Tipos de inmunoensayo:

Radioinmunoensayo (RIA): El
marcador es un istopo radioactivo.

Marcados:
Conjugados a
molculas que emiten
seales detectables

Anlisis inmunoenzimticos (EIA): El

marcador es una enzima.
Fluoroinmunoanlisis: El marcador
es una partcula fluorescente.
Ensayos
inmunoquimioluminiscente: La
marca es una sustancia
quimioluminiscente.

Inmunoensayo:
Formacin de
inmunocomplejos
(antgeno/anticuerpo)

No marcados:
Son medidos por
dispersin de luz o por
visualizacin directa

Precipitacin
Aglutinacin

J lmmunol Methods. 1992; 150: 521

Tcnicas basadas en interaccin

antgeno-anticuerpo

Inmunoensayos
Western blot
Inmunoprecipitacin
Inmunohistoqumica
Inmunofluorescencia

Inmunoensayos:

Comparacin

ELISA (Enzyme linked Immunosorbent

Assay):

La prueba de ELISA se basa en la

formacin de inmunocomplejos, (reaccin
antgeno-anticuerpo, uno de los cuales
debe ser de reactividad conocida), para
detectar la presencia de un analito de
inters.
La deteccin se realiza colorimtricamente
por la interaccin de un sustrato
cromognico y una enzima que ha sido
acoplada a un anticuerpo detector.
En el ELISA, uno de los reactivos se
conjuga con una enzima formando un
complejo con actividad inmunolgica y
enzimtica.

Engvall y Perlman 1971

ELISA. Pasos

Tipos de
ELISA:

Utilidad
Deteccin de Ag y Ac
Bacterias
Parsitos
Hongos
Virus
Deteccin de complejos autoinmunes
Anti- DNA (Antgenos nucleares
extractables: Sm - Ro - La - RNP)
Anti-Histonas (H1, H2A, H2B, H3,
H4)
LES

Utilidad
Deteccin de Acs contra antgenos de tejido
Anti-tiroglobulina
Anti-microsomal
Anticuerpos Antifosfolpidos (Cardiolipina
IgG-M)
Detecin de Ags asociados a tumores:
Ag prosttico
Ag ovario (Ca125)
ACE, alfafetoprotena

Utilidad
Clases y subclases de Ig

ELISAs y Generaciones:
1ra generacin
Ag: lisado purificado de VIH
Pocas sensibilidad y especificidad
2da generacin
Ag: protenas recombinantes de VIH.
Deteccin de VIH-1 y VIH-2
Poca sensibilidad, mejora la especificidad
3ra generacin
Ag: protenas recombinantes de VIH.
Deteccin del grupo O del VIH. IgM e IgG
Mejora la sensibilidad
4ta generacin
Capacidad para detectar al Ag p24 y
anticuerpos

Electroforesis
de protenas

ELECTROFORESIS
Pasos bsicos

WESTERN
BLOTTING

WESTERN BLOTTING
Pasos bsicos

Difusin.
Capilaridad (southern like).
Electrofortica.

WESTERN BLOTTING
Luminol

Mltiples
exposiciones de la
membrana hasta
conseguir la mejor
imagen.
Permite la deteccin
cualitativa y
cuantitativa en un
mayor rango de
concentraciones
Los sustratos
quimioluminiscentes
proporcionan la
mayor sensibilidad.

WESTERN BLOTTING
Everybody knows western

Tcnicas basadas en
fluorescencia
Citometra de flujo
InmunofluoresciaMicroscopia de
fluorescencia

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Hidrodinmica

ptica

Electrnica

Tcnica que permite analizar

partculas en suspensin que
se hacen fluir a travs de un
rayo de luz, las partculas
interactan dispersando este
haz de luz y emitiendo
fluorescencia, estas seales
pticas son detectadas,
transformadas y almacenadas
electrnicamente.

ptica

Fluorocromos

Utilidad: Evaluacin de la funcin hematopoytica

Utilidad: Leucemias linfoblsticas

Evaluacin de clulas
fagocticas
Fagocitosis

Ltex
Marcajes
especficos

Evaluacin de clulas fagocticas

Estrs oxidativo
DHR / DHE

NBT

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

Anticuerpos Antinucleares (IFI Hep-2)

Anticuerpos Anti DNA

Anticuerpos Antimitocondria

Anticuerpos Antimsculo Liso

Anticuerpos contra Polimorfonuclear
Neutrfilo (ANCAS)

Anti-FTA

Microscopa confocal

Microscopa confocal
Aplicaciones!!!

FITC sdica

Violeta de Cresilo

Acriflavina HCL

Inmunohistoqumica

Inmunohistoqumica

Montaje de la muestra

Fijado e inclusin en parafina

Cortado ultrafino
Montaje en laminas

Inmunohistoqumica

Pretratamiento del tejido

Tratamientos proteolticos o por calentamiento

Inhibicin de actividades endgenas indebidas
Bloqueo

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

Inmunohistoqumica
Aplicaciones!!!

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Desarrollada en 1986 por Kary Mullis
Obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de una cantidad muy pequea
Amplificar un fragmento de ADN o ARN (RT-PCR)
Identificacin de:

Microorganismos

Personas (cadveres)
Investigacin

Pasos de la PCR

PCR en tiempo Real. Ventajas

Mayor precisin, exactitud y sensibilidad
Permite hacer detecciones mltiples
No requiere procesamiento post-PCR.
Evita la contaminacin
Mayor rapidez en la obtencin de los
resultados
Cuantificacin del contenido del material
gentico (ADN, ARN)

PCR en tiempo Real. Utilidad

dentificacin de microorganismos
Cuantificacin
Monitoreo de resistencia a tto.
Expresin de genes

Microarray

http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm

Utilidad:

Expresin de genes en
diferentes patologas

Valor pronsticoCncer

Susceptibilidad a
enfermedad

Infecciones

Alergias

Analytica Chimica Acta. 2007, 601: 26