Vous êtes sur la page 1sur 9

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

CENTRO DE CINCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO DE BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE BIOFSICA

EXECUO DE UMA ELETROFORESE SDS-PAGE SEGUIDA DE DIGESTO DE


AMOSTRAS PARA ANLISE DE ESPECTROFOTOMETRIA DE MASSAS

ALUNOS:
Gabriella Bruno
Germana Nogueira
Henrique Sousa
Wesley Rodrigues

EXECUO DO EXPERIMENTO: 15 de janeiro de 2016

FORTALEZA
2016

Introduo
Eletroforese um processo de separao de substancias eletricamente carregadas
mediante a migrao diferenciadas delas quando as mesmas so dissolvidas em um eletrlito,
no qual aplicado uma corrente eltrica. Essa tcnica, que busca a separao de compostos de
acordo com sua cara e/ou tamanho, foi introduzida inicialmente pelo bioqumico sueco Arne
Tislius em 1939 e uma das mais utilizadas atualmente para separao de protenas, RNA,
DNA, alm de outras estruturas.
Geralmente a eletroforese aplicada no estudo de composies proteicas,
enzimticas ou genticas e na busca de relao de doenas com alteraes de protenas e
enzimas, entre outros exemplos. Seus tipos variam de acordo com a finalidade de aplicao,
podendo ser de acetato de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida ou
isoeletrofocalizao. Cada uma tem sua especificidade e sensibilidade, sendo usadas tanto em
processos qumicos como em pesquisas.
A eletroforese em gel poliacrilamida (usualmente conhecido como PAGE) foi o
mtodo utilizado na aula prtica. Esse gel formado pela polimerizao de monmeros de
acrilamida na presena de quantidades pequenas de N,N-methylene-bisacrylamide
(normalmente conhecido como bis-acrilamida). A bis-acrilamida consiste de duas molculas
de acrilamida ligadas por um grupo metileno e utilizada como agente formador de ligaes
cruzadas.
O PAGE definido em termos de porcentagem total da acrilamida presente e o
tamanho do poro gerado pode ser alterado variando-se a porcentagem de acrilamida. Baixas
porcentagens resultam em gis com tamanho de poro maior. Alm disso, esse tipo de gel
fornece informaes sobre a massa molecular aparente e composio de subunidades da
protena em meio desnaturante e redutor.
Nessa prtica tambm houve a introduo do preparo de amostras para anlise em
espectrometria de massa. Essa tcnica consiste na anlise microanaltica para obter
informaes sobre o peso molecular e sobre outras caractersticas estruturais da amostra. Alm
disso, esse mtodo j considerado uma das mais importantes ferramentas analticas
disponveis, capaz de fornecer informaes sobre a composio elementar de amostras, a
estrutura molecular e a composio qualitativa e quantitativa de misturas complexas, entre
outras informaes.

Objetivo

Identificao de substncias presente na amostra.


Homogeneidade de sistemas biolgicos

Material

Fonte eletrofortica
Placas de Vidro
Espaadores
Tubos eppendorfs
Ponteiras
Reagentes

Preparo do gel de Separao e Empilhamento

Acrilamida/Bisacrilamida 30,0%/0,8%
Persulfato de amnio (APS) 1% (p/v)
SDS 10%
Tris-HCl 1,5M pH8,8
Tris 0,5 M pH 6,8;

Tampo de Corrida

Tris 25mM
Glicina 192mM
SDS 0,1%

Tampo de amostra (redutor)

Tris 80mM
SDS 2%
5%; -mercaptoetanol pH 6,8;
Azul de bromofenol 1% (p/v)

Preparo e digesto das amostras para anlise em espectrometria de massas

Soluo A: Bicarbonato de Amnio 50 mM e Acetonitrila 50% ;


Soluo B: Bicarbonato de Amnio 50 mM pH 8,0;
Soluo C: 50% Acetonitrila e 5% cido Frmico;
Soluo D: 10mM DTT em 25mM de Bicarbonato de Amnio pH 8,0;
Soluo E: 55mM Iodoacetamida em 25 mM de Bicarbonato de Amnio pH 8,0.

