200 L para realizar la separacin.
Captulo VI
289
290
Captulo VI
Wilson y Lester
Bibliografa
SMX
6.0
5.9
5.6
TMP
7.1
7.1
7.2
TMP
SMX
11
13
pH
forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
As, se llev a cabo una separacin de una muestra tipo S utilizando como
electrolito de separacin tampn fosfato de pH 6.5 de concentracin 20 mM. Se inyect la
muestra en modo hidrodinmico aplicando una presin de 0.5 psi durante 5 segundos. La
separacin se realiz a 25 kV y 20 C. El electroferograma correspondiente se muestra en la
figura VI.2.
Captulo VI
291
15
FEO+TMP1 + TMP3
10
mAu
TMP
NAC
SMX
0.0
2.0
4.0
6.0
Tiempo de migracin (min)
8.0
10.0
292
Captulo VI
Captulo VI
293
respecto a los compuestos que se encuentran en la matriz y que no han podido ser
eliminados mediante el tratamiento previo de las muestras de suero.
15.00
TMP
TMP1
TMP3
NAC
SMX
mAu
10.00
5.00
FEO
0.00
0.00
4.00
8.00
Tiempo de migracin (min)
12.00
294
Captulo VI
Captulo VI
295
20
30
40
FEO
tm
3.74
4.28
4.78
5.17
TMP1
tm
4.87
5.70
6.46
7.15
Ancho
0.042
0.053
0.059
0.124
tm
5.20
6.40
7.48
8.56
Rs
4.070
8.163
11.532
10.897
Ancho
0.061
0.045
0.042
0.047
tm
5.51
6.89
8.06
9.46
Rs
3.561
6.387
2.269
2.111
Ancho
0.051
0.039
0.052
tm
5.78
6.96
8.15
9.18
Rs
3.000
0.787
0.323
4.721
Ancho
0.049
0.075
0.106
tm
8.12
10.09
12.12
14.46
Rs
24.395
17.297
18.001
19.877
Ancho
0.131
0.189
0.235
NAC
SMX
TMP3
TMP
296
Captulo VI
16
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
14
12
10
8
6
4
2
10
20
30
Concentracin de borato (mM)
40
En cuanto a los anchos de pico, se pueden observar dos tendencias. Por una parte,
en los casos de TMP, TMP1 y TMP3 se observa que cuanto mayor es la fuerza inica del
electrolito, sus anchos de pico tambin son mayores porque aumenta el tiempo de
migracin debido a que disminuye la movilidad. Por otra parte, en los casos de SMX y
NAC, se observa que sus anchos de pico disminuyen al aumentar la fuerza inica hasta 30
mM y que aumentan para concentraciones mayores. Este comportamiento se debe a que en
la primera fase, es decir, hasta concentraciones de 30 mM, predomina el efecto de
compresin de pico, producido porque la fuerza inica en la zona de muestra es mucho
menor que en el electrolito de separacin.
Captulo VI
297
298
Captulo VI
Captulo VI
299
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
10
4.275
4.275
6.469
7.000
4.275
4.275
20
4.400
5.912
6.660
7.18
7.260
10.750
25
4.435
6.348
6.695
7.209
7.952
11.691
30
4.504
6.760
6.760
7.286
8.609
12.499
40
4.600
7.572
6.913
7.438
9.796
14.005
50
4.734
8.546
7.163
7.710
11.257
16.152
20
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
15
10
0
10
20
30
40
50
300
Captulo VI
100
Corriente (microAmperios)
80
60
40
20
0
0
10
20
Voltaje (kV)
30
Captulo VI
301
302
Captulo VI
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
15
7.450
10.624
11.052
11.855
13.216
19.148
20
5.444
7.791
8.148
8.759
9.715
14.185
25
4.356
6.194
6.497
6.985
7.715
11.227
30
3.510
4.945
5.232
5.623
6.136
8.847
20
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
15
10
0
15
20
25
Voltaje (kV)
30
Figura VI.7. Influencia del voltaje aplicado sobre los tiempos de migracin
Captulo VI
303
304
Captulo VI
20
25
30
FEO
tm
4.032
3.515
2.812
2.781
TMP1
tm
5.849
4.948
3.956
3.687
Ancho
0.043
0.041
0.038
0.035
tm
6.048
5.256
4.205
4.129
Rs
2.647
4.480
6.102
7.724
Ancho
0.042
0.039
0.040
0.041
tm
6.509
5.649
4.519
4.441
Rs
6.708
6.128
5.829
5.531
Ancho
0.036
0.034
0.032
0.031
tm
7.356
6.139
4.911
4.491
Rs
8.501
5.872
4.056
Ancho
0.076
0.063
0.050
tm
>10
8.814
7.051
5.908
Rs
18.580
17.815
17.049
Ancho
0.098
0.082
0.067
NAC
SMX
TMP3
TMP
Captulo VI
305
Hasta este momento se ha visto que hay una diferencia de 1.2 minutos entre el
tiempo de migracin del TMP1, el primer compuesto en ser detectado, y el del TMP3, que
es el cuarto compuesto en ser detectado. Esta circunstancia no impide la cuantificacin de
ninguno de ellos porque sus picos aparecen bien resueltos. No obstante, la resolucin puede
mejorarse incorporando al electrolito una cierta cantidad de modificador orgnico para
alterar la selectividad de la separacin.
