Las bacterias lcticas - 20 aos

explorando su potencial como vectores

vivos para la vacunacin de la mucosa
Abstracto
Las bacterias cido lcticas (BAL) son un grupo diverso de bacterias Gram-positivas, no
esporuladas, bacterias bajo contenido de G + C. Muchos de ellos se han dado
generalmente considerado como seguro. Durante las ltimas dos dcadas, la
investigacin gentica y molecular intensiva llevada a cabo en LAB,
principalmente Lactococcus lactis y algunas especies del Lactobacillus gnero, ha
revelado nuevos, potenciales aplicaciones de laboratorio biomdicas, incluyendo el uso
de LAB como adyuvantes, inmunoestimulantes, o la administracin de frmacos
teraputicos sistemas, o como fbricas para producir molculas teraputicas. LAB
permiten la inmunizacin por va mucosa, lo que aumenta la eficacia contra los
patgenos que utilizan la mucosa como la principal va de entrada en el cuerpo
humano. En esta revisin, nos concentramos en la aplicacin alentador
de Lactococcus y Lactobacillusgneros para el desarrollo de vacunas mucosas en
vivo. En primer lugar, se presentan los avances que recientemente se ha hecho en el
campo de las herramientas para la manipulacin gentica de laboratorio, que se ha
traducido en la expresin con xito de muchos antgenos bacterianos, parasitarios y
virales en el desarrollo de cepas de BAL. A continuacin, se discuten los factores que
influyen en la eficacia de los prototipos de vacunas construidos que se han probado en
varios modelos animales. Aparte de la investigacin se centr en una aplicacin de Live
Labs como portadores de antgenos extraos, una gran cantidad de trabajo se ha hecho
recientemente sobre el uso potencial de los no vivos, no
recombinante L. lactis designado como matriz de potenciador de Gram-positivo (GEM),
tal como un sistema de administracin para la vacunacin de la mucosa. Tambin se
presentan las ventajas y desventajas de ambas estrategias.

Palabras clave
Las bacterias del cido lctico Antgenos vacuna de ADN GEM
partculasinmunoprofilaxis
Agnieszka Wyszyska y Patrycja Kobierecka contribuyeron igualmente a
este trabajo.

Caractersticas de las bacterias del cido lctico

Las bacterias cido lcticas (LAB) son Gram-positivas, bacterias no
esporuladas, con genomas bajo contenido de GC. Este grupo se
caracteriza por la capacidad de llevar a cabo la fermentacin de hidratos
de carbono para formar cido lctico. Este grupo de microorganismos
incluye cocos y bacilos, los representantes de las especies pertenecientes

a los gneros
deLactococcus , Lactobacillus , Streptococcus , Pediococcus , Leuconost
oc , Bifidobacterium , y varios otros. Muchos LAB han recibido
generalmente considerado como seguro (GRAS) de la Food and Drug
Administration (FDA), pero vale la pena mencionar que las bacterias
patgenas tales como Streptococcus pyogenes y Streptococcus
pneumoniae tambin pertenecen a este grupo (Daniel et al. 2011 ). Las
bacterias del grupo de LAB se caracterizan por la ausencia de genes en
sus genomas que codifican para las protenas que participan en diversas
rutas de biosntesis. De acuerdo con ello, estos organismos auxtrofos se
producen en ambientes ricos en aminocidos, purinas, pirimidinas, y
donde se pueden cumplir sus altos requerimientos nutricionales.
Hasta hace poco, las bacterias del grupo de LAB se han utilizado
principalmente en la produccin y conservacin de los
alimentos. Algunas especies son reconocidas como probiticos, que, de
acuerdo con la definicin propuesta por la Organizacin Mundial de la
Salud (OMS) -confer un beneficio para la salud en el host cuando se
administran en cantidades adecuadas (de Vos 2011 ; FAO /
OMS 2001 ). Sin embargo, las cepas de LAB reconocidas como
probiticos difieren en sus actividades. Algunas bacterias de este grupo
modulan la composicin de la flora bacteriana del intestino y por lo
tanto mantener la homeostasis de la microbiota intestinal. Adems,
varias de las cepas de probiticos estimulan el sistema inmunolgico y
reducir el riesgo de reacciones alrgicas. Otras especies bacterianas
proporcionan proteccin contra las bacterias patgenas por competir
con ellos para la superficie colonizado, mediante la produccin de
compuestos que inhiben el crecimiento de patgenos, o mediante la
induccin de la produccin de moco y pptidos antimicrobianos (AMP)
por las clulas epiteliales de la mucosa (Isolauri et al. 2004 ). Cepas
probiticas son de suma importancia en el apoyo del tratamiento de
enfermedades del sistema digestivo (principalmente la diarrea de
etiologa viral o la diarrea asociada con el uso de antibiticos),
enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), y trastornos autoinmunes
(Fontana et al. 2013 ; Isolauri et al. 2004 ).
Durante ms de 20 aos, LAB han sido intensamente estudiado como
posibles vectores bacterianos de compuestos con efectos teraputicos o
profilcticos (Bermdez-Humaran et al.2011 ). LAB permiten la
inmunizacin por va mucosa, que no slo es ms sencillo que las
inyecciones estndar, pero tambin aumenta la eficacia contra los
patgenos que utilizan la mucosa como su principal va de entrada en el
cuerpo humano. La entrega de antgenos usando cepas de BAL puede
inducir tanto la mucosa (SIGA) y las respuestas inmunes sistmicas
(Bermdez-Humaran et al. 2011 ). El atractivo de LAB en la

inmunoprofilaxis y la terapia tambin est determinada por su

resistencia al bajo pH del jugo gstrico y, por ciertas cepas, la capacidad
de adherirse a la superficie del epitelio intestinal. Adems, algunas cepas
de laboratorio han propiedades adyuvantes, lo que significa que pueden
mejorar la respuesta inmune inducida por el antgeno
transportado. Gracias a la posibilidad de la liofilizacin, LAB no
requieren almacenamiento a baja temperatura, y la administracin de la
preparacin no requiere personal especializado.
Todas estas caractersticas, en particular, las propiedades promotoras de
la salud y un alto grado de seguridad de LAB, ellos hacen una alternativa
atractiva a otros vectores utilizados para la construccin de vacunas,
incluyendo cepas atenuadas de varias especies de microorganismos
patgenos, liposomas, y micropartculas. Esta revisin examina los
avances en el uso de LAB para la inmunoprofilaxis.

