REPORTE DE PRCTICA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA

DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA
CARRERA MDICO CIRUJANO
LABORATORIO IV
DOCENTES RESPONSABLES:
MARCELA AMALIANZAJUNDANI PALACIOS
HERNANDEZ
BERTHA ALICIA HASHIMOTO YAEZ

REPORTE DE PRCTICA
Grupo: 1465
Fecha: 19 de septiembre de 2016
ALVARADO JIMNEZ ANDREA
BARRON ARMIJO TABTHA JENIFFER
GUADARRAMA HERNANDEZ KARINA
JIMENEZ ALVAREZ LUIS MANUEL
LOPEZ VELAZQUEZ ARIEL
LUNA CRUZ JULIO CESAR
MATA IBARRA BELINDA
MERIDA SOLANO ADRIANA ALEJANDRA
RUIZ LEON MICHELLE
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UTILIDAD DE LAS PRUEBAS

EXAMEN EN FRESCO
El examen en fresco de muestras vaginales es una tcnica de diagnstico rpido,
sencillo y de bajo costo, pero presenta una escasa sensibilidad (entre 62-92 %)
dependiendo del observador, aunque tiene una especificidad del 92-100%.
Su realizacin permite visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos o
teirlos, y por lo tanto estos pueden apreciarse vivos, lo que nos permite apreciar
componentes celulares (hemates, leucocitos, clulas epiteliales) as como la
presencia de cristales, sales amorfas, cilindros y microorganismos. Las levaduras
muestran su tpica forma ovoide y pueden exhibir blastoconidias y estructuras
hifales facilitando la diferenciacin entre Trichomonas Vaginalis y levaduras del
gnero Cndida (se debe considerar que una misma paciente puede presentar
ambas infecciones simultneamente).

Trichomonas Vaginalis es un parsito protozoo flagelado y mvil que

parasita el tracto genito-urinario femenino. La parasitacin o infeccin por
este microorganismo se considera una enfermedad de transmisin sexual.
La mayora de las infecciones en las mujeres suele manifestarse como
vaginitis.

Las levaduras del gnero Cndida son la principal causa de vaginitis en

mujeres en edad frtil a nivel mundial. Para su diagnstico microscpico se
pueden emplear tanto el examen en fresco como la tincin de Gram del
exudado vaginal.

TINCIN GRAM
Es la tincin ms utilizada en Microbiologa. Se emplea para la observacin
microscpica de muestras clnicas y de cultivos bacterianos. Permite visualizar la
mayora de las bacterias y algunos hongos (principalmente levaduras), por lo que
con ella se puede hacer el diagnstico de infeccin por Cndida, y detecta adems
si la paciente padece vaginosis bacteriana. Permite diferenciar las bacterias en dos
grandes grupos:

Gram positivas: se tien de AZUL.

Gram negativas: se tien de ROJO.

3

Tambin permite identificarlas por su forma:

Cocos: bacterias redondas.

Bacilos: bacterias alargadas.

Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884; hoy en da,
sigue siendo una de las tinciones ms utilizadas universalmente debido a lo
econmico, sencillo y eficaz que resulta. En microbiologa clnica resulta de gran
utilidad, ya que a partir de muestras clnicas directas provenientes de sitios estriles
se puede saber de manera rpida las caractersticas de la muestra y hacer una
diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una infeccin.
Los principios de la tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas est constituida
por una capa fina de pptido glicano y una membrana celular externa, mientras
que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por
pptido glicano, pero no cuentan con membrana celular externa; as pues, la
composicin qumica y el contenido de pptido glicano en la pared celular de las
bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las caractersticas
tintrales.
La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el
cual tiene afinidad con el pptido glicano de la pared bacteriana. Posteriormente,
se coloca lugol, el cual sirve como fijador e impide la salida del cristal violeta por la
formacin de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del pptido
glicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcoholacetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
tambin destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que sta es soluble a la accin de solventes orgnicos, como la mezcla de alcoholacetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de pptido
glicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas
no lo pueden retener por tener menos cantidad de pptido glicano. Por ltimo, se
coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contra
tincin y sirve para teir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal
violeta-yodo.
Hay bacterias de un mismo gnero que pueden observarse en la misma muestra
como Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tincin
Gram variable secundaria a alteracin en nutrientes, temperatura, pH o
concentracin de electrolitos.