El disolvente orgnico que se utiliz en este estudio fue el acetonitrilo, y su
concentracin se vari para obtener porcentajes entre el 2.5 y el 15 % (v:v) en el electrolito
de separacin.
Cuando se estudi el efecto del acetonitrilo (figura VI.8), se observ que un
aumento en la concentracin de modificador orgnico supona un aumento en los tiempos
de migracin de aquellos compuestos que presentaban ionizacin al pH de trabajo, es decir,
NAC y SMX. Este comportamiento puede explicarse porque un aumento del disolvente
orgnico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de separacin, disminuyendo
considerablemente la velocidad del flujo electroosmtico, lo que origina que los tiempos de
migracin de los compuestos sean mayores, de manera que aumentan los tiempos de
anlisis.
Por el contrario, en los casos de los compuestos que interaccionan con las micelas,
es decir, TMP y sus metabolitos, la tendencia es diferente. Los tiempos de migracin de los
compuestos TMP1 y TMP3 disminuyen levemente a concentraciones bajas de acetonitrilo,
se estabilizan a concentraciones moderadas y aumentan manifiestamente a concentraciones
elevadas. El tiempo de migracin del TMP disminuye drsticamente al aumentar la
306
Captulo VI
10
6
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
2
2
4
6
8
10
12
14
Concentracin de acetonitrilo (%)
16
Captulo VI
307
308
Captulo VI
Capilar
Electrolito
Temperatura
30 kV (150 kV/min)
Rampa de voltaje
Detector
800 100 m
Ventana deteccin
10
TMP
mAu
TMP3
TMP1
5
SMX
NAC
0.00
2.00
4.00
6.00
Tiempo de migracin (min)
8.00
10.00
Captulo VI
309
310
1.
Captulo VI
2.
3.
4.
Se repiten los pasos 1 a 3, utilizando un suero al que se le han aadido todos los
compuestos de manera que su concentracin fuera 0.4 mg/L de cada uno.
5.
6.
Captulo VI
311
Suero
LOD
LOQ
LOD
LOQ
TMP1
0.6
2.1
0.06
0.21
TMP3
0.7
2.4
0.07
0.24
NAC
0.4
1.4
0.04
0.14
SMX
0.4
1.3
0.04
0.13
TMP
0.6
1.9
0.06
0.19
312
Captulo VI
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y rea de pico corregida y tambin que las ordenadas en el origen resultaron
ser despreciables, segn el intervalo de confianza obtenido para un nivel de significacin de
0.05.
En las figura VI.10 a VI.12 se representan las reas corregidas de los compuestos
frente a las concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mnimos cuadrados
se muestran en la tabla VI.8 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y
que las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.
r2
TMP1
0.9999
0.2 3
TMP3
0.9997
0.2 3
NAC
0.9997
0.2 3
SMX
0.9994
0.2 3
0.2 3
Captulo VI
313
a)
10000
Area corregida
7500
5000
2500
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
b)
4000
Area corregida
3000
2000
1000
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
Figura VI.10. Rectas de calibrado de a) TMP1 y b) NAC
314
Captulo VI
a)
8000
Area corregida
6000
4000
2000
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
b)
4000
Area corregida
3000
2000
1000
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
Captulo VI
315
10000
Area corregida
8000
6000
4000
2000
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
316
Captulo VI
Serie 2
%DER
%DER
S12/S22
F (0.05)
TMP1
2002
93
4.6
2036
64
3.2
2.08
3.717
TMP3
1697
89
5.2
1696
65
3.8
1.82
3.717
NAC
854
38
4.4
859
40
4.7
1.16
3.717
SMX
780
34
4.4
777
34
4.4
1.00
3.717
TMP
2688
127
4.7
2542
114
4.5
1.24
3.717
Captulo VI
317
VI.5. APLICACIONES
318
Captulo VI
M6
M5
M4
M3
M2
M1
TMP3
NAC
SMX
TMP
Concentracin (mg/L)
0.83
0.83
0.42
0.83
0.60
Recuperacin (%)
104.5
104.5
99.8
101.9
101.2
Concentracin (mg/L)
0.41
0.42
0.85
0.42
1.20
Recuperacin (%)
98.3
103.5
98.2
100.6
104.0
Concentracin (mg/L)
0.41
0.42
0.42
0.83
1.20
Recuperacin (%)
103.3
108.6
99.5
104.9
102.7
Concentracin (mg/L)
0.83
0.83
0.85
0.42
0.60
Recuperacin (%)
100.1
101.8
96.5
95.0
97.5
Concentracin (mg/L)
0.21
0.21
1.06
1.04
0.30
Recuperacin (%)
95.4
101.5
100.2
97.3
94.9
Concentracin (mg/L)
1.04
1.04
0.21
1.67
1.51
Recuperacin (%)
101.8
98.0
97.1
95.8
99.6
CONCLUSIONES
Conclusiones
321
La cromatografa lquida, utilizando columna C18 y fase mvil formada por tampn
fosfato 40 mM (pH 3.0), 10 mM de NaClO4:acetonitrilo es til para la separacin entre las
sulfamidas sulfaquinoxalina y sulfametacina y el compuesto asociado pirimetamina.