Herramientas de ingeniera gentica utilizada para la

clonacin de genes heterlogos en Lactococcus lactis
Hasta el momento, L. lactis sigue siendo el microorganismo modelo en
la investigacin de laboratorio. El rpido progreso de la investigacin
sobre el uso de LAB para el tratamiento y la profilaxis se produjo a
finales del siglo XXI. En estos estudios, las cepas de plsmidocurado L.lactis subsp. lactis IL1403 y L. lactis . subsp cremoris MG1363,
cuyos genomas fueron secuenciados en 1999/2001 y 2007,
respectivamente, se utilizan ms comnmente (Bolotin et al. 2001 ;.
Wegmann et al 2007 ; Linares et al. 2010 ). Actualmente, las bases de
datos proporcionan la informacin gentica en 33 cepas de la
especie L. lactis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/156 ,
noviembre de 2014). Los primeros vectores de clonacin de genes
extraos en el laboratorio se desarrollaron hace unos 30 aos, sobre la
base de los sistemas de replicacin de los dos plsmidos, anfitrin de
amplio rango crpticas de L. lactis : pWV01 y pSH71 (de Vos 1987 ; Kok
et al. 1984 ). Hasta la fecha, muchos derivados de estos plsmidos se han
creado (Shareck et al. 2004 ). Otra replicn usado es pAMbeta-1, aislados
de Enterococcus faecalis . Sobre la base de su sistema de replicacin, el
bajo de copias del plsmido pIL252 y el plsmido de alta copia pIL253 se
construyeron (Simon y Chopin 1988 ; Shareck et al. 2004 ). Un nmero
de diferentes sistemas para la expresin de genes que codifican protenas
heterlogas en las clulas de L. lactis fueron desarrollados usando
promotores tanto constitutivos e inducibles. El sistema ms
comnmente utilizado para la expresin de protenas heterlogas es el
sistema NICE, que utiliza el promotor de nisina (Mierau y
Kleerebezem 2005 ). Muchos de los sistemas de expresin desarrollados

tienen promotores inducibles cuya expresin depende de las condiciones

ambientales. Estos incluyen, por ejemplo, el P 170 promotor, activa a pH
bajo y sujeto a la autoinduccin por el cido lctico acumulado cuando el
cultivo entra en la fase estacionaria de crecimiento (Madsen et al. 1999 ),
o la espinilla promotor del opern que se regula por la protena ZitR y se
activa por una baja concentracin de iones de zinc (el llamado hambre
zinc ) (Llull y Poquet 2004 ). El sistema Zirex recientemente descrita
permite la induccin de genes regulados por la concentracin de iones de
zinc y por el uso de la protena reguladora neumococos SczA (Mu et
al. 2013 ). En los estudios dirigidos a examinar la posible aplicacin de
LAB en la inmunoprofilaxis, promotores inducidos en las condiciones
imperantes en el cuerpo inmunizados son particularmente tiles.Un tal
sistema de expresin es inducible estrs sistema de expresin controlada
(SICE). El sistema SICE utiliza un promotor de la L. lactis
groESL opern, cuya expresin es inducida en condiciones de estrs
(Benbouziane et al. 2013 ).

Herramientas de ingeniera gentica utilizadas para la

clonacin de genes heterlogos en Lactobacillus spp.
En los ltimos aos, el inters en las bacterias del
gnero Lactobacillus tambin ha aumentado.Ms de 180 especies se
incluyen en este gnero
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?
id=1578 , agosto de 2014).Sin embargo, la atencin se centra en las cepas
con propiedades probiticas probadas; Entre ellas se encuentran las
siguientes especies bacterianas: Lactobacillus
rhamnosus , Lactobacillus casei, Lactobacillus
bulgaricus , Lactobacillus salivarius , Lactobacillus
plantarum ,Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus
helveticus y Lactobacillus gasseri (Fontana et al. 2013).
Preparacin de vectores de expresin para la clonacin de genes en las
clulas del gneroLactobacillus es un reto, debido principalmente a la
inusualmente alto nivel de diversidad gentica. Algunos de los sistemas
de replicacin de plsmidos descritos se activa slo en cepas especficas,
y los promotores de lactobacilos conocidos tienen diferentes niveles de
actividad, dependiendo de la cepa que se encuentran. Los vectores de
clonacin ms comnmente utilizados
para L. plantarum , L. acidophilus y L. gasseri son los que tienen el
sistema de replicacin de pWV01, pSH71 o pAMbeta-1 (Stoeker et
al. 2011 ; Bron et al. , 2004b ; Duong et al. 2011 ; Kajikawa et
al. 2011 , 2012 ).

En los vectores de expresin para Lactobacillus , ambos promotores

constitutivos tales como P pgm (promotor fosfoglicerato mutasa),
P ldhl (promotor de la lactato deshidrogenasa), o P SIpA(promotor del gen
que codifica la S-capa de la protena SIpA) -y inducible se utilizan
promotores. Uno de ellos es el promotor de un gen que codifica una
protena de choque trmico de Enterococcus faecium ; su actividad se ha
analizado en las clulas de L. plantarum (Maidin et al. 2014 ). Recientes
anlisis global de transcriptomes lactobacilos, o la investigacin de
bibliotecas genmicas utilizando diversos genes informadores, ha dado
como resultado la identificacin de promotores inducidos por las
condiciones ambientales especficas. Un anlisis del transcriptoma
de L. acidophilus identificado promotores que son inducidos por la
presencia de hidratos de carbono, es decir, P FOS (fructo-oligosacrido),
P lac (lactosa), y P tre (trehalosa), pero son reprimidos en presencia de
glucosa. P FOS puede demostrar ser particularmente til en la terapia o la
inmunoprofilaxis, como fructo-oligosacridos son prebiticos que
estimulan el desarrollo de la microflora intestinal (Duong et
al. 2011 ). Usando una alanina racemasa gen que codifica como una
sonda de promotor para la identificacin de todo el genoma de
inducibleL. plantarum genes resultaron en la identificacin de muchos
genes cuya expresin es inducida por la alta concentracin de sal o por
las sales biliares (Bron et al. 2004a , c ).

