PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA
UNIVERSIDAD DE CALDAS

GUAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Mara Marcela Martnez Miranda
Bacteriloga y laboratorista clnico
M.Sc. Microbiologa

2016-1

[CARRERA

35 # 60160 SEDE SANCANCIO BLOQUE B PISO 4TEL.:8781587

ndice
INTRODUCCIN
Prctica 1. Preparacin de muestras y recuento de aerobios de mesfilos por la tcnica de
recuento en placa.
Prctica 2. Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento microbiano.
Prctica 3. Enumeracin de coliformes y E. coli por la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP).
Prctica 4. Recuento de mohos y levaduras.
Prctica 5. Anlisis de microbiolgico de ambientes y superficies en la industria alimentaria.
Prctica 6. Anlisis microbiolgico del agua mediante la tcnica de filtracin por membrana
(FPM).
Prctica 7. Deteccin de Salmonella spp.
Prctica 8. Deteccin de Listeria monocytogenes.
Prctica 9. Determinacin de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) en agua.
Prctica 10. Recuento e identificacin de Staphylococcus coagulasa positivo.
Prctica 11. Recuento e identificacin de Bacillus cereus.
Prctica 12. Evaluacin de esterilidad comercial de conservas.
TEMPORALIZACIN

Introduccin
Los alimentos, al igual que el agua, no son productos estriles cuya carga microbiana vara de
acuerdo del tipo de alimento, su origen, procesamiento, conservacin y manejo.
La calidad microbiolgica de los productos alimentarios hace referencia a dos aspectos
fundamentales: la calidad higinico-sanitaria y la calidad comercial. La primera tiene una gran
importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable riesgo para la salud del
consumidor, ya que los alimentos pueden ser vehculos de microorganismos patgenos.
Respecto a la segunda, cabe sealar que hay microorganismos que aunque carezcan de
significado sanitario, pueden ser causa de deterioro del alimento, modificando su color,
aroma, sabor, consistencia o aspecto de forma tal que sea rechazado por el consumidor.
El anlisis microbiolgico de alimentos est destinado a la bsqueda de agentes patgenos o
de microorganismos indicadores de una contaminacin no admisible, de modo que se asegure
la calidad higinico-sanitaria y comercial de los mismos. Aunque los microorganismos ms
importantes en cuanto a la salud pblica son aquellos que desarrollan enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA), tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, etc., existe un grupo de microorganismos de especial utilidad en la industria
alimentaria, que son los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son
necesariamente patgenos y su presencia se relaciona con la existencia de contaminacin,
avisando de la posible existencia de patgenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de hecho, en
la legislacin se considera su anlisis como un parmetro de calidad microbiolgica.
El propsito de la presente gua de laboratorio es dar a conocer a los estudiantes de Ingeniera
de Alimentos de la Universidad de Caldas los diferentes procedimientos para el anlisis
microbiolgico de alimentos, de la aplicacin de Buenas Prcticas de Laboratorio, toma de
muestras, diluciones, hasta la fase analtica de los mismos, recuento, lectura, interpretacin y
presentacin de los resultados.

Prctica 1. Preparacin de muestras y recuento de aerobios

mesfilos por la tcnica de recuento en placa
I.

INTRODUCCIN

La operacin de preparacin de muestras para el anlisis microbiolgico exige unas reglas de

manipulacin asptica muy estrictas, as como la utilizacin de material y diluyentes estriles,
para evitar la contaminacin exterior del alimento.
La mayora de los alimentos no son estriles sino que contienen una carga microbiana, que
vara ampliamente en nmero, dependiendo del alimento. Es por eso que al preparar el
alimento en el laboratorio se le realizan una serie de diluciones para su cuantificacin, ya que
si se siembran los alimentos sin diluir, presentarn un recuento tan alto que sera imposible
hacer el conteo.
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se
desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. El recuento en placa puede
referirse a distintos grupos de bacterias, segn sea la temperatura y la atmsfera de
incubacin:

Microorganismos mesfilos: crecen a temperaturas ptimas entre 25-40C.

Microorganismos psicrotrofos: Aunque su temperatura ptima de crecimiento se estima
entre 15 y 20C, se pueden multiplicar lentamente a temperaturas de refrigeracin (0 y
6C).
Microorganismos termodricos: Son capaces de sobrevivir el calentamiento de un
alimento a temperaturas de pasteurizacin (63 por 30 minutos), pero no crecen a altas
temperaturas.

El propsito de la presente prctica es capacitar al estudiante en la preparacin de las

muestras de alimentos y sus diluciones y dar a conocer el mtodo para el recuento en placa de
aerobios mesfilos.
II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS
Insumos

Muestras lquidas: Leche, bebida hidratante energtica, jugos, etc.

Muestras slidas: Queso, hamburguesa, lechuga, frutas, arepas, etc.

