Universidad Catlica de Santa Mara

Facultad de Arquitectura e Ingenieras Civil y del Ambiente

Programa Profesional de Ingeniera Ambiental

Prctica 1: Reconocimiento de materiales

usados en el laboratorio y de microbiologa,
normas bsicas de seguridad en el laboratorio y
preparacin de medios de cultivo bacterianos y
esterilizacin

Asignatura : Microbiologa Ambiental

Docente

: Adilmi Milagro Teran Dianderas

Semestre : IV

Grupo: 02

Presentado por:
Morales Pino, Carmen T.

Arequipa Per
2014

I.- RESUMEN:
En un laboratorio de microbiologa es esencial conocer de primera mano las
normas bsicas de seguridad antes de proceder a realizar cualquier proceso ya
que existen diversos tipos de microorganismos que pueden ser perjudiciales para
la salud humana cuando ingresan al organismo o que pueden alterar la muestra
estudiada; asimismo el reconocimiento del material a utilizar se considera parte
fundamental de cualquier proceso, pues si se conoce para qu sirve cada
utensilio, su manipulacin se facilita. En cuanto la preparacin de medios de
cultivo bacterianos, se pueden utilizar mezclas comerciales ya preparadas o
podemos prepararlas nosotros mismos utilizando los materiales adecuados que
deben ser envasados, esterilizados y protegidos para evitar la presencia de otros
microorganismos no deseados.
II.- INTRODUCCIN:
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos,
razn por la cual es difcil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar,
cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas ms importantes para la
identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el
que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que
proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de
microorganismos.

III.- OBJETIVOS:
1.- Conocer todo lo referente a las normas bsicas de seguridad en el laboratorio.
2.- Identificar los materiales y equipos ms frecuentes del laboratorio,
establecindolas diferencias que existen entre ellos.
3.- Preparacin de medios:
a) Que el alumno aprenda los fundamentos de nutricin microbiana,
especficamente en bacterias y conozca los diferentes tipos de medios de
cultivo existentes para el crecimiento bacteriano en el laboratorio.
b) Que el estudiante prepare medios de cultivo de uso general, diferencial y
selectivo para el cultivo de diferentes especies bacterianas.
c) Que el estudiante aprenda a preparar, envasar y esterilizar medios de
cultivo e identifique los diferentes pasos a seguir en la elaboracin de un
medio de cultivo bacteriano.
IV.- MARCO TERICO:
Normas Bsicas De Seguridad En El Laboratorio:

El trabajo en laboratorio de microbiologa requiere la observacin de ciertas

normas y precauciones para utilizar las campanas extractoras adecuadas al
material que se est utilizando.
Usar mandil (guardapolvo) y mantenerlo siempre abrochado.
Es imprescindible el uso de guantes cuando se manipulan sustancias
biolgicas.
Lavarse siempre las manos despus de cada proceso, y antes de salir del
laboratorio.
No comprobar nunca el olor o el sabor de ningn proceso.
No pipetear nunca con la boca; utilizar siempre un dispositivo especial para
pipetear lquidos.
Si el pelo es largo, supone un riesgo en determinadas tcnicas de
laboratorio, por lo que es recomendable recogerlo.
Se debe evitar que las mangas, pulseras, etc, entren en contacto con los
reactivos o muestras que se est manipulando.
No est permitido fumar ni comer.
Se deben cerrar los grifos y llaves de agua, gas, etc, y desconectar los
aparatos utilizados durante la prctica.

El material de vidrio, por su naturaleza, se debe manipular con mucha

precaucin, y no forzar nunca, especialmente las pipetas al introducirlas en
los dispositivos de pipeteado, que pueden producir cortes graves.

Materiales De Laboratorio De Microbiologa:

-

Materiales de vidrio.
Materiales de metal.
Materiales de porcelana.
Equipos.
Reactivos y medios de cultivo.

Los equipos del laboratorio deben funcionar de forma que se asegure la

reproductibilidad de los resultados de las pruebas diagnsticas.
Preparacin De Medios De Cultivo:
Se utilizan diversos tipos de medios de cultivo dependiendo de la especie a
cultivar, estos se diferencian en base a:
o
o
o
o

Composicin qumica: sintticos y complejos.

Presencia de factores de crecimiento: enriquecidos y mnimos.
Funcin: Selectivos y diferenciales.
Consistencia: lquidos, slidos y semislidos.