LAB como portadores de heterloga bacterianas,

parasitarias, virales y antgenos
LAB se caracterizan por su alta diversidad gentica y fisiolgica. Por lo
tanto, la capacidad de diferentes cepas de subsistir y multiplicarse en un
organismo inmunizado diferir sustancialmente. Adems, diferencias en
la composicin de sus paredes de las clulas resulta en diferencias
significativas en la respuesta inmune estimulada. Algunos componentes
de la pared celular tales como peptidoglicano, lipoprotenas, o cidos
lipoteicoicos son reconocidos por Toll-like eucariota (TLR) o dominio de
oligomerizacin de nucletidos (NOD) receptores implicados en la
respuesta inmune anti-inflamatoria. Efectos especficos de la cepa de
LAB resultado de la induccin de diversas vas de regulacin inmune
(Zeuthen et al. 2008 ; Macho Fernndez et al. 2011 ). Por lo tanto, el
programa de inmunizacin desarrolladas para las vacunas que se han
generado sobre la base de un miembro del grupo de laboratorio como un
portador de antgeno es a menudo inadecuado para la inmunizacin de
diferentes objetivos de acogida. Los datos obtenidos por diferentes
grupos de investigacin no son consistentes, y las dificultades que
resultan de la comparacin de la utilizacin de diferentes antgenos,
vectores y los calendarios de vacunacin. Los parmetros que afectan a

la respuesta inmune inducida por los prototipos de vacunas LAB se

discutirn en una parte posterior de esta subseccin.

Rutas de administracion
El primer uso de LAB como un vector de vacuna es un informe de 1990
de la utilizacin de formalina mat Streptococcus lactis clulas que
producen protena PAc (antgeno I / II) en la superficie celular para
inmunizar contra Streptococcus mutans . La inmunizacin intragstrica
de ratones dio como resultado la produccin de anticuerpos IgG e IgA
especficos; por lo tanto, se ha demostrado, por primera vez, que LAB
podra ser una alternativa atractiva a los portadores convencionales
bacterianas de antgenos extraos (Iwaki et al. 1990 ).
La mayora de los prototipos de vacunas utilizando cepas de LAB como
portadores dirigirse enfermedades infecciosas causadas por patgenos
humanos que penetran a travs de las membranas mucosas de los
tractos gastrointestinal, respiratorio y urogenital. Por esta razn, se
examinaron diferentes vas de administracin. Por ejemplo, en el caso
de S. pneumoniae , la eficacia de vacunas administradas por va
intranasal se evalu (Hanniffy et al. 2007 ), mientras que en el caso
de Helicobacter pylori , las vacunas orales o intragstrica fueron los
primeros en ser analizado (Li et al. 2014 ). Debido a que el tejido
linfoide asociado a la mucosa del sistema inmune mucosa-membrana
(MALT) constituye una red que cubre todo el cuerpo, y porque los
linfocitos son capaces de migrar, la inmunizacin oral tambin
proporciona inmunidad sistmica expresada por las membranas
mucosas de otros rganos. Cepas de LAB, en calidad de portadores
de S. pneumoniae antgenos, ya se han demostrado ser eficaces en la
inmunizacin intranasal (vase ms adelante). As, con base en los
conocimientos actuales sobre el funcionamiento MALT,
una L. lactis cepa, que comprende la AAPP gen
de S. pneumoniaeexpresado a partir de un promotor nisina inducible,
tambin se emple para la inmunizacin oral de adulto, as como
jvenes, ratones. Ambos se observaron la induccin de anticuerpos
especficos en el intestino y la estimulacin de una respuesta inmune
sistmica (IgG en el suero). Esta inmunizacin eleva la resistencia de los
ratones a la infeccin, aunque el efecto fue dependiente de la serotipo de
la cepa utilizada en el experimento de proteccin (Villena et
al.2008 , 2010 ).

cepas portadoras
Se llevaron a cabo muchos estudios sobre la eficacia de varios
representantes del grupo de laboratorio como portadores de antgenos
heterlogos para la vacunacin con el fragmento de la toxina tetnica

altamente inmunognica C-terminal (TTFC) como antgeno. Este

fragmento de protena ha sido intensamente estudiado como un
reemplazo para la toxina inactivada en la difteria, el ttanos y la tos
ferina vacuna combinada (DTP). El antgeno se produce en las clulas de
varias especies de bacterias del grupo de LAB ( L.
lactis , Lactobacillus spp., Y Streptococcus gordonii ) que difieren en su
capacidad de sobrevivir en nichos ecolgicos colonizados. Los estudios
con L. lactis y L. plantarum como portadores TTFC indic que la
inmunogenicidad deL. lactis fue significativamente menor que la
de L. plantarum , en particular cuando las cepas tenan una mutacin en
el ALR gen que codifica la alanina racemasa, una enzima implicada en la
sntesis de la pared celular. Se indujo Intestinal TTFC especfica
inmunoglobulina A slo despus de la inmunizacin con el
recombinante L. plantarum cepa mutante. Esta conclusin, sin
embargo, no fue inequvoca debido a que el gen que codifica TTFC se
expres en los portadores laboratorio a partir de promotores que son
difciles de comparar (un promotor nisina inducible y un promotor
constitutivo) (Grangette et al. 2004 ).
El efecto de la portadora en el nivel de la respuesta inmune tambin se
analiz con respecto a la eficacia de una vacuna potencial contra la
malaria. Las cepas que producen el antgeno bien caracterizado
superficie de merozoito (MSA2), una protena de superficie
de Plasmodium falciparum , se pusieron a prueba, utilizando una serie
de variantes. El antgeno producido en las clulas
de L. lactis , L. reuteri y L. salivarius se asoci con peptidoglicano de las
clulas vivas, ya sea por unin covalente o no covalente de unin, o se
encuentra en la superficie de las clulas tratadas con cido
tricloroactico (TCA). Adems, se utilizaron genticamente diferentes
lneas de ratones en los estudios. La inmunizacin nasal y bucal
combinada se emplea en este trabajo. Se observaron diferencias
significativas en los niveles de induccin y los tipos de respuesta inmune
inducida, dependiendo del tipo de animal inmunizado, el gnero de la
portadora, y la ubicacin del antgeno (Moorthy y
Ramasamy 2007 ). L. lactis y L. plantarum (ALR - ) cepas que expresan
la H. pylori subunidad B de la ureasa (UreB) tambin fueron analizados
para anti- Helicobacter inmunizacin. Un efecto positivo (induccin de
los anticuerpos y la reduccin del nivel de colonizacin de ratones por
especficas H. felis ) slo se observ despus de la vacunacin con
un Lactobacillus cepa (Lee et al. 2001 ;. Corthesy et al2005 ). Se postula
que algunos L. lactis cepas que muestran una alta afinidad para el moco
son candidatos prometedores para el desarrollo de una vacuna contra la
gripe aviar (Szatraj et al.2014 ; Radziwill-Bienkowska et al. 2014 ).
El impacto de la portadora en la induccin del sistema inmune y la
eficacia de la vacuna prototipo tambin se analizaron en relacin a las