OBJETIVOS
GENERAL
Determinar por medio de la observacin si hay presencia de agente
patgeno y el tipo en el exudado vaginal.

PARTICULARES
Llevar acabo de manera correcta una tincin Gram, con el fin de conocer
agente patgeno del exudado.
Realizar un examen en fresco y observar en microscopio X10, x40 y x100 en
busca de Trichomonas Vaginalis o Candida Albicans.
Observar un cultivo de exudado vaginal.

INTRODUCCIN
TRICHOMONA VAGINILAS
T. vaginalis es un protozoo de forma ovoide o piriforme que mide de 7 30 m de
longitud y de 5 15 de ancho. El trofozoito se caracteriza por presentar cuatro
flagelos dispuestos de dos en dos en la parte anterior, y un flagelo recurrente que
forma la membrana ondulante, que no llega a la parte posterior del cuerpo El
flagelo libre y la membrana ondulante le confieren al parsito la motilidad
espasmdica caracteristica

Exudado vaginal
Se precisa un especulo que se introducir sin la utilizacin de lubricante.
Utilizando una torunda de alginato calcico o de dacron se recomienda recoger el
exudado de la zona donde este sea ms abundante, o en su caso, del fondo de
saco vaginal posterior. Se debe recordar que si bien el exudado vaginal es ptimo
para la recuperacion de Candida spp., T. vaginalis, y para el diagnstico
microbiologico de las vaginosis, cuando se sospeche la infeccion por N.
gonorrhoeae o C. trachomatis, se debe realizar la toma de exudado endocervical
(excepto en mujeres histerectomizadas en las que se realiza la toma en el fornix
posterior).
Se deben enviar dos muestras, vaginal y endocervical, debidamente rotuladas para
que el laboratorio emplee cada una en la recuperacion de los patogenos que con
mayor probabilidad se encontraran en cada caso. En nias este indicado el cultivo
de Haemophilus spp. Y estreptococos beta-hemolticos aunque se pueden producir
casos de vulvovaginitis por estos microorganismos tambien en mujeres adultas por
lo que su presencia puede indicar patologa o bien estado de portador de los
mismos.
En el caso de Streptococcus agalactiae hay estado de portador en un porcentaje
alto cuando se trata de prostitucin y la presencia de Haemophilus spp. puede
indicar relaciones sexuales orales

Examen en fresco
El examen en fresco de muestras vaginales es una tcnica de diagnstico rpida y
de sencilla realizacin que permite identificar tanto Trichomonas Vaginalis como
levaduras del gnero Candida (se debe considerar que una misma paciente puede
presentar ambas infecciones simultneamente):

1) Trichomonas vaginalis es un parsito protozoo flagelado y mvil que

parasita el tracto genito-urinario femenino y masculino. La parasitacin o
infeccin por este microorganismo se considera una enfermedad de
transmisin sexual. La mayora de las infecciones en el varn son
asintomticas, mientras que en las mujeres suele manifestarse como
vaginitis.
2) Las levaduras del gnero Candida son la principal causa de vaginitis en
mujeres en edad frtil a nivel mundial. Para su diagnstico microscpico se
pueden emplear tanto el examen en fresco como la tincin de Gram del
exudado vaginal que se explica en el siguiente punto.
El elemento diagnstico ms til y asequible en el diagnstico de la trichomoniasis
vaginal es el examen en fresco.
Se coloca una gota de la secrecin vaginal en un portaobjetos, se aade una gota
de suero salino fisiolgico y se tapa con un cubreobjetos; esta preparacin se
examina en el microscopio ptico y puede verse fcilmente, hasta en el 80% de los
casos, el movimiento de Trichomona.