Igualmente, utilizando columna C18 y fase mvil formada por tampn citrato 10 mM (pH
3.0):metanol, en modo de gradiente, es til para la separacin entre las sulfamidas
sulfametoxipiridacina, sulfadimetoxina y sulfametoxazol y de los compuestos asociados
bromhexina y trimetoprim.
322
Conclusiones
BIBLIOGRAFA
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NDICE
ndice
337
OBJETO DE LA TESIS
INTRODUCCIN
ANTECEDENTES HISTRICOS DE LAS SULFAMIDAS ............................ 5
CLASIFICACIN DE LAS SULFAMIDAS ..................................................... 10
ANLISIS DE SULFAMIDAS .......................................................................... 13
Determinacin de sulfamidas y metabolitos.................................................. 33
Determinacin de sulfamidas, potenciadores y sus productos
de degradacin............................................................................................... 43
INTRODUCCIN A LA ELECTROFORESIS CAPILAR................................ 57
Definicin de electroforesis y principios generales de la tcnica ................. 58
TEORA DE LA ELECTROFORESIS ............................................................... 61
Aspectos tericos........................................................................................... 61
El fenmeno de electroforesis y el flujo electroosmtico ............................. 63
Los beneficios del flujo electroosmtico....................................................... 64
El tampn de separacin................................................................................ 68
Parmetros determinantes de la separacin................................................... 69
Factores que afectan al desarrollo de la separacin ...................................... 72
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES
DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR ............................................................ 75
Inyeccin de la muestra ................................................................................. 75
Fuente de alto voltaje..................................................................................... 77
Capilar ........................................................................................................... 78
Sistemas de termostatizacin del capilar....................................................... 79
Sistemas de deteccin.................................................................................... 79
MODALIDADES DE ELECTROFORESIS CAPILAR..................................... 81
Electroforesis capilar en zona........................................................................ 81
Cromatografa electrocintica micelar .......................................................... 82
INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA LQUIDA
DE ALTA RESOLUCIN.................................................................................. 86
Principios bsicos .......................................................................................... 88
Concepto de plato terico.............................................................................. 88
338
ndice
Retencin cromatogrfica.............................................................................. 89
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPRACIONALES DE LA
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN ............................ 90
Sistemas de bombeo ...................................................................................... 90
Sistema de inyeccin ..................................................................................... 91
Columna cromatogrfica ............................................................................... 91
Detector ......................................................................................................... 91
Integrador o procesador................................................................................. 92
PARMETROS CROMATOGRFICOS.......................................................... 93
MODALIDADES DE CROMATOGRAFA LQUIDA .................................... 95
Cromatografa de particin en fase reversa ................................................... 96
ANLISIS ESTADSTICO ELEMENTAL ....................................................... 101
Parmetros estadsticos descriptivos clsicos................................................ 101
Test estadstico t de Student .......................................................................... 102
Mtodos de correlacin ................................................................................. 103
Rectas de calibracin (Regresin por mnimos cuadrados) .......................... 104
Comparacin de las pendientes de dos rectas de calibrado........................... 107
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL Y DISOLUCIONES
INSTRUMENTACIN UTILIZADA ...................................................................... 113
DISOLUCIONES UTILIZADAS ............................................................................. 115
I.
DETERMINACIN
SULFAMETACINA,
PRODUCTOS
DE
SULFAQUINOXALINA,
PIRIMETAMINA
ZOOSANITARIOS
POR
MENADIONA
EN
CROMATOGRAFA
ELECTROCINTICA MICELAR
I.1. INTRODUCCIN........................................................................................ 119
I.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina,
sulfametacina, menadiona y pirimetamina............................................ 121
ndice
339
II.
DETERMINACIN
SULFAMETACINA,
PRODUCTOS
DE
SULFAQUINOXALINA,
PIRIMETAMINA
ZOOSANITARIOS
POR
MENADIONA
EN
CROMATOGRAFA
LQUIDA
II.1. INTRODUCCIN........................................................................................ 159
II.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES...................... 160
II.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 160
II.2.2. Optimizacin del pH de la fase mvil ............................................... 163
II.2.3. Influencia de la concentracin de perclorato..................................... 166
II.2.4. Influencia de la fuerza inica en la fase mvil .................................. 170
II.2.5. Influencia de la concentracin de acetonitrilo................................... 173
II.2.6. Influencia del caudal de fase mvil .................................................. 175
II.2.7. Mtodo cromatogrfico propuesto .................................................... 177
340
ndice
III.
DETERMINACIN
SULFADIMETOXINA,
TRIMETOPRIM
DE
SULFAMETOXAZOL,
SULFAMETOXIPIRIDACINA,
BROMHEXINA
EN
PRODUCTOS
ndice
IV.
341
V.
342
ndice
ndice
343