vacunas contra S. pneumoniae . Los ensayos se realizan principalmente

en un modelo de ratn despus de la inmunizacin intranasal. La
licencia anti- S. pneumoniae vacunas contienen polisacridos
bacterianos [ vacuna de polisacrido (PSV)], que en algunas
preparaciones estn conjugados a una protena portadora
(CMR197- inactivo toxina de la difteria mutada ). Las cepas
de S. pneumoniae se caracterizan por una alta diversidad de serotipos
(ms de 90 serotipos se han descrito hasta el momento), por lo que las
vacunas son eficaces slo contra los serotipos cuya polisacridos estn
incluidos en la formulacin. Debido a la resistencia a mltiples frmacos
de la S. pneumoniae patgeno y las diferentes distribuciones geogrficas
de su serotipos, se llevan a cabo muchos estudios para desarrollar
formulaciones eficaces basadas en antgenos de protena
conservada. Varios antgenos de protena [ antgeno de superficie
neumoccica (PAAS), protena de superficie neumoccica (PspA), y
la protena neumoccica de proteccin (AAPP)] producido
porLactobacillus y Lactococcus especies en diferentes localizaciones
celulares han sido examinados como antgenos protectores. Amplia
informacin sobre el uso potencial de LAB de
anti S.pneumoniae inmunizacin se puede encontrar en la excelente
revisin de Villena et al. ( 2011 ).Los experimentos preliminares
demostraron que la administracin intranasal de L. lactis que produce el
antgeno intracelular PspA a ratones fue ms eficaz que intranasal o
inmunizacin subcutnea con la protena recombinante purificada
(Hanniffy et al. 2007 ). Los primeros intentos de inmunizacin
utilizando una L. casei cepa que contena el pspA gen
de S.pneumoniae clon en un plsmido y bajo el control de un promotor
inducible lactosa no mostraron estimulacin de la respuesta inmune,
probablemente debido a los bajos niveles de antgeno. Por lo tanto, para
la comparacin de la inmunogenicidad de las cepas de laboratorio llevar
la pspA gen, se emple un promotor constitutivo fuerte. Entre las cuatro
especies analizadas ( L. lactis , L. casei , L. plantarum y L. helveticus ),
utilizados para la inmunizacin de ratones nasal, el nivel ms bajo de la
respuesta inmune se observ para L. lactis , que se correlaciona con un
bajo nivel de antgeno producido y un corto tiempo de residencia mucosa
nasal por la cepa portadora. Las cepas de la Lactobacillus gnero
colonizaron la mucosa nasal durante aproximadamente 3 das y se
estimularon un nivel significativo tanto de IgG y IgA. Los estudios
tambin indican diferencias en el nivel de la respuesta inmune inducida
entre varias especies de Lactobacillus gnero. Los autores sugirieron que
refleja las diferencias en su potencial adyuvante intrnseca (Oliveira et
al. 2006 ). El efecto adyuvante de L. plantarumtambin se observ en el
anlisis de la eficacia de dos tipos de LAB, portadores del antgeno de
HPV E7, como vacunas teraputicas de
cncer. Aunque L. plantarum indujo una respuesta inmune menor

que L. lactis , la L. plantarum vacunacin result en una rpida

regresin de los tumores mucho ms (Cortes-Perez et al. 2007 ).

