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CURSO
: BIOTECNOLOGA ANIMAL
CHACHAPOYAS PER
2016
INTRODUCCION
A pesar de que es abundante el conocimiento de los factores que afectan la recoleccin pos
mortem de ovocitos, existe escasa literatura de los efectos de los procedimientos de aspiracin en
el nmero, morfologa y la capacidad de desarrollo subsecuente de los complejos cumulusovocito recuperados. Sin embargo existen pocas deferencias bsicas entre la recuperacin de
ovocitos post mortem e in vivo, que hacen una comparacin entre ambas, al menos parcialmente
hipottica.
Primero la manipulacin transrectal del ovario es ms complicado en la donante viva siendo an
ms trabajoso por la visualizacin indirecta del mismo a travs de imgenes ecogrficas. Cuando
ovarios de mataderos son puncionados el operador puede examinar el ovario completamente.
Segundo, se puede esperar que diferentes fuerzas mecnicas jueguen un rol mientras se
puncionan
aspiracin folicular in vivo con una presin de vaco de aspiracin ajustable, como fue
demostrado en la prctica por el Dc. Luis Murga.
OBJETIVOS
Que el alumno desarrolle sus capacidades y obtenga conocimientos bsicos sobre reas de Biotecnologa
reproductiva animal.
Obtener ovocitos mediante aspiracin folicular in vivo.
Aprender a seleccionar y Categorizar los ovocitos obtenidos de la aspiracin folicular
Obtencin de ovocitos en animales vivos con el mtodo de OPU.
La OPU permite incrementar de forma significativa, el nmero de embriones transferibles y de preeces por
vaca al ao, dada la posibilidad de reutilizar las vacas donantes de ovocitos a intervalos mucho ms cortos en
comparacin con la tcnica de superovulacin y en comparacin con la utilizacin de ovarios de matadero.
La tcnica permite realizar hasta dos sesiones de aspiracin por donante a la semana, obtenindose en
promedio unos 4,1 ovocitos/vaca/sesin. Adems, este nmero puede llegar a 10,4 ovocitos/vaca/sesin, si
las donantes son tratadas previamente con hormona folculo estimulante (FSH) y somatotropina (bST), por lo
que se pueden llegar a obtener entre 50 (sin estimulacin hormonal) y 100 (con estimulacin hormonal,
FSH+bST) becerros por vaca donante al ao. Esto representa entre3 a 4 veces el valor logrado con la
transferencia de embriones clsica. Los resultados pueden estar afectados por factores como el dimetro de la
aguja de aspiracin, la presin de aspiracin, el momento del ciclo estral en que se realice la aspiracin,
edad, raza y condicin corporal de la donante, as como el uso de estimulacin hormonal.
Adems, la OPU permite incorporar hembras donantes que se rechazaran en los procedimientos de
superovulacin por razones de dificultades anatmicas en el crvix como a una falta de respuesta o a una
disminucin progresiva de la respuesta al tratamiento superovulatorio. Tambin pudiera ser que se trate de
hembras que sean infrtiles y que continen vacas luego de cuatro o ms servicios. No debe pasarse por alto
la posibilidad de incorporar como donantes de ovocitos a hembras jvenes e inclusive pre-pberes, lo que
nos permitira no solo acortar el intervalo generacional sino tambin acelerar las pruebas de progenie para la
evaluacin gentica de sementales. Por supuesto que para esto es necesaria an mucha investigacin.
Es importante resaltar que el uso de esta tcnica no est restringida a bovinos y ha sido aplicada en diversas
especies
como
son
equinos,
rumiantes
silvestres
y
bfalos,
ademsderepresentarunaherramientaimportanteenlarecuperacindeespeciesenpeligro de extincin. Otro uso
potencial
de
la
OPU
es
la
posibilidad
de
aplicar
tratamientos
hormonalesdirectamenteenelovario.Taleselcasodelainyeccinintraovricadelfactorde
crecimiento
insulnicotipoI (IGF-I), que permite incrementar la capacidad de desarrollo de ovocitos aspirados de ovarios
de hembras pre-pberes.
