Universidad de

San Martn de
Porres

Curso: Laboratorio de microbiologa

Tema: Actividad antimicrobiana in vitro antibiograma

Alumno: Becerra Walter, Cristhiam

Seccin: 05
Introduccin:
Es un mtodo que se utiliza para determinar la sensibilidad de una cepa
bacteriana frente a los distintos agentes antimicrobianos (antibiticos). Esta
sensibilidad se puede determinar fcilmente utilizando el mtodo de
difusin del agente antimicrobiano en el agar.
La utilidad bsica del antibiograma es la instauracin de un tratamiento
antibitico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo
responsable de la infeccin posee mecanismos que le confieran inmunidad
frente a algn antibitico para no incluirlo como terapia.
En cuanto al tratamiento el antibiograma no slo es necesario en la
instauracin, tambin resulta til en el seguimiento e incluso en la
confirmacin de tratamientos empricos. En ocasiones la enfermedad
infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los
datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confirmar, o en
su caso corregir el tratamiento.
Otra aplicacin de las tcnicas de estudio de resistencia es la epidemiologa.
Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los
aislamientos clnicos para tomar medidas correctoras.

Objetivos
Entender el fundamento del antibiograma, el modo que se realiza y
las principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un
antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una
bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El
mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer

Marco terico
La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de
la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibitico.
La CIM se define como la menor concentracin de una gama de diluciones
de antibitico que provoca una inhibicin de cualquier crecimiento
bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite
establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes
especies bacterianas.
Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de
rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y
mtodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de
rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en funcin de su
sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina Sensible
(S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitico.
Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:

Sensible,

si

existe

una

buena

probabilidad

de

xito

teraputico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.

Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o

muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea
cual fuere el tipo de tratamiento.

Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se

puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes
concentraciones locales o aumento de la posologa).

Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los

resultados (S, I, R) obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a
los antibiticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar
(Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes
cefalosporinas de 1 generacin que no es necesario probar, ya que el
resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotoma). Este hecho

permite ensayar un nmero reducido de antibiticos, sin limitar por ello las
posibilidades teraputicas.
Interpretacin de un Antibiograma
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan dbilmente in vitro, cuando
se inscriben en el DNA bacteriano. Su expresin en el organismo, en donde
las condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondra al riesgo de
fracaso teraputico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado
de manera global a fin de descubrir, a travs de la comparacin de las
respuestas para cada antibitico, un mecanismo de resistencia incluso
dbilmente expresado. As, gracias a la interpretacin, una cepa que
aparece como falsamente sensible ser categorizada como I o R (Ejemplo:
Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede aparecer
sensible in vitro a las cefalospornas de 3" generacin. El resultado de
Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilizacin
de estos antibiticos correra el riesgo de provocar un fracaso teraputico).

Resistencia bacteriana
Cada antibitico se caracteriza por un espectro natural de actividad
antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en
su estado natural, sufren una inhibicin de su crecimiento por
concentraciones de su antibitico susceptibles de ser alcanzadas in vivo. A
estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho
antibitico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro
de dicho espectro se denominan naturalmente resistentes.
El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes
eliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de
seleccin. El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido cas
siempre al uso intensivo del antibitico en cuestin.
La resistencia natural es un carcter constante de todas las cepas de una
misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales
permite prever la inactivdad de la molcula frente a bacterias identificadas
(despus del crecimiento) o sospechosas (en caso de antiboterapia
emprica). En ocasiones, constituye una ayuda para la identificacin, puesto
que certas especies se caracterizan por sus resistencias naturales.
Ejemplos: Resistencia natural del Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la
colistina. Resistencia natural de la Klebsiella pneumoniae a las penicilinas
(ampicilina, amoxicilina).