Su tamao, aproximadamente dos o

tres veces el de un polimorfonuclear, el
aspecto anteriormente descrito y su
movilidad
permiten
identificarlas
fcilmente
y
diferenciarlas,
sin
problemas, de otros elementos mviles
como los espermatozoides.
Algunos autores recomiendan un ligero
calentamiento del portaobjetos para
aumentar su movilidad y hacer ms
evidente su presencia.
Es habitual un aumento en la proporcin de polimorfonucleares, que llega, en
algunos casos, a hacer dificultosa la observacin del protozoo, por lo que deber
buscarse en las zonas del cristal en las que exista la menor densidad celular.
En ocasiones pueden ser necesariasotras tcnicas diagnsticas ms sofisticadas
como la tincin en Giemsa o la tincin de Papanicolaou, el cultivo en medio de
Diamond y el test de inmunofluorescencia identificando antgeno de superficie T.
vaginalis o estudio de la presencia de su cido nucleico mediante hibridacin in
situ o mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Candida Albicans
Candida es un gnero de hongos unicelulares tambin llamados levaduras. La
especie de Candida ms significativa por su importancia clnica gnero es Candida
albicans. Las infecciones causadas por hongos se denominan micosis. Candida
albicans es un comensal de las mucosas humanas, sobre todo de la mucosa oral,
digestiva y genital. Las micosis causadas por Candida albicans o por otras especies
de Candida se denominan (candidiasis) en humanos y en otros animales,
especialmente en pacientes con inmunosupresin

Tincion de Gram
Es la tincin ms utilizada en Microbiologa. Se emplea para la observacin
microscpica de muestras clnicas y de cultivos bacterianos. Permite visualizar la
mayora de las bacterias y algunos hongos (principalmente levaduras), por lo que
con ella se puede hacer el diagnstico de infeccin por Candida, y detecta adems
si la paciente padece vaginosis bacteriana. Permite diferenciar las bacterias en dos
grandes grupos:

Gram positivas: se tien de

AZUL.

Gram negativas: se tien

de ROJO.

Tambin permite identificarlas por

su forma:

Cocos: bacterias redondas.

Bacilos:
alargadas.

bacterias

El mecanismo de la tincin Gram es la reseado en el siguiente esquema:

Productos que
se utilizan

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM +

GRAM -

1) Cristal violeta

Clulas color violeta

Clulas color violeta

2) Lugol
solucin iodada

Se forma el complejo CV-I. Las

clulas continan teidas de
color violeta.

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan
teidas de color violeta.

3) Alcohol

4) Safranina

Se deshidratan las paredes

Eliminacin por extraccin
celulares. Se contraen los poros.
de grasas de las paredes
Disminuye la permeabilidad. El
celulares. Aumenta la
complejo CV-I no sale de las
porosidad. El complejo CVclulas que continan teidas de
I se separa de la clula.
color violeta.
Clulas no decoloradas; quedan
teidas de color violeta.

Clulas decoloradas; se
tien de color rosado.

Teidos con Gram.

Podrn apreciarse levaduras nicas o en gemacin (blastoconidios) con o sin la
presencia de seudomicelio. En frotis las estructuras son Gram positivas. Se da mayor
validez al papel patgeno de Candida, cuando se aprecian ms de cuatro
levaduras por campo, cuando son observadas a un aumento de 40x y/o existe
seudomicelio.

HIPOTESIS DIAGNOSTICA
Como parte del diagnstico presuntivo se ordenaron estudios de laboratorio y se
predice lo siguiente:
Si se realiza un examen en fresco y tincin de gram, entonces se encontrar
presencia de T. vaginalis en el primer examen, mientras que en el segundo se
hallaran bacterias predominantes de tipo gram negativas correspondientes a la
microbiota normal de la vagina.

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MATERIAL Y METODOS
TINCIN DE GRAM. MATERIAL
1. Portaobjetos
2. Cubreobjetos
3. Microscopio ptico
4. Solucin de cristal violeta
5. Solucin de azul de metileno
6. Solucin de safranina
7. Solucin decolorante (alcohol etlico y acetona 1:1)
8. Solucin de I2 / I- (yodo / yoduro al 0.1 %)
9. Cultivo (caldo o agar) a teir.
10. Ansa de punta y ansa de aro.
11. Mecheros
12. Alcohol etlico
13. Gasa

TINCIN DE GRAM. METODO

I.

Se extiende la muestra recogida (que suele ser lquida o viscosa) en un porta

de cristal, y se deja secar al aire.