Los papeles de la ubicacin y la cantidad de antgeno

La influencia de la localizacin del antgeno, en el interior o en la
superficie de las clulas de la cepa portadora, sobre la eficacia de la
vacunacin ha sido probado varias veces. Location-junto con la va de
administracin, el programa de inmunizacin, el gnero / especie de la
cepa portadora, y la cantidad de antgeno es sin duda uno de los factores
que determina el nivel y el tipo de respuesta inmune inducida en el
husped. La investigacin hasta ahora no da una respuesta clara acerca
de la localizacin celular ms eficaz del antgeno para la inmunizacin.
Las protenas extraas en el citoplasma de LAB, incluso si son secretadas
por el husped natural (por ejemplo, la toxina del ttanos fragmento C),
tpicamente provocan un nivel satisfactorio de la respuesta inmune
(humoral y celular) (Grangette et al. 2002 ; Reveneau et al . 2002 ). Tal
localizacin evita la degradacin de los antgenos por las proteasas
presentes en el tracto gastrointestinal, y tambin los hace disponible
para el sistema inmune del husped slo despus de la lisis de las clulas
de la cepa portadora. La liberacin de grandes cantidades de antgeno
citoplsmico in vivo se puede asegurar utilizando cepas con un
nocaut ALR gen racemasa codificacin alanina (Grangette et al. 2004 ;
Hugentobler et al. 2012a ; Corthesy et al. 2005 ). La produccin de
grandes cantidades de protena extraa en el citoplasma es a veces letal
para las clulas de soporte, o la protena puede degradarse
intensamente. El uso de cepas que no producen proteasas exo- o
intracelulares tales como HtrA y Clp veces puede permitir la produccin
apropiada de antgeno heterlogo (Morello et al. 2008 ). En algunos
casos, la nica estrategia efectiva es para cambiar la ubicacin del
antgeno. La produccin intracelular de la protena E7 de papilomavirus
humano tipo 16 (HPV-16) dio lugar a su rpida degradacin. La
situacin no mejor en una L. lactis cepa incapaz de producir ClpP
proteasa. Las cantidades ms grandes de E7 solamente se obtuvieron
mediante el anclaje del antgeno E7 a la pared celular o su liberacin en
el medio ambiente (Bermudez-Humaran et al. 2002 ; Cortes-Perez et
al. 2003 ). Varias estrategias para "enviar" protenas heterlogas a la
superficie celular de las cepas de laboratorio o en el medio ambiente se
han desarrollado. Para la secrecin de antgeno, la secuencia seal de la
protena Usp45 ( protena secretada desconocido de 45 kDa ) -el
nicoL. lactis protena secretada en cantidades significativas
por L. lactis -est generalmente utilizado (van Asseldonk et al. 1990 ). La
secuencia seal Usp45 tambin dio lugar a la secrecin satisfactoria
en Lactobacillus especies. El mtodo para aumentar la eficiencia de la

secrecin es fusionar una secuencia de nucletidos que codifica la

protena antignica a una secuencia de nucletidos que codifica el
pptido sinttico LEISSTCDA (Guimaraes et al. 2006 ). La insercin de
este pptido afecta potencialmente conformacin precursor y por lo
tanto facilita su procesamiento por chaperones citoplsmicos de
secrecin, o puede optimizar el equilibrio de carga alrededor del sitio de
escisin de la seal para facilitar la translocacin (Le Loir et al. 1998).
Dos estrategias se utilizan para presentar antgenos heterlogos sobre la
superficie de LAB. El primero hace uso de la terminal C de las protenas
ancladas por clulas que contienen el motivo de reconocimiento de
LPXTG. La unin covalente de la pared celular de protenas de fusin
que llevan este motivo depende de la actividad de sortase A (srta), una
enzima con actividad transpeptidasa (Llamada y
Klaenhammer 2013 ). Hasta la fecha, los LPXTG motivos de la
proteinasa PrtP de Lactococcus (Ramasamy et al. 2006 ), la proteinasa
prtb de L. delbrueckiisubsp. bulgaricus (Kim et al., 2008 ), la protena
M6 de S. pyogenes (. Dieye et al 2001 ; Ribeiro et al. 2002 ; Wieczorek y
Martin 2010 ), y la protena A de Staphylococcus aureus se han utilizado
para asegurar la localizacin en la superficie de diferentes antgenos
(Steidler et al.1998b ). El segundo enfoque se basa en la (PA) dominio de
unin a peptidoglicano de algunas protenas, tales como lactococcal
ACMA, el principal autolisina de L. lactis (Buist et al. 1997 ).El PA se
encuentra en el extremo C terminal de ACMA y comprende tres motivos
LysM, cada uno con alrededor de 45 aminocidos, separados por
secuencias espaciadoras. Despus de la secrecin, ACMA se dirige a la
pared celular y su terminal C determina su unin no covalente a la
peptidoglicano de la pared celular (Buist et al. 2008 ). Se ha demostrado
que fusiones de PA hbridos mostraron unin similar (Bosma et
al. 2006 ; Steen et al. 2003 ; Raha et al. 2005 ).Adems, los dominios
LysM de otras bacterias Gram-positivas se unen protenas heterlogas a
la peptidoglicano de la pared celular (Xu et al. 2011 ; Turner et
al. 2004 ;. Hu et al 2010 ). En 2011, se identific la protena bsica de
membrana lipoprotena A (BmpA), un componente del transportador
ABC clsico responsable de la importacin de las purinas, (Berlec et
al. 2011 ).BmpA es covalentemente anclado a la bicapa de membrana. La
posibilidad de utilizar esta protena como un portador de antgenos est
siendo examinada (Zadravec et al. 2014 ).
Determinacin de la secuencia genmica de muchas cepas de LAB ha
permitido el anlisis de sus proteomas, incluyendo el secretoma (el
conjunto de protenas que forman la envoltura celular y las secretadas en
el medio ambiente). Estos datos se pueden utilizar para la bsqueda de

nuevas estrategias orientadas a la manipulacin de la localizacin de

antgenos extraos en las clulas de la portadora.
El primer objetivo del estudio fue determinar la importancia de la
localizacin del antgeno para la induccin de respuesta inmune utiliza
la toxina del ttanos antes mencionado fragmento C (TTFC) (Reveneau
et al. 2002 ). En ese trabajo, los autores evaluaron la inmunogenicidad
de las cepas recombinantes de L. plantarum producir variantes de TTFC
que fueron a el citoplasma, a la pared celular o al medio
ambiente. Tambin probaron tres vas de inmunizacin en ratones:
subcutnea, intra-gstrico, o intranasal. Las respuestas inmunes (IgG
especfico en suero) establecidos despus de la aplicacin subcutnea no
dependen de la localizacin del antgeno.En contraste, cuando se
administra a las superficies mucosas del estmago o de la nariz, los
mejores resultados se obtuvieron cuando el antgeno estaba presente en
el citoplasma.Produccin citoplasmtica condujo a la mayor produccin
de TTFC y que se cree que es la causa de las diferencias observadas. La
cantidad de antgeno en la administracin intragstrica clulas
portadoras despus es muy importante. Se observ una respuesta
inmune significativa despus de la administracin de L. plantarum que
contiene altas cantidades de protenas TTFC (Grangette et
al. 2002 ). Cuando cantidades ms bajas de antgeno estaban presentes
en el citoplasma, los niveles de anticuerpos IgG slo aumentaron
despus de la administracin intranasal. Adems, estos anticuerpos no
neutralizan la toxina del ttanos. Un efecto protector slo se observ
cuando las cepas de LAB que producen altas concentraciones de
antgeno se administraron a la mucosa nasal, lo que sugiere que la
cantidad del antgeno es importante para la induccin de anticuerpos
con una alta avidez (Grangette et al. 2001 , 2002 ).
El uso de diferentes cepas portadoras o diferentes vas de administracin
a menudo hace imposible comparar y evaluar la importancia de la
localizacin del antgeno en la induccin de una respuesta inmune. Por
esta razn, los estudios de Marelli et al. en el uso de L. lactis como el
portador de la protena VP8 rotavirus son dignos de mencin. En los
ratones que fueron inmunizados por va oral con una L. lactis cepa que
produce la forma citoplasmtica de antgeno VP8, se observaron niveles
significativos de anticuerpos IgA intestinales. Pero cuando el antgeno
VP8 estaba anclado a la L. lactis pared celular por S. pyogens M6
dominio pared celular protena de anclaje, la respuesta inmune incluye
ambos anticuerpos sIgA especficos a lo largo de las membranas
mucosas del tracto gastrointestinal, as como la induccin de anticuerpos
IgG. Posteriormente, la capacidad infecciosa de las partculas virales
incubadas con anticuerpos aislados a partir de los animales inmunizados
se estudi usando la lnea de clulas MA-104 (lnea celular de rin de
mono fetal). Los anticuerpos de los animales que se inmunizaron con

