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SEGUNDO TP BIOQUIMICA HUMANA 2014

GLUCEMIA-ORINA- ELISA CHAGATEST

Las semanas del 22/9 al 26/9 y 29/9 al 3/10 se realizar el Trabajo Prctico N2.
Los alumnos debern asistir nicamente en la semana que les corresponda al
AULA de BIOQUIMICA del 4 PISO ASCENSORES DERECHA donde se realizar
primero una breve explicacin de lo que se har durante el prctico.
Se realizarn: Medicin de Glucemia, ELISA, anlisis de orina por tiritas reactivas y
una mostracin de una corrida electrofortica de protenas. Las determinaciones
corresponden a dos pacientes X y Z y se agregan dos casos clnicos para discutir con los
resultados obtenidos.
Habr protocolos resumidos en las mesadas para que los alumnos puedan seguirlos
pero NO deben llevrselas.

DETERMINACIN DE GLUCEMIA
FUNDAMENTO DEL MTODO:

Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O

cido glucnico + H2O2

H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato

peroxidasa

quinonimina roja

PROTOCOLO
TUBO
B
T1
T2
T3
T4
Muestra (X o
Z)

H2O
(ml)
1
0.75
0.5
0.25
-

T
(ml)
0.25
0.5
0.75
1

MUESTRA
(ml)
1

REACTIVO
(ml)
1
1
1
1
1
1

A)
B)
C)
D)

Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma


Incubar 15 min a temperatura ambiente
Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolormetro a 500nm
Leer las A 500nm de los tubos de la CURVA DE CALIBRACION o de los tubos de
las MUESTRAS INCGNITAS (X o Z).
E) Realizar la curva de calibracin (grfico A vs [glucosa])
F) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incgnita en dicho
grfico y determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del
valor de la muestra, utilizando la curva.
1

La concentracin del testigo es de 250 mg%. Los alumnos debern calcular la


concentracin de glucosa de cada uno de los puntos que corresponden a:
Tubo blanco
Testigo 1: 60 mg%
Testigo 2: 125 mg%
Testigo 3: 190 mg%
Testigo 4: 250 mg%

Valores obtenidos por los docentes:

Absorbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0

100

200

300

Concentracin glucosa mg%

Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.


Graficar la curva de Absorbancia en funcin de la Concentracin de Glucosa, en hoja
milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar
este valor a los docentes.
TUBOS

Absorbancia

Blanco
Testigo 1 (60 mg%)
Testigo 2 (125 mg%)
Testigo 3 (190 mg %)
Testigo 4 (250 mg%)

ELISA

El enzimoinmunoanlisis es una de las tcnicas inmunoqumicas ms importante


desarrollada en los ltimos aos. Los inmunoensayos sirven para detectar y cuantificar
antgenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de los antgenos. Si el ensayo es
adecuado son rpidos y fciles rindiendo informacin que sera difcil obtener utilizando
otras tcnicas.
El enzimoinmunoanlisis es un mtodo objetivo y automatizable; a diferencia del RIA
est exento de legislacin restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un
tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que slo se
necesita un equipo sencillo y econmico, han llevado al desarrollo reciente de
numerosos enzimoinmunoanlisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados
para su utilizacin en laboratorios pequeos y en pases en desarrollo.
Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanlisis conocido como anlisis por
enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta tcnica presenta como requisito
que los anticuerpos o los antgenos se puedan ligar a una enzima y que este complejo
retenga tanto la actividad inmunolgica como la enzimtica.
En estos ensayos, el antgeno o el anticuerpo se une usualmente a un soporte de fase
slida para facilitar la separacin de los reactivos libres y combinados. Se ha hallado que
antgenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al material particulado, como
celulosa, poliacrilamida, y que tambin se puede obtener una adsorcin pasiva
satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o
polipropileno. Como ya se ha mencionado una parte esencial del ELISA es la
conjugacin del anticuerpo (o antgeno) con una enzima. Es necesario que la enzima
tenga actividad elevada, sea econmica, fcil de obtener en forma pura, y que posea
una reaccin con el sustrato fcilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora
ms satisfactorias son la peroxidasa del rbano picante, la glucosa oxidasa, la galactosidasa y la fosfatasa alcalina. Estas son fijadas generalmente a anticuerpos o
antgenos por medio de glutaraldehdo o periodato. Los conjugados as obtenidos han
demostrado ser estables durante muchos meses, incluso aos.
3

