TALLER

EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS

NOMBRES: ____________________________
GUPO:_____________________________

OBJETIVOS
1. Conocer algunos mtodos de extraccin de cidos nucleicos
2. Realizar la extraccin del DNA por el mtodo del Fenol-Cloroformo
3. Determinar las propiedades de los cidos nucleicos que son evidenciadas en la
prctica.
1. EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS
Existen varios sistemas de extraccin y purificacin de cidos nuclecos.
El mtodo FENOL-CLOROFORMO que se aplicar en esta prctica es el que se utiliza
con mayor frecuencia. Se fundamenta en el uso de solventes orgnicos que por diferencia
de densidades y por su capacidad para degradar protenas permiten la purificacin y
aislamiento de DNA.
A partir de una muestra de sangre perifrica y mediante centrifugacin son obtenidos los
leucocitos (clulas nucleadas) de donde se aislar el DNA.
El protocolo de extraccin mediante Fenol-cloroformo se describe a continuacin:
1. La capa de leucocitos obtenida de un volumen de 10 ml de sangre total, es
sometida a lisis por adicin de 500 ul Tris-Cl 10 mM- EDTA 5mM pH: 8.0 FRIO.
2. La lisis celular es completada agregando 5 ml de buffer de lisis (LSN). Se mezcla
suavemente por inversin.
3. A lo anterior se le adiciona 2.5 ml de Fenol, y se mezcla suavemente por inversin
durante 5 min.
4. Agregar 2.5 ml de Cloroformo-Isoamlico 1:24. Mezclar por inversin 5 min.
5. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min.
6. Obtener el sobrenadante ( DNA ) en un tubo a parte. Adicionar a este
sobrenadante 2.5 ml de fenol + 2.5 ml de cloroformo y mezclar por inversin
durante 5 min.
7. Centrifugar a 3.000 rpm por 10 min.
8. Repetir los pasos 6 y 7.

9. Hacer una ltima extraccin agregando 2.5 ml de Cloroformo al sobrenadante

obtenido. Mezclar suavemente por inversin por 5 min.
10. Centrifugar 10 min a 3.000 rpm.
11. Obtener el sobrenadante y adicionarle 1/10 del volumen en NaCl 5M.
12. Adicionar 2 volumenes de etanol absoluto. EL DNA SE PRECIPITA EN LA
INTERFASE.
13. Hilar con pipeta Pasteur estril (de vidrio) hasta asegurarse que se ha obtenido la
totalidad del DNA.
14. Pasar por soluciones de etanol a 90%, 80% y 70% con el fin de retirar el exceso
de sales. Dejar secar al aire libre.
15. Resuspender en 700 ul de Tris 10 mM- EDTA 1 mM pH:8.0.
16. Incubar a 56C durante 1 hora, mezclando suavemente cada 10 min. Aqui el DNA
se desenrrolla y homogeniza en solucin.
Una vez resuspendido el DNA es analizado mediante migracin electrofortica en un gel
de agarosa al 0.7%. De esta forma es posible determinar si la resuspensin ha sido
homognea, as como su calidad y concentracin aproximada.
Un DNA en buenas condiciones posee un tamao superior a 20 Kb; los valores inferiores
sugieren degradacin del mismo observada por la presencia de un barrido a lo largo de la
trayectoria de migracin. Un DNA con resuspensin del 100% se observa como una
banda de brillo homogneo.
En el siguiente cuadro se dan los valores del rango de separacin del DNA a travs de
diferentes concentraciones de geles de agarosa.

AGAROSA % (P/V)

RANGO DE SEPARACION DE
MOLECULAS DE DNA LINEAL (Kb)

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

Para lograr la visualizacin del DNA sobre un gel de agarosa es indispensable adicionar al
sistema una solucin de Bromuro de Etidio (BrEt) en una concentracin de 0.1 a 0.5
ug/ml. El BrEt es una molcula fluorescente que tiene la propiedad de intercalarse entre
las bases del DNA (propiedad que lo hace altamente mutagnico) permitiendo la
observacin del mismo sobre un transiluminador U.V. a una longitud de onda entre 302 y
366 nm.
Dos importantes procedimientos en el desarrollo de la gentica moderna son: la digestin
del DNA mediante endonucleasas de restriccin y la electroforesis del DNA en geles de
agarosa y poliacrilamida; estos dos sistemas permiten el corte del DNA en fragmentos de
tamao especfico y su posterior separacin por peso molecular a travs de un gel
mediante la aplicacin de un campo elctrico respectivamente.
La agarosa es una forma de agar altamente purificada que al solidificarse forma una malla
a travs de la cual el DNA se desplaza gracias a la accin del campo elctrico. Los
fragmentos de DNA ms grandes migran mas lentamente a lo largo del gel que los
fragmentos pequeos. Esta diferenciacin permite la separacin de una mezcla de
fragmentos de DNA de acuerdo a su peso molecular
Extraccin de DNA
Responda las siguientes preguntas
1. Enumere las propiedades fsicas del DNA
2. Explique brevemente el fundamento de cada uno de los siguientes mtodos de
extraccin o purificacin de Acidos Nuclecos.
A. Extraccin Enzimtica
B. Extraccin por DTAB-CTAB
C. Extraccin por chelex
D. Extraccin Salina
3. Sobre las enzimas de restriccin defina los siguientes trminos:
A. Secuencias palindrmicas
B. Isoesquizmeros
C. Significado de las letras y nmeros con que se asignan. Ej: HaeIII, EcoRI, etc
D. RFLP
4. Diga dos usos para los cuales se emplea la tecnologa del DNA,
5. Bibliografa consultada

BIBLIOGRAFIA
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