D. FACTORES:
E. MADURACIN DE OVOCITOS.
La maduracin ovocitaria es un fenmeno complejo, durante el cual el ovocito progresa desde el estadio de
profase de MI hasta el de MII (maduracin nuclear). El ovocito completa la meiosis en respuesta al pico
ovulatorio de LH, o bien, cuando es retirado del folculo para llevar a cabo la maduracin in vitro. Un periodo
de 24h es necesario para que el ovocito bovino complete la maduracin nuclear, es decir, alcance el estadio de
MII, en el que permanece hasta el momento en que es fertilizado, que es cuando completa la meiosis y se
forma los proncleos.
Adems de la maduracin nuclear, tambin es importante que exista una maduracin citoplasmtica ya que
prepara al ovocito para soportar la fertilizacin y aportar los nutrientes requeridos para el desarrollo
embrionario temprano. De manera natural, la meiosis inicia en el ovario fetal, pero se detiene antes del
nacimiento, en la profase (PI) de la primera divisin meiotica; los ovocitos pasan entonces a la etapa
reticulada, que es un estado de reposo nuclear y que suele durar hasta que se ovula el primer ovocito en la
pubertad. Los ovocitos en reposo o inmaduros tienen un gran ncleo denominado vescula germinal. La
meiosis avanza desde la etapa de vescula germinal o PI hasta la metafase de la segunda divisin meiotica en
la que se detiene una vez ms, dando como resultado un primer cuerpo polar que es expulsado al espacio
perivitelino. De la misma manera en la que madura el nucleo se debe llevar a cabo la maduracin del
citoplasma.
En los ltimos tiempos se ha podido demostrar que la adquisicin de capacidad para desarrollar es un proceso
que comienza mucho antes del periodo periovulatorio, antes de la ruptura de la vescula germinal. En este
sentido se ha demostrado que ovocitos contenidos en folculos antrales de ms de 5-6 mm presentan una
mayor capacidad para desarrollar respecto a aquellos contenidos en folculos de menor dimetro.
Recientemente se han desarrollado protocolos de estimulacin ovrica en bovinos tendientes a aumentar la
presencia de folculos de mayor dimetro al momento de la puncin folicular con los que se han obtenido
tasas de produccin de embriones hasta un 80%.
Cuando los ovocitos son aspirados desde los folculos terciarios reanudan espontneamente la meiosis y al ser
cultivados in vitro continan con los procesos de maduracin. De este modo la composicin de los medios y
el ambiente controlado por estufas de cultivo, deben brindar un ambiente adecuado para que la maduracin
ocurra en 24hs de un modo similar a lo que sucede in vivo durante ms de dos ciclos estrales en el bovino.
Las condiciones utilizadas en la mayora de los laboratorios para lograr este ambiente, involucra el uso de
medios de cultivo tales como el TCM-199 suplementado con hormonas (LH, FSH, estradiol, etc.),
antioxidantes (glutatin, cisteamina, cistina), factores de crecimiento y macromoleculas (suero, albumina), en
una atmsfera de 5% CO2 a 38,5C y humedad a saturacin.
V.
MATERIALES
A. EQUIPOS
transductor
lidocana
Placa trmica de calentamiento
Estereomicropscopio
Micropipetas
Bao mara
B. MATERIALES
LABORATORIO:
Termo
Vaso de precipitado x 200 cc ( 01 unidad)
Solucin Fisiolgica (NaCl 0.9%) 1 litro
Jeringa de 5 ml y agujas de 18 x 1 (1 unidad por alumno).
Placas Petri de 100 mm y placa Petri de 35 mm ( 5 o 6 unidades)
Guantes quirrgicos (1 par / alumno)
Papel Toalla (01 rollo/grupo)
BIOLOGICOS:
Ovarios de la vaca 064, Mara y Ilse
V.