Procedimentos
O gel eletrofortico foi preparado anteriormente por membros no laboratrio do
professor Bruno devido demora, assim, no daria tempo mont-lo em sala de aula. O
utilizado foi um gel de poliacrilamida a 12,5%, seguindo a tabela abaixo:

Tabela 1 Preparo de gel 12,5%.


Todos os reagentes devem ser postos exatamente de acordo com a quantidade
observada acima para ser feito um gel confivel. O SDS colocado justamente para
desnaturar e permitir que as protenas fiquem neutras e possam correr uniformemente pelo gel.
necessrio lembrar de pr o Persulfato e o Temed no mesmo momento, pois eles que
iniciam a polimerizao do gel. Ademais, indispensvel o uso de material de proteo
laboratorial na preparao do gel, devido a toxicidade do material.
Um dos doutorandos do laboratrio iniciou o procedimento de aplicao de amostra,
no gel posto na cuba, deixando a primeira banda do gel com a adio do marcador, para ser
possvel fazer a leitura ps corrida. Cada aluno pode colocar uma amostra para correr no gel,
de acordo com as orientaes ditas pelo doutorando. Aps a aplicao, conectamos a cuba em
uma fonte estabilizadora, fixando uma voltagem de 150V e uma amperagem de 25 mV e
esperamos aproximadamente 2 horas para a corrida ser totalmente realizada.
Paralelamente a essa prtica, iniciamos a preparao de uma amostra para a anlise
em espectrometria de massas. Primeiramente cortamos um spot de um gel de eletroforese j
deixado em sala, e o colocamos em um eppendorf com gua. Em seguida retiramos a gua e
colocamos a soluo A (est descrita nos materiais) e agitamos at a saturao, descartando-a
em seguida e fazendo o mesmo procedimento at que o gel descore. Logo aps, adicionamos a
soluo D e deixamos em ata temperatura, de aproximadamente 56C por 15 minutos,

descartando o sobrenadante em seguida. O prximo a adio da soluo E, deixando-a por


10 minutos em temperatura ambiente e sob proteo da luz, descartando logo aps o
sobrenadante e lavando com a soluo A trs vezes.
Aps esses processos, lavamos o gel com agua ultrapura e adicionamos acetonitrila
100% para o gel desidratar totalmente, retirando o sobrenadante e deixando secar em
speedvac. O ltimo passo feito em sala de aula a adio de uma enzima gelada ao gel
desidratado e recobrindo o gel com a soluo B e deixamos por 4 hrs.

Resultados e Discusses

Figura1 Gel preparado na aula pratica de eletroforese


Como possvel observar no resultado acima, o gel teve alguns problemas, que pode
tanto ter ocorrido na preparao do gel como na aplicao das amostras. presumvel afirmar
que a amostra no estava to purificada, devido ao escorrimento no final da corrida. Alm
disso, visvel que a amostra no estava to diluda quanto o necessrio, em virtude da grande
concentrao em cada banda. Ademais, vivel dizer que em consequncia de inmeras
pessoas diferentes aplicando a amostra, algumas aplicaes no foram depositadas
devidamente em as colunas.
J no preparo das amostras para anlise em espectrometria de massa, no foram
mostrados os resultados obtidos, alm do mais, como o processo foi feito apenas pela metade
devido ao tempo curto de aula prtica, possvel que no haja nem algum resultado bom para
anlise.

Referncias
http://www2.iq.usp.br/docente/miyamoto/DEG_5_Tecnicas_eletroforeticas.pdf. Acesso: 29 de
janeiro de 2016
http://www.abc.med.br/p/exames-eprocedimentos/554982/eletroforese+das+proteinas+o+que+e+isso.htm Acesso: 29 de janeiro
de 2016
https://pt.scribd.com/doc/14171715/Relatorio-aula-pratica-Eletroforese Acesso: 29 de janeiro
de 2016