La resistencia adquirida es una caracterstica propia de ciertas cepas,

dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio
gentico ha sido modificado por mutacin o adquisicin de genes.
Contrariamente a las resistencias naturales, las resistencias adquiridas son
evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilizacin de los
antibiticos. En el caso de numerosas especies bacterianas, y teniendo en
cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas, el espectro natural de
actividad no es ya suficente para guiar la eleccin de un tratamiento
antibitico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.
Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de
resistencia. En general, afecta a varios antibiticos dentro de una misma
familia (Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza
con todas los -lactmicos). En ciertos casos, puede afectar a antibiticos
de familias diferentes (Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las
ciclinas se cruza con la resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).
Un resistencia asociada es cuando afecta a varios antibiticos de familias
dferentes. En general, se debe a la. asociacin de varios mecanismos de
resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va
frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicsidos, macrolidos y
ciclinas).
Con el fin de tener en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas y,
por consiguiente, proporcionar a los mdicos datos tiles cuando deben
proceder a la eleccin emprica de una antibioterapia, la nocin de espectro
clnico completa la de espectro natural. Definido para cada antibitico, este
espectro clnico se incluye en el Resumen de las Caractersticas del Producto
(RCP). Este espectro integra no solamente datos bacteriolgicos (espectro
natural, frecuenca de las resistencias adquiridas), sino tambin datos
farmacocinticos y clnicos (las especies descritras en el espectro son
aquellas para las que se ha demostrado la actividad clnica del producto). El
espectro clnico se revisa regularmente para tener en cuenta la evolucin de
las resistencias adquiridas.
Mecanismos de la resistencia adquirida
El mecanismo gentico de adquisicin de una resistencia puede ser:
- La mutacin de un gen implicado en el modo de accin de un antibitico:
Este mecanismo afecta preferentemente a ciertos antibiticos: quinolonas,
rifampicina, cido fusdico, fosfomicina, antituberculosos y a veces
cefalosporinas (Ejemplo: La resistencia a las quinolonas por modificacin del
ADN grasa en las enterobacterias).
- La adquisicin de genes de resistencia transferidos a partir de una cepa
perteneciente a una especie idntica o diferente: Ciertos Antibiticos estn

particularmente
afectados
por
este
mecanismo:
-lactmicos,
aminoglicsidos,
tetraciclinas;
cloranfenicol,
sulfamidas
(Ejemplo:
Resistencia a la ampicilina E. coli y del Proteus mirabilis).
El mecanismo bioqumico de la resistencia puede ser:
- una produccin por la bacteria de enzimas que inactivan el antibitico.
Ejemplo: Penicilinasa de los estafilococos, lactamasa de amplio espectro
(BLAE) de las enterobacterias.
- una modificacin del blanco del antibitico. Ejemplo: Modificacin de las
Protenas de Enlace con la Penicilina (PBP) de los estafilicocos resistentes a
la oxacilina (llamados estafilococos "Meti-R"). Neumococos resistentes a la
penicilina.
- una impermeabilidad de la pared bacteriana por modificacin o por
disminucion cuantitativa de las porinas. Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa
resistente a la imipenem.
- un mecanismo de efusin: expulsin de la molcula por un transporte
activo. Ejemplo: Estafilococos resistentes a las tetraciclinas.
Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro
En la poca posterior al descubrimiento de las sulfonamidas y de la
penicilina rara vez se probaba la sensibilidad de los microorganismos a las
drogas. Los pacientes eran tratados en forma emprica y los
microorganismos generalmente eran sensibles. Slo tras el surgimiento de
las cepas resistentes, poco despus de la introduccin de estos agentes, los
microbilogos comenzaron a probar la sensibilidad de un microorganismo
infectante frente a los agentes antimicrobianos.
En un primer momento, el mtodo estndar utilizado para las pruebas in
vitro fue el de dilucin en caldo, que proporcionaba un resultado
cuantitativo de la concentracin de agente antimicrobiano necesaria para
inhibir el desarrollo de un organismo dado.

Mtodo base de dilucin en caldo

En los mtodos de dilucin en caldo, base de casi todos los mtodos
utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del
agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo
de cultivo que sostendr el desarrollo del microorganismo. El caldo ms
comnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton
suplementado con los cationes magnesio y calcio.

Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre"

concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones
apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de
crecimiento. Luego de la incubacin adecuada (usualmente de un da para
el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicar desarrollo
bacteriano. El microorganismo crecer en el tubo control y en todos los otros
que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su
desarrollo. La concentracin de antibitico que presente ausencia de
crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo),
se designa como la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) (veresquema
ampliado).
Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un
microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad bactericida,
que emplea el mismo sistema de dilucin en caldo que para medir la
sensibilidad.
Al mismo tiempo que la suspensin inicial del microorganismo es inoculada
en los tubos de caldo, se toma una alcuota del tubo de control de
crecimiento, inmediatamente despus de ser sembrado, y se inocula
tambin en una placa de agar para determinar el nmero real de unidades
formadoras de colonias (UFC) del inculo. Este nmero se obtiene al contar
las colonias presentes luego de la incubacin de la placa de agar hasta el
da siguiente y por multiplicacin por el factor de dilucin. Por ejemplo,
usando un asa calibrada de 0,01 ml para sembrar la placa y contando unas
250 colonias, en 1 ml del tubo original habr 250/0,01.
Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inculo
de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de
agar (la pequea cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto
con el inculo se elimina por dilucin en el agar), y el nmero de colonias
que crece en estos subcultivos, despus de incubar durante la noche, se
compara con el nmero de UFC/ml del cultivo original. Dado que incluso las
drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una poblacin
bacteriana, la mnima concentracin del agente antibacteriano que permite
sobrevivir a menos de 0,1 % del inculo original se denomina concentracin
bactericida mnima (CBM) o concentracin letal mnima (CLM).
Las CMI y las CMB de un agente antimicrobiano pueden ser determinadas,
con este mtodo o con alguna variante, para cualquier bacteria que crezca
en un medio liquido.
Pero segn se pudo disponer de mayor nmero de agentes antimicrobianos
para el tratamiento de una gran variedad de bacterias, se hicieron
aparentes las limitaciones del macromtodo de dilucin en caldo y se

desarrollaron variantes de esta tcnica que permitieran, por ejemplo, probar

simultneamente un gerrnen aislado de un paciente frente a ms de un
agente antimicrobiano.
Actualmente son varios los mtodos que se utilizan para llevar a cabo los
estudios de sensibilidad a los antibiticos y todos ellos se realizan en los
laboratorios de microbiologa bajo condiciones entandarizadas por
organismos internacionales. Entre todos, tres son los que, por su sencillez y
fiabilidad, se han impuesto como sistemtica de rutinaria en la mayora de
los laboratorios:

Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro

Mtodo de difusin en agar
Una vez demostradas las grandes ventajas de las tcnicas de dilucin en
caldo, el paso siguiente, pensando sobre todo en poder realizar fcilmente
pruebas de sensibilidad de un microorganismo frente a mltiples
antibiticos a la vez, consisti en buscar la manera de aplicar la idea
directamente a las placas de agar.
Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una placa de
agar con el microorganismo en estudio, colocando pequeas cubetas (de
metal o vidrio) sobre el agar y agregando las soluciones de los diferentes
antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los agentes antimicrobianos
difundan en el medio en forma radial alrededor de la cubeta e inhiban el
desarrollo del microorganismo en la zona donde su concentracin era
suficientemente alta. Las reas de inhibicin grandes indicaban una
actividad antimicrobiana ms efectiva.
Este mtodo fue modifcado en 1947 por Bondi y col. incorporando el agente
antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso adelante gigantesco
ya que el uso de los discos de papel permita preparar un gran nmero de
pruebas idnticas y almacenarlas para uso futuro.
En 1966, despus de los estudios realizados por Bauer, Kirby, Sherris y Turk,
ensayando diferentes cepas bacterianas, el empleo de los discos de papel
de filtro para las pruebas de sensibilidad fue estandarizado y correlacionado
definitivamente con las CMI correspondientes.
Durante muchos aos, y a pesar de ser una tcnica puramente cualitativa,
el mtodo de difusin por disco (o mtodo Kirby-Bauer), en funcin sobre
todo de su comodidad, economa y fiabilidad, ha sido, y aun es, uno de los
ms utilizados en los laboratorios de todo el mundo.

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y

sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios
antibiticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35C y al cabo de
este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el dimetro de la
zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y se compara con
las referencias oportunas publicadas por el NCCLS. Con esta referencia
podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente
(S, I, R) a cada uno de los antibiticos ensayados en las placas.

Antibiograma realizado por el mtodo de difusin en agar

En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el
mtodo de difusin en agar por medio de discos.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con
crecimiento bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color
claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en
las zonas no inhibidas. Los crculos negros que rodean a cinco de los seis
discos marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han inhibido,
con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El
sexto disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica
la resistencia del microorganismo a ese antibitico.
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad superior de la
placa, permite observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior.
Puede verse adems, con gran claridad, la especial disminucin de la
intensidad de crecimiento del microorganismo en la zona interior del halo de
inhibicin del disco de CTX-30, debido probablemente a la aparicin de
mutantes resistentes de dicho microorganismo capaces de soportar en
mayor medida que el resto el efecto inhibitorio del antibitico.
Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro
Mtodo de E-test
Es uno de los mtodos ms recientes que se han presentado en el mercado
y resulta de una curiosa combinacin de caractersticas de los mtodos
anteriores. Se trata de una tcnica cuantitativa en placa que permite
obtener una lectura directa de CMI en g/ml, ya que se emplean tiras
plsticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibitico
indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.
Una de sus grandes ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un
mtodo ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o

anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan

requerimientos especiales para crecer.
El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se
deposita la tira del antibitico (o antibiticos) a ensayar. Tras la incubacin
de 16-24 horas a 35C se observan las placas y se valora la zona de
inhibicin, de forma elptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee
directamente observando el punto ms bajo de la elipse que presente
crecimiento.
Antibiograma realizado por el mtodo de E-test
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el
mtodo de E-test.
En la fotografa de la izquierda se muestra una vista general de una placa
con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color ms
claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en
las zonas no inhibidas. Las elipses ms oscuras que rodean la parte superior
de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han
inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a
estudio.
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad inferior de la placa,
permite observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior. Se
aprecia perfectamente como el pico de la zona ms estrecha de la elipse en
la tira de MZ coincide, en la escala graduada, con la franja entre las marcas
de 1.5 y 2, lo que nos indicara que la CMI de este antibitico (MZ) para este
microorganismo sera de 2 g/ml.
Prctica de laboratorio

Esterilizar con calor antes

de iniciar la prctica.

Quitar el algodn del tubo de
ensayo, y tomar la respectiva muestra.

 Aplicar la muestra sobre

la placa

Colocar el frmaco alrededor y marcarlo con

numeracin respectiva.

Discusin
En estos 8 aos se ha producido un avance espectacular en el conocimiento
de los mecanismos de resistencia, esencialmente de sus bases genticas y
en el de los determinantes asociados a su dispersin. Este hecho ha estado
en parte influenciado por la introduccin de la lectura interpretada del
antibiograma en los laboratorios de microbiologa, primer escaln en el
reconocimiento de los mecanismos de resistencia, y tambin por la
popularizacin de las tcnicas de microbiologa molecular. Asimismo, otros
facultativos, con responsabilidad directa sobre el paciente, como
infectlogos, pediatras o intensivistas, han comprendido la importancia de
este proceso, han asumido cierto aprendizaje en este terreno y han
demandado al microbilogo informacin complementaria en los informes de
sensibilidad.
Por otra parte, durante este tiempo tambin se ha acumulado un enorme
conocimiento en el terreno de la farmacodinamia (Pd) de los
antimicrobianos que ha influido de manera decisiva en la definicin de los
ndices farmacocintica (Pk)/Pd como elementos predictivos de la eficacia
clnica de estos compuestos. Para algunos antimicrobianos, estos ndices
han contribuido de manera decisiva en la consideracin de las categoras
clnicas utilizadas en la interpretacin del antibiograma. El proceso de
armonizacin en Europa de los puntos crticos de sensibilidad y de
resistencia liderado por el grupo European Committe of Antimicrobial
Susceptibility Testing (EUCAST) y la revisin de los establecidos por el

Clinical Laboratory Stardards Institute (CLSI) en los Estados Unidos han

estado, en parte, guiados por este conocimiento. Adems, el grupo EUCAST
ha establecido los denominados puntos de epidemiological cut-offs (ECOFF,
corte epidemiolgicos) y ha enunciado reglas de experto de los resultados
de sensibilidad.
La lectura interpretada del antibiograma no puede ser ajena a todos estos
avances y debe incorporar aquellos conocimientos que permitan una mayor
eficiencia en su ejercicio para aumentar el valor clnico de las pruebas de
sensibilidad que diariamente se realizan en los laboratorios de Microbiologa
Clnica. Este hecho cobra una mayor importancia en momentos en los que
es necesario reforzar las reas de conocimiento y las competencias del
microbilogo clnico ante las tendencias de troncalidad de las especialidades
de laboratorio de diagnstico clnico y externalizacin de laboratorios. La
lectura interpretada, necesaria en la actividad clnica, cumple estos
objetivos y trasciende la vertiente clnica del microbilogo.

Bibliografia
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST): Expert rules in antimicrobial susceptibility testing, 2008.
Disponible en: http:// www.srga.org/eucastwt/MICTAB/index.html
Mesa Espaola de Normalizacin de la Sensibilidad y Resistencia a los
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Jorgensen JH. Who defines resistance? The clinical and economic
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