La eleccin del sustrato es crtica en el ELISA . Los sustratos deben ser estables y
solubles antes y despus de la reaccin enzimtica. Los sustratos cromognicos deben
ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados despus de la degradacin. Los
sustratos fluorognicos, que producen un compuesto fluorescente,

pueden

ser

ventajosos para anlisis de alta sensibilidad.


ELISA INDIRECTO
Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede clasificar segn
varios criterios diferentes, describiremos el mtodo ms comnmente
denominado

Elisa

Indirecto.

Este

mtodo

utilizado,

es ampliamente utilizado para la

determinacin de anticuerpos, ya que se necesitan slo unos pocos conjugados (ej.


anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas marcadas con enzimas) para analizar
anticuerpos de una gran variedad de enfermedades. La tcnica es la siguiente:
1) El antgeno correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan.
2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se lavan
nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antgeno inmovilizado en la
superficie de las concavidades.
3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se incuba en las
concavidades; ste reacciona con cualquier anticuerpo "capturado en el paso anterior.
El exceso de reactivo se lava.
4) Se agrega el sustrato enzimtico y las placas se incuban; la velocidad de la
degradacin se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentracin de
anticuerpo de las muestras del paso (2).
5) Se detiene la reaccin y el color se determina en un espectrofotmetro

ELISA (Chagatest de Wiener lab)

Fundamento:
1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra
inmovilizado el antgeno (antgenos citoplasmticos y de membrana de Trypanosoma
cruzi). Si la muestra contiene el anticuerpo especfico se formar un complejo antgenoanticuerpo que quedar unido a la cubeta. Luego de la incubacin la fraccin no unida se
elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo antiinmunoglobulina humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contena
anticuerpos especficos que formaron complejo con el antgeno y quedaron adheridos a la
cubeta, entonces el anticuerpo conjugado se unir a los anticuerpos especficos. Luego
de la incubacin, el exceso de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimtico. Si se uni el conjugado, entonces la
peroxidasa producir la reaccin enzimtica dando un color celeste. El sustrato es el
Revelador. La reaccin se detiene con el stopper (cido sulfrico) con lo que el color
celeste vira a amarillo.

Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)

Rotular los pocillos con Nmero de GRUPO y Nmero de Muestra. Mantener cubiertos
con cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa
determinacin. Si el pocillo est rotulado, significa que ya ha sido usado.
2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos
previamente rotulado como (1).
3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos
previamente rotulado como (2).
4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporacin e incubar durante 30
minutos a 37C en bao termosttico. Fijarse que los pocillos estn en contacto con el
agua, pero que no se hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri
plstica que flota en el lquido del bao.
5. Descartar el lquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER
DE LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y despus
descartar con firmeza el lquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces ms (5
lavados en total). Despus del ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual
invirtiendo los pocillos y golpendolos varias veces sobre papel absorbente.
6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.
7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a
37C en bao termosttico.
8. Descartar el lquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO,
como se realiz anteriormente.
9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales
suaves. Puede llevarse a 37C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la
Muestra X (de 15 a 30 min).
10. Detener la reaccin con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo.
Evaluar a simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.