II.

Se aplica metanol al porta; as, las bacterias quedan pegadas en la superficie.

III.

Se aade violeta de genciana, un colorante que tie todas las bacterias de

color prpura. Se debe dejar durante un minuto para que haga efecto.

IV.

Se lava la muestra coloreada con agua y se aade alcohol-acetona para

desteir las bacterias que se deben teir con el violeta de genciana. Es la
parte ms importante de la prueba, ya que si se deja demasiado tiempo se
desteiran todas las bacterias. Despus se lava de nuevo con agua para
eliminar el alcohol.

V.

Se aade fucsina, otro colorante que tie de rosa las bacterias que no se han
teido de color prpura. As se pueden observar al microscopio, aunque
sern gramnegativas.

VI.

El microbilogo estudia la muestra con un microscopio e identifica bacterias

teidas

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EXAMEN EN FRESCO. MATERIAL

1. Portaobjetos.
2. Cubreobjetos 20mmx20mm.
3. Microscopio

EXAMEN EN FRESCO. METODO

I.

Rotular o etiquetar un

para identificar la parte en donde se coloca la

muestra
II.

Depositar una gota de solucin salina atemperada y estril sobre un

portaobjetos (37C o temperatura ambiente si lo anterior no es posible). En
el caso de sospecha de infeccin por Candida no es necesario que la
solucin salina est atemperada.

III.

Una vez tomada la muestra, extenderla rpidamente sobre el portaobjetos,

mezclndola con la solucin salina.

IV.

Colocar sobre la preparacin un cubreobjetos.

V.

Visualizar al microscopio con los objetivos 10x y 40x.

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RESULTADOS
CULTIVO EN FRESCO
EXAMEN EN FRESCO

No se observan microorganismos en movimiento para fundamentar el uso de esta

tcnica, pero se puede observar una estructura de aspecto periforme -encerrada en
el crculo rojo-, por otra parte, se pueden observar estructuras de forma ovoide,
microscpicas alrededor del campo de observacin

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TINCIN DE GRAM.

La observacin bacterias que se tieron de violeta y rojo; son Bacilos Gram

positivos y Bacilos Gram negativos, as como un conjunto de levaduras de forma
ovoide, en el crculo que se encuentra en la imagen se alcanza a observar un par
de filamentos (pseudohifas). La imagen se observ con un lente de 40x, a este
aumento no es posible observar que la levadura se encuentra en gemacin, ya que
existen estructuras ms pequeas: yemas; alrededor del medio de cultivo tambin
contiene extractos de donde se obtuvo la muestra.

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ANALISIS E INTERPRETACION DE
RESULTADOS
A partir de los resultados obtenidos y de acuerdo con la teora se pueden interpretar los
resultados de la siguiente manera:

EXAMEN EN FRESCO
Es la primera prueba al pie de la cama de la paciente para el diagnstico de
Tricomoniasis, y podra demostrar el protozoario hasta en 60% de los casos.
Los resultados arrojados por esta prueba, con base a las observaciones hechas en el
microscopio (cabe resaltar que el lente objetivo 40x no serva), utilizando el objetivo 100x. No
hubo un enfoque claro pese a ello en el crculo rojo parece haber una Trichomona (Fig. 1). Y
no es posible diferenciar algn otro microorganismo propio de encontrarse en exmenes
como este, tales como Candida albicans la cual podra identificarse a travs de pseudomicelios
o blastoconidios (Fig. 2). El resultado obtenido en la muestra, vista al microscopio no
demostr tales estructuras.

Fig. 1 La imagen inferior muestra como debe verse Tricomona vagilalis en un examen en
fresco. En la imagen superior se muestra el resultado obtenido en laboratorio para esta
prctica

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La trichomona vaginalis mide de 7-23 micras de largo y de 5-12 micras de ancho,

tiene forma piriforme, tiene membrana ondulante y 4 flagelos ms un axostilo, que
se observan en el fresco. En la muestra al microscopio no fue posible identificar
estas estructuras en la tricomona que se visualiz.

Fig. 2 Ejemplo de Candida Albicans en examen en fresco.