el L. lactis cepa con protena VP8 localizada en el sobre mostr 100% de

neutralizacin de las partculas virales, mientras que los anticuerpos de
los animales que se inmunizaron utilizando una cepa con localizacin
citoplasmtica del antgeno mostraron reduccin slo 50% de la
infectividad viral (Marelli et al. 2011 ). El uso de la protena VP7, un
antgeno de rotavirus diferente, proporcion datos contradictorios. Los
anticuerpos inducidos por una forma de la protena anclada en la
envoltura celular no neutralizan partculas virales.La mayor
inmunogenicidad fue exhibida por el L. lactis cepa que segrega la
protena VP7 en el medio ambiente (Prez et al. 2005 ).
Tambin se ha observado que el tipo de anclaje con motivos en la
superficie de las clulas de BAL presentadoras de antgeno puede afectar
de manera significativa la eficacia de la vacunacin (Kajikawa et
al. 2011 ). En la literatura reciente, tambin se discute la importancia de
la suerte del antgeno despus de que se entrega al organismo
inmunizado. Por ejemplo, un efecto extremadamente positivo se obtuvo
mediante la generacin de una fusin del antgeno protector (PA)
de Bacillus anthracis con un pptido que lo entrega a las clulas
dendrticas (DCs) (Mohamadzadeh et al. 2009 , 2010 ). Potenciacin de
la respuesta inmune tambin se obtuvo mediante la coexpresin de
una Salmonella enterica gen que codifica la flagelina, una protena
estimulante de los receptores de TLR5, y un gen que codifica la protena
Gag HIV-1 en una L. acidophilus cepa (Kajikawa et al. 2012 ).

Comparacin de la eficacia de las cepas de Lactobacillus vivos y

partculas GEM
En 2005, un nuevo sistema de soporte se ha desarrollado utilizando LAB
nongenetically modificado (Bosma et al. 2006 ). Cuando las clulas LAB
se tratan con cido tricloroactico caliente, lo que les priva de cidos
lipoteicoicos superficie, las protenas y el contenido citoplsmico, el
peptidoglicano se mantiene intacto y proporciona una forma de la
partcula similar a las clulas vivas. Las partculas resultantes se conocen
como promotor de la matriz de Gram-positivas (GEM). El procedimiento
se aplica las protenas de fusin antgeno-PA producidos y purificados a
partir de (recombinante) Escherichia coli o L. lactis , que
posteriormente se mezcla con partculas de GEM. Partculas GEM
revelan mayor capacidad de unin de protenas fusionadas que
contienen dominio PA LAB que las clulas vivas. Por lo tanto, esta
estrategia ofrece la oportunidad de usar organismo nongenetically
modificado (no OGM) y la formulacin lista para ir. La falta de ADN
recombinante en este procedimiento elimina el riesgo de difusin
incontrolada de cidos nucleicos en el medio ambiente. Una ventaja
adicional de esta estrategia es la estabilidad de las partculas de GEM y

la posibilidad de almacenamiento a largo plazo (Bosma et al. 2006 ; van

Roosmalen et al. 2006 ). Adicionalmente, se ha demostrado
recientemente que la mezcla de la vacuna de subunidad con las
partculas de GEM resulta en una respuesta inmune fuertemente
mejorada especialmente despus de la aplicacin intranasal sencilla
(vase ms adelante). Por lo tanto, las partculas de GEM producidos a
partir de una bacteria, que se utiliza en la produccin de productos
lcteos, son ms seguros en comparacin con otros adyuvantes y se
pueden considerar como un adyuvante de la mucosa candidato para su
uso en seres humanos. Sin embargo, las partculas de GEM tienen una
desventaja en comparacin con el uso de cepas de BAL en vivo
( Lactobacillus ) para la inmunizacin. Cepas vivas pueden colonizar el
intestino, reduciendo el nmero de dosis de vacuna necesarios y
simplificando significativamente el procedimiento de inmunizacin.
Hasta el momento, las partculas de GEM han sido probados como
portadores para inmunizar contra tres agentes
patgenos: S. pneumoniae [proteasa IgA1 (IgA1p), proteinasa putativa
protena de maduracin A (PMMA), y la lipoprotena de estreptococos
(RLEA)], Yersinia pestis(la protena LcrV), y P. falciparum (el antgeno
de superficie de merozoito MSA2) (Audouy et al.2006 , 2007 ;
Ramasamy et al. 2006 ;. Ramrez et al 2010 ). La inmunogenicidad y la
eficacia protectora de L. lactis partculas GEM que
muestran Y. pestis LcrV se investig en un modelo de ratn
neonatal. Los ratones recin nacidos inmunizados por va intranasal con
GEM-LcrV desarrollaron anticuerpos LcrV-especficos, de tipo Th1
inmunidad mediada por clulas, y estaban protegidos contra
letal Y. pestis (peste) infeccin (Ramrez et al. 2010 ). GEM MSA2
presentar utilizado para vacunas orales de conejos era igualmente eficaz
en la obtencin de respuestas de anticuerpos especficos de antgeno
como vivo L. lactis clulas que producen el mismo antgeno (Ramasamy
et al. 2006 ). La inmunizacin intranasal con partculas de GEM que
muestran tres antgenos de neumococo (PMMA, RLEA, y IgA1p) mostr
una proteccin significativa contra la neumona neumoccica fatal en los
ratones (Audouy et al. 2006 , 2007 ).Tambin se demostr que las
partculas de GEM pueden constituir una plataforma para la
presentacin de varios antgenos al mismo tiempo, que puede ser
importante para la inmunizacin contra patgenos con una alta
variabilidad gentica, tales como Campylobacter jejuni , una causa
principal de enfermedades gastrointestinales transmitidas por los
alimentos (Kobierecka et al. 2015 ; Wyszynska et al. 2004 ). Los
resultados ilustran el potencial de usar nongenetically
modificado L. lactis como vehculo de suministro de vacuna segura para
provocar anticuerpos sistmicos, evitando as la difusin de ADN
recombinante en el medio ambiente. Cuando se utilizan partculas de

