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Las semanas del 22/9 al 26/9 y 29/9 al 3/10 se realizar el Trabajo Prctico N2.
Los alumnos debern asistir nicamente en la semana que les corresponda al
AULA de BIOQUIMICA del 4 PISO ASCENSORES DERECHA donde se realizar
primero una breve explicacin de lo que se har durante el prctico.
Se realizarn: Medicin de Glucemia, ELISA, anlisis de orina por tiritas reactivas y
una mostracin de una corrida electrofortica de protenas. Las determinaciones
corresponden a dos pacientes X y Z y se agregan dos casos clnicos para discutir con los
resultados obtenidos.
Habr protocolos resumidos en las mesadas para que los alumnos puedan seguirlos
pero NO deben llevrselas.
DETERMINACIN DE GLUCEMIA
FUNDAMENTO DEL MTODO:
Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O
peroxidasa
quinonimina roja
PROTOCOLO
TUBO
B
T1
T2
T3
T4
Muestra (X o
Z)
H2O
(ml)
1
0.75
0.5
0.25
-
T
(ml)
0.25
0.5
0.75
1
MUESTRA
(ml)
1
REACTIVO
(ml)
1
1
1
1
1
1
A)
B)
C)
D)
Absorbancia
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
100
200
300
Absorbancia
Blanco
Testigo 1 (60 mg%)
Testigo 2 (125 mg%)
Testigo 3 (190 mg %)
Testigo 4 (250 mg%)
ELISA
La eleccin del sustrato es crtica en el ELISA . Los sustratos deben ser estables y
solubles antes y despus de la reaccin enzimtica. Los sustratos cromognicos deben
ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados despus de la degradacin. Los
sustratos fluorognicos, que producen un compuesto fluorescente,
pueden
ser
Elisa
Indirecto.
Este
mtodo
utilizado,
Fundamento:
1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra
inmovilizado el antgeno (antgenos citoplasmticos y de membrana de Trypanosoma
cruzi). Si la muestra contiene el anticuerpo especfico se formar un complejo antgenoanticuerpo que quedar unido a la cubeta. Luego de la incubacin la fraccin no unida se
elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo antiinmunoglobulina humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contena
anticuerpos especficos que formaron complejo con el antgeno y quedaron adheridos a la
cubeta, entonces el anticuerpo conjugado se unir a los anticuerpos especficos. Luego
de la incubacin, el exceso de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimtico. Si se uni el conjugado, entonces la
peroxidasa producir la reaccin enzimtica dando un color celeste. El sustrato es el
Revelador. La reaccin se detiene con el stopper (cido sulfrico) con lo que el color
celeste vira a amarillo.
Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)
Rotular los pocillos con Nmero de GRUPO y Nmero de Muestra. Mantener cubiertos
con cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa
determinacin. Si el pocillo est rotulado, significa que ya ha sido usado.
2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos
previamente rotulado como (1).
3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos
previamente rotulado como (2).
4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporacin e incubar durante 30
minutos a 37C en bao termosttico. Fijarse que los pocillos estn en contacto con el
agua, pero que no se hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri
plstica que flota en el lquido del bao.
5. Descartar el lquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER
DE LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y despus
descartar con firmeza el lquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces ms (5
lavados en total). Despus del ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual
invirtiendo los pocillos y golpendolos varias veces sobre papel absorbente.
6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.
7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a
37C en bao termosttico.
8. Descartar el lquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO,
como se realiz anteriormente.
9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales
suaves. Puede llevarse a 37C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la
Muestra X (de 15 a 30 min).
10. Detener la reaccin con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo.
Evaluar a simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.
ELECTROFORESIS
Se colocar una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del
paciente Z en las puntas de cada mesada que dan al pizarrn. Cada grupo de alumnos
usar la orina correspondiente a la muestra del paciente que le toc de la glucemia.
Protocolo:
Examen de laboratorio
Sangre
Glucemia: ______
Proteinemia total: 7 g%
Colesterol total: 260 mg%
Col HDL: 30
Col LDL: 200
TAG: 180 mg %
Bilirrubina total : 1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg %
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg %
Uremia: 25 mg%
Uricemia: 6.5 mg %
Valores de Referencia
70-110 mg%
6-8 g%
<200 mg%
>40 mg%
<100 mg%
<150 mg%
0.8-1 mg%
<0.2 mg%
0.6-1.4 mg%
15-45 mg%
<8 mg%
CUESTIONARIO:
- En base a los valores indicados ms arriba y los obtenidos en el trabajo prctico,
indique posibles alteraciones metablicas presentes en este paciente.
1.- Qu caractersticas considera presentar la orina de este paciente a nivel de:
a) examen fsico, b) qumico y c) microscpico.
2.- Si el anlisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra tcnica que conoce
podra ser utilizada para confirmar el diagnstico?
PACIENTE Z
Un paciente de 18 aos de edad acude al servicio de urgencias con alteracin del estado
de conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3
aos y est siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucmico.
Cinco das antes del ingreso haba comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo
cual fue a pasar unos das a la costa con amigos. Durante los ltimos dos das, adems
de la diarrea, present vmitos y en el ltimo da haba dejado de ponerse la dosis de
insulina de la noche.
Examen Fsico
Impresin de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratacin con mucosas
secas y signo del pliegue. Aliento cetnico. Responde a estmulos dolorosos.
Temperatura: 38C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas.
Auscultacin cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpacin, sin
visceromegalias, ruidos intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg
Datos Complementarios
Sangre:
Glucemia: -------Proteinemia total: 9,5 g%
Na: 132 mEq/l
K: 3.0 mEq/l
Cl: 95 mEq/l
pH: 7.10
pCO2: 30 mmHg
% Sat O2: 95
CO3H: 10 mEq/l
leucocitos: 12500/mm3
Valores de Referencia
70-110 mg %
6-8 g %
135-155 mEq/l
3,5- 5,5 mEq/l
98-107 mEq/l
7,38-7,42
32-48 mmHg
95-98%
2028 mM
5000-10000/mm3
Orina:
CUESTIONARIO:
1- Qu enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metablicas presentes en sangre y orina.
3- Qu tratamiento en lneas generales le dara a este paciente?