Sin embargo todos contienen macronutrientes, micronutrientes y factores de

crecimiento.
Antes de utilizar los materiales de laboratorio y los medios de cultivo preparados a
partir de ingredientes o preparados comerciales, deben ser envasados,
esterilizados y protegidos adecuadamente para evitar la presencia de otros
microorganismos no deseados. La esterilizacin se define como la destruccin o
remocin de cualquier forma de vida. Un objeto que est libre de cualquier
organismo viviente, se dice que est estril.
Existen varios mtodos de esterilizacin para la gran variedad de materiales,
medios de cultivo y sustancias que pueden ser esterilizadas, siendo el calor uno
de los ms utilizados. La velocidad con la cual los microorganismos mueren
cuando son expuestos a temperaturas elevadas, depende de la naturaleza del
medio en el cual ocurre el calentamiento (pH, concentracin de sales y tipo de
nutrientes), el tiempo de exposicin y la temperatura de calentamiento.
Independientemente de los medios y mtodos de cultivo utilizados, el xito del
trabajo en el laboratorio de microbiologa depende de la adecuada eleccin y buen
uso de los mtodos de esterilizacin y tcnicas aspticas.

Medios selectivos
Son medios en cuya composicin presentan algn componente o componentes
que van a impedir el crecimiento de algn tipo bacteriano, estableciendo con ello
una seleccin en el tipo de microorganismo que s puede crecer; por ejemplo, el
medio Rothe se caracteriza porque en su composicin aparece azida sdica
confiriendo al medio propiedades selectivas ya que tal componente va impedir el
crecimiento de todas las bacterias Gramnegativas, permitiendo el crecimiento de
algunas Grampositivas como Streptococus faecalis. Medio Salmonella Shigella,
contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que
inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.
Medios diferenciales
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los
medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de
algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de este medio, presentan
sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho
medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial; por
ejemplo:
El medio Levine (EMB) es te medio presenta en su composicin eosina y azul de
metileno que inhibe el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas,
facilitando el crecimineto de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa
darn lugar a una coloracin caracterstica para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de
aislamiento e identificacin.

V.- MATERIALES:

o
o
o
o
o
o

Placas Petri de vidrio

Pipetas de 1 o 2 ml.
Pipetas de 10 ml .
Pipeta Pasteur
Matraces Erlenmeyer de 250 ml.
Parrilla de calentamiento con agitacin.

o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Autoclave
Mechero
Potencimetro
Horno de calor seco
Incubadora a 35C
Hisopo estril, algodn y gasa
Papel kraft para envolver
Caldo nutritivo
Medio agar nutritivo
Medio de agar papa dextrosa PDA
Medio mnimo de sales
Medio de agar sangre
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Balanza analtica
Cinta esterilizadora

VI.- MTODOS:
a. Lavado y esterilizacin del material de trabajo:
- Lavar las placas Petri y pipetas con escobilln y detergente. Enjuagar con
abundante agua corriente.
- Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada, y ms
en las paredes internas.
- Dejar secar el material en una estufa.
- Una vez seco el material, se proceder a envolver las placas de Petri y
pipetas con papel kraft.
- Las placas Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150C durante
dos horas; despus de secarlas dejarlas enfriar y abrir los paquetes
nicamente en rea sptica.
b. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo:
Preparacin de medio slido en placa.1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos
aadirlo a una concentracin de 15 g/L) y rehidratarlo con agua destilada en
un baln o matraz y tapar con una torunda de algodn.
2. Autoclavar el baln o matraz a 121C y 15Ibs durante 15 minutos. Apagar
la autoclave y dejar que baje la presin a valor de 0.
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir el baln en un
bao a 40C al menos durante 30 minutos.
4. Distribuir el medio en las placas de Petri que estn estriles dentro de una
campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando
bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones.

5. Dejar que el medio solidifique.

Preparacin de medio slido en tubo.1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un
matraz.
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente; el medio
debe hervir hasta que se vuelva transparente.
3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que empiece a
solidificar; para ello se emplear una pipeta y los medios no se llenaran
ms de un tercio del volumen.
4. Autoclavar.
5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre una superficie angulada y
dejar que el medio se solidifique.
6. Todos los medios se guardan en nevera a 4C.
VII.- RESULTADOS:
En la realizacin de la presente prctica se prepararon 3 tipos diferentes de
medios de cultivo, agar sangre, agar manitol y agar McConckey, siendo cada uno
destinado a un tipo de microorganismo especfico; utilizando para ello las medidas
de seguridad necesarias y esterilizando los materiales a utilizar para evitar
cualquier tipo de contaminacin.
VIII.- DISCUSIN:
El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que
debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente
natural en el que se desarrollan. La utilizacin de los medios de cultivo son
necesarios para:
Separacin y aislamiento de las distintas especies microbianas presentes
en una muestra.
Estudio de identificacin de un microorganismo problema.