ELECTROFORESIS

Observar cmo se siembran las muestras de protenas en geles de poliacrilamida-SDS


al 10 %, para realizar una corrida electrofortica de protenas. En este sistema de
electroforesis las protenas se separan solamente por sus diferencias en el peso
molecular, ya que todas estn cargadas negativamente en su superficie por el SDS
(detergente). Luego, pueden observar cmo va avanzando la electroforesis con el paso
del tiempo.
Tambin pueden ver algunos geles, en los cuales ya ha terminado la electroforesis y
luego fueron teidos con un colorante para protenas, llamado Coomasie Blue. Se
observa cada calle del gel con diferentes bandas teidas de color azul, cada banda
corresponde a una, dos o tres protenas del mismo peso molecular.
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LOS ALUMNOS DEBEN ENTREGAR UN INFORME CON LOS RESULTADOS del


ELISA y de la GLUCEMIA TANTO DE LA MUESTRA X COMO DE LA MUESTRA Z y la
discusin de los casos clnicos

TIRILLAS REACTIVAS DE ORINA

Se colocar una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del
paciente Z en las puntas de cada mesada que dan al pizarrn. Cada grupo de alumnos
usar la orina correspondiente a la muestra del paciente que le toc de la glucemia.
Protocolo:

1- Familiarizarse con la forma y la direccin de cmo debe sumergirse la tirilla reactiva


dentro de la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS
ALMOHADILLAS !!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirndola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit
comercial.
5- Anotar los resultados en el cuaderno y en el informe.

CASOS CLNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRCTICO


PACIENTE X
El seor O.G. de 35 aos nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clnica
Mdica a fin de realizarse un examen de rutina y serologa para Chagas por un estudio
catastral que estn realizando en la fbrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 aos. Peso: 95
kg, talla: 1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un rea rural del norte de la
provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.

Examen de laboratorio
Sangre
Glucemia: ______
Proteinemia total: 7 g%
Colesterol total: 260 mg%
Col HDL: 30
Col LDL: 200
TAG: 180 mg %
Bilirrubina total : 1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg %
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg %
Uremia: 25 mg%
Uricemia: 6.5 mg %

Valores de Referencia
70-110 mg%
6-8 g%
<200 mg%
>40 mg%
<100 mg%
<150 mg%
0.8-1 mg%
<0.2 mg%

0.6-1.4 mg%
15-45 mg%
<8 mg%

Chagatest por ELISA: _____


Orina:

CUESTIONARIO:
- En base a los valores indicados ms arriba y los obtenidos en el trabajo prctico,
indique posibles alteraciones metablicas presentes en este paciente.
1.- Qu caractersticas considera presentar la orina de este paciente a nivel de:
a) examen fsico, b) qumico y c) microscpico.
2.- Si el anlisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra tcnica que conoce
podra ser utilizada para confirmar el diagnstico?

PACIENTE Z
Un paciente de 18 aos de edad acude al servicio de urgencias con alteracin del estado
de conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3
aos y est siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucmico.
Cinco das antes del ingreso haba comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo
cual fue a pasar unos das a la costa con amigos. Durante los ltimos dos das, adems
de la diarrea, present vmitos y en el ltimo da haba dejado de ponerse la dosis de
insulina de la noche.

Examen Fsico
Impresin de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratacin con mucosas
secas y signo del pliegue. Aliento cetnico. Responde a estmulos dolorosos.
Temperatura: 38C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas.
Auscultacin cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpacin, sin
visceromegalias, ruidos intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg
Datos Complementarios

Sangre:
Glucemia: -------Proteinemia total: 9,5 g%
Na: 132 mEq/l
K: 3.0 mEq/l
Cl: 95 mEq/l
pH: 7.10
pCO2: 30 mmHg
% Sat O2: 95
CO3H: 10 mEq/l
leucocitos: 12500/mm3

Valores de Referencia
70-110 mg %
6-8 g %
135-155 mEq/l
3,5- 5,5 mEq/l
98-107 mEq/l
7,38-7,42
32-48 mmHg
95-98%
2028 mM
5000-10000/mm3

Chagatest por ELISA:

Orina:

CUESTIONARIO:
1- Qu enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metablicas presentes en sangre y orina.
3- Qu tratamiento en lneas generales le dara a este paciente?