Reactivos y medios de cultivo

Agua peptonada 0,1%

Agar Plate Count (PCA) fundido

Alcohol etlico (70%).

Materiales (estriles)

Instrumentos para la preparacin de las muestras: tijeras, pinzas, cuchillos, cucharas,

esptulas, etc.

Placas de Petri vacas.

Vasos para licuadora.

Gasa estril.

Frascos con 90 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).

Pipetas de 1 y 10 ml.

Tubos con 9 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).

Mecheros de Bunsen.

Propiteadores.

Equipos

Balanza.

Licuadora.

Incubadora regulada a 35C

Cuenta colonias

III. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIN DE LA MUESTRA
1. Muestras slidas o semislidas

Pesar aspticamente 10 gr de la muestra a analizar en un recipiente homogenizador.

Adicionar 90 ml del diluyente (agua peptonada 0,1%).

Homogenizar la muestra con el diluyente en el recipiente homogenizador durante 1-2

minutos a 2000-3000 r.p.m hasta obtener una suspensin completa y homognea.

Filtrar la suspensin usando una gaza poco tupida para retener los restos
macroscpicos de la muestra.

2. Muestras lquidas no viscosas

Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un

tiempo de 7 segundos.

En condiciones aspticas, tomar 10 ml de la muestra y diluir con 90 ml del diluyente

(agua peptonada 0,1%) en un recipiente de tamao adecuado.

Homogenizar la suspensin manualmente durante 1-2 minutos.

3. Muestras slidas y semislidas congeladas

Descongelar en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 h. y no ms de 24 h antes de diluir y

analizar.

Proseguir como se indica en el numeral 1 para muestras slidas y semislidas no

congeladas.

B. PREPARACIN DE LAS DILUCIONES

La preparacin de diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar
diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos
posteriores.
1. La mezcla homogenizada en el apartado anterior se constituye en la suspensin madre y
primera dilucin de la serie (1:10).

2. A un tubo que contenga 9 ml del diluyente se transfiere 1 ml de la suspensin madre.

Mezclar durante 30 segundos en agitador excntrico. As se obtiene la segunda dilucin
(1:100). Desechar la pipeta usada.
3. De la mezcla anterior, y con una nueva pipeta estril, se incorpora 1 ml a otro tubo que
contenga 9 ml del diluyente. Mezclar durante 30 segundos en agitador excntrico. As se
obtiene la tercera dilucin (1:1000). Desechar la pipeta usada.
4. Repetir la operacin en varios tubos hasta lograr las diluciones deseadas. De esta manera
se obtiene la serie de diluciones decimales (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, etc.).
5. Los tubos de la serie se mantendrn en refrigeracin hasta el comienzo del anlisis, que no
debe exceder las dos horas.
C. SIEMBRA EN PLACA
1. Escoger dos diluciones consecutivas para la siembra de acuerdo al tipo de alimento
analizado.
2. A partir de las diluciones escogidas y por duplicado, depositar con pipeta estril 1 ml de
cada dilucin en las cajas de Petri, previamente marcadas as: # de grupo, fecha, hora, el
tipo de ensayo microbiolgico, medio de cultivo y tipo de muestra.
3. Aadir a cada caja de Petri unos 15 ml de agar PC fundido y atemperado a 45C.
4. Mezclar perfectamente medio e inculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos
circulares con la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj y en forma de cruz,
evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar al agar de las placas sobre una superficie totalmente plana durante 10
minutos.
6. Cuando se haya solidificado completamente el agar, se invierten las placas y se incuban a
35C durante 24 - 48 h.
D. REGISTRO DE RESULTADOS
1. Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren entre 10 y 300 colonias aisladas.
2. Marcar las colonias contadas con marcador Sharpie para evitar contarlas de nuevo.
3. Registrar los resultados en la siguiente tabla.
N colonias
Caja 1
Caja 2

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

IV. CUESTIONARIO
1. Elabore una tabla con la composicin qumica de las sustancias usadas como diluyentes en
el laboratorio de microbiologa de alimentos.
2. En una tabla, mencione y describa cada uno de los homogeneizadores de muestras de
alimentos. Cul es el ms usado en el laboratorio de microbiologa de alimentos?
3. Haga una tabla en la que enumere 10 alimentos a los que se les hace recuento de aerobios
mesfilos, los lmites microbiolgicos permitidos y la norma que lo establece en Colombia.

4. Busque en la pgina del Manual de Bacteriologa Analtica de la FDA la gua para calcular y
reportar las UFC de aerobios mesfilos (Items C y D) y extraiga los ejemplos que se
encuentran
all.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm
5. Haga una tabla comparativa entre tres mtodos normalizados diferentes para el recuento
de aerobios mesfilos, incluyendo diluyentes, medios de cultivo, condiciones de
incubacin, etc. (ISO, BAM-FDA, ICMSF, etc.).
V. BIBLIOGRAFA
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