GEM como una plataforma para la presentacin de antgenos

heterlogos, la inmunizacin intranasal es generalmente ms eficaz con
respecto a la respuesta inmune inducida, as como para el efecto
protector.
Partculas de GEM, aunque carente de protenas de superficie,
conservando propiedades inflamatorios caractersticos de bacterias vivas
(Audouy et al. 2006 , 2007 ) y tienen propiedades adyuvantes. Si bien el
anlisis de las propiedades adyuvantes de partculas GEM, una vacuna
monovalente H3N2 disponible en el mercado, que contienen partculas
de hemaglutinina y GEM, se administr a los ratones por va
intranasal. En contraste con otros experimentos, el antgeno del virus de
influenza no estaba anclado en la superficie de las partculas de GEM,
sino que ms bien constituye un componente separado de la
vacuna.Mientras que la respuesta sistmica resultante (IgG) fue similar a
los ratones vacunados por va intramuscular con la vacuna de la gripe, la
respuesta de la mucosa (sIgA) fue significativamente mayor para la
vacunacin intranasal con partculas de GEM. Un aumento del nmero
de clulas productoras de IFN- se observ tambin, que indica la
respuesta dominante de los linfocitos de tipo Th1 (Saluja et
al. 2010a ). Cuando se utilizan partculas de GEM como un adyuvante, la
dosis de hemaglutinina se puede reducir hasta inducir cinco veces y
todava un efecto protector en ratones (Saluja et al. 2010b ).
Estos resultados prometedores despertado el inters de Mucosis BV, una
compaa de biotecnologa holandesa (mucosis es la primera spin-off de
la Fundacin Biomade Tecnologa) (Audouy et al. 2006 ). Una fase I de
ensayos clnicos de una vacuna contra la gripe mucosis para uso humano
(FluGEM) est casi terminada. FluGEM es la nica vacuna, basada en
LAB como portadores, para llegar a esta etapa de la investigacin.

LAB como vacunas de ADN

La inmunizacin gentica con ADN de plsmido se ha estudiado durante
ms de 20 aos, tanto para la inmunoprofilaxis de enfermedades
infecciosas y tambin la inmunoterapia del cncer.La inmunizacin con
ADN conduce a la induccin de respuestas inmunes tanto humorales
como celulares. El ADN del plsmido se puede enviar por inyeccin
intramuscular (la llamada inmunizacin con ADN desnudo) o el uso de
portadores bacterianos adecuados. Los estudios intensivos llevado a
cabo hasta ahora se han centrado en el uso de, bacterias enteropatgenas
atenuadas, tales como Salmonella spp., Yersinia enterocolitica ,
o Listeria monocytogenes , as como convenientemente
modificada E. coli clulas productoras de listeriolysine O ( L.
monocytogenes ) y / o invasina ( Y. enterocolitica ) como portadores de

ADN (Daudel et al.2007 ; Schoen et al. 2008 ). Los estudios iniciales han
demostrado que un 3-h de incubacin deL. lactis cepa MG1363, que
alberga ADN plsmido, con clulas Caco-2, los resultados en la
transferencia del plsmido en las clulas eucariotas y la expresin del
plsmido (Guimaraes et al. 2006 ). La transferencia de ADN tambin se
ha observado in vivo en ratones, despus de la administracin oral de
la L. lactis producir el alergeno probado (BLG protena-vaca lactoglobulina) cepa. La presencia de ADN complementario (ADNc) y la
produccin de protenas en las clulas del intestino delgado, y la
produccin de anticuerpos IgG e IgA especficos, se inform tanto. El
mecanismo de entrada para el BLG gen permanece sin explicacin. Hay
por lo menos dos posibilidades: o bien las clulas eucariotas ocupan
plsmido de ADN que se libera en el intestino de L. lactis , o L. lactis ha
sido tomada por las clulas eucariotas (Chatel et al. 2008 ).
Debido LAB se piensa generalmente para ser incapaz de invadir las
clulas eucariotas, las cepas fueron diseados para interactuar con las
clulas eucariotas, lo que llevara a su internalizacin.La transferencia de
ADN plsmido en las clulas eucariotas ha sido intensamente estudiado
utilizando L. lactis que, o bien expresa extracelularmente protena
PUFNA (una protena de unin a fibronectina A de S. aureus ) o InlA
( L. monocytogenes internalina). La descrito anteriormente BLG gen y
de la GFP gen (que codifica la protena de fluorescencia verde) se usaron
como genes indicadores (ADNc). FnBPA, probado tanto in vitro como in
vivo, el aumento de la cantidad de ADN del gen informador en clulas
eucariotas, pero no aument la cantidad de antgeno producido. Los
datos sugieren, adems, diferentes mecanismos de in vitro e in vivo en la
entrada (Pontes et al. 2012 ). De manera similar, se observaron niveles
elevados de la invasividad y la entrega del plsmido GFP-codificacin en
el experimento in vitro utilizando L. lactis que expresa la principal
internalina InlA de L. monocytogenes . El receptor para internalina A es
la E-cadherina. Debido a la estructura de los diversos E-cadherinas, InlA
reconoce E-cadherina humana pero no murino. La construccin de
una L. lactis NZ9000 cepa expone la forma mutada de InlA, que se une a
murino E-cadherina, por lo que es posible llevar a cabo experimentos in
vivo en el modelo murino. Estos, al igual que los experimentos in vitro,
mostraron un aumento de la invasividad de la cepa, aunque la
produccin de la protena analizada (BLG) no fue mayor en vivo
(Innocentin et al. 2009 ; de Azevedo et al. 2012 ). El anlisis in vitro
anterior, as como los datos sobre la inmunizacin
contra S. neumona con ADN de plsmido puro, obtenido a partir de los
experimentos in vivo (Ferreira et al. 2006 ;. Vadesilho et al 2012 ),
sugieren un alto potencial para la aplicacin del LAB como vacunas de
ADN.