Estudios macroscpicos. Visualizar las caractersticas de las colonias en

medios slidos.

Para la conservacin de especies microbianas o muestras, etc.

IX.- CONCLUSIONES:
Al realizar la presente prctica hemos podido llegar a las siguientes conclusiones:

 Es de gran importancia conocer las normas bsicas de seguridad en un

laboratorio de microbiologa para evitar daos a nuestra salud, pues
diversos microorganismo, ya sean los estudiados o los que estn presentes
en otras muestras pueden ingresar nuestro organismo.
Conocer los materiales con los que vamos a trabajar facilita su
manipulacin a la hora de realizar cualquier proceso.
Existen varios tipos de microorganismos, y cada tipo posee una forma
diferente de nutricin y crecimiento es por eso que se debe conocer con
que microorganismo se va a trabajar para poder preparar los medios de
cultivo.
X.- ANEXOS:
- CUESTIONARIO:
1. Investigar, graficar y describir el fundamento y uso de los materiales y
equipos de laboratorio de microbiologa.
NOMBRE
Balanza
analtica

USO
Aparato con gran sensibilidad,
hasta de 1 diezmilsima de
sensibilidad.

Balanza

Permite
pesar
sustancias,
sensibilidad de 1 dcima de
gramo.

Autoclave

Equipo de esterilizacin de
material limpio y contaminado,
produciendo vapor contenido a
altas presiones.

IMAGEN

Vortex

Aparato que
sustancias
homognea.

permite
en

agitar
forma

Ph-metro

Aparato que
sustancias.

mide

Destilador

Equipo que reduce la cantidad

del total de sales disueltas de
aguas dulces y salobres.

Cmara de
anaerobiosis

Cmara
con
atmsfera
controlada por medio de gases
especiales
para
cultivar
bacterias anaerobias.

Incubadora

Mantiene
temperatura
constante de cultivos microb.
Asegurando su crecimiento

ph

de

Cromatgraf
o con
integrador

Identifica los gases producidos

en el metabolismo microbiano,
el
integrador
reporta
los
resultados del cromatgrafo.

Horno

Seca el material de vidrio y

almacena material estril.

Nevera

Almacena material limpio

conserva microorganismos
reactivos.

Cuenta
colonias

Plancha de
calentamient
o y agitacin

y
y

Aumenta la vista de colonias en

la placa Petri para identificar y
contar.

Permite calentar sustancias.

Bao mara

Desgelifica medios de cultivo a

temperatura constante.

Gradilla

Sirve para colocar tubos de

ensayo.

Pinzas para
crisol

Sujetan crisoles.

Pinzas para
tubo de
ensayo

Sujetan tubos de ensayo.

Agitador de
vidrio

Es una varilla de vidrio usada

para mover sustancias.

Asa de
siembras

Usadas para inocular muestras

o bacterias puras en los medios
de cultivo.

Tapones de
caucho

Se usan para taponar tubos de

ensayo
para
anlisis
anaerbicos.

Pipeteador

Se usa para absorber lquidos a

travs de pipetas.

Jeringas

Se usan para tomar o inocular

sustancias.

Cubetas para Contienen colorantes.

tincin

Pipetas
pasteur

Se usan para tomar pequeos

volmenes de sustancias.

Portaobjetos

Se usan para depositar las

muestras y observar en el
microscopio.

Cubreobjeto
s

Cubren las
portaobjetos.

muestras

del

Cajas de
Petri

Se usan para contener los

medios de cultivo.

Cmara de
newbauer

Se usa para el conteo de

clulas.

Crisol

Permite calentar sustancias a

altas temperaturas.

Embudo de
polietileno

Embudo de 90 mm de dimetro
usado para envasar sustancias.

Esptula

Permite tomar sustancias.

Mechero
bunsen

Presentan una base, un tubo,

una chimenea, un collarn y un
vstago. Con ayuda del collarn
se regula la entrada de aire.
Para lograr calentamientos
adecuados hay que regular la
flama del mechero a modo tal
que sta se observe bien
oxigenada (flama azul).
Son utensilios hechos de
diferentes materiales como:
porcelana, vidrio o gata, los
morteros de vidrio y de
porcelana se utilizan para
triturar materiales de poca
dureza y los de gata para
materiales que tienen mayor
dureza.

Mortero de
porcelana
con pistilo
mano

Termmetro

Es un utensilio que permite

medir la temperatura que tienen
algunas sustancias.