PROCEDIMEINTO Y RESULTADOS
La
OPU
precisa
de
la
tranquilizacion previa del animal,
esta se llevara a cabo con el animal
en un chantador, mediante
lidocana. 2%.
Posteriormente,
se
debe
administrar anestesia va epidural,
para
reducir
los
esfuerzos
expulsivos
y
facilitar
la
manipulacin del ovario.
Se introducir el transductor en la
vagina convenientemente
lubricado y protegido por una
cubierta sanitaria de ltex.
Para la visualizacin de los folculos ovricos empleamos un ecgrafo equipado con una sonda transvaginal de
5-75 MHz y un handgrip o mango de OPU de 60 cm de longitud donde se colocara la gua de puncin. Por la
gua se introducir una aguja de puncin desechable (20 G, 09 x 70mm) conectada a un tubo estril de 50 ml
mediante una conduccin de Tefln. El equipo de OPU se completa con una bomba de vaco accionada por
pedal con la que se aplicara una aspiracin constante de 50-53 mm Hg (20 ml/min).
El tubo de recogida debe mantenerse atemperado a 37oC en bao termosttico (grafico 1).
. Bsqueda y clasificacin de
los vulos.
VI.
Clasificaremos los COCs obtenidos en cuatro categoras, segn homogeneidad, morfologa del citoplasma y
compactibilidad de las clulas del cumulo:
Categora I: Ovocitos con ms de
tres capas de clulas de cumulo
compactas y con citoplasma
homogneo
uniformemente
granulado.
CONCLUCIONES
En conclusin, la aspiracin folicular transvaginal es un procedimiento que permite la recuperacin
repetida de ovocitos de donantes vivas, siendo una tcnica de alta eficiencia y repetibilidad, lo que
permite al combinarla con la fertilizacin in vitro superar con creces el nmero de becerros obtenidos
por donante en un periodo fijo de tiempo en comparacin con la superovulacin.
La aplicacin de esta tcnica puede, adems, incrementar el nmero de donantes de ovocitos entre las
cuales se podr contar con hembras pre-puberales, lo que permitira reducir el intervalo generacional y
as incrementar el progreso gentico.
Con el desarrollo de todos los procesos de produccin de embriones in vitro, se conoci la tcnica de
una manera clara y precisa y como estudiantes nos comprometemos en seguir desarrollando la tcnica
y realizar investigaciones en la tcnica.
Se trabaj con los principales medios de cultivo para la produccin in vitro de embriones y se conoci
de una manera correcta cada una de ellas.
El mtodo descrito de produccin in vitro de embriones permite disponer de un gran nmero de
embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo.
VII.
BIBLIOGRAFIA
STRINGFELLOW. DA., SIEDEL. SM., Manual de la sociedad internacional de transferencia de
embriones (I.E.T.S), 3ed, Alabama USA. 2000.
FELMER R, Produccin in vitro de embriones bovinos: Suplementacin de los medios de cultivo con
suero. Arch. Med. Vet, 2006; 38(2): pp.97-104.
VERNICA A. PELEZ, Produccin In Vitro De Embriones Bovinos.
PALASZ, AT., Y DE LA FUENTE, J. Produccin de embriones bovinos: Efecto de los medios de
cultivo y de los requerimientos fisiolgicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro.
http://es.scribd.com/doc/6137003/9-Cultivo-deEmbriones-Bovinos. 2000.
PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., CRITSER, E.S.,
EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen.
Theriogenology; 25: 591-600. 1986.
VIII. ANEXOS
Preparacin de materiales
Muestra de la vaca 064
Muestra de la vaca 064, Mara
y ILSE
Resultados de la aspiracin
en un bao mara Resultado de la vaca 064,
Muestra de la vaca 064, Mara
Mara y ILSE
y ILSE
Observacin de ovarios y
ovocitos
Resultado de la 064, Mara y Clulas espermticas
ILSE