La modulacin de la actividad del sistema inmune

Las citoquinas juegan un papel importante en la sealizacin celular, la
transmisin de estmulos y dirigir las respuestas inmunes. Se han hecho
intentos de utilizar cepas de BAL para llevar partculas que pueden
controlar el tipo de respuesta inmune inducida, con el objetivo principal
de su uso como terapia para enfermedades inflamatorias del tracto
gastrointestinal (Wells y Mercenier 2008 ). Vectores de laboratorio que
expresan antgenos de microorganismos patgenos o secretan citoquinas
en el medio ambiente deben evocar una respuesta inmune ms
efectiva. Los primeros estudios sobre el uso de las citocinas en la
inmunizacin con L. lactisimplicado la administracin intranasal en
ratones de una L. lactis cepa, producir tanto el TTFC y citoquinas
murinas biolgicamente activas de IL-2 o IL-6. Coproduccin inducida
por niveles significativamente ms altos de anticuerpos IgG especficos
que cuando L. lactis produce slo TTFC (Steidler et al. 1995 , 1998a ). El
uso de L. lactis que expresan interleucina 2 de pollo (Chil-2) junto con
hemaglutinina de la gripe aviar (H5) tambin revelaron propiedades
adyuvantes de Chil-2, y el estudio sugiere que L. lactis podra ser un
candidato prometedor como portador de antgenos en las vacunas contra
la gripe aviar (Szatraj et al. 2014 ). En los ltimos aos, la influencia de
la IL-12 en el sistema inmune ha sido ampliamente estudiado.Uno de los
ejemplos prometedores de IL-12 en la inmunoprofilaxis es el desarrollo
de una vacuna contra la leishmaniasis, una enfermedad infecciosa
causada por Leishmania parsitos que mata a 50.000 personas al ao en
todo el mundo. Dos L. lactis se desarrollaron cepas, una produccin de
una L. importante antgeno, LACK, anclado a la pared celular
bacteriana, y la segunda secretor murino activo IL-12. La administracin
subcutnea de las dos cepas a ratones dio lugar a una respuesta Th1
especfica (Hugentobler et al. 2012b ). Una cepa capaz de expresin
simultnea del antgeno LACK y IL-12 evoc una respuesta inmune que
protege a los ratones de una posterior infeccin
por L. importante (Hugentobler et al. 2012a ).

Resumen
En las dos dcadas desde los primeros informes, se han publicado
muchos estudios de LAB como vectores de vacuna. La mayora de estos
LAB utilizado como portadores de antgenos extraos para inmunizar
contra los patgenos que entran al cuerpo humano a travs de las
membranas mucosas de los tractos respiratorio y digestivo. Cepas de
laboratorio muestran un enorme potencial, especialmente el uso de los
miembros del Lactobacillus gnero para la inmunoprofilaxis. Sin
embargo, los resultados de los diversos estudios son difciles de
comparar e interpretar debido a la gran diversidad de la fisiologa y la

gentica bacteriana dentro del grupo de laboratorio. El LAB se

caracteriza no slo por una variada capacidad de sobrevivir en el
ambiente intestinal, sino tambin por un variado interaccin de las
bacterias con las superficies epiteliales y clulas linfticas, incluso entre
cepas de la misma especie. En conclusin, hay que destacar que cada
vacuna potencial que utiliza LAB como portadores de antgenos
probablemente requerir diferentes construcciones genticas, en
trminos de la localizacin del antgeno en la clula portadora, y
diferentes esquemas de inmunizacin.Adems, la eficacia de estos
constructos slo se conoce a travs de ensayos in vitro e in vivo.GEM
partculas son derivados no son en directo y no recombinante
de L. lactis . Por lo tanto, esta estrategia elimina todos los riesgos
atribuibles a la aplicacin de OMG. Sin embargo, utilizando GEMs
requerir procedimiento de inmunizacin complicado. No son eficaces
cuando se utilizan para la inmunizacin oral, pero eficaz cuando se
administra por va intranasal. Por otro lado, hasta ahora ensayadas
portadores LAB vivo modificados genticamente, de antgenos
heterlogos contienen plsmidos que albergan genes acondicionado
resistencia antibiticos. Por lo tanto, la introduccin de estas cepas para
la vacunacin humana o animal requerir la construccin de sistemas de
equilibrio husped-vector especficos en los que las deleciones
cromosmicas de los genes de limpieza se complementar con copias de
tipo salvaje de genes presentes en los plsmidos. Esta estrategia, que
elimina los marcadores de resistencia a frmacos en las vacunas vivas, se
ha utilizado con xito en caso de otras vacunas vivas. Basado en datos
publicados hasta la fecha, el uso de GEM vs cepas de LAB en vivo para la
inmunizacin humana ser determinado por el tipo requerido de la
respuesta inmune, as como por la ruta ms eficiente de la inmunizacin,
y tiene que ser verificada en pruebas clnicas.