Malla de
asbesto

Son mallas de hierro ms o

menos finas, a veces con un
circulo de asbesto en el centro
(malla de asbesto). Son
usadas cuando no se requiere
calentamiento a fuego directo,
el asbesto es buen aislante del
calor.
Para el lavado del material de
vidrio. Los ms comunes se
utilizan para tubos de ensayo,
buretas y para balones.
Son matraces de vidrio que
permiten realizar soluciones
valoradas, los hay de diversas
medidas como: 50ml, 100ml,
250 ml, 500 ml,1L etc.

Escobillas o
churruscos

Baln
aforado

Pipetas

Probeta

Este material existe en dos

presentaciones:
Pipetas aforadas.
Pipetas volumtricas.
Las primeras permiten medir
diversos volmenes segn la
capacidad de esta, las
segundas no estn graduadas y
slo permiten medir un volumen
nico.
Este material permite medir
volmenes,
las hay de vidrio y de plstico y
de diferentes capacidades.

Frasco
gotero

Frascos
reactivos

Vasos de
precipitado

Matraces

Matraz
erlenmeyer

Frasco
lavador

Permite contener sustancias

que se necesitan agregar en
pequeas cantidades.

Permite guardar sustancias

para almacenarlas, los hay
mbar y transparentes, los de
color mbar se
utilizan para guardar sustancias
que son alteradas por la accin
de la luz del sol.
Permite calentar y contener
sustancias

Son recipientes de vidrio,

esfricos, de fondo redondo,
provistos de un cuello, sirven
para calentar lquidos. Hay
balones con cuello ms largo y
soldado a l un tubo estrecho
inclinado ligeramente hacia
abajo (balones de destilacin).
Es un utensilio que se emplea
para contener sustancias, los
hay de varias capacidades.

Es un recipiente que se utiliza

para contener agua destilada,
este utensilio facilita la limpieza
de electrodos.

Tubo de
ensayo

Estos utensilios sirven para

hacer experimentos o ensayos
los hay en varias medidas y
pueden ser de vidrio o de
plstico.

Tubo de
centrfuga

Se
usa
para
obtener
precipitados de
lquidos, por medio de la
centrifugacin.

Frasco de
rosca

Se usa para
muestras.

Desecador

Su objeto es quitar humedad a

algunas sustancias mediante
otras sustancias que son vidas
de
ella
(cido
sulfrico
concentrado, cloruro
de calcio fundido, carbonato de
potasio, xido de calcio,
anhdrido fosfrico, etc.). La
sustancia a
desecar
se
coloca
en
recipientes especiales en el
compartimiento
superior, mientras la sustancia
desecadora
va
en
el
compartimiento
inferior
comunicado con el anterior por
un orificio.

la

toma

de

2. Indique cuales son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en

microbiologa; y en qu tipo de materiales se aplica cada uno.

Mtodo de
esterilizacin
Incineracin

Calor hmedo

Calor seco

Filtracin

Radiacin
gamma

Radiacin UV

Principio

Material

El material se quema.
Mtodo ms comn de
tratamiento de deshechos
infecciosos.
Calor (121C) hmedo a
1 atmsfera 30-60
minutos. Se usa
autoclave (calor a alta
presin). Para desechos
de peligro biolgico y
objetos resistentes al
calor.
160-180C durante 1-3
horas. Se usa estufa.
Para material de vidrio,
aceites, etc.
Pasaje de soluciones a
travs de membranas
con vaco. Para
soluciones de
antibiticos, qumicos
txicos, radioistopos,
vacunas, carbohidratos,
etc., sensibles al calor.
Radiacin ionizante de
corta longitud de onda y
alta energa.
Para material descartable
como jeringas de
plstico, catteres,
guantes, etc., antes de su
uso.
Radiacin no ionizante de
bajo poder de
penetracin. Slo
esteriliza las superficies
sobre las que incide
directamente o
volmenes pequeos de

Mecheros.

Autoclave

Hornos, fuego directo.

Bombas de vaco.

Pasteurizacin

Filtracin

lquidos.
La leche, nata y ciertas
bebidas alcohlicas
(cerveza y vino) se
someten a tratamientos
de calor controlado que
slo matan a ciertos tipos
de microorganismos pero
no a todos.
Elimina microorganismos
sin modificar su
composicin en
cantidades pequeas de
sustancias termolbiles.

Bomba de vaco.