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TINCIN GRAM
Mediante este mtodo las bacterias gram-positivas y gram-negativas se tien de
forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares.
La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en 80%-90% de
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una
capa ms delgada de peptidoglicano y est rodeada por una membrana de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la
clula gram-negativa es peptidoglicano. Las bacterias Gram positivas se observan
de color azul oscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de
color rosa a rojo.
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos (las envueltas
externas de los microorganismos estn por lo general cargadas negativamente).
Normalmente se debe observar flora regional con predominio de morfotipo
Lactobacillus sp y clulas epiteliales. Evaluar:
1. La presencia de leucocitos.
2. La presencia de levaduras o pseudohifas.
3. La presencia nica o abundante de
microorganismo.
4. El exudado caracterstico

cualquier

otro

Siendo el examen microscpico un mtodo aceptado para el diagnstico

microbiolgico de vaginosis bacteriana se valora:
a. Presencia de Clulas clue (clulas epiteliales recubiertas de bacilos o
cocobacilos Gram variables.)
b. Ausencia o escasos Leucocitos.
c. Flora mixta alterada (Nugent).
En esta prctica no pudimos diferenciar Leucocitos o clulas epiteliales, pero si
estructuras gram positivas (Fig. 3) en cantidad de 21 aproximadamente por campo
(Tabla 1 puntuacin de 3). Leucocitos en cantidad > 30 (Tabla 1 puntuacin de 0).
Indicativo de crecimiento moderado de estructuras gram positivas, pero no cumple
requisitos para diagnosticar vaginosis bacteriana.

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En la fotografa tomada durante la prctica (Fig. 3) a un aumento de 40x se pueden

observar estructuras gram negativas. (Fig. 4)
Los resultados obtenidos en la prctica revelan adems una gran cantidad de bacilos Gram
negativos pertenecientes a la flora normal como Lactobacillus spp que son bacterias gram
variables, pero en el caso de la tincin realizada por el equipo se observan de un color
rosa claro a lo largo del campo visual.

Fig. 3 Tincin de Gram. Vista al microscopio a 100x y la ampliacin de la imagen a la

derecha.

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El estudio microscpico de los organismos levaduriformes se puede llevar a cabo

mediante tinciones, ya sea tincin simple o tincin de Gram; con esta tincin, las
levaduras suelen comportarse como Gram positivas. El diagnstico de Candida
Albicans puede hacerse mediante la observacin de pseudohifas o blastoconidios.
En la tcnica de Gram podrn apreciarse levaduras nicas o en gemacin con o sin
la presencia de pseudomicelio. Se da mayor validez al papel patgeno de Cndida,
cuando se aprecian ms de 4 levaduras por campo, cuando son observadas a un
aumento de 40x y/o existe pseudomicelio. En el caso de la muestra del equipo en
laboratorio se diferencian estructuras gram positivas que podran ser
blastoconidias, pues su estructura es semejante a otras tinciones gram; aunque no
se diferencian pseudohifas (Fig 4 y Fig 5)

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CONCLUSIN
Tras la realizacin de la prctica, se confirm la hiptesis que propona la presencia
de bacterias de tipo gam negativas como parte de la microbiota normal de la
vagina. A dems, tras la realizacin del examen en fresco, se encontraron
estructuras similares a T. vaginalis lo que permiti la confirmacin de la hiptesis
inicial, con respecto a dicho microorganismo.
Resultando de importancia conocer las diferentes pruebas diagnsticas, sus
indicaciones, as como utilidad, los datos que aportan y que pueden ser de gran
apoyo al momento de confirmar o descartar una posibilidad diagnstica. Si bien
cada estudio de laboratorio tiene sus indicaciones correspondientes, es labor del
mdico indicarlo solo en los casos que tanto el interrogatorio como la exploracin
fsica resulten insuficientes y no existan datos precisos sobre lo que se plantea.
Como futuros mdicos en formacin, es imprescindible conocer no solo la
fisiopatologa de las enfermedades ms comunes que afectan a la poblacin, sino,
entrenarse en la disciplina de la semiologa y propedutica; esto con la finalidad de
establecer relaciones diagnsticas que permitan brindar al paciente atencin
integral y tratamiento oportuno.

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BIBLIOGRAFA
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