3. Investigar los tipos de microorganismos que puedan estar presentes

en el aire, cuerpo y superficies.
GRUPO
MICROORGANISMOS
1: De fcil control, que representan un Bacillus cereus
riesgo mnimo tanto para quien los Escherichia coli cepaK12
maneja como para el entorno.
Lactobacillus acidophilus
Virus Distemper canino
2: Riesgo moderado para el individuo y Clostridium spp.
limitado para la comunidad
Listeria monocytogenes
Virus del sarampin
Virus hepatitis
Salmonella thyphi
3: Riesgo individual elevado, pero Mycobacterium tuberculosis
escaso para el entorno.
Brucella spp.
Rickettsia spp.
Virus rbico
4:
Microorganismos
en
extremo Virus Junn
peligrosos para quien los manipula y Virus Lasa
para el entorno.
Virus de la fiebre aftosa
Virus Machupo
4. De los siguientes medios de cultivo, comparar y analizar (en una tabla)
la composicin de cada medio e indicar a qu tipo y clase de

requerimiento energtico y no energtico corresponde y que

microorganismos crecen en ellos:
Mcconkey.
Baird Parker.
Agar sangre.
BVB (bilis verde brillante).
EMB (eosina azul de metileno).
BHI (cerebro corazn).

MEDIO DE
CULTIVO
Mcconkey

CONCEPTO

REQUERIMIENTO
ENERGTICO

REQUERIMIEN
TO NO
ENERGTICO

Observa los diferentes

tipos de colonias segn
el consumo de lactosa.

Lactosa,
peptona de
carne, peptona
de casena

Cristal
violeta, rojo
neutro.

Baird
Parker

Es un medio selectivo
utilizado para el
aislamiento de
Staphylococcus
aureus coagulasa
positivo.

Peptona de
casena,
extracto de
carne.

Agar
sangre

Cultivo mixto que

demuestra la presencia
de dos tipos de
microorganismos:
Un morfotipo de
colonias grandes
blancas, brillantes y con
bordes irregulares
pertenecientes a bacilos
gramnegativos.
El otro morfotipo
presenta colonias
blancas, pequeas,
enteras, tipicas de un
microorganismo
grampositivo.

Nitrgeno
suplementario,
peptona de
casena,
peptona de
carne, lactosa.

Extracto de
levadura,
telurito de
potasio,
cloruro de
litio, piruvato
de sodio.
Rojo neutro,
cristal
violeta.

BVB (bilis
verde
brillante)

Es un medio altamente
selectivo utilizado para
el aislamiento de
Salmonellae distintas de
S. typhi a partir de
heces y otras muestras

Peptona o
polipeptona,
lactosa,
sacarosa, bilis
de buey.

Verde
brillante,
extracto de
levadura.

MICROORGANISMOS QUE
CRECEN EN EL

Escherichia coli,
Klebsiella pneumonias,
Salmonella
typhimurium, Shigella
flexneri, Proteus
mirabilis, Enterococcus
faecalis.
Staphylococcus aureus

Bordetella pertusis
Xanthomonas
Staphyloccous.
Streptococus.

Escherichia coli,
enterobacter, Klebsiella
pneumoniae,
Salmonella
typhimurium,
Staphylococcus aereus,

clnicas.

EMB
(eosina
azul de
metileno).

Son colorantes de
anilina y van a inhibir el
crecimiento de los
microorganismos
Grampositivos,
permitiendo el
crecimiento de todas las
Enterobacterias.

Lactosa,
sacarosa,
peptona de
casena.

Fosfato
dipotsico,
eosina
amarilla,
azul de
metileno.

BHI
(cerebro
corazn)

Permite el crecimiento
de microorganismos
considerados muy
dificiles de cultivar, en l
los grmenes mantienen
su virulencia,
antigenicidad y otras
caractersticas
serolgicas.

Infusin cerebro
de ternera,
Infusin corazn
de res,
Peptonas,
glucosa.

Fosfato
disdico

bacterias no
fermentadoras de
lacosa.
Escherichia coli,
Klebsiella, Enterobacter,
Serratia, Hafnia.

Streptococcus
pneumoniae,
Trichophyton
mentagrophytes,
Candida albicans,
Listeria monocytogenes,
Shigella flexneri.

XII.- BIBLIOGRAFA:
Vignoli, R. Esterilizacin y desinfeccin.21p.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2027.pdf
Laboratorio de Microbiologa. Mtodos de Esterilizacin.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10
_M%C3%A9todos_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf

 https://cv2.sim.ucm.es/moodle/file.php/21298/Practicas/PracMicro07-08.pdf
http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursometodosfito/02Esterilizacion_desinfeccion2012VG.pdf
Brook Th. 1999. Biologa de los Microorganismos. 8. Mac Graw Hill.

http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8800
http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/medios-de-cultivo.pdf
Flores, M., and D. Welch. 1992. Section 6. Mycology: culture media, p.6.7.16.7.3. In : H.D. Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures handbook,
vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C.